專利名稱：一種含p40分子或其基因的醫(yī)藥制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)發(fā)明涉及以p40分子或者編碼p40分子的基因?yàn)橛行С煞?、用于對抗白?xì)胞介素-23(IL-23)引起的免疫反應(yīng)的醫(yī)藥制劑。具體是以機(jī)體的可溶性p40分子或者可以表達(dá)并分泌p40分子的基因?yàn)橛行С煞?，對抗由IL-23介導(dǎo)的對機(jī)體不利的免疫反應(yīng)，可廣泛用于例如治療自身免疫疾病、緩和移植物排異反應(yīng)等用途。本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
以往，使用免疫抑制劑是對抗對機(jī)體有害的免疫反應(yīng)(如以自身臟器為攻擊靶標(biāo)的自身免疫疾病或臟器移植后的排異反應(yīng)等)的唯一手段。這類免疫抑制劑中有對全部免疫反應(yīng)有抑制作用的抗T淋巴細(xì)胞抗體和甾體類激素等制劑、也有對活化的T細(xì)胞有抑制作用的環(huán)孢子菌素等制劑。這些制劑的免疫抑制作用特異性不強(qiáng)，會導(dǎo)致機(jī)體的防御能力下降、對病毒和細(xì)菌的易感染性增強(qiáng)、進(jìn)而使機(jī)會感染的可能性大大增高，所以臨床使用免疫抑制劑都非常慎重。另外，已經(jīng)證實(shí)長期使用免疫抑制劑會增加患惡性腫瘤的危險(xiǎn)性。從醫(yī)療需要出發(fā)，免疫抑制劑是不可缺少的，但是另一方面已有的免疫抑制劑存在嚴(yán)重的副作用和危險(xiǎn)性，因此，人們一直在嘗試開發(fā)出以參與機(jī)體免疫反應(yīng)的分子為作用靶點(diǎn)的特異性免疫抑制劑，但是，至今尚無理想成果。
由各種免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在復(fù)雜而精細(xì)的免疫反應(yīng)調(diào)控中具有重要的作用。而另一方面，這些能活化免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子又與很多疾病有關(guān)。特別是自身免疫疾病患者，已經(jīng)被證實(shí)其炎性細(xì)胞因子的分泌明顯異常于正常健康人(非專利文獻(xiàn)1)。這種細(xì)胞因子分泌異常被認(rèn)為是自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)理之一(非專利文獻(xiàn)2)。因此，阻斷這些細(xì)胞因子的受體信號傳導(dǎo)通路，從而減弱異常免疫反應(yīng)，是開發(fā)新的特異性免疫抑制劑的有效途徑。
2000年，一種在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起中心作用的細(xì)胞因子--白細(xì)胞介素-23(IL-23)被發(fā)現(xiàn)(非專利文獻(xiàn)3)。盡管IL-23與已知的白細(xì)胞介素12(IL-12)結(jié)構(gòu)和功能相似，最近的研究表明，它與免疫反應(yīng)的活化和異常有著更密切的關(guān)系。IL-23是由兩個(gè)亞基(p19分子+p40分子)通過二硫鍵組成的二聚體，IL-12則是由p35與p40分子形成的二聚體(非專利文獻(xiàn)4)，其p40亞基與IL-23的p40亞基相同。另外，IL-23受體是IL-12Rβ1與IL-23R構(gòu)成的二聚體(非專利文獻(xiàn)5)，IL-12受體則是由IL-12Rβ1與IL-12Rβ2構(gòu)成的二聚體(非專利文獻(xiàn)6)。因此IL-23受體和IL-12受體都有IL-12Rβ1亞基。另外，對IL-12與其受體的結(jié)合研究表明，p40分子與IL-12Rβ1相結(jié)合(非專利文獻(xiàn)7)，并且推測p19分子與IL-23R、p35分子與IL-12Rβ2相結(jié)合。進(jìn)一步的研究表明，雖然二者受體的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)都是利用JAK/STAT信號傳導(dǎo)路徑，但是有所不同，IL-23受體激活引起STAT-3活化，IL-12受體激活則引起STAT-4活化?？傊?，由于IL-23這一新的細(xì)胞因子及其受體與IL-12及其受體結(jié)構(gòu)類似，因此推測IL-23在IL-12參與的免疫反應(yīng)中也有重要作用，值得深入探討。
風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、克隆病等臟器特異的自身免疫疾病現(xiàn)在認(rèn)為大多是由于1型輔助細(xì)胞(Th1)和Th2功能之間的平衡被打破，從而自身反應(yīng)性Th1細(xì)胞被活化而引起的。由于IL-12能增強(qiáng)Th1反應(yīng)，因此在自身免疫疾病的發(fā)病上起著可能起重要作用。事實(shí)上，已經(jīng)有報(bào)告表明，在自身免疫疾病模型鼠觀察到，給予能阻斷IL-12與其受體結(jié)合的抗p40單克隆抗體能抑制發(fā)病和減輕癥狀(非專利文獻(xiàn)8)。由于新發(fā)現(xiàn)的IL-23也含有p40亞基，抗p40抗體也能阻斷IL-23與其受體結(jié)合，因此不能排除IL-23在自身免疫疾病中也有重要的作用?，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，在自身免疫疾病模型--實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAEexperimentalautoimmune encephalomyelitis)上，IL-23與其發(fā)病密切相關(guān)(非專利文獻(xiàn)9)。這一模型小鼠的癥狀與人的多發(fā)性硬化癥類似，是用髓鞘堿性蛋白或髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白的肽片段對特定品系的小鼠進(jìn)行免疫，誘導(dǎo)其發(fā)病。雖然抗p40抗體對于EAE也能發(fā)揮治療作用(非專利文獻(xiàn)10)，p35基因(非專利文獻(xiàn)11)缺失或者IL-12Rβ2基因缺失的鼠(非專利文獻(xiàn)12)，盡管其IL-12的生理功能已遭到破壞(這些鼠的IL-23功能正常)，但仍然患上了EAE。不過，對于不能只表達(dá)IL-23的p19遺傳因子缺失鼠，未觀察看到以單核淋巴細(xì)胞為主的的炎性細(xì)胞在腦內(nèi)高度聚集、動物也未發(fā)現(xiàn)EAE癥狀。有意思的是，向p19基因缺失小鼠以腺病毒載體導(dǎo)入IL-23基因后，小鼠則易被誘導(dǎo)發(fā)病，產(chǎn)生EAE癥狀。(非專利文獻(xiàn)9)。另外，p19轉(zhuǎn)基因小鼠則呈現(xiàn)自身免疫疾病的癥狀，在其腦內(nèi)觀察到巨噬細(xì)胞向炎癥部位的顯著浸潤(非專利文獻(xiàn)13)。綜上所述，IL-23會加強(qiáng)炎癥性巨噬細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨?，與IL-12相比，它在自身免疫疾病的發(fā)病中擔(dān)當(dāng)著更加重要的角色。
IL-23與IL-12一樣，能促進(jìn)T細(xì)胞增殖、促進(jìn)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)，在細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活中起著重要作用。這在基因缺失小鼠得到證實(shí)。對不能產(chǎn)生IL-12而能產(chǎn)生IL-23的p35基因缺失小鼠，或者既不能夠產(chǎn)生IL-12也不能產(chǎn)生IL-23的p40基因缺失小鼠，兩者的抗細(xì)菌感染等的能力顯著減弱。而且，p40基因缺失鼠比p35基因缺失鼠的抗感染能力更弱，易發(fā)生感染死亡(非專利文獻(xiàn)14)。這一現(xiàn)象表明，IL-23與IL-12都在細(xì)胞免疫應(yīng)答中有重要的作用。另有研究表明，將導(dǎo)入IL-23基因的腫瘤細(xì)胞接種到動物體內(nèi)，能活化殺傷性T細(xì)胞，從而完全排斥腫瘤(非專利文獻(xiàn)15)，提示動物建立了腫瘤特異性的后天免疫，表明IL-23對細(xì)胞免疫反應(yīng)具有促進(jìn)作用。另外，導(dǎo)入IL-12基因的腫瘤也因?yàn)橥瑯拥臋C(jī)理能被宿主動物排斥，引起后天免疫(非專利文獻(xiàn)16)。人們認(rèn)為IL-23與IL-12一樣，對細(xì)胞性免疫的活化都起著重要作用。
非專利文獻(xiàn)1Shimozato，O et al.，Cytokine，8，99-105，199非專利文獻(xiàn)2Skurkovich，SV et al.，Med.Hypotheses.，59，770-780.200非專利文獻(xiàn)3Oppmann，B et al.，Immunity，13，715-725，2000非專利文獻(xiàn)4Gubler，U et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4143-4147，199非專利文獻(xiàn)5Parham，C et al.，J.Immunol.，168，5699-5708，200非專利文獻(xiàn)6Presky，DH et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，14002-14007，1996
非專利文獻(xiàn)7Presky，DH et al.，Ann.NY Acad.Sci.，795，390-393，199非專利文獻(xiàn)8Fujihira，K et al.，Diabetes，49，1998-2006，2000非專利文獻(xiàn)9Cua，DJ et al.，Nature，421，744-748，200非專利文獻(xiàn)10Leonard，JP et al.，J.Exp.Med.，181，381-386，199非專利文獻(xiàn)11Gran，B et al.，J.Immunol.，169，7104-7110，200非專利文獻(xiàn)12Zhang，G-X et al.，J.Immunol.，170，2153-2160，200非特許文獻(xiàn)13Wiekowski，MT et al.，J.Immunol.，166，7563-7570，200非特許文獻(xiàn)14Holscher，C et al.，J.Immunol.，167，6957-6966，200非特許文獻(xiàn)15Wang，Y-Q et al.，Int.J.Cancer，105，820-824，200非特許文獻(xiàn)16Tasaki，K et al.，Cancer Gene Ther.，7，247-254，2000發(fā)明內(nèi)容如上所述，IL-23參與自身免疫疾病等過度的異常免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的活化，通過特異性地阻斷IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對免疫疾病進(jìn)行治療將是非常有效的手段。
本發(fā)明的目的是特異性地抑制特定的免疫反應(yīng)。具體是使用可溶性p40分子特異性地阻斷與自身免疫疾病中的過度免疫反應(yīng)和臟器移植誘發(fā)炎癥中的細(xì)胞免疫反應(yīng)等密切相關(guān)的IL-23的活動。以往的非特異性免疫抑制劑對機(jī)體的全部免疫功能都有抑制作用，具有較大的缺陷，而本發(fā)明中的p40分子是基于機(jī)體本身存在的分子的結(jié)構(gòu)用分子生物學(xué)進(jìn)行合成、對IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有特異性抑制作用。與已有的免疫抑制劑不同，它可以在臨床上發(fā)揮更大的作用。
因此，本發(fā)明是以p40分子或者編碼p40分子的基因?yàn)橛行С煞?、抑制由IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的醫(yī)藥制劑。
由于p40分子與IL-12Rβ1特異性分子結(jié)合，所以可溶性p40分子能阻斷IL-12與其受體的結(jié)合。另外，有報(bào)道表明，p40二聚體比單體的阻斷效果更好(Gillessen，S et al.，Eur.J.Immunol.，25，200-206，1995)?？扇苄詐40分子阻斷IL-23與其受體結(jié)合的現(xiàn)象已經(jīng)在不少研究中得到證實(shí)，包括p40分子對IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抑制、對IL-23誘發(fā)的的IFN-γ產(chǎn)生的抑制以及對IL-23基因?qū)肽[瘤后抗腫瘤作用的翻轉(zhuǎn)，這些結(jié)果都進(jìn)一步證實(shí)了p40分子對IL-23受體結(jié)合的阻斷作用。表明p40分子或者編碼p40分子基因可以有效成分用來制作抑制IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的醫(yī)藥制劑。
p40分子是構(gòu)成樹狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-23亞基之一。具體地說，本發(fā)明中采用的p40分子是序列表1所示的第23至328氨基酸序列構(gòu)成的人p40分子、或者是在序列表1所列氨基酸序列基礎(chǔ)上，缺失、置換或者添加數(shù)個(gè)氨基酸殘基而產(chǎn)生的與p40分子功能相同的蛋白質(zhì)。這里所說的有著同樣功能，是指具有與人p40分子的抑制IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)作用。編號為1的序列中所示的第1至第22號的氨基酸是信號肽。
具體地說，本發(fā)明中采用的編碼p40分子的基因是序列表1所示的第67號至第984號堿基的基因、或者是能編碼具有與p40分子相同功能的p40分子的突變蛋白的基因。這里所說的有著同樣功能，與上面的解釋意義相同。這里所指的突變蛋白是在序列1所示的第23號至第328號的氨基酸序列基礎(chǔ)上，缺失、置換和(或)添加1至數(shù)個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生的。另外還包括，通過在嚴(yán)格條件下與含有序列1所示堿基序列的基因雜交而獲得的、所編碼分子與p40分子具有同樣功能p40的突變體基因。這里所指的嚴(yán)格條件，比如在下列條件下進(jìn)行雜交在含6×SSPE，2×Denharts溶液、0.5％ SDS、0.1mg/ml魚精DNA的雜交液中、65℃下，進(jìn)行12小時(shí)Southern雜交。
另外，序列1中所示的第1號至第66號的堿基序列與編碼信號肽序列相當(dāng)。在本發(fā)明中，將編碼p40分子的基因作為有效成分來使用時(shí)，通常是用病毒或者非病毒載體將基因?qū)耄⒈磉_(dá)、分泌基因產(chǎn)物。因此，上述的編碼p40分子的基因的上游都附加編碼信號肽的基因序列。編碼信號肽的基因并不局限于序列1所示的第1號至第66號的序列，還可以使用編碼其他常規(guī)信號肽的基因序列。
按照序列1所示的人p40分子的基因序列、采用眾所周知的PCR法可以獲得上述基因。按照Molecular Cloning 2nd Edt.，Cold SptingHarbor Laboratory Press(1989)等基本參考書去做，本行業(yè)中的人員，可以輕易掌握這類方法。例如部位特異性突變誘導(dǎo)法、PCR法或者通常的雜交法等都能輕易掌握。具體可以參照上述Molecular Cloning等基本參考書來進(jìn)行操作。上述的p40分子也一樣，使用上述本行業(yè)中眾所周知的重組DNA法就能夠輕易獲得，也可以用常規(guī)蛋白質(zhì)合成法來獲得。
本發(fā)明中采用的p40分子通?？赏ㄟ^靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部、經(jīng)直腸、經(jīng)皮、經(jīng)鼻等非經(jīng)口方式施用。作為非經(jīng)口方式施用的劑型可以是例如注射用水性劑或者油性劑、軟膏劑、乳膏劑、洗劑、氣霧劑、坐劑、粘貼劑等。進(jìn)一步，還可以配制成緩慢釋放的丸劑埋入體內(nèi)、或者用滲透泵等使其在體內(nèi)緩慢釋放。另外，也可以采用經(jīng)口施用的方式，通常，以小膠囊或微脂粒等在消化道不易被分解的劑型施用。
這些制劑采用公眾熟知的技術(shù)進(jìn)行配制，可以含有制劑領(lǐng)域常規(guī)使用的無毒性、惰性載體或者賦形劑。另外，還可以根據(jù)需要采用常規(guī)的結(jié)合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、助溶劑等調(diào)和劑。
p40分子的施用劑量和施用次數(shù)因使用對象的癥狀、病歷、年齡、體重、給藥方式等而不同。例如，對于成人(體重60kg)，采用靜脈內(nèi)、經(jīng)口等的方式施用時(shí)，通常為1日100～5,000mg，更好是400～2,000mg、最好是800～1,200mg的范圍內(nèi)酌情配制，可以一次或分成數(shù)次施用。
本發(fā)明中，在使用編碼p40分子的基因時(shí)，如上所述，通常是在含有能表達(dá)并分泌p40分子的基因的病毒載體或者非病毒載體中使用。作為病毒載體，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等是有代表性的病毒載體。具體地說，例如，如無毒化的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、辛德畢斯病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、仙臺病毒、SV40、人類免疫缺陷病毒(HIV)等DNA病毒和一些RNA病毒。在這些病毒中，腺病毒的感染效率比起采用其它病毒要高得多、最好采用腺病毒類載體。
非病毒載體指能在哺乳動物體內(nèi)表達(dá)目的基因的一些載體，例如pcDNA3.1，pZeoSV，pBK-CMV(Invitrogene公司，Strategene公司)，pCAGGS(Gene 108，193-200，1991)等載體。
為制備本發(fā)明所包括的醫(yī)藥制劑，須向上述各類載體中以可表達(dá)的方式插入上述基因或突變體。用于這些病毒載體或者非病毒載體的制備方法和施用方法都是利用本行業(yè)人員所熟知的技術(shù)，有很多文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書可以參考，如《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分冊》，基因治療的基本技術(shù)，羊土社，日本，1996；《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分冊》，基因?qū)牒捅磉_(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，羊土社，日本，1997；日本基因治療學(xué)會編《基因治療開發(fā)研究手冊》，NTS，1999等。
這些被插入p40基因并能表達(dá)、分泌p40分子的病毒或者非病毒載體既可直接給藥，也可以在醫(yī)藥制劑常規(guī)許可范圍內(nèi)加入賦形劑，制成溶液、懸濁液、膠體等劑型。給藥方式，可以采用局部注射等形式?；蛲ㄟ^靜脈或者動脈進(jìn)行系統(tǒng)給藥。
本發(fā)明還包括向載體細(xì)胞導(dǎo)入上述基因使其表達(dá)、分泌p40，然后可以將這些細(xì)胞施用到人體。作為載體使用的細(xì)胞可以是例如纖維芽細(xì)胞、肌肉芽細(xì)胞、末梢血細(xì)胞、各種干細(xì)胞、經(jīng)放射線處理過的腫瘤細(xì)胞等。為了使用病毒載體或者非病毒載體將引入了遺傳因子的細(xì)胞，例如、在LXSN(Miller，AD，Rosman，GJ，BioTechniques，7，980-990，1989)、MGF、α-SCG、PLJ、pEm(特表平6-503968號公報(bào))等逆病毒載體的克隆化部位上插入p40分子的編碼遺傳因子，以使其能顯現(xiàn)并分泌，然后，將DNA引入包裝細(xì)胞、使用引入了p40分子編碼遺傳因子的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中含有的逆轉(zhuǎn)錄病毒，使細(xì)胞感染，就能將p40分子的編碼引入了遺傳因子的細(xì)胞。引入了遺傳因子的細(xì)胞通常用半透過性聚合物等包裹、以精氨酸—聚-L-賴氨酸膠囊或者瓊脂珠等形態(tài)來施用(Suzuki，R et al.，Cell Transplant.，11，787-797，2002；Al-Hendy，A et al.，Hum.Gene Ther.，7，61-70，1996)。
本發(fā)明的醫(yī)藥制劑對IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常引起的免疫性疾病、例如膠原病、多發(fā)性硬化癥、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、慢性甲狀腺炎等特別有效。另外對IL-23介導(dǎo)的移植器官排斥反應(yīng)也很有效。本發(fā)明的醫(yī)藥制劑的優(yōu)點(diǎn)是能特異性阻斷IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
為更詳細(xì)地說明本發(fā)明，下面以實(shí)施例來進(jìn)行說明。實(shí)施例并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限定。
實(shí)施例1重組IL-23和p40分子的制作從BALB/c小鼠皮下移植性腫瘤的細(xì)胞中提取總RNA，用RT-PCR法獲得p19和p40的全長cDNA、并將其插入到動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)的克隆化部位(Eco RI/Bam HI)，兩種cDNA之間由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosomal entry site，IRES)(Duke，GM etal.，J.Virol.，66，1602-1609，1992)連接。，IL-23表達(dá)載體是在CMV啟動子的下游插入以p19/IRES/p40順序排列的基因，p19與p40 cDNA一起由CMV啟動子控制其轉(zhuǎn)錄。用于表達(dá)可溶性p40分子的載體中，只插入p40 cDNA，其轉(zhuǎn)錄由CMV啟動子進(jìn)行控制。用Lipofectin試劑(Invitrogen公司)將上述載體引入猴的腎細(xì)胞COS-7(American Type Culture Collection，ATCC)、培養(yǎng)48小時(shí)后回收培養(yǎng)上清液。用ELISA法(BioSource公司)確認(rèn)該培養(yǎng)上清液中p40分子的存在。引入IL-23或p40基因的細(xì)胞培養(yǎng)上清中p40的濃度分別為6.56ng/ml、4.97ng/ml，在下面的實(shí)驗(yàn)中，將利用這些培養(yǎng)液中的IL-23和可溶性p40分子。
這里使用的小鼠編碼p40分子的基因是序列表2中所示的堿基序列。序列2中的5’末端包含編碼信號肽的堿基序列。
實(shí)施例2p40抑制IL-23誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的作用用Concanavalin A(5μg/ml、Sigma公司)刺激C57BL/6鼠的脾臟細(xì)胞，48小時(shí)后，回收活細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次后，接種于24孔板上(2.5×106個(gè)/孔)，加入含有IL-23的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入加入導(dǎo)入p40基因的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清或未引入任何基因的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清。經(jīng)過48小時(shí)培養(yǎng)后，回收培養(yǎng)上清，用ELISA法(eBioscience公司)測定其中IFN-γ的含量。
所得結(jié)果如圖1所示。添加含p40分子的培養(yǎng)上清后，與添加不含p40分子的培養(yǎng)上清的組相比，IFN-γ的分泌發(fā)生了顯著降低。表明p40分子顯著抑制了IL-23誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的作用。
實(shí)施例3將IL-23或p40基因?qū)爰?xì)胞將小鼠p19和p40 cDNA用IRES插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN的克隆化位點(diǎn)(Eco RI/Bam HI)中。IL-23表達(dá)載體是在5’LTR下游插入以p19/IRES/p40順序排列的基因片段，可溶性p40分子的表達(dá)載體中，只插入p40的cDNA。IL-23和p40的轉(zhuǎn)錄都由5’LTR進(jìn)行控制。用Lipofectin試劑(Invitrogen公司)將上述表達(dá)載體引入包裝細(xì)胞Psi-2(ATCC)后，用添加了G418(400μg/ml、Invitrogen公司)的培養(yǎng)液進(jìn)行選擇培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)上清液和多聚季胺(polybrene，8μg/ml、Aldrich公司)再進(jìn)一步感染PA317細(xì)胞(ATCC)、用G418(400μg/ml、Invitrogen公司)選擇培養(yǎng)，此PA317細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的含逆轉(zhuǎn)錄病毒。用此上清感染小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(Colon26)，從而導(dǎo)入IL-23或p40基因，克隆化(Colon26/IL-23、Colon26/p40)后確認(rèn)這些細(xì)胞中的p19、p35、p40基因的表達(dá)和培養(yǎng)上清液中p40分子的分泌量。(Colon26/IL-23、Colon26/p40的分泌量均為0.8～1.1ng/ml/1×106/48小時(shí))。另外，還確認(rèn)了對顯示腫瘤抗原的遞呈有重要作用的主要組織相容性抗原H-2K/H-2D的表達(dá)，與親株細(xì)胞無顯著差別、另外，導(dǎo)入上述基因的細(xì)胞體外增殖速度也與親株細(xì)胞相同。這里使用的小鼠p40基因是序列表2所示的堿基序列構(gòu)成。序列2中所示的堿基序列的5’末端上包含的編碼信號肽的序列。
實(shí)施例4p40分子對導(dǎo)入IL-23基因后抗腫瘤效果的抑制作用將Colon26/IL-23細(xì)胞(1×106個(gè))向同種BALB/c小鼠皮下接種后，長出的腫瘤在經(jīng)過一段時(shí)間后全部退縮、最終完全消失。將Colon26/IL-23與母株Colon26以1∶1比例混和(總細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))后給同類小鼠做皮下接種，腫瘤在經(jīng)過一段時(shí)間后、最終腫瘤完全被排斥(圖2)。但是，將Colon26/IL-23與Colon26/p40以1∶1的比例混和(總細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))后給同類鼠做皮下接種，它的增殖與單接種親株細(xì)胞(總細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))時(shí)一樣，長出的腫瘤并未受到排斥(圖2)。表明，導(dǎo)入IL-23基因產(chǎn)生的抗腫瘤效果受到可溶性p40分子的抑制。
技術(shù)效果如上所述，現(xiàn)已闡明，導(dǎo)入p40基因的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清對于由IL-23濃度性誘導(dǎo)脾細(xì)胞分泌IFN-γ的作用有顯著抑制作用。另外，導(dǎo)入p40基因的Colon26細(xì)胞對Colon26/IL-23細(xì)胞的抗腫瘤效果有抑制作用。從上述事實(shí)可以推斷，利用載體表達(dá)并分泌p40分子，所產(chǎn)生的可溶性p40分子能抑制IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，使用p40分子或者編碼p40分子基因可以抑制自身免疫疾病和移植器官排異反應(yīng)等IL-23能參與的免疫反應(yīng)，使得自身免疫疾病和過敏性疾病的預(yù)防和治療成為可能，并為移植器官的順利存活提供保障。


圖1.圖中表示，導(dǎo)入p40基因的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清抑制IL-23濃度依賴性誘導(dǎo)脾細(xì)胞分泌IFN-γ的作用。
圖2.圖中表示，導(dǎo)入了p40基因的結(jié)腸癌colon26細(xì)胞抑制IL-23基因的抗腫瘤作用。
SEQUENCE LISTING<110> 中華人民共和國復(fù)旦大學(xué)；日本國千葉縣政府(Chiba Prefecture，Japan)<120> 一種含p40分子或其基因的醫(yī)藥制劑<130> Fudan-20040812<150> JP2003 292937<151> 2003-08-13<160> 2<170> Patentln version 3.2<210> 1<211> 987<212> DNA<213> 人(Homo sapiens)<400> 1atg tgt cac cag cag ttg gtc atc tct tgg ttt tcc ctg gtt ttt ctg48Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu1 5 10 15gca tct ccc ctc gtg gcc ata tgg gaa ctg aag aaa gat gtt tat gtc96Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val20 25 30gta gaa ttg gat tgg tat ccg gat gcc cct gga gaa atg gtg gtc ctc 144Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu35 40 45acc tgt gac acc cct gaa gaa gat ggt atc acc tgg acc ttg gac cag 192Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln50 55 60agc agt gag gtc tta ggc tct ggc aaa acc ctg acc atc caa gtc aaa 240Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys65 70 75 80gag ttt gga gat gct ggc cag tac acc tgt cac aaa gga ggc gag gtt 288Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val85 90 95
cta agc cat tcg ctc ctg ctg ctt cac aaa aag gaa gat gga att tgg 336Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp100 105 110tcc act gat att tta aag gac cag aaa gaa ccc aaa aat aag acc ttt 384Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe115 120 125cta aga tgc gag gcc aag aat tat tct gga cgt ttc acc tgc tgg tgg 432Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp130 135 140ctg acg aca atc agt act gat ttg aca ttc agt gtc aaa agc agc aga 480Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg145 150 155 160ggc tct tct gac ccc caa ggg gtg acg tgc gga gct gct aca ctc tct 528Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser165 170 175gca gag aga gtc aga ggg gac aac aag gag tat gag tac tca gtg gag 576Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu180 185 190tgc cag gag gac agt gcc tgc cca gct gct gag gag agt ctg ccc att 624Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile195 200 205gag gtc atg gtg gat gcc gtt cac aag ctc aag tat gaa aac tac acc 672Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Lau Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr210 215 220agc agc ttc ttc atc agg gac atc atc aaa cct gac cca ccc aag aac 720Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn225 230 235 240ttg cag ctg aag cca tta aag aat tct cgg cag gtg gag gtc agc tgg 768Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp245 250 255gag tac cct gac acc tgg agt act cca cat tcc tac ttc tcc ctg aca 816Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr260 265 270ttc tgc gtt cag gtc cag ggc aag agc aag aga gaa aag aaa gat aga 864
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg275 280 285gtc ttc acg gac aag acc tca gcc acg gtc atc tgc cgc aaa aat gcc 912Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala290 295 300agc att agc gtg cgg gcc cag gac cgc tac tat agc tca tct tgg agc 960Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser305 310 315 320gaa tgg gca tct gtg ccc tgc agt tag 987Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Sto325<210> 2<211> 1008<212> DNA<213> 小鼠(mouse)<400> 2atg tgt cct cag aag cta acc atc tcc tgg ttt gcc atc gtt ttg ctg 48Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu1 5 10 15gtg tct cca ctc atg gcc atg tgg gag ctg gag aaa gac gtt tat gtt 96Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val20 25 30gta gag gtg gac tgg act ccc gat gcc cct gga gaa aca gtg aac ctc 144Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu35 40 45acc tgt gac acg cct gaa gaa gat gac atc acc tgg acc tca gac cag 192Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln50 55 60aga cat gga gtc ata ggc tct gga aag acc ctg acc atc act gtc aaa 240Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys65 70 75 80gag ttt cta gat gct ggc cag tac acc tgc cac aaa gga ggc gag act 288
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260 265 270cga atc cag cgc aag aaa gaa aag atg aag gag aca gag gag ggg tgt 864Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys275 280 285aac cag aaa ggt gcg ttc ctc gta gag aag aca tct acc gaa gtc caa 912Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln290 295 300tgc aaa ggc ggg aat gtc tgc gtg caa gct cag gat cgc tat tac aat 960Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn305 310 315 320tcc tcg tgc agc aag tgg gca tgt gtt ccc tgc agg gtc cga tcc tag 1008Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Sto325 330 33權(quán)利要求
1.一種用于特異性阻斷白細(xì)胞介素23(IL-23)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的醫(yī)藥制劑，其特征是以p40分子或其基因?yàn)橛行С煞帧?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥制劑，其特征為所述p40分子是由序列表1所示的第23至328氨基酸序列構(gòu)成的人p40分子、或者是在序列表1所列氨基酸序列基礎(chǔ)上，缺失、置換和(或)添加數(shù)個(gè)氨基酸殘基而產(chǎn)生的與人p40分子功能相同的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥制劑，其特征為所述的編碼p40分子的基因是具有序列表1所示的第67號至第984號堿基序列的基因、或者是編碼具有與人p40分子相同功能的p40分子突變蛋白的基因，這里所指的突變蛋白是在序列1所示的第23號至第328號的氨基酸序列基礎(chǔ)上，缺失、置換和(或)添加1至數(shù)個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生的，或者通過在嚴(yán)格條件下與含有序列1所示堿基序列的基因雜交而獲得的、所編碼分子與人p40分子具有同樣功能p40突變體基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的醫(yī)藥制劑，其特征是編碼p40分子的基因以可表達(dá)、分泌的形式構(gòu)建到病毒或者非病毒載體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的醫(yī)藥制劑，其特征是將所述的能表達(dá)、分泌p40分子的病毒或者非病毒載體導(dǎo)入到細(xì)胞中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5所述的任一醫(yī)藥制劑，在制備預(yù)防或治療由IL-23介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常相關(guān)的免疫疾病或者抑制機(jī)體對移植器官的排異反應(yīng)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，涉及以p40分子或者編碼p40分子的基因?yàn)橛行С煞?、用于對抗白?xì)胞介素－23(IL－23)引起的免疫反應(yīng)的醫(yī)藥制劑。具體是以可溶性p40分子或者可表達(dá)并分泌p40分子的基因?yàn)橛行С煞?，對抗由IL－23介導(dǎo)的對機(jī)體不利的免疫反應(yīng)，可廣泛用于例如治療免疫反應(yīng)異?？哼M(jìn)引起的免疫疾病如膠原病、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、慢性甲狀腺炎等。還可以用于抑制機(jī)體對移植物的排異反應(yīng)。
文檔編號A61P37/06GK1748787SQ200410059129
公開日2006年3月22日 申請日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者田川雅敏, 王彥青 申請人:復(fù)旦大學(xué), 日本國千葉縣