專利名稱：靶向去唾液酸糖蛋白受體的抗乙型肝炎病毒反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種靶向去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR，asialoglucoprotein receptor)治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的反義寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、結(jié)構(gòu)及其治療藥物。
HBV感染嚴(yán)重威脅人類的健康，是導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。目前仍然缺乏特別有效的治療藥物，因此新型抗HBV藥物具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
ASGPR為本實(shí)驗(yàn)室通過篩選從肝細(xì)胞中獲得的幾種靶標(biāo)之一，通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其具有很好的特異性和可藥性。國外文獻(xiàn)報(bào)道ASGPR為乙型肝炎病毒進(jìn)入肝細(xì)胞的受體之一，可發(fā)展成為抗HBV治療的潛在作用靶點(diǎn)。
ASODN是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長(zhǎng)度多為15～30個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于ASODN作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一。
本發(fā)明的目的是，根據(jù)已公開的ASGPR基因mRNA序列，設(shè)計(jì)針對(duì)ASGPR的ASODN，通過抑制ASGPR mRNA和蛋白的表達(dá)，阻斷HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，阻止HBV感染，抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，為治療慢性HBV感染提供新的特效的藥物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是，通過檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的ASGPRmRNA參考序列NM_001671，對(duì)其進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬，選擇了5個(gè)不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點(diǎn)。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正?；虻谋磉_(dá)。在Expedite 8909型自動(dòng)DNA合成儀上合成硫代反義寡核苷酸序列(S-ASODN)，合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時(shí)后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱純化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存?zhèn)溆?。采用轉(zhuǎn)染有HBV DNA，可穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白和完整Dane氏顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞模型，對(duì)上述ASODNs進(jìn)行活性篩選和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示5條ASODNs中，AS2，AS3在0.8μmol/L-1.6μmol/L時(shí)對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg，ASGPR mRNA具有明顯的抑制作用，AS2在0.2-0.8μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及ASGPR mRNA和蛋白都具有特異性的劑量依賴性抑制活性。且當(dāng)濃度為0.8μmol/L-1.6μmol/L時(shí)，AS2對(duì)HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。同時(shí)，設(shè)計(jì)了AS2對(duì)應(yīng)的正義，隨機(jī)序列，活性篩選結(jié)果顯示AS2具有很好的特異性。
硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)編號(hào) 名稱 ASGPR靶位 長(zhǎng)度 性質(zhì)反義序列1 AS1 1083-110220ATCC CAA TCC CGG ACC CCT GC2 AS2 749-768 20ACCT CCC AGG ACG TGA CCA CC3 AS3 460-479 20ATCT TCC CAC ATT GCC TCC CT4 AS4 171-190 20ATCC TTG GTC ATG ATA GGG CT5 AS5 456-475 20ACCC ACA TTG CCT CCC TGG GT6 S2 749-768 20SGGT GGT CAC GTC CTG GGA GG7 R2 -20RGAC CGG CCT AAC CCG CCT ACA反義；S正義；R隨機(jī)序列根據(jù)本發(fā)明，針對(duì)ASGPR mRNA的ASODNs能特異性抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，有可能成為治療及預(yù)防HBV相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)，AS2的長(zhǎng)度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，本發(fā)明包含了與AS2具有相同序列的任何長(zhǎng)度寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了AS2硫代修飾。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其他反義寡核苷酸及其衍生物形式。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。
本發(fā)明的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的乙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
結(jié)合圖表

本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1硫代ASGPR反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制作用圖2硫代ASGPR反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg的抑制作用圖3硫代ASGPR反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBeAg的抑制作用
圖4硫代ASGPR反義寡核苷酸序列對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ASGPR mRNA的抑制作用圖5硫代ASGPR反義寡核苷酸序列AS2，AS3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ASGPR蛋白的抑制作用圖6硫代ASGPR反義寡核苷酸序列AS2對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響圖7硫代ASGPR反義寡核苷酸序列AS2特異性分析結(jié)果圖8硫代ASGPR反義寡核苷酸序列AS2劑量依賴關(guān)系檢測(cè)結(jié)果表15條硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)表2硫代反義寡核苷酸AS2的正義、隨機(jī)序列實(shí)施例一材料與方法1.S-ASODN的設(shè)計(jì)和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的ASGPR mRNA參考序列NM_001671，通過對(duì)其進(jìn)行基于多預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，選擇了5個(gè)不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點(diǎn)。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正常基因的表達(dá)(見表1)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自動(dòng)DNA合成儀合成并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾，過程如下將硫代試劑(Beaucage regent，Transgenomic)溶于無水乙腈中使其終濃度為1g/100ml，置于DNA合成儀的AUX位置處，采用合成儀上提供的DNA硫化程序進(jìn)行自動(dòng)合成硫代寡核苷酸。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時(shí)后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.ASODN轉(zhuǎn)染Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將Hep2.2.15細(xì)胞接種6孔板，1.5×105細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長(zhǎng)至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM并設(shè)細(xì)胞對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛ep2.2.15細(xì)胞總RNA(Trizol RNA提取試劑盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15細(xì)胞總蛋白，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用檢測(cè)取細(xì)胞培養(yǎng)液，100℃煮沸15min，12000r/min離心10min，取上清作為熒光定量PCR的模板，實(shí)驗(yàn)過程按本實(shí)驗(yàn)室建立的復(fù)合探針PCR定量檢測(cè)HBV的方法操作(何云燕，王升啟等，中華肝臟病雜志，2001，V9N6376-377)。定量檢測(cè)HBV DNA的引物序列為P15’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；熒光探針序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬滅探針序列Q5’-GTA GTT TCCGGA AGT-3’。20μl反應(yīng)體系含200nmol/L引物，670nmol/L熒光探針F，180nmol/L淬滅探針，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混勻后將各反應(yīng)管與標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管一起放入iCycle自動(dòng)PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動(dòng)計(jì)算出定量結(jié)果。
4.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用檢測(cè)取收集好的細(xì)胞培養(yǎng)液，按照HBsAg，HBeAgELISA檢測(cè)試劑盒(華美公司)說明書操作步驟檢測(cè)。取50μl細(xì)胞培養(yǎng)液加入乙肝表面抗原，e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原，e抗原對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入顯色液A50μl，再加入顯色液B50μl，37℃孵育15min，加入終止液50μl，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上測(cè)定450nm處1s吸光值A(chǔ)。根據(jù)IR＝(A450對(duì)照-A450給藥)/A450對(duì)照計(jì)算抑制率。
5.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞中ASGPR mRNA的抑制作用檢測(cè)按照Trizol試劑盒(Invitrogen)說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，OD260/280在1.8-2.0之間，RNA甲醛變性電泳顯示無降解。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法如下各取總RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制劑(40U)0.1μl，共10.3μl，混勻，70℃溫育10min，立即冰上冷卻。加入第一鏈反應(yīng)緩沖液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制劑0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混勻，42℃反應(yīng)2min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶superscriptII0.5μl，42℃溫育1h，最后70℃變性15min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取0.5μl作為PCR擴(kuò)增的模板，以看家基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙重PCR。靶基因ASGPR上游引物為5’CTGGACAATGAGGAGAGTGAC3’，下游引物為5’CTGGACAATGAGGAGAGTGAC3’，擴(kuò)增片斷為651bp。GAPDH的上游引物為5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物為5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，擴(kuò)增片斷449bp。PCR反應(yīng)體系總體積20μl，上下游引物終濃度為1μM，Mg2+濃度1.5mM，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，Taq 1U。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2min，94℃ 20s，61℃30s，72℃20s，循環(huán)26次，最后72℃延伸2min。2％瓊脂糖膠(Sigma)電泳檢查，利用ImageQuant軟件讀取各電泳條帶信號(hào)值V，根據(jù)IR＝(1-VtsVcs/VtβVcβ)×100％計(jì)算抑制率。其中Vts表示給藥組ASGPR擴(kuò)增條帶的信號(hào)值，Vcβ表示細(xì)胞對(duì)照組GAPDH擴(kuò)增條帶的信號(hào)值，Vtβ表示給藥組GAPDH擴(kuò)增條帶的信號(hào)值，Vcs表示細(xì)胞對(duì)照組ASGPR擴(kuò)增條帶的信號(hào)值。
6.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞中ASGPR蛋白的抑制作用檢測(cè)RIPA-PICT(Pharmacia)提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔50μg總蛋白，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PROTRANBA-S83 Reinforced NC，Schleicher&Schuell)上。4℃封閉過夜，封閉液組成10％脫脂奶粉，1×TBST。然后與羊抗人ASGPR抗體(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗體(Sigma)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗羊或抗鼠二抗(中山)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)顯色系統(tǒng)顯色，X光片曝光。
結(jié)果1.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列AS1-AS5，分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陽性藥拉米夫定對(duì)照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測(cè)AS1-AS5對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。圖中顯示，脂質(zhì)體對(duì)照(LIP)對(duì)HBV DNA無明顯抑制作用，AS2，AS3對(duì)HBV DNA的抑制作用強(qiáng)于10μM拉米夫定對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA的抑制作用。
2.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列AS1-AS5，分別以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM給藥處理HepG2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陽性藥拉米夫定對(duì)照組，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBsAgELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達(dá)情況。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，25μM拉米夫定對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg的平均抑制率為53.76％，脂質(zhì)體對(duì)照(LIP)對(duì)HBsAg無明顯抑制作用，AS1-AS5對(duì)HBsAg的抑制作用檢測(cè)結(jié)果見圖2，圖中顯示AS2，AS3對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg具有較高的抑制率，AS2在0.8μM給藥時(shí)對(duì)培養(yǎng)液中HBsAg的平均抑制率大于50％，且大于25μM拉米夫定對(duì)培養(yǎng)液中HBsAg的抑制率，AS3在1.6μM濃度時(shí)對(duì)HBsAg的平均抑制率大于50％。
3.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列AS1-AS5，分別以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，HBeAgELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBeAg的表達(dá)情況。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，25μM拉米夫定對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg的平均抑制率為51.21％，脂質(zhì)體對(duì)照(LIP)對(duì)HBeAg無顯著抑制作用，AS1-AS5對(duì)HBsAg的抑制作用檢測(cè)結(jié)果見圖3。圖中顯示AS2，AS3對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBeAg具有較高的抑制率，1.6μM給藥時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液中HBeAg的抑制率大于等于50％，1.6μM AS2對(duì)HBeAg的抑制率大于拉米夫定的抑制率。
4.ASODN對(duì)Hep2.2.15細(xì)胞中ASGPR mRNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五條反義序列AS1-AS5，分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72h后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以看家基因GAPDH為內(nèi)標(biāo)(擴(kuò)增片段459bp)進(jìn)行雙重PCR(靶基因ASGPR擴(kuò)增片段為651bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物2％瓊脂糖電泳分析，應(yīng)用公式(詳見實(shí)驗(yàn)方法5)計(jì)算各種處理對(duì)靶基因mRNA表達(dá)的抑制率(見圖4)。從圖中可以看出AS2，AS3對(duì)ASGPR mRNA的表達(dá)起到較好的抑制作用，而AS1，AS5無抑制作用，AS4抑制率很低，脂質(zhì)體對(duì)照(LIP)無顯著抑制效應(yīng)。
5.ASODN對(duì)細(xì)胞ASGPR蛋白的抑制作用根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，挑選AS2，AS3分別以0.8μM給藥處理Hep2.2.15細(xì)胞，72h后提取總RNA，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以β-actin(43kD)為對(duì)照，通過Western Blot方法檢測(cè)硫代反義寡核苷酸對(duì)靶蛋白ASGPR表達(dá)量的影響。由圖5可見，AS2可顯著抑制ASGPR蛋白的表達(dá)，而AS3對(duì)ASGPR蛋白沒有明顯的抑制作用。
實(shí)施例二材料與方法1.ASODN的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)實(shí)施例一結(jié)果，選擇效果較好的反義寡核苷酸序列AS2，合成其正義寡核苷酸以及隨機(jī)序列(見表2)。所有硫代寡核苷酸的合成同實(shí)施例一。
2.硫代反義寡核苷酸序列AS2的細(xì)胞毒性檢測(cè)Hep2.2.15細(xì)胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接種96孔板，0.75×105細(xì)胞/孔，37 ℃，5％CO2孵育48-72小時(shí)，待長(zhǎng)至40-60％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸AS2的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，每濃度重復(fù)三孔。轉(zhuǎn)染22小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2孵育72小時(shí)后，參照MTS(Promega)使用說明書，每孔加入MTS20μl/100μl培養(yǎng)液，避光培養(yǎng)1.5小時(shí)，在多標(biāo)記檢酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm檢測(cè)吸光度。同時(shí)，在轉(zhuǎn)染ASODN后在倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)。
2.硫代反義寡核苷酸序列AS2的特異性考察硫代反義寡核苷酸序列AS2及其正義(S2)，隨機(jī)(R2)序列分別以0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例一。收集培養(yǎng)液，提取總RNA和總蛋白，參照實(shí)施例一的方法，檢測(cè)AS2及其正義，隨機(jī)序列對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用，AS2及其正義，隨機(jī)序列對(duì)ASGPR mRNA以及蛋白的抑制作用。
3.硫代反義寡核苷酸序列AS2的劑量依賴性檢測(cè)硫代反義寡核苷酸序列AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例一。收集培養(yǎng)液，提取總RNA和總蛋白，參照實(shí)施例一的方法，檢測(cè)AS2不同濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用，以及對(duì)ASGPR mRNA以及蛋白的抑制作用。
結(jié)果1.硫代反義寡核苷酸AS2對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增值的影響硫代反義寡核苷酸AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM處理細(xì)胞過程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，加藥組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見圖6。圖中顯示，在0.2μM-10μM范圍內(nèi)，各劑量組OD值與正常細(xì)胞對(duì)照基本相同。
2.硫代反義寡核苷酸序列AS2的特異性硫代反義寡核苷酸序列AS2對(duì)ASGPR mRNA，蛋白以及培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用特異性檢測(cè)結(jié)果見圖7。圖中顯示，AS2的正義和隨機(jī)硫代寡核苷酸序列處理組細(xì)胞中ASGPR mRNA、蛋白，以及培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg與正常細(xì)胞對(duì)照無明顯差異。而硫代反義寡核苷酸序列AS2具有很好的抑制作用(抑制率≥50％)。
3.硫代反義寡核苷酸序列AS2對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)影響的劑量依賴性。
硫代反義寡核苷酸序列AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM給藥處理HepG2.2.15細(xì)胞后，檢測(cè)系列濃度S-ASODN對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中ASGPR mRNA、ASGPR蛋白以及培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用，結(jié)果見圖8。圖中顯示細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及細(xì)胞中ASGPR mRNA及蛋白表達(dá)量隨著硫代反義寡核苷酸序列AS2濃度的增加而遞減，顯示出很明顯的劑量依賴關(guān)系。
權(quán)利要求
1.與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)mRNA(GeneBank接受號(hào)NM_001671)互補(bǔ)的寡核苷酸，其長(zhǎng)度是10-30個(gè)堿基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)ASGPR靶位序號(hào) 名稱 長(zhǎng)度(nt)特性序列(5’-3’)(nt)1AS1 1083-110220 A TCC CAA TCC CGG ACC CCT GC2AS2 749-768 20 A CCT CCC AGG ACG TGA CCA CC3AS3 460-479 20 A TCT TCC CAC ATT GCC TCC CT4AS4 171-190 20 A TCC TTG GTC ATG ATA GGG CT5AS5 456-475 20 A CCC ACA TTG CCT CCC TGG GT
2.根據(jù)權(quán)利要求書1中的寡核苷酸，其最佳序列為AS2，AS3
3.根據(jù)權(quán)利要求書2中的寡核苷酸，其最佳序列為AS2
4.根據(jù)權(quán)利要求書1中的寡核苷酸，經(jīng)不同化學(xué)修飾后，可以用于治療乙型肝炎及相關(guān)性疾病。
5.權(quán)利要求書3中的寡核苷酸化學(xué)修飾物可以為硫代修飾。
6.權(quán)利要求4中經(jīng)化學(xué)修飾后的寡核苷酸可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途徑用于乙型肝炎及其相關(guān)性疾病的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是靶向去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)抗乙型肝炎病毒(HBV)反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ASGPR為治療HBV感染的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室通過篩選和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其具有很好的特異性和可藥性。因此，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成了靶向ASGPR的反義寡核苷酸，采用轉(zhuǎn)染有HBV DNA，可穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白以及完整Dane′s顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞，對(duì)5條反義寡核苷酸序列進(jìn)行了活性篩選及評(píng)價(jià)，首次發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)于ASGPR mRNA特定功能區(qū)域的寡核苷酸AS2在培養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞中能有效地抑制乙型肝炎的復(fù)制和表達(dá)。因此，本發(fā)明涉及到靶向ASGPR mRNA抗HBV感染的反義寡核苷酸的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療乙型肝炎病毒相關(guān)性疾病，減小乙型肝炎相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1587408SQ200410058300
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者王升啟, 楊靜, 伯曉晨, 張敏麗, 丁小然 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所