專利名稱：乙肝乙腦雙價(jià)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組領(lǐng)域，具體地涉及以乙腦病毒為載體構(gòu)建的重組病毒疫苗。
背景技術(shù)：
乙腦(Japanese encephalitis)和乙肝(Hepatitis B)均為亞洲多發(fā)的傳染性疾病。乙腦是由乙腦病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，病死率接近40％，10％～30％的幸存者留有嚴(yán)重的永久性神經(jīng)學(xué)后遺癥。
目前，全世界有兩類獲得上市許可的乙腦疫苗滅活疫苗和減毒活疫苗。乙腦減毒活疫苗實(shí)質(zhì)上是一種活的減毒乙腦病毒(live attenuated JEV)，我國(guó)選用的毒株為SA14-14-2，它于1988年在我國(guó)獲得上市許可，目前為止已有約2億兒童使用，一次免疫的有效率達(dá)95％，兩次免疫的有效率達(dá)98％，無(wú)嚴(yán)重副反應(yīng)，保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)30年以上，其安全性和有效性均超過(guò)了滅活疫苗。并且，乙腦減毒活疫苗的免疫費(fèi)用遠(yuǎn)低于滅活疫苗，應(yīng)用減毒活疫苗比滅活疫苗節(jié)約47％的免疫費(fèi)用(Ding Ding，et al.Cost-effectivess of routine immunization to control Japanese encephalitis inShanghai，China.Bulletin of the World Health Organization 2003，81(5)334-342)。已有一些亞洲國(guó)家開(kāi)始進(jìn)行乙腦減毒活疫苗的臨床試驗(yàn)，如韓國(guó)、尼泊爾等。乙腦減毒活疫苗的安全、高效，顯示出其作為基因治療載體的美好前景，但由于乙腦減毒活疫苗近幾年才逐步獲得國(guó)際上的認(rèn)可，以及其RNA基因組重組技術(shù)的復(fù)雜性，迄今為止，尚無(wú)任何以乙腦減毒活疫苗為載體的生物制品的研究報(bào)道。
乙肝是廣泛存在于亞洲的、危害最嚴(yán)重的傳染性疾病?，F(xiàn)在，乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已成為世界性的健康問(wèn)題，全球HBV感染者約3億，每年約100萬(wàn)感染者死于肝硬化或肝癌等HBV相關(guān)疾病。中國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，約有1億HBV感染者，部分地區(qū)感染率可高達(dá)14.29％，每年約有30萬(wàn)人死于肝硬化或肝癌，每年報(bào)告的急性肝炎病例約270萬(wàn)，其中10％～30％為急性乙肝病例。
乙肝疫苗是預(yù)防和控制HBV感染的重要手段。現(xiàn)在，國(guó)際市場(chǎng)上的乙肝疫苗基本均為基因工程HBV亞單位疫苗，其安全性和有效性及已得到充分的證實(shí)，但生產(chǎn)成本較高，且需接種3次(即第一次接種后1個(gè)月和6個(gè)月各接種一次)。另外乙肝疫苗的有效保護(hù)率為80-95％，免疫后體內(nèi)保護(hù)性抗體濃度逐年下降，7年后約有30～50％的免疫者體內(nèi)基本檢測(cè)不到抗體，因此，乙肝疫苗一般應(yīng)每隔5～7年重復(fù)免疫一次。
據(jù)1999年底由衛(wèi)生部疾控司、中國(guó)預(yù)防醫(yī)科院全國(guó)計(jì)劃免疫指導(dǎo)中心聯(lián)合組織的調(diào)查結(jié)果，全國(guó)新生兒乙肝疫苗平均接種率達(dá)70.7％，其中城鎮(zhèn)接種率88.5％，農(nóng)村62.7％。從總體看，我國(guó)仍有近1/3新生兒在乙肝免疫保護(hù)之外，而且全國(guó)平均第一針及時(shí)接種率(出生24小時(shí)之內(nèi)接種)僅有29％，平均全程合格接種率僅有28.4％。接種不及時(shí)和未全程接種的情況，農(nóng)村明顯比城市嚴(yán)重。影響乙肝疫苗效果和普及的主要原因在于疫苗成本較高、需多次重復(fù)免疫。目前，國(guó)際上正在開(kāi)發(fā)的乙肝疫苗種類有合成肽疫苗、DNA疫苗以及以沙門(mén)氏菌(Salmonella)為載體的基因工程疫苗等，然而這些乙肝疫苗在免疫效率和生產(chǎn)成本等方面還不令人滿意。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)免疫效率高、生產(chǎn)成本低的新型疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了基于減毒乙腦病毒的新型疫苗。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組乙腦病毒，所述的重組乙腦病毒由乙腦病毒衣殼和重組乙腦病毒基因組構(gòu)成，所述的乙腦病毒基因組中插入了外源核酸序列，且重組后的基因組保留了自我復(fù)制功能。
在另一優(yōu)選例中，所述的外源核酸中含有編碼抗原、抗原決定簇、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、多肽類激素、酶、受體、抗體和/或癌相關(guān)蛋白的核酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的外源核酸序列含有乙肝病毒抗原或抗原決定簇的核酸序列。
在另一優(yōu)選例中，外源核酸的插入位點(diǎn)選自下組(i)在乙腦病毒基因組的NS2B和NS3編碼區(qū)之間；(ii)在乙腦病毒基因組的E和NS1編碼區(qū)之間；(iii)在乙腦病毒基因組的C和prM編碼區(qū)之間。
在另一優(yōu)選例中，所述的乙腦病毒基因組缺失了部分乙腦病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。更佳地，所述缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列選自下組C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的乙腦病毒是減毒的，例如毒株SA14-14-2。
在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明所述的重組乙腦病毒的用途，它被用于制備治療性或預(yù)防性的疫苗，尤其是制備用于防治乙腦和乙肝的雙價(jià)疫苗。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明所述的重組乙腦病毒和藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備重組乙腦病毒的方法，包括步驟(a)將乙腦病毒基因組引入包裝細(xì)胞，其中所述的乙腦病毒基因組中插入了外源核酸序列，且缺失了選自下組的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其組合，并且重組后的基因組保留了自我復(fù)制功能而所述的包裝細(xì)胞選自下組(i)被含所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，
(ii)被含所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的輔助病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(iii)基因組整合有所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的細(xì)胞；(b)培養(yǎng)步驟(a)的包裝細(xì)胞；(c)從培養(yǎng)物中分離出重組乙腦病毒。
當(dāng)乙腦病毒基因組不缺失結(jié)構(gòu)蛋白時(shí)，將其直接引入可被乙腦病毒感染的宿主細(xì)胞即可生產(chǎn)得到重組乙腦病毒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從下文更詳細(xì)的描述中理解本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)、實(shí)施方式等具體內(nèi)容。


圖1為乙腦病毒的RNA基因結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為把乙腦病毒RNA轉(zhuǎn)化成四段乙腦病毒cDNA片段的流程圖。
圖3為制備全長(zhǎng)的乙腦病毒cDNA克隆的流程圖。
圖4為制備插入點(diǎn)在NS2B和NS3之間的雙價(jià)疫苗的流程圖。
圖5為制備插入點(diǎn)在E和NS1之間的雙價(jià)疫苗的流程圖。
圖6為制備插入點(diǎn)在C和prM之間的雙價(jià)疫苗的流程圖。
圖7為制備含有JEV亞基因組的乙肝乙腦雙價(jià)疫苗的流程圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了重組乙腦病毒的構(gòu)建和應(yīng)用方法，在減毒乙腦病毒基因組中插入了外源(即非JEV)核酸序列，且外源核酸序列的插入不影響基因組的自我復(fù)制功能。本發(fā)明提供的這種重組乙腦病毒，不僅具有乙腦減毒活疫苗的全部免疫活性，而且能在使用者(患者、易感人群等)體內(nèi)表達(dá)外源核酸產(chǎn)生外源多肽。這種重組乙腦病毒能引發(fā)使用者機(jī)體對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防和/或治療外源多肽相關(guān)疾病的作用。
本發(fā)明所述的乙腦病毒基因組，可以是全基因組，也可以是缺失部分核酸序列的亞基因組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的乙腦病毒基因組是全基因組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的乙腦病毒基因組是缺失了部分結(jié)構(gòu)蛋白基因序列的亞基因組，其中，缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列選自下列基因C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其組合。
本發(fā)明所述的外源核酸序列，可以編碼一種或幾種多肽，編碼的多肽類型包括但不限于抗原或其決定簇、細(xì)胞因子、癌相關(guān)蛋白、生長(zhǎng)因子、多肽類激素、受體、酶、抗體等。如果外源核酸含有編碼某種病原的抗原或抗原決定簇的序列，則該重組乙腦病毒可以激發(fā)人體對(duì)JEV和該病原的免疫應(yīng)答，起到同時(shí)預(yù)防和/或治療JEV和該病原相關(guān)疾病的作用。
本發(fā)明提供了重組乙腦病毒中外源核酸序列的插入方法。在本發(fā)明中，所述的外源核酸序列的插入位點(diǎn)可以是JEV基因組的任何適宜位置，但外源核酸序列的插入不能造成JEV基因組的移碼突變，不能影響JEV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能，也不能影響重組基因組的自我復(fù)制功能。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，外源核酸序列的插入位置選自下組在JEV基因組的NS2B和NS3編碼區(qū)之間；在JEV基因組的E和NS1編碼區(qū)之間；在JEV基因組的C和prM編碼區(qū)之間。
本發(fā)明提供了重組乙腦病毒的生產(chǎn)方法。對(duì)于含有JEV全基因組的重組乙腦病毒，可采用現(xiàn)有乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)方法。對(duì)于含有JEV亞基因組的重組乙腦病毒，需要制造一種特殊的包裝細(xì)胞用以生產(chǎn)重組乙腦病毒。
術(shù)語(yǔ)本文所述的“乙腦病毒”一般是指減毒的乙腦病毒，感染后不能造成神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重的病理變化，既可以是我國(guó)現(xiàn)在使用的乙腦減毒活疫苗—毒株SA14-14-2，也可以是其它減毒的乙腦病毒。特別優(yōu)選的已經(jīng)用于臨床的減毒乙腦病毒。
本文所述的“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意長(zhǎng)度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)單鏈、雙鏈的DNA或RNA，基因組DNA和cDNA。
本文所述的“使用者”指需要進(jìn)行預(yù)防接種或診斷、治療的任何個(gè)體，包括人和動(dòng)物，特別是那些易被JEV感染的物種。
本文所述的“抗原”是指能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與抗體或效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。包括但不限于病原(細(xì)菌、病毒等病原微生物)的表面抗原、腫瘤抗原等。
本文所述的“包裝細(xì)胞”是指能提供重組JEV基因組不能表達(dá)的JEV蛋白的細(xì)胞。包裝細(xì)胞內(nèi)含有乙腦病毒亞基因組缺失的JEV核酸序列，并能表達(dá)該序列所編碼的蛋白，因此，當(dāng)重組乙腦病毒亞基因組轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞后，可以獲得自我組裝所需的全部JEV蛋白，進(jìn)而包裝成重組乙腦病毒顆粒。
本文所述的“輔助病毒載體”是指含有乙腦病毒亞基因組缺失的JEV核酸序列的異種病毒或其核酸(包括但不限于DNA、RNA和cDNA)，轉(zhuǎn)染JEV宿主細(xì)胞后，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株可成為包裝細(xì)胞。
重組乙腦病毒本發(fā)明提供了一種重組乙腦病毒的構(gòu)建和應(yīng)用方法。該重組乙腦病毒可攜帶外源核酸進(jìn)入人體，適用于傳染性疾病的預(yù)防免疫和一些惡性疾病的基因治療。
外源核酸編碼的外源多肽可以是各種功能蛋白，HBV表面抗原僅是其中一種非限制性的示例。以下對(duì)重組HBV表面抗原的乙腦病毒的描述通常也可用于其它重組乙腦病毒。
JEV為球形，直徑40nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)11kb，自5’至3’端依次編碼結(jié)構(gòu)蛋白C、prM(M蛋白的前體)、E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1～NS5，病毒RNA在細(xì)胞漿內(nèi)直接起mRNA作用，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。
插入重組乙腦病毒的外源核酸長(zhǎng)度通常小于5kb，可編碼單個(gè)多肽或多個(gè)多肽。由于JEV自身的基因組較小，所以最適的外源核酸長(zhǎng)度約為200～2500kb。為保證外源多肽在使用者體內(nèi)能正常發(fā)揮其功能，通常在外源核酸序列前后各連接一段編碼蛋白水解酶的序列(即釋放元件)，以便其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能釋放出完整的、不含無(wú)關(guān)序列的外源多肽。在本發(fā)明的實(shí)施例中，該蛋白酶序列為口蹄疫病毒2A序列。
可從公用數(shù)據(jù)庫(kù)(包括，如GenBank)獲得若干減毒乙腦病毒毒株的核苷酸序列。示范毒株是“SA14-14-2”?？稍贕enBank登記號(hào)AF315119獲得JEV SA14-14-2基因組的核苷酸序列。減毒乙腦病毒顆粒的生產(chǎn)可采用本領(lǐng)域所熟知的生產(chǎn)方法。許多減毒的乙腦病毒毒株可市售獲得，例如從ATCC獲得。
本發(fā)明的外源多肽位于乙腦病毒基因組的不同位點(diǎn)。作為非限制性例子，可將外源核酸序列插入以下的一個(gè)或多個(gè)位置(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白質(zhì)C和prM之間；(3)病毒蛋白質(zhì)NS2A和NS2B之間；(4)病毒蛋白質(zhì)NS2B和NS3之間；(5)病毒蛋白質(zhì)NS3和NS4A之間；(5)NS4A和NS4B之間；(6)E編碼區(qū)和NS1編碼區(qū)之間。外源核酸也可插入乙腦病毒基因組的其它位點(diǎn)。最好是，外源核酸的插入不致破壞乙腦病毒蛋白質(zhì)的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的復(fù)制。
用含有HBV表面抗原的重組乙腦病毒感染宿主細(xì)胞，可在宿主細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的HBV表面抗原，從而引發(fā)針對(duì)HBV表面抗原的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明的重組乙腦病毒可用作乙肝的預(yù)防性疫苗。
本發(fā)明的重組乙腦病毒會(huì)持續(xù)繁殖/在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制重組乙腦病毒基因組，直到免疫系統(tǒng)被充分活化從而制止重組乙腦病毒感染或清除重組乙腦病毒基因組，因而能引發(fā)足夠強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。
藥物組合物本發(fā)明還提供了包含上述重組乙腦病毒的各種組合物，包括藥用組合物，尤其是疫苗組合物。
包含重組乙腦病毒的各種組合物可以包含按重組乙腦病毒實(shí)際用途選用的緩沖劑，以及適用于特定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種緩沖劑以及適用于特定用途的各種物質(zhì)均可用于藥物組合物中。該組合物可含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的各種賦形劑在多種出版物已有詳述，如“Remington藥學(xué)和藥學(xué)實(shí)踐”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可將藥用組合物制備成各種劑型，包括但不限于《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版所述的各種劑型，如注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧、栓劑、透皮藥物(如貼片等)、油膏、洗劑等。另外，適用于口服或局部用藥的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體和/或稀釋劑，可用于配制包含重組乙腦病毒的各種組合物。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物性和動(dòng)物性油和脂肪。在藥物組合物中，還可用穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類、維持不同pH值的各種緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為輔助性材料。
當(dāng)用作疫苗時(shí)，本發(fā)明的重組乙腦病毒可采用各種方法進(jìn)行配制。通常，可以采用本領(lǐng)域熟知的各種方法，用合適的藥用載體和/或介質(zhì)配制本發(fā)明的疫苗。無(wú)菌鹽水是一種適宜的疫苗介質(zhì)，其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的水性和非水性等滲無(wú)菌注射液、懸浮液等也可用于疫苗配制。并且，本發(fā)明疫苗組合物的配制還可含有疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它成分，包括如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。佐劑類包括(但不限制于)鋁鹽佐劑；皂苷佐劑；Ribi佐劑(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐劑(Seppic，Paris，F(xiàn)rance)；Hunter’sTiterMax佐劑(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐劑(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制劑中也可包含調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的其它成分。
重組乙腦病毒的使用方法本發(fā)明提供了多種引發(fā)對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)使用者施用本發(fā)明提供的重組乙腦病毒或其組合物，使重組乙腦病毒進(jìn)入細(xì)胞，表達(dá)并釋放外源多肽，進(jìn)而引發(fā)對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答。
在一些實(shí)施方案中，外源多肽是病原的抗原/抗原決定簇。將這種重組乙腦病毒施予使用者，可預(yù)防或治療由該病原引起的疾病。該方案特別適合預(yù)防和治療細(xì)胞內(nèi)感染的病原(病毒、細(xì)菌、原蟲(chóng)等)導(dǎo)致的疾病。外源多肽是一種病原的抗原/抗原決定簇時(shí)，重組乙腦病毒可以作為乙腦病毒和該病原的雙價(jià)疫苗；當(dāng)外源多肽是兩種以上病原的抗原時(shí)，重組乙腦病毒可以作為乙腦病毒和含有上述抗原/抗原決定簇的病原的多價(jià)疫苗。
在另一些實(shí)施方案中，外源多肽是腫瘤抗原。該方案適用于腫瘤患者或腫瘤高危人群。腫瘤抗原的免疫原性通常較弱，以乙腦病毒作為腫瘤抗原載體，可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
在其它實(shí)施方案中，外源多肽還可以是細(xì)胞因子、多肽類激素、酶、抗體等，適用于特定的基因治療方案。
給予方式和劑量將本發(fā)明所述的重組乙腦病毒用作疫苗時(shí)，通常采用與常規(guī)的疫苗給予途徑和/或模擬病原感染途徑接種這些疫苗。當(dāng)以組合物形式施用時(shí)，疫苗制劑中除含有重組乙腦病毒外，還可包括藥學(xué)上可接受的載體，以及任選的佐劑、矯味劑或穩(wěn)定劑等。
給予重組乙腦病毒或其組合物時(shí)，可通過(guò)常規(guī)的、藥學(xué)上可接受的各種途徑，如鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)陰道、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑等。另外，還可根據(jù)需要組合給藥途徑，或按抗原種類和疾病特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
疫苗組合物可以單劑量、多劑量加強(qiáng)劑量給予，以引發(fā)和/或維持免疫力。應(yīng)以“有效量”給予重組乙腦病毒或其組合物，即重組乙腦病毒的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效地促使保護(hù)宿主抵抗乙腦病毒和含有外源抗原的病原的感染。
在疫苗制劑中重組乙腦病毒的單份劑量，是按可引發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答而無(wú)明顯副作用的劑量而定。通常，重組乙腦病毒疫苗的有效劑量的一般范圍約為102-108蝕斑形成單位(plaque forming units，Pfu)，較佳的約為103-107Pfu，最佳的為104-106Pfu。當(dāng)疫苗采用注射方式施用時(shí)，一般給予10ul～1ml的注射液，其中含有重組乙腦病毒和藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。疫苗的最佳用量可通過(guò)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定，如抗體效價(jià)測(cè)定等。監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來(lái)確定是否需要加強(qiáng)免疫。在疫苗中加入佐劑和/或免疫刺激劑可提高使用者機(jī)體對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是安全，它所提供的重組乙腦病毒的毒性低于或類似于現(xiàn)有的乙腦減毒活疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是高效，它所提供的重組乙腦病毒能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組JEV基因組的自我復(fù)制，并在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)外源多肽，因此，可引發(fā)高效的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)是使用成本低。依據(jù)本發(fā)明提供的制造方法生產(chǎn)重組乙腦病毒，其成本相當(dāng)于或略高于現(xiàn)有的乙腦減毒活疫苗。
本發(fā)明還提供了一種含有編碼HBV抗原的重組乙腦病毒。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，外源核酸編碼HBV表面抗原/抗原決定簇，所得的重組乙腦病毒可作為預(yù)防乙腦和乙肝的雙價(jià)疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的乙肝乙腦雙價(jià)疫苗具有如下優(yōu)點(diǎn)1.高效1)能在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)HBV表面抗原，比不能在體內(nèi)增殖的乙肝亞單位疫苗具有更高的免疫原性。應(yīng)用該疫苗無(wú)需多次重復(fù)免疫即可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保護(hù)，因而減少了接種者的痛苦，節(jié)約了醫(yī)療資源，避免了因漏種而導(dǎo)致的免疫效果不良及免疫失??；2)該疫苗是一種重組乙腦病毒，其預(yù)防乙腦的效果同親代病毒——乙腦減毒活疫苗。
3)同時(shí)預(yù)防乙肝和乙腦兩種高危傳染病，省去了兩種疫苗需要分別接種的麻煩，同時(shí)也減少了接種者的痛苦，節(jié)約了醫(yī)療資源。
2.安全該疫苗是一種重組的乙腦病毒，組成重組乙腦病毒的所有JEV功能蛋白與親代病毒——乙腦減毒活疫苗相同，重組病毒的生長(zhǎng)特性、宿主專一性也與乙腦減毒活疫苗相同，因此，其安全性與乙腦減毒活疫苗相近。對(duì)于缺失部分JEV結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組病毒，由于在體內(nèi)不能自我增殖，不會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)感染，因而其安全性高于乙腦減毒活疫苗。
3.低成本該疫苗的生產(chǎn)成本等同或略高于乙腦減毒活疫苗。相對(duì)于現(xiàn)有的乙腦疫苗和乙肝疫苗，相當(dāng)于節(jié)約了乙肝疫苗的生產(chǎn)成本，而現(xiàn)有的乙肝疫苗售價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙腦疫苗，因此該疫苗具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
該疫苗的低生產(chǎn)成本和低接種成本(免疫次數(shù)少)，有助于提高疫苗接種的覆蓋率，提高人們的健康水平，并減少因漏種疫苗而發(fā)生的腦炎、神經(jīng)系統(tǒng)障礙、急慢性肝炎及肝癌等疾病的醫(yī)療費(fèi)用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不能限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體細(xì)節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1乙腦病毒全長(zhǎng)cDNA克隆的制備過(guò)程用圖1、圖2、圖3所示的流程，將把全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA整合到pRS424質(zhì)粒內(nèi)，所述的乙腦病毒SA14-14-2(ATCC#VR-1255)和pRS424質(zhì)粒(ATCC#77105)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC。
a)用RT-PCR的方法把乙腦病毒RNA轉(zhuǎn)化成四段乙腦病毒cDNA片段(5’端cDNA，3’端cDNA和2個(gè)中間段cDNA)，在5’端cDNA片段的5’端加上Not I酶切位點(diǎn)和Sp6增強(qiáng)子序列；在5’端cDNA片段的3’端加上EcoR I酶切位點(diǎn)；在3’端片段的3’端加上KpnI酶位點(diǎn)；近5’端的中間片段的兩頭包括部分與5’端cDNA片段的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列；近3’端的中間片段cDNA的兩頭包括部分與近5’端的中間片段cDNA的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下

獲得4個(gè)修飾后的乙腦病毒cDNA片段，長(zhǎng)度分別為2.9kb、2.8kb、3.8kb和1.8kb。
b)依次把修飾后的5’端片段和3’端片段用傳統(tǒng)方法連接、克隆到pRS424質(zhì)粒內(nèi)。
c)利用在酵母菌(S.Cerevisiae YPH857)(ATCC 75628)中相同序列的DNA重組，把修飾后的近5’端的中間片段cDNA插到上述克隆中。
d)利用在酵母(ATCC 76628)中相同序列的DNA重組，把修飾后的近3’端的中間片段cDNA插到上述克隆中，產(chǎn)生全長(zhǎng)的乙腦病毒cDNA克隆。
實(shí)施例2制備插入點(diǎn)在NS2B和NS3之間的雙價(jià)疫苗參見(jiàn)圖4。
1)將實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆用BspE I內(nèi)切酶和BamH I內(nèi)切酶切去一約2.1kb長(zhǎng)的片段，此片段包括乙腦病毒cDNA序列3445-5576的堿基。
2)以實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆為模板，分別以GGCATAGTCTTGGACTTTGAT(SEQ ID NO9)和GACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCGGGGCT TTCGGTTATTGGCTCACTTTA(SEQ ID NO10)，以CCATGCCCTGTCTGGTATC TC(SEQ ID NO11)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTT AAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGTGGGGATGGCGTGTCCCAAAACAC(SEQ ID NO12)為引物，用PCR的方法產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段。以融合PCR(Fusing PCR)方法將上述兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)在NS2B和NS3基因之間含有口蹄疫病毒2A基因序列(2A序列中間引入了一個(gè)Afl II酶切位點(diǎn))的DNA片段，其兩端分別含有BspE I和BamH I的酶切位點(diǎn)序列。
3)將步驟1中切去約2.1kb的乙腦病毒cDNA片段和步驟2中產(chǎn)生的DNA片段轉(zhuǎn)化酵母菌(ATCC 76628)，得到修飾后的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆。
4)以HBV的DNA質(zhì)粒(ATCC#45020D)為模板，以GACACGCCATCCCCACAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGACGTCGAGTCCAACCCCGGCCCCATGGAGAACATCACATCGGGA(SEQ ID NO13)和GGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCGT CTCCCGCAAGCTTAAGCAGGTCAAAATTCAACAGCTGAATGTATACCCAAAGACAAAA(SEQ ID NO14)為引物，用PCR方法合成一段含有HBV表面抗原的DNA片段(HBsAg)，其5’端和3’端包括口蹄疫病毒2A基因序列(SEQ ID NO36)。
5)用Afl II內(nèi)切酶將步驟3中產(chǎn)生的修飾后的乙腦病毒cDNA線性化。
6)將線性化的修飾后的乙腦病毒cDNA和步驟4中產(chǎn)生的HBsAg片段轉(zhuǎn)化酵母菌(ATCC 76628)，得到含有HBsAg的重組乙腦病毒(簡(jiǎn)稱重組乙腦病毒，rJEV)cDNA。
7)用Kpn I內(nèi)切酶將步驟6中產(chǎn)生的重組乙腦病毒cDNA線性化。
8)用DNA依賴性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)將線性化的重組乙腦病毒cDNA轉(zhuǎn)錄成RNA。
9)用電擊的方法(electroporation)，把重組乙腦病毒RNA轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞BHK-21(Baby hamster kidney)內(nèi)(ATCC#CCL-10)。7-10天后收集上清，得到每毫升106的重組乙腦病毒顆粒(rJEV)，即乙肝乙腦雙價(jià)疫苗。
實(shí)施例3制備插入點(diǎn)在E和NS1之間的雙價(jià)疫苗參見(jiàn)圖5。
1)將實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆用BsrG I內(nèi)切酶和BspE I內(nèi)切酶切去約1.6kb長(zhǎng)的片段。此片段包括乙腦病毒cDNA序列1887-3445。
2)以實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆為模板，分別以CAGGCCACCTGAAATGTAGGC(SEQ ID NO15)和GACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAA ATTCAACAGCTGTCCAGTGTCAGCATGCACATT(SEQ ID NO16)，以CTTCTTAA GCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCCGATCAATTGCTTTGGCCTTC(SEQ ID NO17)和ATCATGCATAACAGGTCTGAT(SEQ ID NO18)為引物，用PCR方法產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段。以融合PCR方法將上述兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)在E和NS1基因之間含有2A基因序列(2A序列中間引入了一個(gè)Afl II酶切位點(diǎn))的DNA片段，其兩端分別含有BsrG I和BspE I酶切位點(diǎn)序列。
3)將步驟1中切去約1.6kb的乙腦病毒cDNA片段和步驟2中產(chǎn)生的DNA片段轉(zhuǎn)化酵母菌(ATCC 76628)，得到修飾后的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆。
4)其余步驟采用同實(shí)施例2的方法。
實(shí)施例4制備插入點(diǎn)在C和prM之間的雙價(jià)疫苗參見(jiàn)圖61)將實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆用SpeI內(nèi)切酶切去612bp的片段。此片段包括乙腦病毒cDNA序列175-785。
2)以實(shí)施例1所得的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆為模板，分別以GGTAAAAACCGGGCTA TCAAT(SEQ ID NO19)和AGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAAATTCAACAG CTGGGCTCCTGCACAAGCTATGAC(SEQ ID NO20)，以GGAGACGTCGAGTCCAA CCCTGGCCCCGGAGGAAATGAAGGCTCAATC(SEQ ID NO21)和TCAGTTTTCATGAGATATCGT(SEQ ID NO22)為引物，用PCR的方法產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段。以融合PCR方法將上述兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)在C和prM基因之間含有2A基因序列(2A序列中間引入了一個(gè)Afl II酶切位點(diǎn))的DNA片段，其兩端分別含有Spe I酶切位點(diǎn)序列。
3)將步驟1中切去612bp的乙腦病毒cDNA片段和步驟2中產(chǎn)生的DNA片段轉(zhuǎn)化酵母菌(ATCC 76628)，得到修飾后的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆。
4)其余步驟采用同實(shí)施例2的方法。
實(shí)施例5乙肝乙腦雙價(jià)疫苗的神經(jīng)毒性將實(shí)施例2所得的重組乙腦病毒顆粒、實(shí)施例3所得的重組乙腦病毒顆粒以及JEV減毒株SA14-14-2病毒顆粒分別以104PFU的劑量(0.5ml)分別腹腔注射3組4周齡的ICR小鼠，每組小鼠5只。14天內(nèi)小鼠無(wú)異常死亡。在接種后1、3、5、7、14天取腦(每次每組取小鼠1只)，將鼠腦用PBS緩沖液研磨乳化制成10％(w/v)腦懸液，8000g離心30min取上清。加入BHK21細(xì)胞進(jìn)行病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)。以100PFU的乙腦病毒SA14作為對(duì)照組。結(jié)果試驗(yàn)組均未檢測(cè)出蝕斑，對(duì)照組蝕斑數(shù)為84。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明兩種重組乙腦病毒(雙價(jià)疫苗)和乙腦減毒活疫苗對(duì)4周齡小鼠均無(wú)神經(jīng)毒性。
實(shí)施例6中和試驗(yàn)乙腦病毒中和抗體測(cè)定采用蝕斑減少試驗(yàn)。將實(shí)施例2所得的重組乙腦病毒顆粒(雙價(jià)疫苗)和乙腦減毒活疫苗(SA14-14-2)分別以106PFU的劑量(0.5ml)分別腹腔注射2組4周齡的ICR小鼠，免疫7天后采血，分離血清。將兩組血清分別與稀釋好的乙腦病毒P3(約200PFU/0.4ml)等量混合，同時(shí)將稀釋好的病毒再1∶2稀釋，作為病毒對(duì)照，置37℃水浴作用90分鐘，接種6孔板BHK21細(xì)胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分鐘，加入含甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蝕斑計(jì)數(shù)，計(jì)算血清蝕斑減數(shù)中和效價(jià)，其中，病毒對(duì)照組的蝕斑平均數(shù)為80，雙價(jià)疫苗的抗體中和效價(jià)為1∶20，乙腦減毒活疫苗(陽(yáng)性對(duì)照)的抗體中和效價(jià)為1∶20。
雙價(jià)疫苗免疫4周后采血，分離血清，中和抗體采用美國(guó)Abbott單克隆酶聯(lián)免疫試劑測(cè)定，抗HBs平均幾何滴度為650mIU/ml。
實(shí)施例7制備重組JEV亞基因組參見(jiàn)圖7。本實(shí)施例制備去除了JEV結(jié)構(gòu)蛋白C序列的cDNA克隆。
1.將實(shí)施例4得到的含有HBsAg序列的重組乙腦病毒cDNA克隆用Apa I酶切成線性。
2.用融合PCR的方法，制備一段102堿基長(zhǎng)的DNA片段，這個(gè)片段5’端的72bp包括結(jié)構(gòu)蛋白C的前20個(gè)密碼子及其相連的部分5’非編碼區(qū)序列，3’端的30bp包括結(jié)構(gòu)蛋白的第106到第116密碼子。
3.將線性的重組乙腦病毒cDNA和102bp的cDNA片段轉(zhuǎn)化酵母菌(ATCC 76628)，得到去除了JEV結(jié)構(gòu)蛋白C序列的重組乙腦病毒cDNA克隆(ΔC-rJEV cDNA)。
4.用Kpn I內(nèi)切酶將步驟3中產(chǎn)生的ΔC-rJEV cDNA線性化。
5.用DNA依賴性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)將線性化的ΔC rJEV cDNA轉(zhuǎn)錄成RNA，即ΔC-rJEV RNA。
實(shí)施例8制備含有JEV亞基因組的乙肝乙腦雙價(jià)疫苗1.以pCI(購(gòu)自PROMEGA，USA)作為模板，以5’CMV和3’CMV作為引物，用PCR方法制備CMV(cytomegalovirus，巨細(xì)胞病毒)的DNA片段(簡(jiǎn)稱CMV)。CMV作為早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，其長(zhǎng)度為631bp。以實(shí)施例1得到的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆為模板，以5’JEV5’end和3’JEV5’end作為引物，用PCR的方法制備JEV cDNA的5’端片段(簡(jiǎn)稱JEV5’end)。以上述2個(gè)DNA片段作為模板，以5’CMV和3’JEV5’end作為引物，用fusing PCR的方法制備CMV-JEV 5’end的DNA片段(簡(jiǎn)稱CMV-JEV 5’end)。
2.將步驟1產(chǎn)生的CMV-JEV 5’end與pRS424質(zhì)粒(ATCC#77105)用Not I和ApaI進(jìn)行酶切。用Qiagen spin column(購(gòu)自QIAGEN Inc.)對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行純化。將上述兩個(gè)DNA片段用T4連接酶(購(gòu)自New England Bio lab)連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌內(nèi)。篩選得到CMV-JEV 5’end克隆(簡(jiǎn)稱pRS/CMV-JEV 5’end)。
3.以實(shí)施例1得到的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA為模板，以5’JEV3’end和3’KEV3’end作為引物，用PCR方法制備JEV cDNA的3’端片段(簡(jiǎn)稱JEV 3’end)。以5’HDVr和3’HDVr作為引物，用融合PCR方法制備肝炎delta病毒抗原血癥核酶(hepatitisdelta virus antigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(簡(jiǎn)稱HDVr)。以pcDNA3(購(gòu)自Invitrogen)作為模板，以5’pA和3’pA作為引物，用PCR的方法制備牛生長(zhǎng)激素poly A(bovine growth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(簡(jiǎn)稱pA)。以上述三個(gè)片段為模板，以5’JEV3’end和3’pA作為引物，用融合PCR方法制備JEV3’end-HDVr-pA的DNA片段。

4.將上述步驟2生成的pRS/CMV/-JEV5’end與步驟3生成的JEV3’end-HDVr-pA的DNA片段用Apa I and Sac II進(jìn)行酶切，用Qiagen spin column對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行純化。將上述兩個(gè)DNA片段用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌內(nèi)。篩選得到pRS/CMV-JEV5’end-JEV3’end-HDVr-pA的克隆。
5.將上述步驟4生成的pRS/CMV-JEV5’end-JEV3’end-HDVr-pA的克隆用Apa I進(jìn)行酶切，將實(shí)施例1得到的全長(zhǎng)乙腦病毒cDNA克隆用Not1 and Kpn I進(jìn)行酶切。將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，并將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至釀酒酵母，利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，得到修飾后的全長(zhǎng)JEVcDNA克隆(簡(jiǎn)稱pRS/CMV/JEV)。
6.將步驟5產(chǎn)生的pRS/CMV/JEV用BamH I進(jìn)行酶切，得到線性的pRS/CMV/JEV克隆。以GATTCCAATGGAGACATTATAGGCCTATAGCTGCTTAGGACGGCTGACCTC(SEQ ID NO33)和CCACACCGGGAGGTCAGCCGTCCTAAGCAG(SEQ ID NO34)為引物，用融合PCR方法生成一個(gè)60bp長(zhǎng)的DNA片段，其序列為GATTCCA ATGGAGACATTATAGGCCTATAGCTGCTTAGGACGGCTGACCTCCCGGTGTGG(SEQ ID NO35)。將上述線性的pRS/CMV/JEV克隆和60bp長(zhǎng)的DNA片段一同轉(zhuǎn)化至酵母菌(ATCC 76628)，利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，將線性的pRS/CMV/JEV克隆中部分JEV NS3編碼區(qū)基因序列(nt5059-6215)切除，得到NS3缺失的JEV cDNA克隆。
7.將上述步驟6產(chǎn)生的NS3缺失的JEV cDNA克隆和pcDNA3(購(gòu)自INVITROGEN)同時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21 cell(ATCC#CCL-10)。該細(xì)胞培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)換為含有G418(購(gòu)自SIGMA)的細(xì)胞培養(yǎng)液。用實(shí)施例7得到的ΔC rJEV RNA轉(zhuǎn)化抗G418細(xì)胞株，挑選出包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系的產(chǎn)量可以達(dá)到每毫升106重組乙腦病毒顆粒(ΔC-rJEV)，即乙肝乙腦雙價(jià)疫苗。
實(shí)施例9-13重組乙腦病毒(含有全JEV基因組)的各種構(gòu)建體采用與實(shí)施例2～4的相似的方法構(gòu)建了下列重組乙腦病毒，不同點(diǎn)僅在于插入的外源核酸和插入位點(diǎn)不同。

實(shí)施例14-16重組乙腦病毒(含有JEV亞基因組)的各種構(gòu)建體采用如實(shí)施例7和8的相似的方法構(gòu)建了下列重組JEV亞基因組和重組乙腦病毒，外源核酸插入位置仍然為JEV基因組去除結(jié)構(gòu)蛋白基因處，不同點(diǎn)僅在于插入的外源核酸不同。

實(shí)施例17重組乙腦病毒疫苗的中和試驗(yàn)對(duì)實(shí)施例8、9-16制備的重組乙腦病毒，用實(shí)施例6相同的蝕斑減少試驗(yàn)進(jìn)行乙腦病毒中和抗體測(cè)定，結(jié)果各重組乙腦病毒的抗體中和效價(jià)為1∶5～1∶20。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海天甲生物醫(yī)藥有限公司美國(guó)天甲生物醫(yī)藥有限公司北京東方天甲科技發(fā)展有限公司<120>乙肝乙腦雙價(jià)疫苗<130>041890 PCWO<150>CN 03115912.5<151>2003-03-20<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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權(quán)利要求
1.一種重組乙腦病毒，其特征在于，所述的重組乙腦病毒由乙腦病毒衣殼和重組乙腦病毒基因組構(gòu)成，所述的乙腦病毒基因組中插入了外源核酸序列，且重組后的基因組保留了自我復(fù)制功能。
2.如權(quán)利要求1所述的乙腦病毒，其特征在于，所述的外源核酸中含有編碼抗原、抗原決定簇、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、多肽類激素、酶、受體、抗體和/或癌相關(guān)蛋白的核酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的乙腦病毒，其特征在于，所述的外源核酸序列含有乙肝病毒抗原或抗原決定簇的核酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的乙腦病毒，其特征在于，外源核酸的插入位點(diǎn)選自下組(i)在乙腦病毒基因組的NS2B和NS3編碼區(qū)之間；(ii)在乙腦病毒基因組的E和NS1編碼區(qū)之間；(iii)在乙腦病毒基因組的C和prM編碼區(qū)之間。
5.如權(quán)利要求1所述的乙腦病毒，其特征在于，所述的乙腦病毒基因組缺失了部分乙腦病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。
6.如權(quán)利要求5所述的乙腦病毒，其特征在于，所述的缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列選自下組C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其組合。
7.如權(quán)利要求1所述的乙腦病毒，其特征在于，所述的乙腦病毒是減毒的。
8.如權(quán)利要求1所述的重組乙腦病毒的用途，其特征在于，用于制備治療性或預(yù)防性的疫苗。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的重組乙腦病毒和藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種制備重組乙腦病毒的方法，其特征在于，包括步驟(a)將乙腦病毒基因組引入包裝細(xì)胞，其中所述的乙腦病毒基因組中插入了外源核酸序列，且缺失了選自下組的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其組合，并且重組后的基因組保留了自我復(fù)制功能；而所述的包裝細(xì)胞選自下組(i)被含所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，(ii)被含所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的輔助病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(iii)基因組整合有所述病毒缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因的細(xì)胞；(b)培養(yǎng)步驟(a)的包裝細(xì)胞；(c)從培養(yǎng)物中分離出重組乙腦病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)防和治療流行性乙型腦炎(又稱日本腦炎，簡(jiǎn)稱“乙腦”)和乙型肝炎(簡(jiǎn)稱“乙肝”)的乙肝乙腦雙價(jià)疫苗。此雙價(jià)疫苗由乙肝病毒抗原基因插入到減毒乙腦病毒的基因組中構(gòu)建而成，既能以減毒乙腦病毒為載體高效率地表達(dá)乙肝病毒的抗原，又保持了乙腦減毒活疫苗的安全性和免疫原性，因而是一種能夠同時(shí)預(yù)防和治療乙腦和乙肝的雙價(jià)疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1609204SQ200410031768
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
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