專利名稱：球蟲疫苗及其制造和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備免疫原組合物和抗由球蟲導致的疾病的疫苗。本發(fā)明也提供用于抗球蟲病的減毒疫苗。
背景技術：
球蟲病是由于感染一種或更多的許多種類的球蟲而引起的疾病，所述球蟲屬于原生動物門(protozoa)的亞門，是頂復(Apicomplexa)亞門和艾美球蟲(Eimeria)屬的細胞內原生寄生蟲。艾美球蟲屬包含大多數具有重要經濟價值的家禽種類，例如雞、鴨、鵝、珍珠雞、孔雀、野雞、鴿子和火雞。雖然球蟲病實際上會在所有種類的禽類中發(fā)生，但所述寄生蟲是宿主特異性的并且各種球蟲只在單一或有限相關宿主內出現(xiàn)。另一方面，已知鳥類宿主具有超過一個品種的球蟲。在雞中引起球蟲病的艾美球蟲種包括堆形艾美球蟲(E.acervulina)、波氏艾美球蟲(E.brunetti)、哈氏艾美球蟲(E.hagani)、巨型艾美球蟲(E.maxima)、和緩艾美球蟲(E.mitis)、變位艾美球蟲(E.mivati)、尼氏艾美球蟲(E.necatrix)、塞前艾美球蟲(E.praecox)和禽艾美球蟲(E.tenella)。堆型艾美球蟲是在烤房垃圾中發(fā)現(xiàn)的最普遍的品種。其具有巨大的繁殖潛能并且被認為是致病的，因為其對體重增長、更高的飼料轉化率產生了明顯的壓制并且對小腸上部造成嚴重損傷。
在家禽中，雞是最容易遭受來自球蟲病造成的重大經濟損失的，盡管在火雞、鵝、鴨和珍珠雞上也會發(fā)生損失。球蟲病也曾給圈養(yǎng)在籠中的野雞和鵪鶉造成嚴重損失。球蟲病感染的效果會采取明顯可見的毀滅性禽群死亡的形式，但另一個不希望看到的效果是由感染造成的病態(tài)和/或體重減少。
在生命周期中，所述艾美球蟲寄生蟲經歷許多階段(為查閱，參見例如美國專利6,100,241)。生命周期從雞在地面喂養(yǎng)期間或通過吸入灰塵而攝入稱作孢子形成了的囊合子的傳染性階段開始。所述孢子形成了的囊合子的壁通過鳥胃和腸道中的機械磨擦和化學作用相結合而破裂，導致釋放4個孢子囊。所述孢子囊經過十二指腸，在那里其被暴露于膽汁和消化酶，導致每個孢子囊內釋放2個子孢子。
所述子孢子是可移動的并且尋找合適的宿主上皮細胞以穿入并在其中繁殖。在感染上皮細胞后，所述寄生蟲進入其生命周期的裂殖體階段，每個裂殖體產生從8到16到大于200個裂殖子。一旦裂殖子從裂殖體中釋放出來，其能自由地進一步感染上皮細胞。在2到5個這樣的無性生殖周期后，細胞內裂殖子成長到進入稱作雌性或大配子母細胞和雄性或小配子母細胞的有性形式。通過由小配子體母細胞釋放的小配子與大配子母細胞的受精作用后形成了合子，所述合子在其自身周圍形成了孢囊壁。新形成的囊合子以排泄物從感染的雞中排出。
在溫度和濕度以及空氣中含有充分氧氣的合適環(huán)境下，所述囊合子將形成孢子進入感染階段，準備感染新的宿主并因此傳播疾病。于是，不需要中間宿主將寄生蟲在禽與禽之間傳播。
艾美球蟲寄生蟲感染雞消化道的結果是體重減少、增加的飼料轉化、停止生產雞蛋，以及在某些情況下死亡。家禽密集生產的急劇增加已經伴隨著因這些寄生蟲的嚴重損失；事實上，球蟲病已經成為在經濟上重要的寄生蟲病。
過去，已經發(fā)展出幾種用于試圖控制球蟲病的方法。在化學治療藥劑到來之前，使用消毒劑結合機械去除垃圾以改善衛(wèi)生狀況是主要運用的方法；然而，通常仍有足夠多的囊合子留下傳播疾病。在飼料和飲用水中導入抑球蟲劑藥物再加上良好的管理會在疾病控制上獲得一些成功。已發(fā)現(xiàn)這類藥物多年后效果會降低，部分因為產生了抗藥性的球蟲株系。此外，已發(fā)現(xiàn)幾種化學治療藥物殘留在肉中，使得其不適于消費。
美國專利4,438,097；4,639,372；4,898,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438 5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,5685,932,225；6,001,363和6,100,241涉及球蟲病疫苗，包括活疫苗和重組疫苗。然而，在已有的球蟲病疫苗中存在一些問題，例如藥效降低、與其它寄生蟲(例如梭菌屬)發(fā)生交叉感染和較差的禽類表現(xiàn)。于是，需要具有減少或使交叉感染不存在、不會不利地影響禽類行為的有效的球蟲病疫苗。
本發(fā)明中任何文獻的引用或確認并不承認該文獻作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術而可以獲得。
發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于減毒球蟲病疫苗，所述疫苗能有效地面對致命攻擊、降低與梭菌(clostridium spp.)的交叉反應并且通過與其它球蟲病疫苗相比具有更好的由飼料轉化率定義的禽類表現(xiàn)。
本發(fā)明涉及來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物。從由一只或多只雞中收獲的種子培養(yǎng)物中分離孢子形成了的囊合子，所述雞是用堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系培養(yǎng)物接種的，即用堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲或禽艾美球蟲的早熟株系接種一只或多只雞，產生4個組群的雞，每個組群用不同的艾美球蟲株系接種。所述分離的孢子形成了的囊合子組合起來形成來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子混合物。
在有利的實施方案中，所述雞是2到8周大小的SPF雞。在另一個有利的實施方案中，用約100到15,000個囊合子接種每只雞以產生所述種子培養(yǎng)物。在另一個有利的實施方案中，通過離心分離來自種子培養(yǎng)物的孢子形成了的囊合子。
本發(fā)明也提供鑒定具有堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲或禽艾美球蟲早熟株系特征的孢子形成了的囊合子。
本發(fā)明涉及來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物，其中所述混合物有約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個禽艾美球蟲囊合子。有利地，所述混合物含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子、約100到500個禽艾美球蟲囊合子。更有利地，所述混合物約由500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子組合而成。
本發(fā)明也涉來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本發(fā)明也涉及測試來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的效率。有利地，所述測試涉及對動物施用約100,000到500,000個堆型艾美球蟲囊合子和約10,000到100,000個巨型艾美球蟲囊合子、約100,000到500,000個和緩艾美球蟲囊合子或約10,000到100,000個和緩艾美球蟲囊合子的攻擊劑量。在更有利的實施方案中，所述攻擊劑量是約200,000個堆型艾美球蟲囊合子和約20,000到50,000個巨型艾美球蟲囊合子、約200,000個和緩艾美球蟲囊合子或約20,000到50,000個和緩艾美球蟲囊合子。
本發(fā)明涉及免疫雞，有利地是烤子雞(broiler chicken)。不過制造此處描述的疫苗的方法可以外推到其它被艾美球蟲感染的動物，特別是禽，類例如但不限于雞、鴨、鵝、珍珠雞、孔雀、野雞、鴿子、鵪鶉和火雞。
本發(fā)明包括免疫原性或疫苗組合物，所述組合物包含分離自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物。在有利的實施方案中，所述混合物是約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子。有利地，所述混合物是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到500個和緩艾美球蟲囊合子。更有利地，所述混合物是由約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100和緩艾美球蟲囊合子組合而來。
本發(fā)明也涉及免疫原性或疫苗組合物，所述組合物包含特定比例的從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系分離的孢子形成了的囊合子，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊中就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本發(fā)明也提供引起免疫應答或誘導免疫學的或保護性的應答，所述應答包括對施用有效量的免疫原性或疫苗組合物以引起或誘導動物中的應答，所述組合物包含從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系分離的孢子形成了的囊合子混合物。有利地，所述動物是鳥類，例如但不限于雞、鴨、鵝、珍珠雞、孔雀、野雞、鴿子、鵪鶉和火雞。在最有利的實施方案中，所述鳥類是雞，有利地是烤子雞。引起免疫應答或誘導免疫學應答的方法也包括施用佐劑、細胞因子或兩者都施用。
有利地，引起免疫應答或誘導免疫學或保護性應答的有效劑量是約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子。有利地，有效劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到500個禽艾美球蟲囊合子。更有利地，有效劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100和緩艾美球蟲囊合子的組合。在另一個實施方案中，所述有效劑量足以抵抗約100,000到500,000個堆型艾美球蟲囊合子和約10,000到100,000個巨型艾美球蟲囊合子、約100,000到500,000個和緩艾美球蟲囊合子或約10,000到100,000個禽艾美球蟲囊合子對動物的攻擊劑量。更有利地，所述攻擊劑量是約200,000個堆型艾美球蟲囊合子和約20,000到50,000個巨型艾美球蟲囊合子、約200,000個和緩艾美球蟲囊合子或約20,000到50,000個和緩艾美球蟲囊合子。
引起免疫應答或誘導免疫學或保護性應答的有效劑量也可以表示為來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子的比例，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
考慮到各種艾美球蟲品種的流行性和致病性，成功的減毒球蟲病疫苗應當含有足以引起免疫應答或誘導免疫學或保護性應答的最少量的艾美球蟲株系，所述反應對所述疫苗的接受者是非致病性的。該關系涉及來自4種特定艾美球蟲株系的囊合子的組合，即堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲，所述株系(組合)產生有效的和非致病性的疫苗。其它艾美球蟲株系，例如波氏艾美球蟲、尼氏艾美球蟲和塞前艾美球蟲的加入可能會對所述疫苗的效力、交叉反應或致病性不利。因為波氏艾美球蟲、尼氏艾美球蟲和塞前艾美球蟲對于此處公開的球蟲病疫苗的效力不是必需的，從本發(fā)明的疫苗中排除這些株系將是有利的。
應該注意在這個公開的說明書中和特別是在權利要求書和/或段落中，術語例如“包含”、“已包含”、“正包含”等具有屬于美國專利法中的含意；例如，它們可是表示“包括”、“已包括”、“正包括”等；并且術語例如“基本由……構成”和“基本由……構成”具有美國專利法中規(guī)定的含意，例如它們允許組成部分不做明確地說明，但排除在現(xiàn)有技術中發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明基本性或新特征的組成部分。
這些和其它實施方案公開于或明顯來自或包含于下面的詳述中。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于減毒球蟲病疫苗，所述疫苗能有效地面對致命攻擊、降低與梭菌的交叉反應和當與其它球蟲病疫苗相比時具有更好的由飼料轉化率定義的禽類表現(xiàn)。
本發(fā)明涉及來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系的孢子形成了的囊合子混合物。由從一只或多只雞中收獲的種子培養(yǎng)物中分離孢子形成了的囊合子，所述雞是用堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系培養(yǎng)物接種的，即用堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲或禽艾美球蟲的早熟株系接種一只或多只雞，產生4個組群的雞，每個組群用不同的艾美球蟲株系接種。
有利地，所述艾美球蟲株系是早熟株系。早熟株系來源于野生品種，當施以適當劑量時其是非致病性的。在有利的實施方案中，所述艾美球蟲株系是P.L.Long和Joyce K.Johnson在Avian Pathology，17305-314，1988標題為“Eimeria of American ChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Produced by Selectionfor Precocious Development”中所描述的各微生物的早熟株系，引用其公開的全文作為參考。通過對其早熟發(fā)育的選擇可減毒微生物，如P.L.Long和Joyce K.Johnson在AvianPathology，17305-314，1988，標題為“Eimeria of AmericanChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Producedby Selection for Precocious Development”所描述的，引用其公開的全文作為參考。簡短地說，通過選擇較早的顯露前期(pre-patent)，即當所述囊合子第一次出現(xiàn)在糞便中時，減毒所述微生物。這些方法對本領域技術人員來說是熟知的并且構成常規(guī)實驗。
作為種子培養(yǎng)的艾美球蟲株系的貯存培養(yǎng)物包括但不限于下面所列。據認為堆型艾美球蟲的親本，于1969年獲自Hess和Clark實驗室的T.K.Jeffers，曾由USDA，Beltsville，MD的M.M.Farr博士分離，所述親本來自單一囊合子。所述巨型艾美球蟲培養(yǎng)物來源于從Georgia，Delaware，Maryland，Virginia和Texas獲得的10個純化分離株的混合異種交配。和緩艾美球蟲培養(yǎng)物的親本于1978年7月在Gainesville，Georgia分離而來并且從單一囊合子分離物純化而來。禽艾美球蟲培養(yǎng)物的親本來自由Pennsylvania State University的Patten博士自1960年代早期以來維持的培養(yǎng)物，并于1982年從Georgia大學獲取。其它艾美球蟲早熟株系包括LS100早熟堆型艾美球蟲分離株系809-13和獲自Merck研究實驗室LS早熟和緩艾美球蟲，所述株系獲自Peter Long博士?；蛘?，已作為專利保藏物(參見例如美國專利5,055,292，引用其公開全文作為參考)以孢子囊形式在歐洲動物細胞保藏中心(“ECACC”)保藏的減毒早熟艾美球蟲株系是用于產生此處描述的艾美球蟲種子培養(yǎng)物的保藏培養(yǎng)物。特別地，如美國專利5,055,292中描述的，堆型艾美球蟲(保藏號ECACC 86072203)、巨型艾美球蟲(保藏號ECACC 86112011和86112012)、和緩艾美球蟲(保藏號ECACC 86072206)和禽艾美球蟲(保藏號ECACC 86072201)的保藏物是用于產生本發(fā)明種子培養(yǎng)物的保藏培養(yǎng)物。
有利地，通過如上面描述對其早熟發(fā)育的選擇對所述微生物進行減毒。在另外有利的實施方案中，所述培養(yǎng)物是無病原體的。上面描述的貯存培養(yǎng)物有利地維持在液氮的液相或氣相中。這類方法對本領域技術人員是熟知的。
在有利的實施方案中，所述雞是2到8周大小。孢子形成了的囊合子成功地、無限制地在雞中傳代，直至囊合子數目足夠用作種子進行生產。有利地，為保持活力/有效性所述培養(yǎng)物不應該放置超過12個月。
在有利的實施方案中，用專用設施來維持各艾美球蟲品種。有利地，將足夠量的孢子形成了的囊合子(種子)與飼料混合或，進行經口給藥以對每只雞提供最小劑量。在有利的實施方案中，每只雞接種約5000到15,000個囊合子以產生種子培養(yǎng)物。
有利地通過離心從禽類的糞便中分離來自種子培養(yǎng)物的所述孢子形成了的囊合子。在有利的實施方案中，如下進行收獲。在水中以約10％(W/V)的比例勻漿排泄物。將勻漿物通過篩子以除去大的顆粒。將固體用離心、篩選或在5±3℃放置達24小時進行分離。如果固體通過在5±3℃放置進行分離，將它們通過離心進一步濃縮。棄去上清液，并將所述固體重新懸浮于飽和氯化鈉(80％W/V)水溶液中。將終溶液離心。從液體上部中收集(取去)所述囊合子并重新懸浮于水中。任選地，將剩下的液體用水稀釋到20-40％的氯化鈉并離心。然后將所述沉淀重新懸浮于飽和氯化鈉溶液中并再離心，直到沒有額外的囊合子被回收。所述囊合子沖洗不超過2次。通過將囊合子重復重懸浮離心循環(huán)然后懸浮于0.5％的次氯酸鈉溶液中10到15分鐘以洗去囊合子的鹽分。接著通過重復(3X)離心和重新懸浮步驟洗去囊合子的次氯酸鈉溶液。最終懸浮在2.5％重鉻酸鉀(K2CrO7)液體溶液中。然后將囊合子轉到孢子形成容器中。通過在27±3℃下在不超過72小時的時間內用空氣噴射懸浮液幫助形成孢子。在形成孢子后將所述囊合子于5±3℃下放置直到產生最終產物。
在另一個實施方案中，可通過本領域技術人員所熟的幾種方法中任何方法制備用于本接種疫苗方法的囊合子。這些方法包括J.F.Ryley等人在Parasitology 73311-326，1976、P.L.Long等人在Folia Veterinaria Latina VI#3，201-217，1976和美國專利6,627,205中所描述的方法，引用其公開的全文作為參考。根據一種方法通過口部飼入合適劑量的孢子形成了的囊合子用目的艾美球蟲品種感染2周大小、商業(yè)購得的烤子雞。然后實施從感染的禽類收集和純化囊合子的熟知方法。對于大多數艾美球蟲品種，在感染后5-7天從感染的禽類中收集糞便，混合并過濾除去殘渣，然后以能充分沉淀剩余糞便材料的速度進行離心。將所述沉淀在飽和鹽溶液中重新懸浮，在所述溶液中囊合子漂浮其中并且通過離心可去除絕大多數污染殘渣。然后用更低的鹽濃度稀釋所述囊合子懸浮物。反復洗滌所述囊合子除去鹽分并且重新懸浮于重鉻酸鉀溶液中(2.5％W/V)。所述囊合子懸浮液于29℃搖動(例如140rpm)孵育約72小時以誘導所述囊合子孢子的形成?；蛘?，可用次氯酸鈉處理所述囊合子然后使之形成孢子。使用血球計數器或McMastor載玻片直接計數確定每毫升孢子形成了的囊合子的數目，并且將培養(yǎng)物貯存于冰箱直至需要。
為制備孢子囊，通過反復洗滌囊合子將重鉻酸鉀從上面描述的囊合子懸浮液中除去，所述洗滌過程包括通過離心和在去離子或蒸餾水中重新懸浮以收集囊合子。當通過缺少微桔黃色著色判斷重鉻酸鹽已被經除去時，將囊合子懸浮液與等體積的次氯酸鈉(漂白劑)混合并且在室溫下孵育15分鐘。通過反復洗滌除去漂白劑并將所述囊合子重新懸浮于生理鹽水或去離子水中。使用各種已知的技術破裂囊合子釋放孢子囊。例如，通過將囊合子與直徑1-4mm的玻璃珠混合并用手、渦旋攪拌器或震蕩培養(yǎng)箱搖動或使用手控勻漿器可以破裂囊合子釋放孢子囊。通過在50％PERCOLL中使用差速離心可以將未破的囊合子和囊合子壁與釋放的孢子囊分離，所述PERCOLL是如Dulski等人在Avian Diseases，32235-239，1988所描述的覆蓋有聚乙烯吡咯烷酮的硅顆粒(由Pharmacia Biotech出售)或1M蔗糖的膠狀懸浮物。所述孢子囊可以以與未破裂囊合子和囊合子壁混合或從其中分離出來的方式應用于本接種方法中。有利地，將孢子囊藥劑與囊合子和囊合子壁分離。
在有利的實施方案中，對可接受的種子培養(yǎng)物的收獲具體要求如下。首先，要確定孢子形成了的囊合子對全部囊合子的比例。只有達到或超過＞40％孢子形成的收獲物才認為是可接受的。第二，各囊合子收獲物的大小、形狀和外表必需具有該品種預期產生的特征。例如，被認為確定艾美球蟲品種特征的參數包括但不限于基于DNA的技術、DNA浮力密度、酶變異、宿主和位點特異性、免疫學特異性、致病性、顯露前期和孢子形成時間(參見例如Long & Joyner，Jprotozool.1984 Nov；31(4)535-41和Shirley，Acta Vet Hung。1997；45(3)331-47，引用其公開的全文作為參考)。
從此處描述的種子培養(yǎng)物中分離的來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子組合起來形成孢子形成了的囊合子混合物。通常，所述混合物含有約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個禽艾美球蟲囊合子。有利地，混合物中孢子形成了的囊合子的范圍是約125到500個堆型艾美球蟲囊合子、約25到100個巨型艾美球蟲囊合子、約125到500個和緩艾美球蟲囊合子和約25到500個禽艾美球蟲囊合子。在一個實施方案中，較低劑量是約125個堆型艾美球蟲囊合子、約25個巨型艾美球蟲囊合子、約125個和緩艾美球蟲囊合子和約25個禽艾美球蟲囊合子。在另一個實施方案中，中等劑量是約250個堆型艾美球蟲囊合子、約50個巨型艾美球蟲囊合子、約250個和緩艾美球蟲囊合子和約50個禽艾美球蟲囊合子。然而在另一個實施方案中，高劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子。
本發(fā)明也涉及從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
有利地，所述混合物含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到約500個禽艾美球蟲囊合子。在更有利的實施方案中，所述混合物含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100禽艾美球蟲囊合子。
有利地，所述囊合子懸浮于由含有慶大霉素的0.01M磷酸緩沖鹽溶液構成的防腐劑中。在另一個實施方案中，所述囊合子懸浮于任何種類的防腐劑或有機酸中，后者例如但不限于乙酸、檸檬酸、重鉻酸鉀或丙酸。使用例如但不限于充分滅菌的、含有不超過30mcg/ml慶大霉素的0.01M的磷酸緩沖鹽溶液生產2,000劑量展示的每瓶2ml、5,000劑量展示的每瓶5ml、10,000劑量展示的每瓶10ml的藥劑。有利地，所述囊合子貯存于滅菌的、硼硅酸鹽玻璃小瓶中。例如，但不限于，用半自動或全自動分配器將所述囊合子分別裝入疫苗小瓶中，機械地或人工地將塞子插入并且放上并卷曲鋁封條而將其封裝。
在另一個實施方案中，將囊合子懸浮于含有懸浮劑的滅菌的蒸餾水中，所述懸浮劑例如多醣懸浮劑，例如樹膠(例如黃素樹膠或阿拉伯樹膠)、纖維素衍生物，例如羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或微晶纖維素、鹿角菜膠、藻酸鈉、果膠或淀粉；多肽懸浮劑，例如白明膠；合成聚合物懸浮劑，例如聚丙烯酸；或硅酸鹽懸浮劑，例如鎂鋁硅酸鹽(參見，例如美國專利5,055,292，引用其公開的全文作為參考)。
本發(fā)明也提供鑒定以堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系為特征的孢子形成了的囊合子。有利地，所有囊合子都減毒了，因為它們是早熟的。在另一個有利的實施方案中，各囊合子收獲物的大小、形狀和外表必需具有該品種預期產生的特征。而在另一個有利的實施方案中，對孢子形成了的囊合子混合物的純度、外來病原體和/或所述測試動物(例如雞)的死亡或嚴重損傷進行檢測。在Long P.L和Reid W.M.(1982A Guide for the Diagnosis ofCoccidiosis in Chickens；University of Georgia Research Report404)和Joyner L.P(1978Identification and Diagnosis，AvianCoccidiosis，Poultry Science Symposium No.13，British PoultryScience Ltd)中詳細描述了各種艾美球蟲品種的特征，引用其公開的全文作為參考。
本發(fā)明也涉及測試來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的效力。有利地，所述測試涉及給動物施用約100,000到500,000個堆型艾美球蟲囊合子和約10,000到100,000個巨型艾美球蟲囊合子、約100,000到500,000個和緩艾美球蟲囊合子或約10,000到100,000個禽艾美球蟲囊合子的攻擊劑量。在更有利的實施方案中，所述攻擊劑量是約200,000個堆型艾美球蟲囊合子和約20,000到50,000個巨型艾美球蟲囊合子、約200,000個和緩艾美球蟲囊合子或約20,000到50,000個禽艾美球蟲囊合子。
本發(fā)明進一步提供確定根據飼料轉化率定義的禽類表現(xiàn)，所述飼料轉換率是對禽類施用來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的結果。飼料轉化效率定義為產生一磅肉所需要的飼料磅數。普通的結果是約1.90或2.00。在普通行話中飼料轉化中的1點是.01，等于約0.5％(百分之一的一半)。如果使用公制系統(tǒng)，所述飼料轉化表示為每千克肉需要的飼料千克數，并且仍與上述成比例。
本發(fā)明涉及免疫雞，有利地是烤子雞。然而，此處描述的制造疫苗的方法可以外推到被艾美球蟲感染的其它動物中，特別是禽類例如但不限有于雞、鴨、鵝、珍珠雞、孔雀、野雞、鴿子、鵪鶉和火雞，或在較不有利的實施方案中是野兔。
本發(fā)明包括含有從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離的孢子形成了的囊合子混合物的免疫原性或疫苗組合物。從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離的孢子形成了的囊合子組合起來形成孢子形成了的囊合子組合物。通常，所述混合物含有約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個禽艾美球蟲囊合子。有利地，組合物中孢子形成了的囊合子的范圍是約125到500個堆型艾美球蟲囊合子、約25到100個巨型艾美球蟲囊合子、約125到500個和緩艾美球蟲囊合子和約25到250個禽艾美球蟲囊合子。在一個實施方案中，較低劑量是約125個堆型艾美球蟲囊合子、約25個巨型艾美球蟲囊合子、約125個和緩艾美球蟲囊合子和約25個禽艾美球蟲囊合子。在另一個實施方案中，中等劑量是約250個堆型艾美球蟲囊合子、約50個巨型艾美球蟲囊合子、約250個和緩艾美球蟲囊合子和約50個禽艾美球蟲囊合子。而在另一個實施方案中，高劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子。
有利地，所述組合物含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到500個禽艾美球蟲囊合子。在更有利的實施方案中，所述組合物含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子所述組合物也涉及從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離出來的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
術語“免疫原性組合物”此處涵蓋任何組合物，所述組合物一旦給動物例如禽類施用就能引起對抗寄生蟲或抗原或免疫原或抗原表位的保護性免疫應答。術語“疫苗”此處涵蓋任何組合物，所述組合物一旦給動物例如禽類施用就能誘導對抗病毒的保護性免疫應答或有效地保護動物對抗寄生侵害。
根據本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗也可以包括病原體或免疫原、所述病原體的抗原或抗原表位和另一病原體、寄生蟲或病毒的至少一個免疫原、抗原或抗原表位，即所述球蟲病疫苗與另外的禽類疫苗組合。這種免疫原、抗原或抗原表位是例如細菌或其它寄生蟲或病毒來源，或病原體、寄生蟲或病毒的無活性或減毒形式。本發(fā)明也包括制備這些組合的組合物的試劑盒以及制備這些組合物和使用這些組合物的成份制備組合物的方法。因此，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物的試劑盒；例如，這類試劑盒包含(a)生物體、病原體或病毒或抗原或其抗原表位(有利地為此處提到的病原體)和(b)不同于(a)中的生物體、病原體或病毒或抗原或其抗原表位(有利地為病毒或免疫原、抗原或其抗原表位，但如此處提到的其它病原體也是可包括的)，所述試劑盒存在于分開的容器中，可選地放入同一個包裝盒中和可選地具有混合和/或施用的說明書。
根據本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗可包括艾美球蟲培養(yǎng)物或制備物(例如，滅活或減毒的艾美球蟲，或其免疫原或抗原或抗原表位)和另外的禽類病原體(包括但不限于滅活的或減毒形式的病原體)的至少一種免疫原、抗原或抗原表位。對于禽類的多價免疫原性組合物和多價疫苗，其中包括另外的禽類抗原或其免疫原或抗原表位和/或其中通過所述多價免疫原性組合物和多介疫苗表達另外的禽類抗原或免疫原或抗原或抗原表位的額外的禽類病原體是病毒、疾病或馬立克氏病病毒(MDV)(例如血清型1和2，有利地是1)、新城疫病毒(NDV)、除了新城疫的副粘病毒(PMV2到PMV7)、感染性支氣管炎病毒(IBV)、感染性貧血癥病毒或雞貧血癥病毒(CAV)、感染性家禽呼吸氣管病病毒(ILTV)；感染性囊癥病毒(IBDV)、腦脊髓炎病毒或禽類腦脊髓炎病毒(AEV或禽類白血病病毒ALV)、火雞出血腸炎病毒(HEV)、肺病毒(TRTV)、家禽瘟疫病毒(禽流感)、雞積水性心包炎病毒、禽呼腸孤病毒、球蟲病、產蛋量下降綜合病癥(EDS76)、禽痘病毒、內含體肝炎(腺病毒)、火雞淋巴增生疾病、雞網狀內皮組織增生、火雞網狀內皮組織增生、輪狀病毒腸炎和火雞鼻氣管炎、梭菌屬(Clostridium spp.)，大腸肝菌、雞支原體(Mycoplasma gallinarum)、雞敗血支原體(Mycoplasmagallisepticum)、鳥嗜血桿菌(Haemophilus avium)、雞巴斯德氏菌(Pasterella gallinarum)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida gallicida)和其混合物。有利地，對于MDV所述免疫原有利地是gB和/或gD，例如gB和gD，對于NDV所述免疫原有利地是HN和/或F，例如HN和F；對于IBDV所述免疫原有利地是VP2；對于IBV所述免疫原有利地是S(更有利地是S1)和/或M和/或N，例如S(或S1)和M和/或N；對于CAV所述免疫原有利地是VP1和/或VP2；對于ILTV所述免疫原有利地是gB和/或gD；對于AEV所述免疫原有利地是env和/或gag/pro，例如evn和gap/pro或gag/pro；對于HEV所述免疫原有利地是100K蛋白質和/或異己酮；對于TRTV所述免疫原有利地是F和/或G以及對于家禽瘟疫，免疫原有利地是HA和/或N和/或NP，例如HA和N和/或NP。于是，本發(fā)明也涉及制造這些組合物及其試劑盒的方法。
根據本發(fā)明的也含有這種額外的免疫原性組分(額外的免疫原、抗原或抗原表位)的免疫原性組合物或疫苗具有同時誘導抗多種感染或疾病或其病原體的免疫應答或保護作用。這種額外的免疫原性組分可是減毒的或滅活的微生物、重組構建體或亞基(例如蛋白質、糖蛋白、多肽或抗原表位)?？乖砦粵Q定方法，例如生成交疊肽文庫(Hemmer等人，Immunology Today，1998，19(4)，163-168)、肽掃描技術(Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81(13)，3998-40002；Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1985，82(1)，178-182；Van der Zee R.等人，Eur.J.Immunol.，1989，19(1)，43-47；Geysen H.M.，Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health，1990，21(4)，523-533；Multipin Peptide SynthesisKits de Chiron)和算法(De Groot A.等人，Nature Biotechnology，1999，17，533-561)，可用于本發(fā)明實踐以確定免疫原、抗原、多肽、糖蛋白等的抗原表位而不需過多的實驗。根據這些信息，人們可以構建編碼這種抗原表位的核酸分子，并且根據這些知識和本領域知識，人們可以構建載體或構建體，例如表達免疫原、抗原表位或抗原的重組病毒或載體或質粒；所有這些不需要過多的實驗。
藥物學上或獸醫(yī)學上可接受的媒介物或載體或賦形劑對本領域技術人員是熟知的。例如，藥物學上或獸醫(yī)學上可接受的媒介物或載體或賦形劑可以是0.9％氯化鈉(例如鹽水)溶液或磷酸緩沖液。藥物學上或獸醫(yī)學上可接受的媒介物或載體或賦形劑可以是任何協(xié)助載體(或自發(fā)明的載體體外表達的蛋白質)施用的化合物或化合物的組合；有利地，媒介物、載體或賦形劑可幫助轉染和/或改善載體(或蛋白質)的保存。此處的劑量和劑量體積在免疫和接種方法總述中進行論述，并且也可以通過本領域技術人員根據這些公開的資料結合本領域相關知識進行確定而不需任何過多的實驗。
根據本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含或基本上由一種或更多佐劑組成。用于本發(fā)明實踐中的合適的佐劑有(1)丙烯酸或甲基丙酸烯聚合物、順丁烯二酸酐和烯烴衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一個或更多非甲基化的CpG單位(Klinman等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1996，93，2879-2883；WO98/16247)的寡聚脫氧核糖核苷酸序列，(3)水包油乳液，例如“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”，由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995發(fā)表；其中147頁描述的SPT乳液和同一著作中183頁所描述的乳液MF59，(4)含有四價銨鹽的陽離子脂類，(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁或(7)其它在任何本申請引用作為參考的文獻中論述的佐劑，或(8)其組合物或混合物。
水包油乳液(3)(特別適合于病毒載體)可以是基于輕的液態(tài)石蠟油(歐州藥典類型)、類異戊二烯油，例如異三十烷、三十碳六烯、來源于烯烴(例如異丁烯或癸烯)的寡聚化的油、具有直鏈烴基基團的醇或酸的酯(例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯)、或分枝的脂肪醇或酸的酯，特別是異硬脂酸酯。油與乳化劑結合使用形成了乳劑。乳化劑可以是非離子表面活性劑，例如一方面是山梨聚糖、甘露醇(例如脫水甘露醇油酸)、甘油、多聚甘油或丙二醇的酯，而另一方面是油酸、異硬脂酸、蓖麻油或羥基硬脂酸，所述的任意乙氧基化的酯或聚氧化丙烯-聚氧化乙稀共聚物嵌段，例如聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物(例如L121)。
在類型(1)佐劑聚合物中，優(yōu)選丙烯酸或甲基丙酸烯交聯(lián)聚合物，特別是通過糖或多元醇的多聚烯烴酯交聯(lián)的。這些化合物以名稱卡波姆(Pharmeuropa，Vol.8，no.2，June 1996)為人所知。本領域技術人員也可以參考美國專利2,909,462，所述專利提供這種通過多聚羥基化合物交聯(lián)的丙烯酸聚合物，所述化合物具有至少3個羥基基團，有利地不超過8個這樣的基團，至少3個羥基基團的氫原子被不飽和脂肪族基團取代，所述脂肪族基團至少具有2個碳原子。有利的自由基是那些含有2到4個碳原子的基團，例如乙稀基、烯丙基和其它稀基不飽和基團。所述不飽和基也可以含有其它取代基，例如甲基。以名稱聚羧乙烯(BF Goodrich，Ohio，USA)銷售的產物是特別適合的。它們通過烯丙基蔗糖或烯丙基pentacrythritol交聯(lián)。其中，參見Carbopol 974P、934P和971P。
至于順丁烯二酸酐烯烴衍生共聚物，優(yōu)選EMA(Monsanto)，所述EMA是直鏈或交聯(lián)的乙稀基順丁烯二酸酐共聚物并且它們通過例如聯(lián)乙烯醚(divinyl ether)交聯(lián)。參考J.Fields等人，Nature186778-780，6月4日，1960。
關于結構，所述丙烯酸或甲基丙酸烯聚合物和EMA優(yōu)選由具有下列化學式的基本單位形成 其中-R1和R2，可以相同或不同，代表H或CH3-x＝0或1，優(yōu)選x＝1-y＝1或2，且x+y＝2對于EMA，x＝0和y＝2并且對于卡波姆x＝y(tǒng)＝1這些聚合物是水或生理鹽水溶液(20g/l氯化鈉)可溶性的并且pH可通過例如蘇打(氫氧化鈉)調節(jié)到7.3到7.4以提供其中可整合表達載體的佐劑溶液。最終疫苗組合物的聚合物濃度范圍在0.01和1.5％w/v之間，有利地是0.05到1％w/v和優(yōu)選0.1到0.4％w/v。
有利地但不是只專門適合于質粒的、含有四價銨鹽的陽離子脂類優(yōu)選是那些具有下列化學式的脂類 其中R1是具有12到18個碳原子的飽和或不飽和的直鏈脂肪族基團，R2是另一個具有2個或3個碳原子的脂肪族基團，而X是胺或羥基集團。
在這些陽離子脂質中，優(yōu)選DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-1-丙烷銨；WO96/34109)，其優(yōu)選與中性脂相聯(lián)(優(yōu)選DOPE)(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)形成DMRIE-DOPE。
有利地，臨時形成具有佐劑的混合物和優(yōu)選在施用所述配制品時或之前較短時間內臨時形成具有佐劑的混合物；例如在給藥之前或之前較短時間內形成質粒-佐劑混合物，這樣就有利地給予足夠時間在給藥之前混合形成復合物，例如在給藥前約10和20分鐘之間，例如在給藥前約30分鐘。
當DOPE存在時，DMRIE∶DOPE摩爾比優(yōu)選是約95∶約5到約5∶約95，更有利地約1∶約1，例如1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑質粒重量比可以在約50∶約1和約1∶約10之間，例如約10∶約1和約1∶約5，并且優(yōu)選約1∶約1和約1∶約2，例如1∶1和1∶2。
所述細胞因子或多種細胞因子(5)可以是免疫原性或疫苗組合物中的蛋白質形式，或可以同免疫原或其抗原表位在宿主中共表達。優(yōu)選細胞因子既可以與免疫原或其抗原表位在相同的載體上共表達，也可以通過分開的載體共表達。
本發(fā)明包括制備這類組合的組合物；例如有利地通過將活性組分與佐劑、載體、細胞因子和或稀釋劑混合在一起。
可以用于本發(fā)明的細胞因子包括但不限于粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素α(IFNα)、干擾素β(IFNβ)、干擾素γ(IFNγ)、白細胞介素-1α(IL-1α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-5(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-9(IL-9)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-11(IL-11)、白細胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、、腫瘤壞死因子β(TNFβ)和轉化生長因子β(TGFβ)。應該理解細胞因子可以與本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物共同施用和/或相繼施用。于是，例如，本發(fā)明的疫苗也可以含有在體內表達合適細胞因子的外源核酸分子，所述合適細胞因子是例如與這個被接種的或在其中可引起免疫學反應的宿主細胞匹配的細胞因子(例如，給禽類施用的制劑的禽類細胞因子)。
本發(fā)明也提供包括施用有效劑量的免疫原性或疫苗組合以引起免疫應答或誘導免疫學或保護性反應。所述免疫原性或疫苗組合物含有從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系分離出來的孢子形成了的囊合子混合物以引起或誘導動物體內的反應。有利地，所述動物是禽類，例如但不限有于雞、鴨、鵝、珍珠雞、孔雀、野雞、鴿子、鵪鶉和火雞。在最有利的實施方案中，禽類是雞，有利地是烤子雞。引起免疫應答或誘導免疫學應答的方法也可以包括施用佐劑、細胞胞因子或兩者同時施用。
引起免疫應答或誘導免疫學或保護性反應的有效量是約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個禽艾美球蟲囊合子。有利地，引起免疫應答或誘導免疫學或保護性反應的有效量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到500個禽艾美球蟲囊合子。更優(yōu)選，有效量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子。在另一個實施方案中，有效劑量足以對抗約100,000個到500,000個堆型艾美球蟲囊合子、約10,000個到100,000個巨型艾美球蟲囊合子、約100,000個到500,000個和緩艾美球蟲囊合子和約10,000個到100,000個禽艾美球蟲囊合子對動物的攻擊劑量。更有利地，所述攻擊劑量是約200,000個堆型艾美球蟲囊合子、約20,000個到50,000個巨型艾美球蟲囊合子、約200,000個和緩艾美球蟲囊合子和約20,000個到50,000個禽艾美球蟲囊合子。
引起免疫應答或誘導免疫學或保護性反應的有效量也涉及從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離出來的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本發(fā)明的另一個方面是分別使用根據本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物進行免疫的方法或進行接種的方法。
所述方法至少包括一種對動物施用足夠量的根據本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗的方法。所述動物可以是雄性的或雌性的。這種給藥方法可通過肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射或通過鼻內或經口給藥特別進行，其中經口給藥包括但不限于通過飼料或飲水、凝膠體或噴霧施用。根據本發(fā)明所述免疫原組合物或疫苗也可以通過注射器或無針頭器械(如例如Pigjet或Biojector(Bioject，Oregon，USA))進行給藥。在有利的實施方案中，所述給藥方法是經口給藥。
根據發(fā)明所述組合物也可以施用于其它哺乳動物，例如以生產多克隆抗體或為單克隆抗體制備雜交瘤，所述哺乳動物例如小鼠或實驗動物。
本發(fā)明提供對動物的免疫，有利地是禽類。美國專利4,438,097；4,639,372；4,898,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438 5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,568 5,932,225；6,001,363和6,100,241描述了施用球蟲病疫苗的方法，引用其公開的全文作為參考。所述方法包括對動物施以有效免疫劑量的本發(fā)明的疫苗。所述疫苗通過任一種本領域技術人員熟知的方法進行施用，例如通過肌內、皮下、腹膜內、靜脈內、鼻內、經口、皮內、囊內(intrabursal)(剛好在雞肛門上方)、在卵內或眼部施用。本領域技術人員熟悉這些施用技術。例如，此處全文引用美國專利5,693,622；5,589,466；5,580,859；和5,566,064作為參考。也可以在噴霧室內對禽類施用疫苗。如美國專利4,458,630和6,627,205所描述的，也可對禽類在卵內施用疫苗，引用其公開的全文作為參考。
有利地，在噴霧室內對禽類施用疫苗，即將鳥放入室內并暴露于含有疫苗的蒸汽中，或通過噴霧方式給藥。在另一個有利的實施方案中，所述免疫原性或疫苗組合物通過口部給藥?；蛘?，通過將所述免疫原性或疫苗組合物放在飲用水中或飼料中進行給藥。
本發(fā)明包括含有從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離的孢子形成了的囊合子混合物的免疫原性或疫苗組合物。所述來自堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系的孢子形成了的囊合子是從此處描述的種子培養(yǎng)物中分離出來的。一般地，組合物中的孢子形成了的囊合子的劑量范圍是約10到1000個堆型艾美球蟲囊合子、約10到100個巨型艾美球蟲囊合子、約10到1000個和緩艾美球蟲囊合子和約10到1000個禽艾美球蟲囊合子。有利地，組合物中的孢子形成了的囊合子的劑量范圍是約125到500個堆型艾美球蟲囊合子、約25到100個巨型艾美球蟲囊合子、約125到500個和緩艾美球蟲囊合子和約25到500個禽艾美球蟲囊合子。在一個實施方案中，較低劑量是約125個堆型艾美球蟲囊合子、約25個巨型艾美球蟲囊合子、約125個和緩艾美球蟲囊合子和約25個禽艾美球蟲囊合子。在另一個實施方案中，中等劑量是約250個堆型艾美球蟲囊合子、約50個巨型艾美球蟲囊合子、約250個和緩艾美球蟲囊合子和約50個禽艾美球蟲囊合子。而在另一個實施方案中，高劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子。
有利地，免疫原性或疫苗組合物劑量是含有約500個堆型艾美球蟲囊合子、約50到100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100到500個禽艾美球蟲囊合子。在更有利的實施方案中，所述劑量是約500個堆型艾美球蟲囊合子、約100個巨型艾美球蟲囊合子、約500個和緩艾美球蟲囊合子和約100個禽艾美球蟲囊合子本發(fā)明也涉及從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲早熟株系中分離出來的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到10(即對于每10個堆型艾美球蟲孢子囊，就有1到2個巨型艾美球蟲的孢子囊、約10個和緩艾美球蟲孢子囊和約2到10個禽艾美球蟲孢子囊)。有利地，堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例是約5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
有利地，所述囊合子懸浮于由含有慶大霉素的0.01M磷酸緩沖鹽溶液構成的防腐劑中。在另一個實施方案中，所述囊合子懸浮于任何種類的防腐劑或有機酸中，后者例如但不限于乙酸、檸檬酸、重鉻酸鉀或丙酸。使用例如但不限于充分滅菌的、含有不超過30mcg/ml慶大霉素的0.01M的磷酸緩沖鹽水生產2ml每瓶2,000劑量展示的、5ml每瓶5,000劑量展示的、10ml每瓶10,000劑量展示的藥劑。有利地，所述囊合子貯存于滅菌的、硼硅酸鹽玻璃小瓶中。例如，但不限于，用半自動或全自動分配器將所述囊合子分別裝入疫苗小瓶中，機械地或人工地將塞子插入并且放置并卷曲封裝鋁封條。
所述疫苗以多劑量在市場上銷售，每瓶含2000劑量、5000劑量、10,000劑量或20,000劑量。所述產品從其功效測試開始的日期到過期日期應該不超過13個月。
可以在任何合適的年齡對動物(有利地是禽類)進行疫苗接種，并且通常第一次接種是在約1到3天大小的之前。有利地，所述動物接種一次。可選地，當使用2劑量疫苗時，正常情況下在動物3天到1周大小時給予第一次接種并且接著根據接種動物的類型再過1到10周進行第二次接種。
在有利的實施方案中對各動物品種給藥的使用、劑量和途徑如下。將本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物給一天或更大一點的健康雞接種以幫助預防由球蟲病引起的疾病。有利地，劑量為通過每100只雞粗略地噴20ml水霧的方式給每只雞一劑藥。
現(xiàn)通過下列非限制性的實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例實施例1球菌生產產物組成。所使用的微生物是堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲。所述微生物的貯存培養(yǎng)物來源如下。堆型艾美球蟲的親本于1969年從Hess和Clark實驗室的T.K.Jeffer獲得并且據認為由USDA，Beltsville，MD的M.Farr博士分離，其源于單一囊合子。所述巨型艾美球蟲培養(yǎng)物來源于獲自Georgia，Delaware，Maryland，Virginia和Texas的10種純化分離株的異種交配混合物。和緩艾美球蟲的親本培養(yǎng)物于1978年7月分離自Gainesville，Georgia并且由單一囊合子分離株純化而來。禽艾美球蟲的親本培養(yǎng)物獲自1960年代早期由Patten博士維持在Pennsylvania State University的培養(yǎng)物，并且于1982年由University of Georgia獲得。
所使用的各艾美球蟲株系是如P.L.Long和Joyce K.Johnson在Avian Pathology，17305-314，1988標題為“Eimeria of AmericanChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Producedby Selection for Precocious Development”中描述的各微生物的早熟株系，引用其公開的全文作為參考。根據該方法通過對其早熟發(fā)育的選擇對所述微生物進行減毒。
培養(yǎng)物。通過其獨特的顯微外形、大小和形狀以及如Long，P.L.和W.M.Reid，A guide for the diagnosis of cocciodiosis inchickens.Re.Report 404(修改的Report 355)，Athens，GACollegeof Agriculture Experiment Station，Univ.of Georgia；1982中所描述的受感染的雞小腸或盲腸的帶狀結構對本產品中所使用的各艾美球蟲品種進行鑒定，引用其公開的全文作為參考。
如上所述通對其早熟發(fā)育的選擇對所述微生物進行減毒。通過使用9 CFR 113.37描述的方法檢測確定各培養(yǎng)物不含病原體。上述貯存培養(yǎng)物維持在液氮的液相或氣相中。
2到8周大小的雞用來生產種子培養(yǎng)物。給藥途徑是經口(即經口部施用)。所有種子都是孢子形成了的囊合子并且由2到8周大小的SPF雞生產。用專門的設備來維持各艾美球蟲品種。將足夠量的的孢子形成了的囊合子與不含抗球蟲劑的飼料混合，或通過口部強飼法給藥以給每只雞提供表1所列的最低劑量。孢子形成了的囊合子不受限于傳代地接連地在2到8周大小的SPF雞中傳代直到囊合子的數目足夠作為種子用于生產。為保持活性/感染性，所述培養(yǎng)物不能放置超過12個月。
表1孢子形成了的囊合子(種子)的最小劑量
接種后第3天到第8天每天都收集雞的排泄物。隨機宰殺雞并且觀察除了和緩艾美球蟲外的各品種感染的特征。如果有任何外來疾病的跡象就不作收獲。
作為參照的貯存培養(yǎng)物維持在液氮里。生產培養(yǎng)物維持在5±3℃并且在2到8周大小的SPF雞體內傳代。
用于播種或接種的懸浮配制品涉及種子培養(yǎng)物在2到8周大小的SPF雞體內的一系列傳代，直到產生充足的囊合子用于生產。
將足夠量的孢子形成了的囊合子(種子)與不含抗球蟲劑的飼料混合，并且給每只雞施用列于表1中的最小劑量。接種后第3天到第8天每天都收集雞的排泄物。隨機宰殺雞并且觀察除了和緩艾美球蟲外的各品種感染的特征。如果有任何外來疾病的跡象就不作收獲。如上述通過對其早熟發(fā)育的選擇對所述微生物進行減毒。
收獲。因為生產目的，在除去微生物以前，雞被養(yǎng)在設計用來生產單一品種的房間里。用不含抗球蟲劑的食物供養(yǎng)雞并且讓其自由接觸到水。接種后第3天到第8天每天都收集雞的排泄物并且于5±3℃下保存直至加工。
使用用于生產目的的收獲微生物的技術如下進行收獲。將排泄物在水中以約10％(w/v)的比例進行勻漿。將勻漿物通過篩子除去大的顆粒。通過離心、篩選或通過在5±3℃下放置24小時分離固體物。如果通過在5±3℃放置分開固體物，其可進一步通過離心濃縮。棄去上清液，并且將固體物重新懸浮于飽和氯化鈉(80％w/v)水溶液。將得到的溶液進行離心。從液體的上部可收集(取得)所述囊合子，并且重新懸浮于水中。最佳地，將剩下的液體用水稀釋到20-40％的氯化鈉并離心。然后將沉淀重新懸浮于飽和氯化鈉溶液中并再離心，直到沒有額外的囊合子被回收。對所述囊合子洗滌不超過二次。通過將囊合子懸浮于0.5％的次氯酸鈉溶液中10到15分鐘然后重復重新懸浮離心循環(huán)以洗去囊合子的鹽分。接著通過重復(3X)離心和重新懸浮步驟洗去囊合子的次氯酸鈉溶液。在2.5％重鉻酸鉀(K2CrO7)水溶液中制備最終懸浮物。然后將囊合子轉到孢子形成容器中。通過在27±3℃下、不超過72小時的時間里用空氣噴射懸浮液促進形成孢子。在形成孢子后將所述囊合子于5±3℃下放置直至產生最終產物。
在有利的實施方案中，對可接受的收獲的種子培養(yǎng)物具體要求如下。首先，要確定孢子形成了的囊合子對全部囊合子的比例。只有達到或超過＞40％孢子形成的收獲物才被認為是可接受的。第二，各囊合子收獲物的大小、形狀和外表必需具有該品種預期產生的特征。
根據9 CFR 114.15中的方式處理產品中沒有使用的棄物。
產物制備。使用大量收獲流質組裝系列或亞系列終產物。如上面所描述，因為囊合子是早熟的所以所有囊合子都是減毒的。所述囊合子懸浮在由含有不超過30.0mcg慶大霉素的0.01M磷酸緩沖鹽溶液組成的防腐劑中。所述產物經標準化產生至少如表2中顯示的各品種的孢子形成了的囊合子的最終數目。
表2孢子形成了的囊合子的標準化劑量
如下組裝系列產物。在四個艾美球蟲品種中，將各品種的大體積懸浮塊從5±3℃的貯存狀態(tài)下取出并且允許在環(huán)境室溫下攪拌回暖。將足夠量的各個塊在無菌條件下取出并組合起來以產生不少于上面表2中所列每劑的囊合子數，通過基于對各個品種的大體積懸浮物計數的計算確定其囊合子數。如果需要，將各艾美球蟲品種的多個塊組合到一起以提供所需要數量的孢子形成了的囊合子。用充分滅菌、含有不超過30mcg/ml慶大霉素的0.01M的磷酸緩沖鹽溶液生產每瓶2ml的劑量展示為2,000的、每瓶5ml的劑量展示為5,000的藥劑和每瓶10ml的劑量展示為10,000的藥劑。在持續(xù)攪拌下維持大體積系列。
表3系列體積的例子(基于10,000劑產品的10,000,000劑量批次)
平均10,000劑量的系列變化范圍為從20L到40L。裝填體積為每1000劑裝1.0ml。所述疫苗瓶子是滅菌的硼硅酸鹽玻璃小瓶。
裝填和密封最終容器的方法和技術如下。用半自動或自動分配器將所述疫苗在無菌條件下裝填到疫苗小瓶中。機械或人工地將塞子插入瓶中。放上鋁封條并卷曲以封口。
各劑量含有不少于表2中所列的孢子形成了的囊合子劑量，根據對大體積的計數計算其劑量。將一系列數分配給在一次操作中分批處理的和提交的各品種的定量。
檢測。使用在9 CFR 113.27(e)中所述的檢測方法對各系列的純度進行檢測。在二者中任何一個孵育條件下平均點數應該不超過每劑1個菌落。如果在起始檢測中，在二者中任何一個孵育條件下所述平均點數超過每劑1個菌落，任選地用20個未打開的終容器進行一次重新檢測。如果在最終的檢測中，在二者中任何一個孵育條件下所述平均點數超過每劑1個菌落，所述系列是令人不滿意的。
沙門氏菌顯示既能被次氯酸鈉又能被重鉻酸鉀有效殺死，于是，不再進行額外的檢測。支原體顯示能被次氯酸鈉有效地殺死，于是不再進行額外的檢測。
根據9 CFR 113.37對各系列的外源病原體進行檢測。
為檢測所述疫苗的安全性，使用10劑疫苗通過噴霧接種對每組至少25只1天大小、無特定病原體的雞進行接種。每天對雞進行觀察持續(xù)21天。檢查在此期間死亡的雞并確定死亡原因。如果至少有20雞在觀察期間沒有存活下來，所述檢測是無結論的。如果任何疾病和死亡直接由疫苗導致，所述系列是令人不滿意的。所述疫苗的結腸損傷特性被認為是正常的，并且在安全評估中不予考慮。如果少于20只雞在觀察期中活下來并且無所述疫苗造成的死亡或嚴重損傷，任選地再重復一次所述檢測。如果不能重復所述檢測，表明所述系列是不令人滿意的。
將對由各批新的生產種子產生的終產物的第一個系列的潛能進行檢測。所述產物將在1到14天大小的SPF或烤子雞中進行檢測。評價從生產種子獲得的后繼系列的效能，使用上述的配制前的計數和從接種的禽類回收的囊合子。使用不超過70只雞。用一劑野生疫苗對不超過35只雞進行經口接種。在初次接種后26到30天對所有的雞進行單獨鑒定和稱重記錄。用1.0ml如表4中顯示的的各攻擊劑量通過口部對來自下列各組的不超過10只接種的雞和10只對照的雞進行攻擊。
表4攻擊劑量
也可以根據致病性選擇攻擊劑量，因為選擇水平給出至少為2的最低分值。
攻擊后6天，對表4中各組的接種雞和對照雞進行宰殺、稱重和檢查腸和盲腸并對損傷打分。如表5中所顯示，根據Johnson和Reid在Experimental Parisitology，Vol.28，p30-36，1970中所描述的球蟲病打分系統(tǒng)進行打分，引用其公開的全文作為參考。
表5損傷分值
后預備步驟。所述疫苗以多劑量銷售，含每瓶2000劑量、每瓶5000劑量、每瓶10,000劑量或每瓶20,000劑量。根據9 CFR 113.3收集、貯存和提交代表性樣品。從開始效力檢測的日期到所述產物到期日期不超過13個月并根據9 CFR 114.13確定。
針對各動物品種給藥的用途、劑量和途徑如下。本產品用于對1天大小或更大的健康雞進行接種，幫助預防由球蟲病引起的疾病。通過粗略的水噴霧對每只雞施以1劑的劑量，每100只雞20ml。
實施例2含有禽類球蟲減毒株的實驗疫苗與商用活球蟲病疫苗和鹽霉素、用于商業(yè)禽類的抗球蟲病藥物的效用比較。
本實施例的目的是確定與USDA證明是活囊合子的疫苗(Coccivac-B)相比減毒艾美球蟲囊合子疫苗的效力，該效力保護烤子雞免受致死艾美球蟲品種的攻擊，并且比較減毒疫苗與傳統(tǒng)抗球蟲病藥劑鹽霉素的用途。
所述目的變量如下。主要變量是腸損傷分值。當與未免疫的受攻擊的對照禽類相比，可接受的標準是更低的攻擊后腸球蟲病損傷分值。第二個變量是(1)在7周生長階段期間體重的增加和飼料轉化以及(2)死亡率?？山邮艿臉藴拾ㄏ啾扔谟肅occivacB免疫的或使用抗球蟲病藥物的禽類，在免疫的禽類中相同的或更高的體重增加和飼料轉化并且相比于未免疫的對照禽類、CoccivacB免疫的禽類和抗球蟲病藥物處理的禽類，在免疫的禽類中較低的死亡率。
材料。表6描述之疫苗。
表6疫苗
表7致死/攻擊生物體
表8動物
對動物實行同樣的管理并考慮它們的舒適安寧。遵循所有適宜的規(guī)則管理動物。
實驗設計。實驗設計如下。
表9實驗處理組
*每100只雞給予20ml。
時間線如下。第0天，按圍欄給雞稱重。如表9中所描述對第1組和第2組中的禽類進行接種，每種疫苗通過食物療法免疫1300只禽類并將其分配到2個圍欄，每個圍欄占據各半間屋。第三組中的禽類開始用鹽霉素免疫(60g/噸)，所述禽類按照第1組和第2組中所描述的方法分組。圍欄上鎖。另外的孵化的雞作為未免疫的雞保留在鐵絲籠里。
第21天，將所有禽類的飼料從起始飼料換為生長飼料。在第3組中繼續(xù)使用鹽霉素。
在第28天，將受攻擊的禽類移到鐵絲籠子內。在被攻擊的第三組禽類中停用鹽霉素。將鳥和飼料稱重。從來自大籠的各組垃圾中收集新鮮排泄物樣品，每個圍欄20個樣品。按品種對囊合子定量。
第29天，用表7中描述的囊合子數量對籠中的鳥進行攻擊。
第35天，終止攻擊禽類，對損傷打分，并稱量增加的體重。
第42天，將所有組都換成未加藥的終止飼料并且稱量反饋。
第49天，對所有禽類和飼料稱重并結束實驗。
實驗方法。
疫苗/藥物。在半個房間中重復確定為表9中1到3組的三個禽類處理，每個屋3個圍欄，每個圍欄650只禽類，每個處理共1300只禽類。如表9中描述的對1到3組中禽類進行接種疫苗。另外的處理組(4)分開地供養(yǎng)在干凈的籠內作為未接種、未處理對照，只在攻擊測試中使用。
給處理組1、2和4提供未加藥的飼料。給處理組3從第1天開始一直到第42天提供鹽霉素(60克/噸)。在移居到攻擊籠后，給要攻擊的第3組禽類提供未加藥的飼料。起始飼料一直提供到第21天，生長飼料提供到第42天而終止飼料提供到第49天。記錄配給的飼料，并且任何剩下未消費的飼料在更換飼料和終止供給時回稱重量。
觀察。在第0天和第28天將禽類按圍欄稱重，而在第49天按圍欄和性別稱重。每天2次收集死亡禽類并且進行驗尸以確定死亡原因。于第28天收集排泄物樣品以觀察活性囊合子并按品種定量。
攻擊。在第28天，從各圍欄取出10只雞一組的3個重復(每個處理總共60只)稱重并移至層架式雞籠中用艾美球蟲(對應于在疫苗中使用的品種)野生株系進行攻擊。在籠內給所有的禽類提供未加藥飼料。在第29天，攻擊1到4組的禽類然后在第35天停止。記錄損傷分值和體重。
在接種前通過從雞盒中隨機揀出動物將動物隨機地分配到各處理組中?？茖W家知道所述處理組，因為要在組之間一直保持嚴格的安全措施以防止交叉感染。
對有害事件進行一致用藥和管理。Coccivac接種的禽類在進入實驗14天后開始發(fā)病。診斷為壞死性腸炎。對應的致病因子鑒定為索氏梭菌芽孢桿菌(Clostridium sordelli)。實驗中所有禽類施用盤尼西林G以減少圍欄之間的感染及其影響并消除組間可歪曲球蟲病結果的任何處理上的差異。
數據分析。
測量標準。對于地面圍欄階段最主要的變量是第28天和第49天的活體重和第49天的飼料轉化率。對于攻擊階段，主要的變量是攻擊后6天的體重增加量，和也是在攻擊后六天的上部腸、中部腸和盲腸部分的損傷分值。
統(tǒng)計學分析。使用SAS、Cary、NC(8.2版本)進行所有的統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計學顯著性是基于本研究中接受檢驗的零假設二尾檢測法在p值為0.05或更低時給出。
腸部損傷分值。使用包含處理組和分批(block)因素的對數模型和/或包含處理組和分批(取決于數據的本質)因素的存活分析模型對攻擊后腸部球蟲損傷的發(fā)生率和嚴重度(按損傷分值分類)進行分析。
死亡率。如果涉及致死艾美球蟲品種攻擊的死亡發(fā)生，用包含處理組和分批因素的ANOVA(即方差分析)確定在各處理組總體死亡率平均值(不箮發(fā)生的日期)之間是否存在差異。
體重增量和飼料轉化地面圍欄階段。在處理組內，進行成對的t檢驗(按分批和作為整個組，不考慮分批效應)以確定在各處理組內在活體重平均值上是否存在顯著差異。成對比較包括第0天對第28天體重(攻擊前)和第28天對第49天體重(攻擊后)。
進行成對t檢驗(按分批和作為整個組，不考慮分批效應)以確定在各處理組內飼料轉化平均值上是否存在顯著差異。成對比較包括第28天對第49天飼料轉化重量(攻擊后)和第42天對第49天飼料轉化重量(未加藥的終止飼料的效應)。
在處理組之間，根據所有天數記錄的體重，將重復測量的包含有處理組、天數、分批和組與天數相互作用的因素的ANOVA用于確定在組之間的活體生重平均值上是否存在顯著差異。
攻擊階段。在處理組內，進行成對的t檢驗(按分批和作為整個組，不考慮分批效應)以確定在各處理組內在活體重平均值上是否存在顯著差異。成對比較包括第28天對第35天體重(攻擊后第6天)。
在處理組之間，利用對地面圍欄階段處理組之間分析的結果對攻擊后處理組之間活體重平均值進行分析，所述分析集中在第28天和第3 5天的比較。
結果。
表10第28天總結
*分組的顯著統(tǒng)計學差異。
表11第49天總結
表12.攻擊結果
每個處理攻擊60只禽類。
*表示分組的統(tǒng)計學差異a、b、c和d是Duncan分離平均值。(Duncan檢驗是分離平均值的統(tǒng)計學hoc檢驗)。
1是總體損傷分值2是平均總體損傷分值討論。對于實驗疫苗和Coccivac來說，堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲和和緩艾美球蟲的攻擊造成的損傷分值沒有顯著差異。與實驗株系相比，對于禽艾美球蟲攻擊，Coccivac確實具有更低的損傷分值。
重要的是要注意到Coccivac接種的禽類開始感染索氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium sordelli)。在野外梭菌屬疾病一直是和球蟲病感染聯(lián)系在一起的。甚至所述感染會傳播到其它處理中，Coccivac接種的禽類受到的影響最大，顯示有11.77％的死亡率。
結論。所述實驗艾美球蟲株系在致死攻擊面前顯示出有效性。與Coccivac和鹽霉素處理的禽類相比，用實驗株系接種的禽類在第49天時具有更好的以飼料轉化率定義的表現(xiàn)，所述表現(xiàn)對家禽生產者來說對應著經濟上的有利方面。
***由于已經如此詳細地描述了本發(fā)明有利的實施方案，因此應該理解本發(fā)明不限于上面描述中所列的具體細節(jié)，正如其許多明顯的改變可能沒有背離本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.免疫原性或疫苗組合物，所述組合物基本上由從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系分離出來的孢子形成了的囊合子的混合物構成。
2.權利要求1的組合物，其中所述混合物由約500個堆型艾美球蟲的囊合子、約50到約100個巨型艾美球蟲的囊合子、約500個和緩艾美球蟲的囊合子和約100個到約250個禽艾美球蟲的囊合子組合而成。
3.權利要求1的組合物，其中所述混合物由約500個堆型艾美球蟲的囊合子、約100個巨型艾美球蟲的囊合子、約500個和緩艾美球蟲的囊合子和約100個禽艾美球蟲的囊合子組合而成。
4.免疫原性或疫苗組合物，所述組合物包含從堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲的早熟株系分離出來的孢子形成了的囊合子組成的混合物，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是10∶1到2∶10∶2到5。
5.權利要求4的組合物，其中堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約是5∶1∶5∶1。
6.引起免疫應答的方法，所述方法包括施用有效劑量的權利要求1的免疫原性或疫苗組合物以誘導雞中的應答反應。
7.誘導免疫學的或保護性應答的方法，所述方法包括施用有效量的權利要求1的免疫原性或疫苗組合物以誘導雞中的應答反應。
8.引起免疫應答的方法，所述方法包括施用有效劑量的權利要求4的免疫原性或疫苗組合物以誘導雞中的應答反應。
9.誘導免疫學的或保護性應答的方法，所述方法包括施用有效量的權利要求4的免疫原性或疫苗組合物以誘導雞中的應答反應。
10.權利6或7的方法，其中有效劑量是約500個堆型艾美球蟲的囊合子、約50個到100個巨型艾美球蟲的囊合子、約500個和緩艾美球蟲的囊合子和約100個到約250個禽艾美球蟲的囊合子。
11.權利6或7的方法，其中有效劑量是約500個堆型艾美球蟲的囊合子、約100個巨型艾美球蟲的囊合子、約500個和緩艾美球蟲的囊合子和約100個禽艾美球蟲的囊合子。
12.權利要求8或9的方法，其中有效劑量是堆型艾美球蟲∶巨型艾美球蟲∶和緩艾美球蟲∶禽艾美球蟲的比例約為5∶1∶5∶1。
13.權利要求6到9中任一項的方法，其中有效劑量足以對抗約100,000個到500,000個堆型艾美球蟲囊合子、約10,000個到100,000個巨型艾美球蟲囊合子、約100,000個到500,000個和緩艾美球蟲囊合子或約10,000個到約100,000個禽艾美球蟲囊合子對動物的攻擊劑量。
14.權利要求13的方法，其中所述攻擊劑量為約200,000個堆型艾美球蟲囊合子、約20,000個到50,000個巨型艾美球蟲囊合子、約200,000個和緩艾美球蟲囊合子或約20,000個到約50,000個禽艾美球蟲囊合子。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于雞的球蟲病的疫苗，所述疫苗由四種減毒的艾美球蟲品種制備而來堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、和緩艾美球蟲和禽艾美球蟲。所述疫苗在激起對抗球蟲病的保護性免疫方面相似于或優(yōu)于其它抗球蟲病藥物。
文檔編號A61K39/35GK1735429SQ200380108552
公開日2006年2月15日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權日2002年12月9日
發(fā)明者L·R·麥克杜格爾德, A·L·富勒 申請人:佐治亞州大學研究基金會