專利名稱：通過微波照射處理生物體組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及再生醫(yī)療即進(jìn)行移植以代替不發(fā)揮正常功能的患者自身的器官或組織而恢復(fù)正常功能的醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，涉及一種通過從動(dòng)物來源的生物體組織中除去細(xì)胞成分或者通過典型地使用固定劑戊二醛固定組織，來制作移植用組織片的方法。
背景技術(shù)：
通過用戊二醛這樣的固定劑對(duì)生物體組織進(jìn)行化學(xué)處理，或者通過除去生物體組織中的細(xì)胞成分，而制作成移植用組織片，這被廣泛地應(yīng)用于臨床。例如，在心臟瓣膜置換術(shù)中，異種生物體瓣膜是指用戊二醛固定化豬的心臟瓣膜或牛的心臟瓣膜以降低免疫原性。這種異種生物體瓣膜在抗凝固性方面具有優(yōu)勢(shì)，但如果用于年輕人，只有大約5～10年的耐久性，通常適用于60歲以上的高齡人群。歐美從1985年開始，而日本國(guó)內(nèi)也從近幾年開始建立了通過冷凍保存的組織庫，由尸體提供的冷凍保存同種瓣膜正用于臨床。這種同種瓣膜與機(jī)械瓣膜相比具有抗血栓性，與異種生物體瓣膜相比具有耐久性，并且在抗感染性方面也具有優(yōu)勢(shì)。然而，提供數(shù)量絕對(duì)不夠是個(gè)大問題。另外，有報(bào)道稱在年輕人當(dāng)中，有在移植后比較早期出現(xiàn)功能不全的病例，提示與免疫反應(yīng)強(qiáng)烈相關(guān)。對(duì)年輕人有效的Ross手術(shù)的特點(diǎn)是，把自身的肺動(dòng)脈瓣置換移植到主動(dòng)脈瓣的位置上，再用冷凍保存的同種瓣膜重新構(gòu)建缺損的肺動(dòng)脈瓣，而移植到主動(dòng)脈瓣位置上的自體的肺動(dòng)脈瓣會(huì)隨著患者的成長(zhǎng)逐漸增大。與此相比，更不必說機(jī)械瓣膜或異種生物體瓣膜，就連冷凍保存的同種瓣膜也沒有成長(zhǎng)性，所以，很多兒科患者都需要重新移植。最近，為了解決這些問題，出現(xiàn)了關(guān)于通過除去同種瓣膜中來源于供體的細(xì)胞以減弱抗原性而降低免疫反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性、從而提高瓣膜的耐久性和自體化的研究的報(bào)道。美國(guó)CryoLife公司發(fā)表了通過名為SynerGraft的藥液處理的細(xì)胞除去方法，報(bào)道了在移植后幾個(gè)月內(nèi)自體細(xì)胞向組織內(nèi)浸潤(rùn)而自體組織化。另外，德國(guó)的Hannover醫(yī)科大學(xué)的Haverich等的小組將作為表面活性劑的Triton X-100或作為蛋白質(zhì)分解酶的胰蛋白酶(tripsin)溶液用于除去細(xì)胞。然而，只在僅僅利用過去的表面活性劑或者藥液的清洗工序中，除去組織片內(nèi)部的細(xì)胞成分以及細(xì)菌或病毒是通過藥液從表面的擴(kuò)散或滲透進(jìn)行的，所以不夠充分。另外，因?yàn)榫哂羞@樣的限制，在對(duì)大塊組織片的處理中，很難完全地除去細(xì)胞或細(xì)菌、病毒。另外，當(dāng)用化學(xué)方法處理時(shí)，為了達(dá)到充分的效果，有必要提高處理的程度，這樣就會(huì)產(chǎn)生埋入后的鈣化或處理試劑的除去等問題。而且，正如在硬膜移植的BSE和CJD的感染中所知道的那樣，確保移植組織的安全性是極其重要的，可是用現(xiàn)在的化學(xué)藥液處理并不能保證使組織內(nèi)的病毒完全失活。另外，由于處理過程中的污染，來自移植用組織的感染事故也經(jīng)常發(fā)生。
另外，關(guān)于已除去細(xì)胞成分的異種或同種移植用組織片，在其中播種患者自身的細(xì)胞，使自家細(xì)胞在細(xì)胞片內(nèi)增殖，從而作為混合再生組織用于移植。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改善如上所述的以往技術(shù)的問題點(diǎn)。即，首先第一是實(shí)現(xiàn)用藥液處理不能實(shí)現(xiàn)的除去大塊組織內(nèi)部的細(xì)胞成分以及細(xì)胞、病毒，第二是在不破壞處理組織的生物體力學(xué)特性的情況下進(jìn)行處理，第三是簡(jiǎn)便而短時(shí)間地進(jìn)行處理。
本發(fā)明提供一種生物體組織的處理方法，其特征在于，針對(duì)浸漬于處理液中的動(dòng)物來源的生物體組織，在維持0℃～40℃的溫度的同時(shí)照射微波。


圖1是表示用于實(shí)施本發(fā)明的裝置的一個(gè)例子的概略圖。
圖2是表示豬心臟瓣膜組織的組織斷面照片。左圖表示提供以往方法的處理，右圖表示通過合用了微波照射的本發(fā)明的處理。在以往的處理中，在組織深部(照片的左下方)內(nèi)可見細(xì)胞核的殘留。
圖3是表示從用Triton X-100已除去細(xì)胞的豬心臟瓣膜的Triton X-100的除去效率的曲線圖。在通過微波照射的本發(fā)明的方法中，用以往方法的大約10分之1的時(shí)間除去Triton X-100是可能的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于除去生物體組織中的細(xì)胞成分而制作移植用組織片的處理。這種情況下，作為處理液，可以使用含有水、高滲溶液、低滲溶液、表面活性劑溶液、酶溶液、液體培養(yǎng)基(liquid medium)或它們當(dāng)中的任一種和小比例的有機(jī)溶劑的混合液。
當(dāng)將本發(fā)明的方法應(yīng)用于固定組織制作移植用組織片的處理時(shí)，使用戊二醛這樣的化學(xué)固定劑的溶液。
即便在任何處理中，在不照射微波的以往的方法當(dāng)中，處理液通過從樣品表面的擴(kuò)散和滲透而遍布全體，所以需要長(zhǎng)時(shí)間的處理，其間也有污染樣品等危險(xiǎn)。微波照射能夠?qū)⑻幚硪簼B透到達(dá)組織深部所需的時(shí)間縮短為以前的約10分之1，所以能夠大幅度地提高處理效率，能夠防止其間的樣品污染等。另外，當(dāng)除去組織中的細(xì)胞制作移植片時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)除去組織深部的細(xì)胞核成為可能，這在以前的方法中是不可能或是難以完成的。
在病理組織學(xué)領(lǐng)域中，微波處理應(yīng)用于組織固定、骨骼的脫鈣、脫脂、免疫組織化學(xué)等。但是，沒有將微波照射用于制作移植用組織片的先例。在本發(fā)明的新的生物來源組織處理方法中，將處理樣品放入到透過微波的玻璃或塑料制的樣品容器內(nèi)；在除去細(xì)胞的處理中，注入表面活性劑或低滲溶液、高滲溶液等處理液并將樣品完全浸入其中；在細(xì)胞固定處理中，注入戊二醛等化學(xué)固定液并將樣品完全浸入其中。將處理樣品的溫度控制在0～40℃內(nèi)，同時(shí)照射微波，一般在照射微波時(shí)樣品溫度上升，所以為了長(zhǎng)時(shí)間照射微波，必須冷卻樣品。對(duì)此，使用例如市售的微波迅速樣品處理裝置是有效的。將該裝置改造為使經(jīng)微波爐外部的冷卻裝置冷卻的防凍溶液在用于照射微波的微波爐內(nèi)的樣品容器周圍循環(huán)，從而使用。在樣品容器內(nèi)設(shè)置溫度傳感器并間歇性地控制冷卻裝置和微波照射時(shí)間，由此可以在微波照射時(shí)將樣品溫度控制為0～40℃。與病理組織學(xué)領(lǐng)域不同，在移植用生物體組織的情況下，為了不改變生物體力學(xué)特性，需要防止構(gòu)成基質(zhì)的變性，在微波照射時(shí)，必須避免溫度在冰點(diǎn)以下或40℃以上。
圖1是表示用于實(shí)施本發(fā)明的裝置的一個(gè)例子的概略圖。裝置由具備磁控管(magnetron)12的微波爐1構(gòu)成。在爐內(nèi)部設(shè)置有容納了冷卻用防凍溶液21的冷卻槽2，在冷卻槽2的大致中央位置放置樣品容器3。樣品容器3內(nèi)裝滿了處理液，在其中浸漬樣品即想要處理的生物體組織4。冷卻槽2和樣品容器3是用玻璃或塑料如聚丙烯、聚苯乙烯等透過微波的材料制成。如前所述，微波的照射是依照處理液31對(duì)樣品4進(jìn)行加熱，使樣品的構(gòu)成基質(zhì)不可逆地發(fā)生熱變性，所以有必要使冷卻槽2內(nèi)的冷卻液31通過導(dǎo)管5、6在設(shè)置于爐1外部的冷卻裝置7和冷卻槽2之間循環(huán)。因此，在冷卻槽21變暖的冷卻液21通過導(dǎo)管6返還到冷卻裝置的熱交換器72，再次冷卻后通過導(dǎo)管5并借助泵71回到冷卻槽21。用傳感器11感知槽21內(nèi)的冷卻液的溫度，為了將該溫度維持在0℃～40℃范圍內(nèi)的恒定溫度例如如20℃，借助控制器13間歇性且自動(dòng)地控制磁控管12的工作時(shí)間。為了均勻地照射微波，也可設(shè)置攪拌扇等其它機(jī)構(gòu)。
本發(fā)明的方法也可以與用于除去組織中的細(xì)胞成分的已知方法組合使用。例如在使用表面活性劑或酶進(jìn)行除去組織內(nèi)的細(xì)胞的前處理之后，可以在微波照射下進(jìn)行除去殘留在組織片中的藥液的清洗。
本發(fā)明的方法的應(yīng)用領(lǐng)域或用途1)移植用動(dòng)物來源的軟組織例如從來自于腦死亡或心臟死亡供體的移植用軟組織處理，或者從來自于豬、牛等異種動(dòng)物的移植用軟組織處理除去細(xì)胞成分的清洗處理工序的效率能夠得到飛躍性的提高。另外，還能夠達(dá)到大幅度減少抗原性原因物質(zhì)的目的。
2)移植用動(dòng)物來源的硬組織例如與上述一樣，能夠進(jìn)行骨、軟骨、牙齒等硬組織處理。
3)醫(yī)療用生物組織的處理例如能夠用于對(duì)動(dòng)物和植物來源的組織中含有細(xì)胞的組織進(jìn)行的細(xì)胞破壞處理。
實(shí)施例1.從食用豬養(yǎng)殖場(chǎng)買進(jìn)豬心臟，在4℃的條件下搬運(yùn)。摘出心臟時(shí)的熱缺血時(shí)間為20分鐘以內(nèi)。摘出肺動(dòng)脈瓣、血管，用Hank氏液清洗。將樣品浸漬于作為表面活性劑的Triton X-100的1％水溶液中，用圖1中以概略圖表示的裝置在20℃下間歇性地照射48小時(shí)微波，除去供體細(xì)胞。在處理后，用磷酸緩沖生理鹽水清洗除去。借助HE染色對(duì)處理標(biāo)本的組織斷面進(jìn)行光鏡觀察，由此進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。其結(jié)果是在豬肺動(dòng)脈瓣膜葉組織中，當(dāng)如圖2所示合用微波照射時(shí)，與不合用時(shí)的情況相比，更能除去組織深部的細(xì)胞。
2.同樣將從食用豬養(yǎng)殖場(chǎng)買進(jìn)的豬心臟瓣膜在作為表面活性劑的Triton X-100的1％水溶液中浸漬24小時(shí)，由此除去細(xì)胞。然后浸漬于磷酸緩沖生理鹽水中，在10℃下間歇性地照射48小時(shí)微波進(jìn)行處理。如圖3所示，其結(jié)果是為了除去在不照射微波的以往的方法中顯示細(xì)胞毒性的Triton X-100溶液，需要3周左右，而通過照射微波可以將處理時(shí)間大幅度地縮短為幾天。
權(quán)利要求
1.一種生物體組織的處理方法，其特征在于，針對(duì)浸漬于處理液中的動(dòng)物來源的生物體組織，在維持其溫度為0℃～40℃的同時(shí)對(duì)其照射微波。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述處理是用于除去生物體組織中的細(xì)胞成分的處理，處理液是水、高滲溶液、低滲溶液、表面活性劑溶液、酶液、液體培養(yǎng)基或它們當(dāng)中的任一種與小比例的有機(jī)溶劑的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述處理是用于固定生物體組織的化學(xué)處理，處理液是含有戊二醛的藥液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述微波照射是在頻率2450MHz下，作為凈照射時(shí)間進(jìn)行照射1小時(shí)～1周。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，處理的生物體組織是含有血管、心臟瓣膜、心膜、角膜、羊膜、和硬膜的軟組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，處理的生物體組織是含有骨、軟骨、和牙齒的軟或硬組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，處理的生物體組織是含有心臟、腎臟、肝臟、胰臟、和腦的臟器或其一部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包含在微波照射后使用新鮮的清洗液從組織中清洗除去已被破壞的供體細(xì)胞的工序。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，處理的生物體組織接受使供體細(xì)胞的除去變得容易的前處理。
全文摘要
本發(fā)明提供一種有效地完成從來源于動(dòng)物的生物體組織除去或固定化供體細(xì)胞的處理的方法，其包含針對(duì)浸漬于處理液中的動(dòng)物來源的生物體組織，在維持其溫度為0℃～40℃的同時(shí)對(duì)其照射微波。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1723047SQ200380105579
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者藤里俊哉, 岸田晶夫, 船本誠(chéng)一, 中谷武嗣, 北村惣一郎 申請(qǐng)人:國(guó)立循環(huán)器病中心總長(zhǎng)代表的日本國(guó)