專利名稱：治療大量失血患者的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用血紅蛋白溶液治療需要血液或其它氧載體的患者。更具體來講，本發(fā)明涉及對(duì)遭受大量失血的患者施用一種血紅蛋白溶液。
相關(guān)領(lǐng)域的說明下面的說明涉及大量由括號(hào)中數(shù)字所示的參考文獻(xiàn)。對(duì)參考文獻(xiàn)完整的引用可在權(quán)利要求書之前標(biāo)題為“參考文獻(xiàn)”的部分找到。
從外傷和外科手術(shù)中的急性失血(acute blood loss)中復(fù)蘇的重點(diǎn)在于總血容積的恢復(fù)和保持足夠的攜氧能力，以避免組織供氧不足。(1，2，3，4)容量補(bǔ)充不足導(dǎo)致血壓降低和最終的低血容量性休克。紅細(xì)胞補(bǔ)充不足可能導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血、不可逆性缺血(irreversible ischemia)和死亡。(5，6)深度貧血的生理后果已被很好的理解。出血但其它方面健康的外科患者，其心血管代償機(jī)能在紅細(xì)胞(RBC)血紅蛋白濃度降到低于5g/dL之前應(yīng)是足夠的。(26)當(dāng)繼續(xù)出血且RBC血紅蛋白濃度進(jìn)一步降低時(shí)，代償反應(yīng)開始減弱。(7，8，29，31)當(dāng)RBC血紅蛋白濃度降到3.5g/dL以下時(shí)，心臟代償功能變得不足，(32，33，34，35)當(dāng)RBC血紅蛋白濃度降到3g/dL以下時(shí)，報(bào)道的死亡率達(dá)到50-95％。(9，10，11，12，13，14，29)現(xiàn)有復(fù)蘇方法包括最初用鹽溶液的不含血(asanguineous)(非血)容量補(bǔ)充，接著在相容血存在并供應(yīng)充足時(shí)的紅細(xì)胞輸入。(1，2)現(xiàn)有治療方法的目的是恢復(fù)充足的血容量從而保持平均動(dòng)脈壓力高于60mmHg，并且補(bǔ)充充足的紅細(xì)胞從而根據(jù)美國麻醉學(xué)家學(xué)會(huì)(theAmerican Society of Anesthesiologists，ASA)保持循環(huán)的血紅蛋白水平高于6g/dL，(7)或根據(jù)國家健康協(xié)會(huì)(the National Institutes of Health，NIH)的共識(shí)會(huì)議(Consensus Conference)，處于7-10g/dL之間。(8)然而，有時(shí)紅細(xì)胞暫時(shí)不能得到或供應(yīng)不足，或由于不相容性或宗教異議而不能使用。這可導(dǎo)致緊急的危及生命的情況，當(dāng)血紅蛋白水平≤3g/dL時(shí)，報(bào)道的死亡率達(dá)到50-95％。(9，10，1，12，13，14)在這些情況下所需的是全血的補(bǔ)充品，例如恢復(fù)容量和攜氧能力的溶液。此外，考慮到血液補(bǔ)充治療伴隨的感染或其它毒效的危險(xiǎn)，患者即使在可用全血時(shí)，也可能選擇氧載體溶液來恢復(fù)容量和攜氧能力。
在本發(fā)明之前，使用聚合血紅蛋白溶液作為大量出血患者的治療方法的益處還未被研究。雖然美國專利第6,498,141號(hào)提出可給予患者多達(dá)5L的血紅蛋白溶液，但未建議使用聚合血紅蛋白溶液治療遭受大量失血的患者，包括那些總Hb低于7g/dL的患者。據(jù)報(bào)道幾乎所有Hb水平低于5g/dL且拒絕輸血的患者，在未使用例如低血壓麻醉、低體溫、肌肉麻痹和鎮(zhèn)靜的非常手段的情況下死亡。(29)然而，盡管需要非血療法治療大量出血，使用血液替代品還未被提出，例如攜氧的聚合血紅蛋白溶液。
所需的是另外一種的氧載體，其能夠大量施用并且提供及時(shí)的生命維持治療直到恢復(fù)了充足的紅細(xì)胞血紅蛋白水平(RBC血紅蛋白濃度)。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物由于失血而遭受危及生命的紅細(xì)胞血紅蛋白(RBC Hb)水平的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種聚合血紅蛋白溶液。
另一方面，本發(fā)明提供了一種使遭受大量失血的患者避免貧血、不可逆性缺血或低血容量性休克的方法。該方法包括對(duì)患者施用足夠維持總Hb高于5.0g/l并且動(dòng)脈壓力高于60mmHg所需體積的聚合血紅蛋白溶液。
另一方面，本發(fā)明提供了一種使遭受大量失血的患者保持平均循環(huán)Hb水平高于5.0g/dL的方法。該方法包括對(duì)患者施用至少該患者一個(gè)血容積的血紅蛋白溶液。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種治療由于大量失血而血紅蛋白濃度低于大約7g/dL的人的方法。該方法包括對(duì)人施用一種聚合血紅蛋白溶液。
另一方面，本發(fā)明提供了一種維持遭受大量失血的人生命的方法。該方法包括通過對(duì)人施用一種聚合血紅蛋白溶液來避免血量減少性休克和血壓的進(jìn)一步降低。
在本發(fā)明的各個(gè)方面中，該血紅蛋白溶液可以是一種非細(xì)胞溶液，包括基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，這種溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。該血紅蛋白溶液可以以至少5L或至少一個(gè)患者血容積的量施用。血紅蛋白溶液的施用可以保持平均循環(huán)血紅蛋白水平高于5.0g/dL并且動(dòng)脈壓力高于60mmHg。血紅蛋白溶液可以以至少每分鐘2單位的速度施用并且可以避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
此外，該聚合血紅蛋白可具有的分子量分布是(d)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(e)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(f)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
附圖簡要說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案參考以下


，其中圖1是血漿血紅蛋白平均(±SD)濃度相對(duì)于聚合血紅蛋白溶液劑量的圖示。一個(gè)單位的聚合血紅蛋白溶液是包含50g聚合血紅蛋白的0.5L溶液。
圖2是總血紅蛋白平均(±SD)濃度(實(shí)線)和RBC血紅蛋白濃度(虛線)相對(duì)于聚合血紅蛋白溶液劑量的圖示。陰影部分代表根據(jù)NIH共識(shí)聲明(Consensus Statement)的7-10g/dL指標(biāo)。點(diǎn)線代表危及生命水平的3g/dL。一個(gè)單位的聚合血紅蛋白溶液是包含50g聚合血紅蛋白的0.5L溶液。
圖3是40個(gè)最低RBC血紅蛋白溶液≤3g/dL的個(gè)體患者數(shù)據(jù)的圖示，將總血紅蛋白濃度以RBC血紅蛋白濃度和血漿血紅蛋白濃度之和表示。直線代表危及生命的3g/dL水平。
圖4是展示了接受PolyHeme的患者中的死亡率和歷史對(duì)照中的死亡率的邏輯回歸。當(dāng)RBC血紅蛋白濃度降低時(shí)兩組的死亡率都增加。曲線在RBC血紅蛋白濃度約為7.0g/dL時(shí)開始分離，并且在RBC血紅蛋白濃度低于約5.0g/dL時(shí)出現(xiàn)顯著差異(p＜0.05)。
具體實(shí)施例方式
在進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明之前，將定義一些術(shù)語。如本文所使用的，單數(shù)形式冠詞“一個(gè)(種)(a，an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)的對(duì)象，除非上下文另有明確的指示。
如本文所使用的，術(shù)語“交聯(lián)的(cross-linked)”意指為了改變分子的形狀、尺寸、功能或物理性質(zhì)而在分子上或分子內(nèi)、或分子之間以化學(xué)方法放置的分子“橋”。交聯(lián)的分子可以是聚合或非聚合的，即交聯(lián)的分子可以是四聚的。
如本文所使用的，術(shù)語“四聚體(tetramer)”指具有分子量約為64KDa的血紅蛋白分子；即，該術(shù)語指天然的及分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白分子。
如本文所使用的，術(shù)語“基本無四聚體(essentially tetramer free)”表示關(guān)于四聚體污染的純度水平，處于該純度水平下四聚體給予哺乳動(dòng)物某種生物反應(yīng)不再存在。一個(gè)主要指標(biāo)是當(dāng)注入藥學(xué)有效量時(shí)腎功能不改變，即，具有的純度水平約為99％或更高(少于約1％的四聚體存在)。本發(fā)明的方法制備的優(yōu)選的產(chǎn)品含有基于總血紅蛋白(THb)的重量不多于約0.8％的四聚體。也就是說，根據(jù)本發(fā)明的基本無四聚體的產(chǎn)品含有不超過生理上可接受量的非聚合的血紅蛋白四聚體。本發(fā)明的產(chǎn)品特別優(yōu)選含有少于約0.5％四聚體；最優(yōu)選含有約0.3-0.4％四聚體。發(fā)現(xiàn)此含量的四聚體是生理上可接受的。
如本文所使用的，術(shù)語“超純化的產(chǎn)品(ultrapurified product)”或“純化的產(chǎn)品(purified product)”具有與術(shù)語“基本無四聚體(essentiallytetramer-free)”相同的意義。
如本文所使用的，％總血紅蛋白(THb)定義為血紅蛋白的克數(shù)/100mL溶液。
如本文所使用的，術(shù)語“聚合溶液(polymerizing solution)”意指在生物化學(xué)合適的載體中含有例如戊二醛、亞氨酸酯、琥珀酰水楊酸或其它的“交聯(lián)的(cross-linking)”或聚合的試劑的溶液。
如本文所使用的，術(shù)語聚合的(polymerized)意指通過在分子或四聚的亞單位之間放置分子橋使所得聚合的分子相比于天然的或四聚的血紅蛋白具有增加的尺寸和重量。聚合的血紅蛋白不是四聚的血紅蛋白。
遭受大量失血的患者急需血液或其他替代的氧載體。已發(fā)現(xiàn)聚合血紅蛋白溶液能夠用于治療這種患者，代替提供非血溶液及其后的RBC注射液。在本發(fā)明的方法中，已發(fā)現(xiàn)高達(dá)至少20個(gè)單位(10L)，或約為患者兩個(gè)血容積的聚合血紅蛋白溶液能夠代替紅細(xì)胞，作為它們最初的攜氧補(bǔ)充品，施用于大量出血的患者。該方法可以在患者急速、大量出血并且具有危及生命的RBC血紅蛋白濃度水平時(shí)維持沒接受紅細(xì)胞的患者的生命。另外，根據(jù)本發(fā)明的聚合血紅蛋白可以與紅細(xì)胞一起施用。聚合血紅蛋白的施用可以幾乎同時(shí)，或完全先于或后于紅細(xì)胞的施用。
為了用于治療大量失血的患者，聚合血紅蛋白溶液優(yōu)選是攜氧能力恢復(fù)的、普遍相容的、快速可用且無疾病的液體。該溶液優(yōu)選能夠快速大量注入的，并且該溶液必須消除歷史上在未改進(jìn)的血紅蛋白中(16，17，18，19)和近期試驗(yàn)中改進(jìn)的血紅蛋白中(20，21，22，23)觀測(cè)到的毒效。這些毒效包括血管收縮和腎、胰腺、腸胃及心臟功能紊亂。小分子量四聚型血紅蛋白具有這些不可接受的有害效果。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，聚合血紅蛋白溶液具有表1所示的下列一般特性。
表1

1分光光度測(cè)定。
2通過滲壓計(jì)測(cè)定。
3通過離子特定電極測(cè)定。
4通過原子吸收測(cè)定。
5通過體積排斥-HPLC測(cè)定，聚合血紅蛋白重量％。
6通過HPTLC測(cè)定。
本發(fā)明可用的血紅蛋白溶液的一個(gè)實(shí)例是PolyHeme(Northfield實(shí)驗(yàn)室公司(Northfield Laboratories，Inc.)，伊云斯頓(Evanston)，伊利諾伊州(Illinois))。PolyHeme是無菌的、無熱原質(zhì)的、等滲壓的、和等膨脹壓的血紅蛋白溶液。該溶液與紅細(xì)胞相似地裝載和解除氧氣，這是任何氧載體的基本先決條件。(15，24，36，37)一個(gè)單位的該血紅蛋白溶液的一些性質(zhì)列于表2
表2PolyHeme的特性

P50＝50％血紅蛋白飽和度的氧壓PolyHeme的制備設(shè)計(jì)為避免血紅蛋白溶液相關(guān)的毒效，并且包括與戊二醛的聚合及其后純化去除所有未聚合的四聚體。早期經(jīng)驗(yàn)證明在緊急失血中注入6個(gè)單位(300g，3L)的PolyHeme是完全可以忍受的，并且避免了血紅蛋白溶液相關(guān)的毒效。(24，25)適合的血紅蛋白溶液制劑，例如PolyHeme，能夠通過實(shí)施例8所示制備。
一個(gè)單位的PolyHeme是含有50g血紅蛋白的500mL溶液(10g/dL)。這是相當(dāng)于1單位紅細(xì)胞注射液功能上傳遞的血紅蛋白的質(zhì)量。PolyHeme在2-8℃具有大于一年的保存期。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它血紅蛋白溶液包括來源于非人類血液的血紅蛋白溶液。在這些溶液能夠快速和大量注入，并且該溶液避免血紅蛋白溶液相關(guān)的普遍毒效的條件下，這些溶液能夠用于本發(fā)明的方法中。此外，此溶液應(yīng)與紅細(xì)胞相似地裝載和解除氧氣。
遭受危及生命的大量失血的患者一般被認(rèn)作是失去至少約一個(gè)血容積的60％，或一般約整個(gè)血容積的患者(70kg的成人的整個(gè)血容積約為5L)。體積將根據(jù)尺寸和其它因素而變化。如此大量的失血一般是外傷、大出血或外科手術(shù)的結(jié)果。遭受大量失血的患者可以接受血紅蛋白溶液代替紅細(xì)胞作為最初的攜氧補(bǔ)充。血紅蛋白溶液的快速施用可以通過輸液/輸血治療中的使用方法完成?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)遭受大量失血的患者可忍受聚合的血紅蛋白注射液以每分鐘兩個(gè)單位或更多單位的速度注入。
在紅細(xì)胞暫時(shí)不能得到或不能使用時(shí)，注入例如PolyHeme的血紅蛋白溶液，已被證明提高了在輸液之前具有的RBC血紅蛋白濃度低于約5g/dL的患者的存活率。在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中，患者可能接受高達(dá)20個(gè)單位(1000g，10L)例如PolyHemeTM的血紅蛋白溶液。由于一個(gè)普通人的平均血容積大大約為10個(gè)單位或5升，這代表大約兩個(gè)整個(gè)血容積置換的大量輸入液。
根據(jù)本發(fā)明，即使患者具有的RBC血紅蛋白濃度水平≤3g/mL，聚合血紅蛋白溶液的注入使總血紅蛋白濃度維持在治療上充足的范圍(＞5.0g/dL)內(nèi)。圖3顯示了在每個(gè)不同的具有極低RBC血紅蛋白濃度水平的個(gè)體中由PolyHeme提供的大量的血紅蛋白濃度儲(chǔ)備。
圖4顯示了沒接受治療的患者與接受PolyHeme的患者的死亡率的對(duì)比。盡管兩組中死亡率都隨著RBC血紅蛋白濃度的降低而增加，曲線在血紅蛋白濃度降到低于約7g/dL時(shí)開始分離并且在血紅蛋白濃度低于5g/dL時(shí)差異顯著，其中接受PolyHeme的患者的死亡率得到改善。這個(gè)觀察結(jié)果與血紅蛋白濃度為5g/dL時(shí)，生理觀察結(jié)果證明的充足心血管代償功能的一致。(26)血紅蛋白溶液可以通過允許直接、快速和同步的體積擴(kuò)展及無紅細(xì)胞注入的血紅蛋白替換簡單方便的早期治療緊急失血。此溶液能夠在嚴(yán)重失血可被手術(shù)控制和得到紅細(xì)胞輸液之前，避免危及生命的貧血發(fā)作和并發(fā)的死亡。在緊急失血時(shí)，使用血紅蛋白溶液通過維持足夠的總血紅蛋白濃度，提供維持生命的治療是適當(dāng)?shù)?，即便在之后的時(shí)期需要隨后的紅細(xì)胞輸液。使用血紅蛋白溶液相比于RBC的其它優(yōu)勢(shì)在于長期儲(chǔ)存的能力，施用時(shí)的安全性，和避免發(fā)生大量出血時(shí)的筆誤。
實(shí)施例實(shí)施例1-研究人群接受PolyHeme的患者的30日死亡率與由于宗教原因拒絕輸血的患者的歷史對(duì)照組作比較。符合條件的至少18歲的男和女患者基于以下包含的標(biāo)準(zhǔn)由于外傷和/或手術(shù)的急失血，預(yù)料到血紅蛋白濃度的緊急輸血的臨床決定，和/或由于失血的收縮壓＜100mmHg。排除的標(biāo)準(zhǔn)包括嚴(yán)重的頭部外傷(格拉斯哥昏迷標(biāo)度指數(shù)(Glasgow ComaScale score)≤8)、沒有急性失血、嚴(yán)重器官功能紊亂的征兆或癥狀、或懷孕。此研究由美國外科醫(yī)生學(xué)會(huì)(American College of Surgeons)認(rèn)證的一級(jí)外傷中心和三級(jí)護(hù)理推薦機(jī)構(gòu)實(shí)施。
文獻(xiàn)中有大量的報(bào)告說明了由于宗教異議拒絕血液的出血患者的匯總結(jié)果。某一個(gè)研究被選為比較的基礎(chǔ)是因?yàn)槠鋽?shù)據(jù)來源于單一調(diào)查人，因此，用于數(shù)據(jù)收集和分析的方法是符合標(biāo)準(zhǔn)的。(29)除了是血紅蛋白濃度≤8g/dL的患者最大組群(n＝300)，不同于其它報(bào)告中的匯總分類，運(yùn)用了真實(shí)個(gè)體患者血紅蛋白濃度測(cè)量。在治療和歷史對(duì)照組中共同的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和醫(yī)學(xué)特征是年齡、ASA身體狀況指數(shù)、心血管風(fēng)險(xiǎn)或歷史、入院日期、性別、種族和醫(yī)院地點(diǎn)。盡管兩組的這些參數(shù)都不同，支持性模型確定這些參數(shù)中的任何一個(gè)都不改變初始分析的結(jié)果。重要的共同點(diǎn)是在手術(shù)中不伴隨紅細(xì)胞補(bǔ)充的漸進(jìn)性失血。雖然近年重癥照顧取得了進(jìn)展，有關(guān)漸進(jìn)貧血的死亡率仍然很高，特別是在血紅蛋白濃度水平≤3g/dL時(shí)。
實(shí)施例2-方法按照晚期創(chuàng)傷生命支持(Advanced Trauma Life Support)和美國血庫協(xié)會(huì)(American Association of Blood Banks)關(guān)于血液和輸液治療的指導(dǎo)方針，所有接受PolyHeme的患者接受相同的治療，除了在做出進(jìn)行攜氧輸液治療的臨床決定時(shí)，輸入的是代替紅細(xì)胞的PolyHeme。所有患者接受注入1-2升晶體作為最初的容量補(bǔ)充。PolyHeme的適應(yīng)癥和注入速率依據(jù)患者的臨床狀況。隨著容許的劑量逐漸升高，患者適合接受高達(dá)1、3、6、10和最終20個(gè)單位(1000g，10L)的PolyHeme。如果PolyHeme達(dá)到最大劑量后患者仍需額外的攜氧治療，需要輸入紅細(xì)胞。大體積失血后凝血因子和血小板在需要時(shí)被施用。PolyHeme在手術(shù)前、手術(shù)中和手術(shù)后注入急救室、手術(shù)室和重病特別護(hù)理室中的清醒和麻醉患者。
實(shí)施例3-血紅蛋白測(cè)定如下列方程所示，注入PolyHeme之后，總血紅蛋白等于紅細(xì)胞與血漿中PolyHeme攜帶的血紅蛋白之和。
總血紅蛋白濃度＝RBC血紅蛋白濃度+聚血紅蛋白濃度分離血漿和紅細(xì)胞，確定每個(gè)組分中攜帶的血紅蛋白量?？傃t蛋白濃度和血漿血紅蛋白濃度使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置，分別在全血或血漿樣品中測(cè)定。RBC血紅蛋白濃度由通過細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置測(cè)定的血細(xì)胞比容(Hct)獲得，為Hct/3。因此可能記錄由于未進(jìn)行紅細(xì)胞補(bǔ)充治療的失血引起的RBC血紅蛋白濃度漸進(jìn)性降低，并且觀測(cè)血漿中PolyHeme對(duì)于維持總血紅蛋白濃度的效果。
實(shí)施例4-統(tǒng)計(jì)分析平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差敘述為連續(xù)變量，并且頻率和百分比敘述為名義變量(nominal variable)。
邏輯回歸用于分析死亡率。使用治療組的項(xiàng)(PolyHeme或歷史對(duì)照)、最低RBC血紅蛋白濃度和它們的相互關(guān)系被。RBC血紅蛋白濃度與治療組的相互關(guān)系被認(rèn)為是適合分析死亡率的，因?yàn)榛颊咴诰哂凶銐蚋叩难t蛋白濃度時(shí)沒有貧血的死亡危險(xiǎn)，并且在血紅蛋白濃度降低時(shí)可預(yù)料到死亡危險(xiǎn)增加。血紅蛋白濃度＞8g/dL的患者由于不面臨貧血的死亡危險(xiǎn)不包括在內(nèi)。
進(jìn)行支持性分析檢測(cè)任何觀察到的不同是否可能是由于人口統(tǒng)計(jì)的/醫(yī)學(xué)的特征參數(shù)引起的。在治療和歷史對(duì)照組中存在的參數(shù)是年齡、ASA身體狀況指數(shù)、心血管風(fēng)險(xiǎn)、性別、醫(yī)院、種族和手術(shù)年份。每個(gè)這些參數(shù)與它們同RBC血紅蛋白濃度和治療之間的相互關(guān)系在初步模型中分別測(cè)試。隨后，所有有效的人口統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括在完整的邏輯回歸分析中。
實(shí)施例5-結(jié)果171個(gè)患者的年齡范圍是17至85歲。這些患者失血的病因包括鈍性損傷(n＝86)，穿透性損傷(n＝41)，和非外傷的起因(n＝44)。171個(gè)病人接受的PolyHeme劑量列在表3。在未受控制的大出血中注入的最大速率大大約為每分鐘2個(gè)單位(100g，1L)。
表3注入PolyHeme劑量

血紅蛋白關(guān)系表示于圖1、2和3。隨著PolyHeme劑量的增加而增加的血漿血紅蛋白濃度表示于圖1。最大血漿血紅蛋白濃度在某一個(gè)接受8個(gè)單位(400g，4L)PolyHeme的患者中為8.0g/dL。在接受20個(gè)單位(1000g，10L)PolyHeme的一組患者中，最大平均血漿血紅蛋白濃度是的5.9±1.1g/dL，反映了進(jìn)行中的血液流失和補(bǔ)充的平衡。
所有患者總血紅蛋白濃度與RBC血紅蛋白濃度之間的關(guān)系示于圖2。該圖說明當(dāng)由于未輸入紅細(xì)胞的漸進(jìn)性大失血導(dǎo)致的RBC血紅蛋白濃度降低時(shí)，通過PolyHeme的注入使總血紅蛋白濃度保持在7-10g/dL范圍內(nèi)。在需要多于6個(gè)單位(300g，3L)PolyHeme的大失血中，RBC血紅蛋白濃度降到低于危及生命的3g/dL水平。
有40個(gè)患者的RBC血紅蛋白濃度≤3g/dL。圖3將每個(gè)個(gè)體患者的總血紅蛋白濃度以RBC血紅蛋白濃度和血漿血紅蛋白濃度之和表示。最右邊的患者具有的RBC血紅蛋白濃度是0.2g/dL，總血紅蛋白濃度是7.5g/dL。29個(gè)患者的總血紅蛋白濃度≥6g/dL。在11個(gè)總血紅蛋白濃度＜6g/dL的患者中，只有兩個(gè)患者接受了全部20個(gè)單位的劑量(1000g，10L)。所有患者具有的總血紅蛋白濃度明顯高于關(guān)鍵性的3g/dL水平。
死亡率數(shù)據(jù)表示于表4。171名患者中總共有18個(gè)死亡，其死亡率是10.5％。盡管隨著RBC血紅蛋白濃度降低死亡率增加，其在RBC血紅蛋白濃度降至3g/dL之下時(shí)沒有進(jìn)一步增加。RBC血紅蛋白濃度≤1g/dL的12名患者中有9名存活。
表4PolyHeme接受者中依據(jù)輸液后RBC血紅蛋白水平最低點(diǎn)的累積死亡率(N＝171)

CI＝置信區(qū)間10個(gè)死亡發(fā)生于早期(0天-1天)，全部由于放血，包括一個(gè)是一種未知的已存在的危及止血的肝臟疾病的結(jié)果。3個(gè)死亡發(fā)生于中期(1天-7天)。一個(gè)由于放血，另兩個(gè)由于存在的損傷。5個(gè)死亡發(fā)生于后期(7天或其后)。4個(gè)由于多器官衰竭，一個(gè)由于已有的肺纖維化并發(fā)癥。沒有一個(gè)死亡被認(rèn)定是由于PolyHeme。
實(shí)施例6-歷史對(duì)照表5顯示了300名歷史對(duì)照患者的死亡率數(shù)據(jù)。其中總共有48名死亡，死亡率為16.0％。在RBC血紅蛋白濃度降低時(shí)死亡率有顯著得增加，在RBC血紅蛋白濃度≤2g/dL時(shí)沒有人存活。
表2歷史對(duì)照中依據(jù)輸液后RBC血紅蛋白水平最低點(diǎn)的累積死亡率(N＝300)

實(shí)施例7-死亡率對(duì)比邏輯回歸方法產(chǎn)生兩種不同曲線(圖4)，各代表一個(gè)治療組。盡管在RBC血紅蛋白濃度降低時(shí)兩組死亡率都增加，在RBC血紅蛋白濃度都低于7.3g/dL時(shí)PolyHeme組的死亡率低于歷史對(duì)照。此減低在RBC血紅蛋白濃度都低于5.3g/dL時(shí)具有顯著性(p＜0.05)。
這兩組的區(qū)別在于以下人口統(tǒng)計(jì)和醫(yī)學(xué)特征年齡、ASA身體狀況指數(shù)、治療組、RBC血紅蛋白濃度最低值和他們的相互關(guān)系(p＜0.05)。然而，支持性模型測(cè)定這些參數(shù)都不改變?cè)挤治龅慕Y(jié)果。
實(shí)施例8-血紅蛋白溶液的制備PolyHeme可以通過以下的方法制備。對(duì)于該方法的各種改變?cè)诿绹鴮＠?,498,141號(hào)中描述，其公開內(nèi)容在此完整引入以供參考。
1.細(xì)胞抽吸和過濾刺穿陳舊血液捐獻(xiàn)袋并注入大約150ml 1％的氯化鈉水溶液。該袋在負(fù)壓或真空下抽液。被抽出的血液經(jīng)過三層白血球吸附深層式過濾器(three leukocyte adsorption depth filter)。一般，大約225個(gè)單位的陳舊全血被抽出，過濾并隨后轉(zhuǎn)移到容器1。過濾器隨后經(jīng)大約75升1％(w/v)氯化鈉水溶液沖洗。
2.細(xì)胞洗滌和裂解在將血液轉(zhuǎn)移到容器1中之前，容器1充入1％的氯化鈉水溶液大約40-50L。在全部225個(gè)單位的陳舊全血被抽出，過濾和轉(zhuǎn)移，并且過濾器被沖洗之后，容器和連接管含有大約365-390升含4％總血紅蛋白的溶液。在抽出和過濾步驟中，容器1保持負(fù)壓，即，20-28″Hg的真空。一旦全部陳舊血液被轉(zhuǎn)移至容器1，關(guān)閉真空并在容器中充入一氧化碳從而使容器含有一氧化碳?xì)夥铡?br> 容器1與0.65μ切向流動(dòng)性過濾器連接。最初充入的365-390升含4％總血紅蛋白的溶液通過切向流動(dòng)性過濾器微量過濾，濃縮為約215-225L含7％總血紅蛋白的溶液。血紅蛋白溶液的pH在此情況大大約為6至6.5。在濃縮為7％總血紅蛋白之后，通過加入1％(w/v)氯化鈉水溶液，以與加入氯化鈉水溶液相同的速率滲濾和移除濾液來洗滌溶液。215-225L血紅蛋白溶液一般用大約8體積的1％氯化鈉水溶液(約1，800L)洗滌。在洗滌之后，溶液濃縮為約90-95L，即，大約16％總血紅蛋白，并且加入“注射用水(water for injection，WFI)”使溶液體積達(dá)到約220L。通過加入WFI，細(xì)胞膨脹并破裂，將血紅蛋白釋放至溶液中。得到的血紅蛋白溶液的濃度大約為7％總血紅蛋白(THb)。
得到的溶液在容器1中澄清。該溶液首先濃縮至約90L并且將濾液轉(zhuǎn)移至容器2。在溶液被吸抽經(jīng)過過濾器時(shí)，紅細(xì)胞基質(zhì)雜質(zhì)和細(xì)胞壁物質(zhì)殘留于并通過過濾器移除。容器1剩余的90L溶液用大約280LWFI洗滌(滲濾)。該洗滌液加入容器2。容器2得到的是約405-415L含3.3％總血紅蛋白的溶液。
3.熱處理然后，所得的無基質(zhì)血紅蛋白溶液于60-62℃的溫度在容器2中加熱處理10小時(shí)。在此期間，適度攪拌溶液。在溶液加熱并且經(jīng)過55℃的溫度時(shí)，形成沉淀。
4.純化和病毒減量接下來，所得3.3％THb(w/v)無基質(zhì)、經(jīng)熱處理的血紅蛋白溶液經(jīng)0.2μ預(yù)過濾器和隨后的0.1μ預(yù)過濾器過濾并且之后經(jīng)過100kDa病毒減量超濾器吸入容器3。
5.超濾濃縮該過濾的血紅蛋白溶液隨后濃縮至85-105升(大約14％THb)并且接著用4體積WFI(350 L)洗滌和滲濾。濃縮和滲濾通過使用10千道爾頓(kDa)分子量超濾器實(shí)現(xiàn)。連接在超濾器上的排液管收集濾液。在此情況下，每毫升pH約為6至6.5的血紅蛋白溶液含有每克血紅蛋白少于50ng的磷脂和每克血紅蛋白少于2ng的糖酯(由TLC測(cè)量)，少于1％的高鐵血紅蛋白(由聯(lián)合血氧計(jì)測(cè)量)，少于約0.03內(nèi)毒素單元的內(nèi)毒素。此溶液中的血紅蛋白主要是碳氧血紅蛋白。
6.脫氣所得碳氧血紅蛋白溶液隨后轉(zhuǎn)移至一個(gè)175L的容器(容器4)。氧氣在10℃以66L/min經(jīng)過18小時(shí)噴入該溶液。所得溶液含有基于總血紅蛋白重量少于5％的碳氧血紅蛋白。
在充氧之后，氮?dú)庠?0℃以相似流量經(jīng)過約3至3.5小時(shí)噴入該溶液，直到基于總血紅蛋白重量少于10％的氧合血紅蛋白殘留于溶液中。
7.化學(xué)改性該脫氧血紅蛋白溶液轉(zhuǎn)移至容器5進(jìn)行化學(xué)改性。在含有脫氧血紅蛋白的大約4℃溶液的容器5中，隨后以吡哆醇(pyridoxyl)-5-磷酸酯(P5P)相對(duì)于血紅蛋白1∶1至3∶1的摩爾比例加入P5P水溶液(93.75g/L)。優(yōu)選P5P相對(duì)于血紅蛋白的摩爾比例為2∶1。吡哆醇化在約4℃的溫度下進(jìn)行。在硼氫化鈉/氫氧化鈉溶液以硼氫化鈉相對(duì)于血紅蛋白約為20∶1的摩爾比加入血紅蛋白溶液之后，P5P溶液一般經(jīng)過大于約1分鐘加入并混合約15分鐘。合適的硼氫化鈉/氫氧化鈉水溶液中每2升含有0.8g氫氧化鈉和90.8g硼氫化鈉。硼氫化物溶液以盡可能快的大約1分鐘的時(shí)間加入并且隨后攪拌1小時(shí)。
8.反應(yīng)物移除所得150L吡哆醇化的血紅蛋白溶液接著用4體積(600L)WFI，使用10K道爾頓超濾器滲濾，從而將過量反應(yīng)物移除。一個(gè)連接在超濾器上的排液管收集過濾器的濾液。
9.UP聚合濃縮在含有吡哆醇化血紅蛋白溶液的容器5中加入足夠的WFI，制備含4.5％總血紅蛋白的溶液(大約265L血紅蛋白溶液)。戊二醛溶液以，相對(duì)于血紅蛋白約為24∶1的摩爾比加入吡哆醇化的血紅蛋白溶液。戊二醛溶液一般通過計(jì)量泵經(jīng)過2.5小時(shí)加入血紅蛋白溶液。聚合反應(yīng)準(zhǔn)許進(jìn)行大約15-18小時(shí)。目標(biāo)分子量分布是大約75％的聚合物和25％的四聚體。目標(biāo)聚合物具有分子量小于約600,000并且分子量的主要部分處于100,000-350,000范圍。
當(dāng)聚合反應(yīng)達(dá)到目標(biāo)分子量分布(大約15-18小時(shí)之后)時(shí)，含水甘氨酸(約166g/L)以相對(duì)于血紅蛋白為140∶1的摩爾比加入(作為終止劑)血紅蛋白中。此時(shí)溶液pH是8.9。在硼氫化鈉/氫氧化鈉溶液(具有以上相同濃度)以硼氫化鈉相對(duì)于血紅蛋白為28∶1的摩爾比加入血紅蛋白中之后，所得溶液接著混合大約30-40分鐘。此得到的混合物攪拌1小時(shí)。隨后該溶液通過超濾器濃縮至約150L并且用4體積(600L)的WFI洗滌。具有與以述相同摩爾比的硼氫化鈉附加等分試劑加入到濃縮的溶液中，再混合1小時(shí)。所得溶液用4體積(600L)的WFI洗滌得到聚合的、吡哆醇化的、無基質(zhì)的、經(jīng)熱處理的血紅蛋白。
該所得溶液通過使該溶液處于氧氣氛下氧化并且接著轉(zhuǎn)移至過濾循環(huán)容器(容器10)。隨后血該紅蛋白稀釋為約4％THb。該4％THb溶液接著使用10mM NaCl/20μM NaOH和由Millipore Corp.商業(yè)供應(yīng)的300,000分子量的過濾器滲濾。持續(xù)過濾直到約97％的血紅蛋白物質(zhì)通過了過濾器進(jìn)入容器11并且在其中使用70kDa超濾器繼續(xù)濃縮至4-8％THb。(大約3％的原料，即，高分子量聚合物殘留于容器10)。血紅蛋白的量通過使用聯(lián)合血氧計(jì)(cooximeter)光譜光度測(cè)定。
容器11中所得的物質(zhì)是大約4-8％THb并且含有基于THb約25％的四聚體。該血紅蛋白溶液轉(zhuǎn)移至容器12并且隨后使用10mMNaCl/20μM NaOH緩沖液和由Pall-Filtron商業(yè)供應(yīng)的100,000分子量的過濾器滲濾。持續(xù)過濾直到由通過使用TOSO BioSep TSKG-3000SWXL 300×7.8mm柱的尺寸排除色層分析法測(cè)定的四聚體水平少于血紅蛋白質(zhì)量的1.0wt.％(典型為0.3wt.％)。所得純化的血紅蛋白溶液最初存于容器11并且隨后轉(zhuǎn)移至氣交換容器8進(jìn)行脫氧。
10.脫氧氣體交換容器8基本上以與氣體交換容器4相同的方式安裝。在約10℃和溶液pH約為8.8時(shí)進(jìn)行氮?dú)鈬婌F，經(jīng)過約2.5小時(shí)進(jìn)行脫氧。繼續(xù)噴氮?dú)庵钡交诳傃t蛋白重量少于約16％的氧合血紅蛋白殘留于溶液中。所得脫氧血紅蛋白溶液隨后轉(zhuǎn)移至容器9進(jìn)行制劑。
11.制劑在制劑容器9中，溶液首先濃縮至大約7％總血紅蛋白。接著將電解液加入該血紅蛋白溶液。加入葡萄糖和甘氨酸使最終濃度分別達(dá)到約1g/L和3.5g/L。在該溶液中加入氯化鉀使得到的鉀濃度大約為3.5至4.5mM。然后加入3M氯化鈉從而得到85-110mM氯濃度。隨后加入乳酸鈉從而得到135-155mM濃度的鈉離子。加入0.45摩爾的抗壞血酸溶液使抗壞血酸濃度增至約1000mg/L。加入的抗壞血酸作為儲(chǔ)存用防腐劑/抗氧化劑。使用0.22M NaOH調(diào)節(jié)pH至8.7-9.1@10-15℃。所得血紅蛋白溶液具有最終重量摩爾滲透壓濃度約為每千克280-360毫摩爾。
配制的血紅蛋白濃度隨后使用連有閥門的過濾器濃縮至約10％總血紅蛋白，并且該10％的血紅蛋白溶液隨后通過過濾除菌，并且在無菌條件下注入預(yù)先滅菌的袋子。
考慮到本發(fā)明的原理能夠適用的多種實(shí)施方案，應(yīng)該理解舉例說明的實(shí)施方案只是范例性的，并且不應(yīng)用來限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求不應(yīng)被理解為限制于說明的順序或要素，除非聲明了此主旨。因此，在下列權(quán)利要求和其等效物的范圍和精神內(nèi)的所有實(shí)施方案被要求為本發(fā)明。
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權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動(dòng)物由于失血而遭受危及生命的紅細(xì)胞血紅蛋白(RBC Hb)水平的方法，其中所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種聚合血紅蛋白溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液是一種非細(xì)胞溶液，該溶液含有一種基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，該溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的失血是大量失血。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少5L的量施用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少哺乳動(dòng)物一個(gè)血容積的量施用。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持平均循環(huán)血紅蛋白水平高于5.0g/dL。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持動(dòng)脈壓力高于60mmHg。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少每分鐘約2單位的速度施用。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的溶液避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中所述的聚合血紅蛋白具有的分子量分布是(a)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(b)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(c)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的危及生命的RBC Hb水平是低于3.0g/dL。
12.一種避免遭受大量失血的患者貧血、不可逆性缺血或血量減少性休克的方法，其中所述方法包括對(duì)患者施用足夠維持總Hb高于5.0g/l并且動(dòng)脈壓力高于60mmHg所需體積的聚合血紅蛋白溶液。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液是一種非細(xì)胞溶液，該溶液含有一種基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，該溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中治療前所述患者的RBC Hb水平低于5.0g/dL。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中治療前所述患者的RBC Hb水平低于3.0g/dL。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少5L的量施用。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少哺乳動(dòng)物一個(gè)血容積的量施用。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持動(dòng)脈壓力高于60mmHg。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少每分鐘約2單位的速度施用。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的溶液避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
21.如權(quán)利要求12的方法，其中所述的聚合血紅蛋白具有的分子量分布是(a)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(b)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(c)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
22.一種用于維持遭受大量失血患者的平均循環(huán)Hb水平高于5.0g/dL的方法，其中所述方法包括對(duì)患者施用至少該患者一個(gè)血容積的聚合血紅蛋白溶液。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液是一種非細(xì)胞溶液，該溶液含有一種基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，該溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中所述的聚合血紅蛋白具有的分子量分布是(a)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(b)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(c)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少5L的量施用。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少哺乳動(dòng)物一個(gè)血容積的量施用。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持動(dòng)脈壓力高于60mmHg。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少每分鐘約2單位的速度施用。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的溶液避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
30.一種用于治療由于大量失血而具有血紅蛋白濃度低于大約7g/dL的人的方法，其中所述方法包括對(duì)該人施用一種聚合血紅蛋白溶液。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液是一種非細(xì)胞溶液，該溶液含有一種基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，該溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少5L的量施用。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少哺乳動(dòng)物一個(gè)血容積的量施用。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持平均循環(huán)血紅蛋白水平高于5.0g/dL。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持動(dòng)脈壓力高于60mmHg。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少每分鐘約2單位的速度施用。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的溶液避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
38.如權(quán)利要求30的方法，其中所述的聚合血紅蛋白具有的分子量分布是(a)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(b)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(c)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
39.一種用于維持遭受大量失血的人生命的方法，其中所述方法包括通過對(duì)該人施用一種聚合血紅蛋白溶液，阻止血量減少性休克和進(jìn)一步的血壓降低。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述人具有的血紅蛋白濃度低于約7g/dL。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液是一種非細(xì)胞溶液，該溶液含有一種基本無四聚體的、交聯(lián)的、聚合血紅蛋白溶液，該溶液基本不含基質(zhì)和其它雜質(zhì)。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少5L的量施用。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少哺乳動(dòng)物一個(gè)血容積的量施用。
44.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液的施用維持動(dòng)脈壓力高于60mmHg。
45.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的血紅蛋白溶液以至少每分鐘約2單位的速度施用。
46.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的溶液避免血管收縮及腎、胰腺、腸胃和心臟功能紊亂伴隨的毒效。
47.如權(quán)利要求39的方法，其中所述的聚合血紅蛋白具有的分子量分布是(a)聚合物中大約5-30wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為128KDa；(b)聚合物中大約15-35wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為192KDa；和(c)聚合物中大約35-75wt.％的聚合血紅蛋白具有的分子量大約為256KDa。
全文摘要
治療遭受大量失血哺乳動(dòng)物的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種聚合血紅蛋白溶液。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1703235SQ200380100912
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月3日
發(fā)明者S·A·古爾德, R·E·德沃斯克, M·D·道布爾迪, G·A·希德斯 申請(qǐng)人:北原實(shí)驗(yàn)室有限公司