專利名稱：一種直接的細(xì)胞能量遞送系統(tǒng)的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以序號(hào)60/380,762的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，F(xiàn)USOGENICLIPID VESICLES，為優(yōu)先權(quán)。該臨時(shí)申請(qǐng)是William D.Ehringer和Sufan Chien在2002年5月14日申請(qǐng)的，在此由于提及而全文引入。
背景技術(shù)：
ATP是給所有細(xì)胞如動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等細(xì)胞供能的燃料。正如汽車沒(méi)有汽油一樣，人類和其它生物的空的ATP“儲(chǔ)備”(tank)使之不能繼續(xù)前進(jìn)。事實(shí)上，它們將會(huì)死亡。營(yíng)養(yǎng)素分解產(chǎn)生的能量最終保存在高能磷酸鍵內(nèi)。當(dāng)這些鍵斷裂時(shí)，就給細(xì)胞、組織、器官和器官體系提供了可利用的能量。細(xì)胞不斷地合成和代謝ATP。ATP要么以有氧代謝的方式通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生以氧作為末端電子受體，并產(chǎn)生副產(chǎn)物二氧化碳(CO2)和水，要么在糖酵解過(guò)程中以無(wú)氧代謝的方式產(chǎn)生。盡管糖酵解能給細(xì)胞提供能量，但所提供的能量有限，因?yàn)榧?xì)胞環(huán)境變?yōu)樗嵝?，?duì)細(xì)胞有損傷并抑制ATP的產(chǎn)生。
血管循環(huán)系統(tǒng)遞送由氧和營(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)生的持續(xù)供應(yīng)的能量。在脈管系統(tǒng)中，內(nèi)皮細(xì)胞屏障將被供能的細(xì)胞與脈管腔隔離。為了到達(dá)個(gè)體的細(xì)胞，氧和營(yíng)養(yǎng)素必須穿過(guò)內(nèi)皮內(nèi)層進(jìn)入間質(zhì)隙以輸送氧和營(yíng)養(yǎng)素。這種氧供給會(huì)因?yàn)榧膊』騽?chuàng)傷被中斷。例如，心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、中風(fēng)、低血壓和嚴(yán)重的創(chuàng)傷如車禍中頸動(dòng)脈的斷裂會(huì)導(dǎo)致氧喪失，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境平衡的喪失并可能導(dǎo)致死亡。
在局部缺血這一事件導(dǎo)致組織失去氧和營(yíng)養(yǎng)素，之后重建血液供給時(shí)可能發(fā)生缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。如細(xì)胞試圖合成ATP一樣，再供氧后，當(dāng)細(xì)胞試圖再合成ATP時(shí)產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物，如自由基。局部缺血不僅是一種與損傷或疾病相關(guān)的現(xiàn)象，也可能由外科手術(shù)如主動(dòng)脈旁路、開(kāi)胸手術(shù)、主要組織再造、腫瘤切除、腸切除和器官移植的副作用引起。
局部缺血給成功進(jìn)行組織和器官移植提出了巨大的挑戰(zhàn)。在美國(guó)每年大約有14,000例腎移植和2500例心臟移植。在切除后，器官在缺少氧和營(yíng)養(yǎng)素的情況下只有有限的壽命。心臟必須在獲得后4到6小時(shí)內(nèi)移植，而腎必須在72小時(shí)內(nèi)移植。因?yàn)榻邮苷咄ǔ＿h(yuǎn)離捐贈(zèng)者，這些很短的存活時(shí)間妨礙了移植。血液可在4℃下大約只能儲(chǔ)存45天，然后就必須丟棄。更復(fù)雜的是在手術(shù)預(yù)處理中本體血的獲得?；颊咄ǔＶ惶峁┰谶@45天內(nèi)的兩個(gè)單位的血。這些量并不夠用，因?yàn)樵S多外科手術(shù)中用到3個(gè)、4個(gè)或更多單位的血。
已進(jìn)行多種嘗試來(lái)克服或抑制低氧供給的有害影響。這些方法包括(1)提供糖酵解中間體以增加無(wú)氧的ATP產(chǎn)出；(2)減少代謝需求，如在4℃下貯藏細(xì)胞、組織和器官；和(3)直接把ATP加入細(xì)胞、組織或器官。給細(xì)胞供應(yīng)能量?jī)?yōu)選通過(guò)直接供給ATP實(shí)現(xiàn)；但是，細(xì)胞攝取外源性ATP的能力差，因?yàn)槿鄙貯TP受體或通道。而且，細(xì)胞漿膜是疏水性的，而ATP是親水性的，因而阻止了ATP的通過(guò)。將ATP引入血流是無(wú)效的，因?yàn)锳TP不能穿過(guò)內(nèi)皮屏障且ATP容易水解。嘗試使用脂質(zhì)體輸送ATP大多是不成功和無(wú)效的(ARAkawa等，1998，Puisieux等，1994)。例如，Puisieux等構(gòu)建了包封有ATP的磷脂酰膽堿、膽固醇和磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)囊泡，然后與精細(xì)胞、肝和腦組織一起孵化。盡管觀察到一些攝取，不能取得滿足代謝對(duì)ATP的要求的受控遞送。當(dāng)在血流中給藥時(shí)，脂質(zhì)體通常不能突破內(nèi)皮細(xì)胞屏障；此外，它們通常不具有與細(xì)胞膜的高融合率，這是囊泡將其載運(yùn)的ATP遞送到細(xì)胞的必要條件。
動(dòng)物細(xì)胞漿膜含有四種主要的占脂質(zhì)總量一半以上的磷脂磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂。磷脂酰膽堿和鞘磷脂大多存在于外層小葉中，而磷脂酰膽胺和磷脂酰絲氨酸主要存在于內(nèi)層小葉中。在外層小葉中負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇占優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致在細(xì)胞表面帶凈負(fù)電荷。漿細(xì)胞膜有助于維持細(xì)胞的完整性和可被選擇性的滲透。一些分子能擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜，而大多分子包括ATP需要以其它方式進(jìn)入，如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道。
概述一方面，本發(fā)明涉及一種囊泡，該囊泡包括ATP和一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物(former)的磷脂。所述囊泡具有至少20個(gè)囊泡融合/每秒的融合速率。
第二方面，本發(fā)明涉及一種囊泡，該囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂和另一種極性脂質(zhì)和/或PEG。囊泡具有至少20個(gè)囊泡融合/每秒的融合速率。
第三方面，本發(fā)明涉及一種囊泡，該囊泡包括ATP和一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂。磷脂具有式(I’)的結(jié)構(gòu)X’-L’-Z’2(I’)其中X’具有式(II’)的結(jié)構(gòu) B’是陽(yáng)離子或烷基，A’是烷基，L’是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且一個(gè)Z’是E”，或是式(XI”)的結(jié)構(gòu) 其中E”是烷基或烯基，并且另一個(gè)Z’是E’，或是式(XI’)的結(jié)構(gòu) 其中E’是烯基。
第四方面，本發(fā)明涉及一種囊泡，該囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂和一種不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)和/或PEG。作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂具有式(I)的結(jié)構(gòu)X-L-Z2(I)其中X是氫或具有式(II)的結(jié)構(gòu) B是陽(yáng)離子或烷基，A是H或烷基，L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且每一個(gè)Z獨(dú)立地為H、E，或是式(XI)的結(jié)構(gòu)， 其中E是烷基或烯基，并且當(dāng)一個(gè)Z是H時(shí)，另一個(gè)Z不是H。
第五方面，本發(fā)明涉及一種將ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括使將細(xì)胞與囊泡相接觸。囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，和ATP。遞送到細(xì)胞的ATP的量足以滿足細(xì)胞的代謝需要。
第六方面，本發(fā)明涉及一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將創(chuàng)傷與含有囊泡的組合物相接觸。囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂和ATP。
第七方面，本發(fā)明涉及一種包括囊泡和貝卡普勒明(becaplermin)的組合物。囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂和ATP。
第八方面，本發(fā)明涉及一種提高具有至少一個(gè)細(xì)胞的生物反應(yīng)器的產(chǎn)率的方法，包括將細(xì)胞與囊泡相接觸。囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂和ATP。
定義“烷基”(或烷基-或烷-)指的是取代或非取代的、直鏈、支鏈或環(huán)狀烴鏈，優(yōu)選含有1到20個(gè)碳原子的烴鏈。合適的非取代烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、環(huán)丁基、戊基、環(huán)戊基、己基、環(huán)己基和類似基團(tuán)?！巴榉蓟焙汀巴殡s環(huán)基”是各自通過(guò)共價(jià)鍵與芳環(huán)或雜環(huán)相連的烷基。
“烯基”指的是取代或非取代的、直鏈、支鏈或環(huán)狀、不飽和烴鏈，其中包括至少一個(gè)雙鍵，優(yōu)選2到20個(gè)碳原子的烴鏈。例如不飽和的烯基包括乙烯基(ethenyl)或vinyl)，1-丙烯基，2-丙烯基(或烯丙基)、1，3-丁間二烯基、己烯基、戊烯基、1，3，5-己三烯基和類似基團(tuán)。優(yōu)選含5到8個(gè)碳原子和至少一個(gè)雙鍵的環(huán)烯基。例如環(huán)烯基包括環(huán)己二烯、環(huán)己烯、環(huán)戊烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)辛烯基、環(huán)己二烯、環(huán)庚二烯、環(huán)辛三烯等。
“烷氧基”指的是取代或非取代的、-O-烷基。例如烷氧基基團(tuán)包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、異丙氧基、正-丁氧基，叔-丁氧基等。
“芳基”指的是任何單價(jià)芳香碳環(huán)或芳香雜環(huán)，優(yōu)選3到10個(gè)碳原子的基團(tuán)。芳基可以是二環(huán)(即苯基(或Ph))或多環(huán)(即萘基)，并且可以是未取代的和取代的。優(yōu)選的芳基基團(tuán)包括苯基、萘基、呋喃基、吡啶基、吲哚基、喹啉基或異喹啉基。
“氨基”指的是非取代或取代的-NRR’基團(tuán)。胺可以是伯胺(-NH2)、仲胺(-NHR)或叔胺(-NRR’)，這取決于取代基(R或R’)的數(shù)量。例如取代的氨基基團(tuán)包括甲氨基、二甲氨基、乙氨基、二乙氨基、2-丙胺基、1-丙胺基、雙(n-丙基)氨基、雙(異-丙基)氨基、甲基-n-丙氨基、t-丁氨基、苯氨基等。
“雜環(huán)基”指的是穩(wěn)定、飽和、部分不飽和，或芳香的環(huán)、優(yōu)選含5到10個(gè)碳原子，更優(yōu)選含5到6個(gè)碳原子的基團(tuán)。環(huán)可以被取代基1次或多次取代(優(yōu)選1、2、3、4或5次)。環(huán)可以是單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)。雜環(huán)由碳原子和1個(gè)到3個(gè)獨(dú)立地選自氮、氧和硫的雜原子組成。雜原子可以是保護(hù)的或非保護(hù)的。例如可用的雜環(huán)包括取代或非取代、保護(hù)或非保護(hù)的吖啶、苯并噻啉、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并苯硫基、咔唑、噌啉、呋喃、咪唑，1H-吲唑、吲哚、異吲哚、異喹啉、異噻唑、嗎啉、噁唑(也即1，2，3-噁二唑)、吩嗪、吩噻嗪、吩卓嗪、呔嗪、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑啉、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噻吩、1，3，5-三嗪、三唑(即1，2，3-三唑)等。
“取代”指的是基團(tuán)含有至少一個(gè)，優(yōu)選1到3個(gè)取代基。合適的取代基包括氫(H)和羥基(-OH)、氨基(-NH2)、氧基(-O-)、羰基(-CO-)、硫醇、烷基、烯基、炔基、烷氧基、鹵素、腈、硝基、芳基和雜環(huán)。這些取代基可任選地被1-3個(gè)取代基進(jìn)一步取代。例如被取代的取代基包括氨甲酰(carboxamide)、烷巰基、烷磺基、烷氨基、二烷氨基、羧酸鹽、烷氧羰基、烷芳基、芳烷基、烷雜環(huán)等。


圖1表示一小時(shí)后，ATP在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)的分配系數(shù)。
圖2表示本發(fā)明組合物治愈裸鼠創(chuàng)傷的效果。
圖3表示大鼠斷肢的成功再植入。重新接上后肢體功能完全正常。
詳細(xì)描述本發(fā)明利用下述發(fā)現(xiàn)完成，小的脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞脂雙層膜之間具有可融合性，能包封ATP并將把ATP直接遞送到細(xì)胞。通過(guò)改變脂質(zhì)囊泡組合物或通過(guò)其它方式獲得不同的融合速度很容易控制遞送ATP的速度。此外，囊泡組合物可以調(diào)整以適應(yīng)不同的給藥模式。例如通過(guò)注射進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)時(shí)可制成小的脂質(zhì)囊泡，囊泡與內(nèi)皮細(xì)胞融合，使間隙打開(kāi)，因而能有效與靶細(xì)胞融合。為了更好地實(shí)現(xiàn)靶向融合，可在囊泡中加入其它成分，例如某些多肽。通過(guò)載入脂質(zhì)囊泡，ATP變得穩(wěn)定不易水解。
本發(fā)明的組合物和方法滿足了有效地把ATP遞送到細(xì)胞的要求。為了把ATP遞送到細(xì)胞有四個(gè)必要的要求第一，ATP必須通過(guò)細(xì)胞膜；第二，遞送ATP的量必須達(dá)到一定的速度以滿足基礎(chǔ)代謝的需要；第三，含有ATP的組合物必須與給藥途徑相適應(yīng)。最后，為了起效，ATP必須在水解前進(jìn)入細(xì)胞。
脂質(zhì)囊泡膜類似于漿細(xì)胞膜；此外也易于制備。因?yàn)樗鼈冇幸粋€(gè)水溶性部分，脂質(zhì)囊泡可以包封多種的溶液，包括含有ATP的溶液。制得的脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞膜融合，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)囊泡內(nèi)容物的遞送。
本發(fā)明的方法和組合物具有廣泛的用途，包括出血性休克、心臟病中風(fēng)、冠心病、中風(fēng)、低血壓、嚴(yán)重創(chuàng)傷、傷口愈合、組織和器官貯藏、肺心病復(fù)蘇術(shù)和移植。在嚴(yán)重創(chuàng)傷的情況下，本發(fā)明的組合物在傷區(qū)給藥使傷害最小化直至獲得醫(yī)療幫助。本發(fā)明的方法和組合物可用于延長(zhǎng)血液和血小板的貯存。
下述內(nèi)容不是限定本發(fā)明，介紹這些內(nèi)容是為了幫助專業(yè)人員，盡管還可使用其它方法、技術(shù)、細(xì)胞、試劑和方法。
可融合性(fusogenic)脂質(zhì)囊泡脂質(zhì)囊泡與漿細(xì)胞膜相似，可制備與細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)囊泡。先前的脂質(zhì)體研究表明已觀察到脂質(zhì)體和細(xì)胞膜之間存在四種主要的相互作用細(xì)胞表面吸收作用；內(nèi)吞作用(吞噬細(xì)胞主動(dòng)攝入脂質(zhì)體)；脂質(zhì)交換(涉及單個(gè)脂分子在脂質(zhì)體和漿細(xì)胞膜之間的遷移)；和融合(其中脂質(zhì)體膜與漿細(xì)胞膜聯(lián)合)。脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞膜之間的相互作用可能類似于脂質(zhì)體和細(xì)胞膜之間的情況。融合是一種最吸引人的機(jī)制，因?yàn)樗鼓遗輧?nèi)容物直接導(dǎo)入細(xì)胞中。吸收和脂交換可在囊泡不易融合和不能遞送囊泡的水溶性內(nèi)容物的情況下發(fā)生。內(nèi)吞作用也只發(fā)生于某些類型的細(xì)胞，如白細(xì)胞。
然而，大多數(shù)脂質(zhì)體和多層囊泡不易融合，主要因?yàn)槟遗輳澢霃絻?nèi)儲(chǔ)存的能量極少。但本發(fā)明的小的單層囊泡具有非常緊密的彎曲半徑，易于融合。一般而言小的單層囊泡(SUV)的平均直徑在5nm到500nm之間；優(yōu)選10nm到100nm之間，更優(yōu)選20nm到60nm，包括40nm。該尺寸使囊泡可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的間隙。所用囊泡可在大小上有很大變化，根據(jù)具體應(yīng)用進(jìn)行選擇。
本發(fā)明用于制備囊泡的組合物含有一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，優(yōu)選同時(shí)含有另一種極性脂質(zhì)，和任意的一種或多種附加的極性脂質(zhì)和/或筏形成物。
極性脂質(zhì)是同時(shí)具有疏水性末端和親水性末端的有機(jī)分子，含有至少6個(gè)碳原子；它們具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)，其中X是頭基團(tuán)(headgroup)，L是主鏈基團(tuán)，每個(gè)Z都是脂肪基。兩個(gè)Z基團(tuán)可以相同或不同。磷脂是具有式(II)頭基團(tuán)的極性脂質(zhì)，其中A和B是頭基團(tuán)的取代基。
頭基團(tuán)X可以是任何極性基團(tuán)，優(yōu)選陽(yáng)離子、陰離子或兩性離子基團(tuán)，或H。更優(yōu)選X是結(jié)構(gòu)式(II)所示的基團(tuán)。優(yōu)選地，B是陽(yáng)離子，如Na+，K+，或四甲銨離子；或烷基。優(yōu)選地，A是H，或烷基；更優(yōu)選地A是氨基取代的烷基；最優(yōu)選A是式(III)、(IV)、(V)、(V)或(VII)的基團(tuán)。應(yīng)當(dāng)注意，在整個(gè)說(shuō)明書中，結(jié)構(gòu)式可能顯示的是質(zhì)子化形式的結(jié)構(gòu)，但它們也包括非質(zhì)子化形式(反之亦然)；其在任一組合物中出現(xiàn)的形式取決于組合物確切的pH值，以及水和/或適當(dāng)抗衡離子的存在。
主鏈基團(tuán)L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基(以提供總共三個(gè)開(kāi)放連接點(diǎn))，優(yōu)選烷氧基，或氨基取代的烷基。最優(yōu)選L是式(VIII)(IX)或(X)的基團(tuán)。
脂肪基Z可以相同或不同，是氫或E基團(tuán)，或是式(XI)所示的基團(tuán)，其中E是烷基或烯基。優(yōu)選地，E是未取代的直鏈烷基或烯基，有6-26個(gè)碳原子；更優(yōu)選E是式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的基團(tuán)。如果一個(gè)脂基團(tuán)是H，另一個(gè)必須不同。如果出現(xiàn)雙鍵，優(yōu)選順式構(gòu)型。

一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂(或極性脂質(zhì))是形成囊泡的磷脂(或極性脂質(zhì))，在按下述方法制成后其中至少50％能維持至少一個(gè)小時(shí)磷脂溶于氯仿并置于玻璃試管內(nèi)。在穩(wěn)定的氮?dú)饬飨抡麴s除去溶劑，然后將樣品置于真空器12小時(shí)除氣。然后將干燥后的脂質(zhì)在10mMNa2HPO4中再次水合，時(shí)間60分鐘，溫度高于脂相轉(zhuǎn)變溫度；所需的最終濃度為25mg/ml。脂質(zhì)混合物用超聲攪拌，所用微末端(microtip)450瓦超聲器，在40％負(fù)載循環(huán)下工作。
優(yōu)選地，除了作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂外組合物還包括至少一種其它的磷脂，更優(yōu)選，包括一種或多種作為不穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)。
當(dāng)囊泡在水溶液中，筏(raft)形成物是一種位于囊泡脂層內(nèi)的化合物，會(huì)形成或?qū)е滦纬稍谀遗荼趦?nèi)的分散區(qū)域(也稱作筏)。這些分散的區(qū)域容易使囊泡去穩(wěn)定化，提升了融合能力。例如，筏形成物是具有膜結(jié)合性的膽固醇(結(jié)構(gòu)式XXIV)、鞘磷脂和蛋白質(zhì)和多肽。通過(guò)選擇極性脂質(zhì)融合能力得到加強(qiáng)，這使得囊泡產(chǎn)生表面電荷，與靶細(xì)胞Gouey-Chapman層的電荷相反(典型的Gouey-Chapman層帶正電荷)。
用于本發(fā)明的極性脂類的例子包括1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)(結(jié)構(gòu)式XVII；一種穩(wěn)定的囊泡形成物)、1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸(POPA)(見(jiàn)結(jié)構(gòu)式XVIII的單鈉鹽)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOPC-e)(見(jiàn)結(jié)構(gòu)式XIX的鹽酸鹽)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽胺(DOPE)(結(jié)構(gòu)式XX)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-1-絲氨酸](DOPS)(見(jiàn)結(jié)構(gòu)式XXI的鈉鹽)、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(結(jié)構(gòu)式XXII；一種穩(wěn)定的囊泡成形器)、一種典型的鞘磷脂(結(jié)構(gòu)式XXIII；膽固醇加入到由鞘磷脂和DOPC混合物形成的囊泡時(shí)形成筏，)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(結(jié)構(gòu)式XXV)和1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(XXVI)。其它可用于本發(fā)明的極性脂類包括磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、混合鏈磷脂酰膽堿(MPC)、磷脂酰乙醇(PE)和含有廿二碳六烯酸的磷脂。Cit-DOPC和cit-DOPC-e尤其適用。也可用磷脂酰膽堿，包括在sn-1和sn-2位置具有廿二碳六烯酸的磷脂酰膽堿(DHPC)。其它二不飽和脂類，如二花生四烯酸磷脂酰膽堿(例如20∶4DOPC∶DArPC)也適用。二亞麻酸磷脂酰膽堿(例如18∶3DOPC∶DLnPC)也適用。例如，在制備SUV時(shí)，DOPC中可與增長(zhǎng)量的DLnPC、DArPC和DHPC混合。適用的比例包括(DOPC∶DLnPC、DArPC或DHPC)1-1000∶1，如25-500∶1，包括1∶1、25∶1、50∶1、100∶1、500∶1和1000∶1。也可用具有大均值分子域的磷脂的組合，如DOPC∶DLnPC∶DHPC。也可將二酰甘油(一種非層狀脂質(zhì))與DOPC混合。此外，可使用分子量為20到4000重復(fù)單元聚乙二醇(PEG)。
優(yōu)選地，作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂與作為不穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)的比例在1∶1到500∶1之間，更優(yōu)選在10∶1到100∶1之間(例如50∶1)。例如包括DOPC/COPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)和DOPC/POPA(1∶1)。


脂質(zhì)囊泡的構(gòu)造為了構(gòu)建脂類囊泡，先把脂類溶于氯仿或其它適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑并置于容器中，如玻璃試管內(nèi)。在穩(wěn)定的氮?dú)饬骰蚱渌栊詺怏w下蒸發(fā)除去溶劑，然后除氣，例如通過(guò)將樣品置于真空中0.1到48小時(shí)，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，24，25，30，36，40，42或48小時(shí)。通常12小時(shí)就足夠了。將干燥所得的脂質(zhì)在適當(dāng)?shù)木彌_液中再次水合，例如Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)或10mM Na2HPO4，時(shí)間30-60小時(shí)，溫度高于脂類相轉(zhuǎn)變溫度；所需的最終濃度通常在約1到30mg/ml，典型地約25mg/ml。然后攪拌脂類混合物。例如可以使用超聲攪拌；如用微末端(microtip)450瓦超聲器，在40％負(fù)載循環(huán)下工作以制備SUV。超聲處理的時(shí)間取決于脂質(zhì)的量；總之，當(dāng)觀察到傳導(dǎo)百分比不再進(jìn)一步下降或通過(guò)粒徑分析儀分析已獲得正確的囊泡大小時(shí)，就停止超聲處理。如有需要，可用紫外光譜和薄層色譜(TLC)對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行分析以評(píng)估氧化的程度。
使干燥的脂質(zhì)再次水合可使用其它溶液。這些溶液包括以下緩沖液N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)，雙(2-羥乙基)氨基-三(羥乙基)甲烷(BIS-Tris)，N-(2-羥乙基)哌嗪-N’3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)，glyclclycine，N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)，3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)，哌嗪-N，N’-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)，碳酸氫鈉，3-(N-三(羥甲基)-甲基-氨基)-2-羥基-丙烷磺酸)TAPSO，(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)，N-三(羥甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)和三(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)。其它適用的溶液包括鹽溶液，如Alseverr氏羊血保存液、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、Earle氏平衡鹽溶液、Gey氏平衡鹽溶液(GBSS)、Puck氏鹽A、Tyrode氏鹽溶液、St.Thomas溶液和University of Wisconsin溶液。
可在SUV中加入其它成分以控制其融合速度。例如，與膜的融合有關(guān)的多肽，如fertilin、可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺-敏感因子聯(lián)接蛋白受體(SNAREs)，SM(sec1/munc18)多肽(例如Vps33p、Slylp和Vps45p的哺乳動(dòng)物的重整異構(gòu)體；(Jahn和Sudhof 1999))和病毒鞘融合蛋白，如來(lái)自人免疫缺陷病毒(HIV；如，gp41)、澤姆利基森林病毒和流感病毒的鞘融合蛋白)。哺乳動(dòng)物SNARE家族包括突觸融合蛋白(1A，1B，1C；2(和剪接變體)；3，3A，3B，3C，3D；4；5，5A，5B，6，7，8，10，11，12，13(可以和12相同)；16(A，B，C)；和17)，Hsyn 16，rbet1，GS15，GOS32，GOS28，Membrin，SNAPs(25，25a，25b；23，23A，23B；29)，vtilb，小突觸泡蛋白(1和剪接變體；2)，細(xì)胞短蛋白聚糖，VAMP4，VAMP5/6，Ti-VAMP，Endovrevin，Tomosyn和msec22b(Jahn和Sudhof 1999)。其它使膜去穩(wěn)定化的兩親肽，即使它們最初的功能并非用來(lái)調(diào)整膜的融合，也能被用于促進(jìn)融合，例如膜聯(lián)蛋白(Jahn和Sudhof 1999)。
為了對(duì)特定細(xì)胞具有靶向作用，將要么與針對(duì)靶細(xì)胞的多肽相互作用，例如配體-受體反應(yīng)(至少在給予SUVs的區(qū)域是這樣)，要么與識(shí)別細(xì)胞特異性抗原的抗體相互作用的多肽導(dǎo)入SUVs。其它靶向的多肽包括在那些在細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)中用到的多肽和Rab GTP酶蛋白。病毒融合蛋白也能開(kāi)發(fā)用作靶向分子。也可使用膜結(jié)合物質(zhì)，例如生物素基化脂質(zhì)，和糖類。
ATP包封典型地方法是，在脂質(zhì)再次水合時(shí)加入ATP的鎂鹽。ATP的濃度可根據(jù)具體應(yīng)用變化。優(yōu)先使用的ATP的濃度包括0.01mM到200mM，優(yōu)選0.1mM，1mM，2.5mM，5mM，7.5mM，10mM，25mM和50mM，更優(yōu)選0.1mM、1mM和10mM。含有ATP的緩沖液應(yīng)具有低蛋白含量以降低脂質(zhì)原料的非特異性吸收的機(jī)會(huì)。含有ATP的SUV方便起見(jiàn)稱作ATP-SUV。
被SUV包封的ATP易于進(jìn)行評(píng)估。例如，標(biāo)記ATP分子(如標(biāo)記不影響囊泡形成)，如放射性標(biāo)記ATP，優(yōu)選使用含氚ATP。放射性標(biāo)記包括32P和3H并且在干燥后、再次水合時(shí)、攪拌之前加入。溶液上Sephadex G-25柱(或其它適用的基質(zhì))以除去未包封的ATP。收集流出物，檢測(cè)囊泡的存在。SUV一般在最先被洗脫下來(lái)部分里。包封百分率通過(guò)定量測(cè)量囊泡和上清液部分的放射性來(lái)確定，測(cè)定已包封ATP的比率并乘以100。優(yōu)選的包封率從約1％到10％。
除ATP之外的分子也通過(guò)SUV遞送到細(xì)胞，如有機(jī)和無(wú)機(jī)分子，包括藥物、多肽、核酸和與細(xì)胞內(nèi)抗原相互影響的抗體。
測(cè)量SUV融合能力的檢測(cè)融合速率是測(cè)量在孔中脂質(zhì)囊泡每秒鐘與HUVEC細(xì)胞融合的數(shù)目(約106個(gè)細(xì)胞)，檢測(cè)包括下述步驟(1)培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞(American Type Culture Collection(ATCC)；Manassus，VA或BioWhittaker；MD)；(2)制備SUV，SUV裝有熒光探針，如羧基熒光素；(3)將SUV與細(xì)胞接觸使相融合；(4)在一個(gè)選定的時(shí)間，除去剩余的SUV；和(5)測(cè)量熒光。
除去SUV后熒光信號(hào)的存在和強(qiáng)度表明SUV與細(xì)胞膜融合以及遞送內(nèi)容物的能力。
以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為例。細(xì)胞在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的12-孔培養(yǎng)皿的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EGM)上生長(zhǎng)融合(例如，來(lái)自COSTAR；細(xì)胞的數(shù)目接近106)。然后把HUVECs用緩沖液，如HBSS沖洗3次。制備好的脂質(zhì)囊泡(例如DOPC/DOPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)，DOPC/POPA(1∶1)，PS，PG，MPC，PE，cit-DOPC和cit-DOPCe)中裝入1mM羧基熒光素。囊泡與細(xì)胞一起在37℃，95％空氣/5％CO2條件下培養(yǎng)120分鐘，每過(guò)5分鐘檢測(cè)一次熒光，這段時(shí)間之后，用緩沖液洗滌細(xì)胞除去剩余的囊泡。如果使用的是負(fù)電荷的脂質(zhì)囊泡，在融合步驟中應(yīng)加入鈣(最終濃度0.1-10mM)。
用胰蛋白酶處理從培養(yǎng)皿中除去細(xì)胞。使用熒光分光光度計(jì)或其它合適的儀器檢測(cè)熒光(在495nm下激發(fā)，在520nm下發(fā)射)。
ATP-SUV組合物的融合速率約為20個(gè)囊泡融合/秒至8.0×1011囊泡融合/秒，包括500到1×108囊泡融合；750000到50×107囊泡融合/秒；5×106到1×107囊泡融合/秒；包括1×106到8×108囊泡融合/秒；1×107到5×108囊泡融合/秒；和5×107到1×108囊泡融合/秒。例如融合速率是至少100，1000，104，105，106，107，108，109，1010，1011囊泡融合/秒。這些數(shù)值有一部分是通過(guò)在37℃下使用DOPC、DOPC/DOPC-e和DOPC/POPA，加入和不加入鈣，使用人內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。
因?yàn)榧?xì)胞漿膜的脂質(zhì)組合物因細(xì)胞類型不同而變化，所以需要仔細(xì)考慮選擇檢測(cè)用細(xì)胞，最好與靶細(xì)胞類型相匹配。例如，肝細(xì)胞漿膜含有約7％的磷脂酰膽胺，而紅細(xì)胞漿膜含有18％(Albert等2002)。原代培養(yǎng)細(xì)胞以及細(xì)胞系(購(gòu)自American Type TissueCollection(ATCC)；Manassus，VA)都可以使用，盡管因?yàn)榧?xì)胞漿膜脂質(zhì)組合物在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可能被改變而優(yōu)選原代培養(yǎng)物。細(xì)胞類型包括胰、腸、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)元(包括腦、眼、鼻和耳的)、肺、心、血液、循環(huán)(淋巴和血液)、骨、軟骨、生殖、腺、牙釉質(zhì)、脂肪、皮膚和肝的細(xì)胞。細(xì)胞系包括衍生自這些組織中的細(xì)胞，如Madin-Darby犬腎(MDCK)，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)，Hela，等。細(xì)胞也可以是來(lái)自其它有機(jī)體，如植物、真菌(包括酵母)和細(xì)菌。這些細(xì)胞類型融合速率包括至少100，1000，104，105，106，107，108，109，1010和1011囊泡融合/秒。除非另有注明，融合速率指的是HUVECs在上述指定條件下的融合速率。其它細(xì)胞類型的融合速率是約106個(gè)細(xì)胞，使用緩沖液如HBSS測(cè)得的，囊泡與細(xì)胞一起在37℃，95％空氣/5％CO2條件下培養(yǎng)120分鐘，之后，用緩沖液洗滌細(xì)胞除去剩余的囊泡。
最佳融合速率的檢測(cè)在特定的囊泡組合物與特定的細(xì)胞類型的融合速率達(dá)到最佳時(shí)，對(duì)融合速率的檢測(cè)方法還能進(jìn)一步修改。例如，脂質(zhì)囊泡可含有的熒光或放射性示蹤劑，它是囊泡雙層膜的一部分。
也可以使用其它熒光探測(cè)劑。這些探測(cè)劑包括熒光素異硫氰酸鹽；熒光素二氯三嗪和熒光素的熒光類似物；萘并熒光素羧酸及其琥珀酰亞胺酯；羧基若丹明6G；吡啶噁唑衍生物；Cy2，3和5；藻紅蛋白、包括丙酸琥珀酰亞胺酯和戊酸琥珀酰亞胺酯的琥珀酰亞胺脂，羧酸，異硫氰酸，磺酰氯和丹磺酰氯的熒光種類；羧基四甲基若丹明的琥珀酰亞胺酯；若丹明Red-X琥珀酰亞胺酯；Texas Red磺酰氯；Texas Red-X琥珀酰亞胺酯；Texas Red-X四氟苯酚鈉酯；Red-X；Texas Red染料；四甲基若丹明；麗絲胺若丹明B；四甲基若丹明；四甲基若丹明異硫氰酸鹽；萘并熒光素；香豆素衍生物；芘；吡啶唑衍生物；dapoxyl染料；級(jí)聯(lián)藍(lán)和黃染料；苯并呋喃異硫氰酸鹽；四氟苯酚鈉；和4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene。這些化合物的激發(fā)波長(zhǎng)各不相同。在一定比例的示蹤劑1∶800脂質(zhì)/探測(cè)劑存在的條件時(shí)制備脂質(zhì)囊泡。其它有效的比例包括1∶200到1∶10,000，包括1∶400，1∶500，1∶600，1∶700，1∶800，1∶900和1∶1000。
改變?nèi)诤纤俾嗜魏沃|(zhì)囊泡的融合速率都能通過(guò)多種因素的改變來(lái)調(diào)整，例如溫度、離子、脂質(zhì)濃度、脂質(zhì)囊泡組合物、流速、脂質(zhì)囊泡大小，等。對(duì)SUV磷脂的劑型進(jìn)行改變可用于使融合速率最大化以及毒性最小化。例如，為了保護(hù)用于移植的器官或懸浮液(如血液)中的細(xì)胞，需要具有較低、緩慢的融合速率的SUV。只含DOPC的囊泡能獲得這樣的融合速率。另一方面，如果迅速提升細(xì)胞內(nèi)ATP的含量至關(guān)重要，例如對(duì)于中風(fēng)、心臟病發(fā)作或創(chuàng)傷的患者，則期望獲得具有很快遞送速率的SUV；例如，DOPC/PODA組合物在不到五分鐘內(nèi)能遞送足夠的ATP(參見(jiàn)實(shí)施例)。
四種常規(guī)的方法可用于通過(guò)控制脂質(zhì)組合物改變?nèi)诤纤俾?1)加強(qiáng)靜電相互作用；(2)使雙層膜去穩(wěn)定化；(3)增加非雙層相；和(4)生成不同的脂相。
加強(qiáng)靜電相互作用靜電相互作用能用于提升融合速率。磷脂根據(jù)其電荷進(jìn)行分類(陽(yáng)離子、陰離子和兩性離子)。許多陽(yáng)離子磷脂如PE，和陰離子磷脂如磷脂酸(POPA)，在生理pH條件下不能形成封閉的囊泡。但是混合有兩性離子磷脂酰膽堿的陽(yáng)離子和陰離子脂質(zhì)能在生理pH條件下形成封閉的囊泡。
大多數(shù)細(xì)胞漿膜的帶負(fù)電荷。因?yàn)檫@些負(fù)電荷，存在一層保持荷電平衡的離子，典型的有鈣、鎂、鈉和鉀離子，它們具有正的凈電荷。利用脂質(zhì)體和細(xì)胞漿膜之間靜電的相互作用，將SUV設(shè)計(jì)成具有凈的負(fù)電荷，以使得細(xì)胞脂質(zhì)囊泡融合最大化。然而，一些細(xì)胞漿膜含有較多的陽(yáng)離子脂質(zhì)，它們通過(guò)一個(gè)陰離子層保持電荷平衡。在這些情況下，將SUV設(shè)計(jì)成具有正的凈電荷以使細(xì)胞脂質(zhì)囊泡融合最大化。
生成不同的脂相細(xì)胞漿膜含有富集特定脂質(zhì)的脂域或脂筏。在這樣一種膜的邊界上，筏就是不同脂質(zhì)的區(qū)域。這些區(qū)域具有潛在的不穩(wěn)定性，影響到了該膜與其它膜之間相互作用的方式。已知有幾種磷脂有助于脂筏的形成，包括磷脂酰膽堿、鞘磷脂和膽固醇的混合物。例如，在制備SUV時(shí)，DOPC，18∶0鞘磷脂和膽固醇以1∶1∶1的比例混合。膽固醇優(yōu)先在鞘磷脂相中分配，形成DOPC富集而膽固醇很少的區(qū)域，和鞘磷脂和膽固醇都富集的區(qū)域。
改變?nèi)诤系奈锢韰?shù)，如溫度，濃度、離子強(qiáng)度和融合期，也能影響到融合速率。通過(guò)改變溫度，系統(tǒng)的自由能(G)被改變，產(chǎn)生不同的融合速率。提高脂質(zhì)囊泡的濃度也會(huì)影響膜的融合速率，尤其在很高濃度下。融合期(融合的長(zhǎng)度)和融合期的數(shù)量也會(huì)影響遞送SUV中包封的內(nèi)容物的速率。
溫度ATP-SUV與組織一起在組織的保藏溫度下(4℃-低溫，22℃-室溫，37℃-溫度正常)培養(yǎng)5、10、15、30、60或120分鐘。升高囊泡溶液的溫度導(dǎo)致囊泡的動(dòng)能增加，融合能力因之獲得增強(qiáng)。溫度也會(huì)影響囊泡的自由擴(kuò)散。
囊泡融合的濃度憑直覺(jué)，濃度升高，SUV內(nèi)容物的遞送也會(huì)提高，但膜的融合速率并非線性變化。一旦SUV脂質(zhì)占據(jù)所有可能的細(xì)胞漿膜的表面，進(jìn)一步融合就受到了限制。與細(xì)胞漿膜融合的程度影響膜的通量和性質(zhì)，例如離子滲透性和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)給予SUV時(shí)，必須控制SUV的濃度以使靶細(xì)胞得到有效的處理。
融合期能夠進(jìn)行融合的時(shí)間長(zhǎng)度可用于控制已包封物質(zhì)遞送的程度。優(yōu)選的融合期是1-180分鐘，例如1，5，10，30，60，120和180分鐘。為了停止融合，需除去囊泡(例如通過(guò)緩沖液洗去)，或給予的囊泡濃度正好使囊泡在在預(yù)期時(shí)間的終點(diǎn)耗盡。融合也可以被優(yōu)化以使囊泡的遞送總量可以通過(guò)一種或多次給藥加以控制。例如，如果目標(biāo)融合期是120分鐘，就可以使用兩個(gè)60分鐘，或四個(gè)30分鐘，12個(gè)10分鐘，或24個(gè)5分鐘的融合期。如果有合適的裝置，1分鐘或更短的融合期也是可以實(shí)現(xiàn)的，盡管這樣短的融合期經(jīng)常是難于實(shí)現(xiàn)并需要一定的技術(shù)。
測(cè)定靶細(xì)胞和組織對(duì)ATP的需求給予ATP的最佳速率是接近細(xì)胞基礎(chǔ)代謝對(duì)ATP需求的速率；這可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定。可以計(jì)算耗氧速率、丙酮酸鹽、葡萄糖、乳酸鹽和質(zhì)子泄漏(proton leak)，由這些數(shù)據(jù)可以測(cè)定組織消耗ATP的量，以所消耗的ATP/分鐘為單位。
組織耗氧量將組織樣品置于預(yù)冷至-20℃的玻璃勻漿器中。加入以冰水冷卻分離緩沖液，如200mM蔗糖、70mMKCl、5mM馬來(lái)酸鹽和40mMpH7.3的Tris，將組織緩緩勻化。勻漿快速地離心除去未被勻漿的物質(zhì)。然后將五毫升氧合緩沖液置于測(cè)氧計(jì)中并使其平衡至37℃。將細(xì)胞置于一個(gè)YSI氧浴攪拌器(Yellow Springs，OH)以使最終蛋白質(zhì)的濃度為2-3mg/ml。將氧探針?lè)旁谌芤褐?，并用YSI測(cè)氧計(jì)測(cè)量溶液中氧的百分?jǐn)?shù)。然后將ADP加入浴液測(cè)得狀態(tài)2呼吸速率，然后通過(guò)加入谷氨酸鹽測(cè)得狀態(tài)3呼吸速率。一旦谷氨酸鹽被組織消耗，就測(cè)得最終的呼吸狀態(tài)，狀態(tài)4。根據(jù)狀態(tài)3呼吸速率對(duì)加入勻漿中的ADP量的曲線，可計(jì)算出磷/氧(P/O)的比例。該值測(cè)定組織每分鐘可以從ADP產(chǎn)生的ATP量，這是組織每分鐘耗ATP的量的指標(biāo)。
膜電位和質(zhì)子泄漏將組織樣品分離出來(lái)，與膜電位熒光探測(cè)劑(Sigma；St.Louis，MO)一起培養(yǎng)。MC540的熒光因加入鉀量的不同而變化，按先前所述的方法(Brand，1995)以膜電位和質(zhì)子泄漏作指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量。
葡萄糖、丙酮酸鹽與乳酸鹽水平這些代謝的中間產(chǎn)物使用標(biāo)準(zhǔn)方法或用市售分析試劑盒(例如購(gòu)自Sigma公司的試劑盒)測(cè)定。這些中間產(chǎn)物的水平被校至蛋白質(zhì)水平，在一個(gè)超過(guò)120分鐘的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。
ATP消耗量的測(cè)定根據(jù)乳酸鹽、丙酮酸鹽和葡萄糖蓄積量、耗氧量和質(zhì)子泄漏的比值，按照Ainscow和Brand所述的反應(yīng)化學(xué)計(jì)量法計(jì)算所有通過(guò)系統(tǒng)的流出物是可能的。
給藥藥物組合物在許多情況下，可將ATP-SUV以一種含有ATP-SUV和用來(lái)制備ATP-SUV的緩沖液的簡(jiǎn)單組合物形式遞送。然而如有需要，也可以加入其它產(chǎn)品，如在傳統(tǒng)上用作藥物組合物載體的產(chǎn)品。
“藥學(xué)上可接受的載體”包括與藥物給藥方式相適應(yīng)的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等(Remington2000)。優(yōu)選的這類載體或稀釋劑的例子包括水、鹽水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。也可將作為補(bǔ)充的活性化合物加入到組合物中。
總體考慮將本發(fā)明的藥物組合物配制成與所設(shè)計(jì)的給藥途徑相適應(yīng)的劑型，包括靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、吸入、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥和直腸給藥。作非胃腸道、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液和混懸液包括滅菌的稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)谆剑豢寡趸瘎┤缈箟难峄騺喠蛩釟?bisulfite)鈉；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉和葡萄糖。非胃腸道制劑可以密封在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量的小瓶?jī)?nèi)。
如果帶負(fù)電荷的脂質(zhì)囊泡用于ATP-SUV，其中必然包括鈣，最終在融合點(diǎn)鈣的濃度優(yōu)選在0.1mM-10mM之間，包括0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。
ATP-SUV中的ATP通常與ATP-SUV周圍任何溶液中的ATP保持平衡；典型地，只有ATP總量1-10％在ATP-SUV里面。剩余的ATP與受體結(jié)合，例如與嘌呤受體P2y結(jié)合，使離子流出細(xì)胞，影響離子平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。盡管細(xì)胞通?？梢灾亟x子平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但畢竟這一過(guò)程消耗了額外的ATP。因此，特別是對(duì)組織而言，需要即時(shí)的存儲(chǔ)功能(例如，在器官移植中，或斷肢再接中)，在組合物中包括一種或多種嘌啉受體P2y拮抗劑也是有利的。由于嘌啉受體P2y拮抗劑不需置于SUV內(nèi)，所以拮抗劑優(yōu)選在囊泡形成后加入，或者在給藥前不久加入。嘌啉受體P2y拮抗劑的例子包括吡哆醛5-磷酸鹽、維他命B6(吡哆醛-5-磷酸)和Reactive Blue2(1-氨基-4-[[4-[[4-氯-6-[[3(或4)-磺苯基]氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-3-磺苯基)氨基-9，10-二氫-9，10-二氧-2-蒽磺酸)，及其組合。優(yōu)選使用嘌啉受體P2y拮抗劑的濃度為0.1到250微摩爾/升，更優(yōu)選1-100微摩爾/升。
注射制劑適合作為注射劑的藥物組合物包括用于即時(shí)制備無(wú)菌注射用溶液或分散體的無(wú)菌水溶液或分散體。對(duì)于靜脈給藥，適宜的載體包括生理鹽水、制菌水、CREMOPHOR ElTM(BASF，Parsippany，N.J.)或者磷酸鹽緩沖液(PBS)。無(wú)論如何，組合物必須無(wú)菌和流體的，這樣就可以通過(guò)注射器給藥。這類組合物應(yīng)在制備和儲(chǔ)存中保持穩(wěn)定，必須保持不被微生物如細(xì)菌和真菌污染。載體可以是含有如水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)和其它相容的、合適的混合物在內(nèi)的適宜分散體介質(zhì)。不同的抗菌劑和抗真菌劑，如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫汞撒會(huì)制約微生物污染。組合物中可包括等滲劑如糖、多元醇，多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化鈉。組合物可以包括延遲吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠。
無(wú)菌注射液的制備可通過(guò)將需要量的ATP-SUV和一種所需成分或多種所需成分的組合一起加入到適宜的溶劑中，然后進(jìn)行滅菌處理。制備用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌固體的方法包括真空干燥和冷凍干燥以獲得一種固體，固體中含有ATP-SUV脂質(zhì)和任意所需成分(如ATP)無(wú)菌溶液。
口服組合物口服組合物一般包括惰性稀釋劑和可食用的載體。被密封于明膠膠囊或壓成片劑。為了口服治療給藥，活性化合物與賦型劑一起加入并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物可用流體載體制備作為漱口劑使用，其中流體載體中的化合物通過(guò)口服使用。藥學(xué)上相容的粘合劑，和/或助劑材料也可包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任何下列成分，或性能相近的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦型劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸，PRIMOGEL，或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或STEROTES；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、甲基水楊酸鹽或桔味劑。
吸入劑組合物對(duì)于吸入給藥，化合物通過(guò)噴霧劑或高壓容器以氣溶膠噴霧遞送，噴霧器或高壓容器含有合適的拋射劑，例如二氧化碳?xì)怏w。
經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚給藥可以經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚給藥。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚給藥，選擇可以滲透進(jìn)入靶屏障的滲透劑。經(jīng)粘膜的滲透劑包括，去污劑，膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。噴鼻劑或栓劑作經(jīng)粘膜給藥用。對(duì)于經(jīng)皮膚給藥被配制成軟膏、油膏、明膠或霜?jiǎng)?。也可以制成栓?例如使用椰子油或其它甘油酯作為基質(zhì))或保留灌腸劑(retention enemas)進(jìn)行直腸遞送。
載體在一個(gè)實(shí)施方案中，用保護(hù)化合物不被身體快速排出的載體配制活性化合物，例如控釋制劑，包括植入片和微囊包封遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到夂蜕锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯醋酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯，和聚乳酸。這類材料可購(gòu)自ALZACorporation(Mountain View，CA)和NOVA Pharmaceuticals，Ins.(LakeElsinore，CA)，或者由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。
劑量劑量決定于并直接依賴于ATP-SUV的獨(dú)特的特性，ATP-SUV的獨(dú)特的特性隨不同SUV脂質(zhì)組合物、具體所需的療效和給藥途徑而變化。具體的劑量水平和次數(shù)對(duì)于任何特定的患者或應(yīng)用都是可變的。應(yīng)考慮各種因素，其中包括(1)給藥和發(fā)生融合時(shí)的溫度；(2)給藥部位的離子環(huán)境和ATP-SUV組合物的離子強(qiáng)度；和(3)融合發(fā)生的時(shí)間長(zhǎng)度?？刂七@些因素有助于控制已包封物質(zhì)包括ATP的遞送范圍。
當(dāng)給予SUV時(shí)，通過(guò)用SUV使細(xì)胞漿膜飽和來(lái)控制SUV的濃度以有效處理靶細(xì)胞而不抑制其功能。優(yōu)選的SUV濃度依賴于脂質(zhì)組合物、給藥的靶細(xì)胞的散布和體積，可以是0.5mg/ml-100mg/ml，比如0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml和100mg/ml。
囊泡融合經(jīng)靜電相互作用發(fā)生，這一過(guò)程受到鈣和或鎂濃度變化的顯著影響，也在較輕程度上受到鈉和或鉀濃度變化的影響。調(diào)節(jié)這這些離子濃度，在給予ATP-SUV之前或之后或者在將用于給予ATP-SUV的組合物中進(jìn)行或者在已給藥到靶點(diǎn)的組合物中進(jìn)行，它們影響了對(duì)劑量的考慮。優(yōu)選地，所用的離子濃度為0.01nm到1nm，包括0.1nm、1nm、10nm、100nm、1000nm，10毫摩爾/L和100毫摩爾/L。
可以使用長(zhǎng)期的或單劑量的給藥，并根據(jù)治療的類型、給藥途徑和囊泡本身進(jìn)行選擇。優(yōu)選的融合期包括1-180分鐘，例如1、5、10、30、60、120和180分鐘。為了停止融合，需除去ATP-SUV(例如通過(guò)緩沖液洗去)，或給予的囊泡濃度正好使囊泡在在預(yù)期時(shí)間的終點(diǎn)耗盡。融合也可以被優(yōu)化以使囊泡的遞送總量可以通過(guò)一種或多次給藥加以控制。例如，如果目標(biāo)融合期是120分鐘，就可以使用兩個(gè)60分鐘，或四個(gè)30分鐘，12個(gè)10分鐘，或24個(gè)5分鐘的融合期。
ATP-SUV的用途因?yàn)榧?xì)胞對(duì)ATP的普遍需求，ATP-SUV和其它SUV/ATP組合物橫跨生物界具有廣泛的用途。
血液血可以冷藏儲(chǔ)存約45天，之后紅細(xì)胞死亡。通常紅細(xì)胞在體循環(huán)中存活約120天，此后就被脾和肝除去并破壞。因此如果不能存活的細(xì)胞用于輸血，它們同樣從體循環(huán)中被迅速除去。
加入ATP-SUV或其它SUV包封ATP的組合物，以收集血液使紅細(xì)胞存活更久，延長(zhǎng)存活狀態(tài)下的儲(chǔ)藏時(shí)間和提高了細(xì)胞留在體循環(huán)中不被破壞的可能性。
脂質(zhì)組合物可以進(jìn)行改變以優(yōu)化ATP的遞送。例如，因?yàn)檠涸?℃下儲(chǔ)存時(shí)，代謝對(duì)ATP的需求降低。即使在該溫度下SUV的融合速率會(huì)降低，但該融合速率對(duì)于獲得存活儲(chǔ)存和SUV脂組合物可能還是太高以致不能滿足血細(xì)胞的代謝需求。
但所有收集的血液在存儲(chǔ)時(shí)與本發(fā)明的組合物相接觸，白細(xì)胞和血小板也會(huì)受益并存活更長(zhǎng)時(shí)間。
支持離體部分再植入在身體某部分被切斷(通常是無(wú)意的)后，成功的再植入很大程度上依賴于肢體離體后的存活能力。局部缺血時(shí)間越長(zhǎng)，再植入后得到正常機(jī)能的肢體的可能性就越小，或者無(wú)論如何都不會(huì)成功。
在一實(shí)施例中，撿回的斷肢(recovered severed limb)的主要給養(yǎng)動(dòng)脈進(jìn)行插管灌注。肢體灌注ATP-SUV，每四小時(shí)一次，或根據(jù)組織ATP水平變化的需要灌注。灌注期間監(jiān)控肢體的動(dòng)脈壓力，以降低流動(dòng)誘導(dǎo)損傷的機(jī)會(huì)，并且通過(guò)病肢的高灌注壓全面監(jiān)控病肢的保存情況，病肢的高灌注壓可指示肢體的發(fā)病。在保存期之后，肢體用Ringers或其它合適的溶液沖洗以除去ATP-SUV的痕跡。然后使用公知的方法通過(guò)外科手術(shù)將肢體再連接上。吻合術(shù)后肢體功能的外部指標(biāo)被評(píng)估(顏色、微血栓的跡象、溫度、脈搏、氧飽和度、Doppler流體測(cè)量?jī)x)以監(jiān)控是否成功。再植入之前或之后，推薦用肝素和抗菌療法以減少感染的可能。
心臟驟停在缺氧發(fā)作后立即或盡可能快的將ATP-SUV通過(guò)靜脈或心內(nèi)注射注入心臟。小心地控制SUV脂質(zhì)組合物使ATP遞送符合心臟組織代謝的需要，使心臟性能最佳。在生理?xiàng)l件下ATP-SUV可以持續(xù)灌入心臟直至局部缺血的危險(xiǎn)過(guò)去。
為保存器官遞送ATP器官(例如心臟、肝、肺或胰)從捐獻(xiàn)者體內(nèi)摘除，器官內(nèi)主要的給養(yǎng)動(dòng)脈被切斷。器官內(nèi)的血液從器官中用鹽水、Ringers溶液或其它適合的溶液沖洗。將ATP-SUV加入常規(guī)的保藏溶液或緩沖液，并緩緩灌入器官，灌注次數(shù)取決于器官。
同樣的ATP-SUV被用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)布置。例如采用Lagendorff心臟(或其它器官)灌注設(shè)備。切斷大動(dòng)脈并將心臟置于灌注室。把加入ATP-SUV的氧合灌注液灌入心臟中。注射高濃度的鉀溶液室心博停止。ATP-SUV下的心麻痹可在保存期間采用。心臟可以再灌注進(jìn)行功能性研究或在缺血保存后移植。
系統(tǒng)遞送ATP諸多理由需要給予有機(jī)體ATP-SUV。例如，使用ATP補(bǔ)充體內(nèi)能量(優(yōu)選的給藥途徑為口服、局部或吸入)，或使用ATP降低整個(gè)身體對(duì)氧的依賴(優(yōu)選的給藥途徑為靜注)。當(dāng)經(jīng)由頸動(dòng)脈的動(dòng)脈持續(xù)注入給予動(dòng)物體ATP-SUV時(shí)，心率和血壓降低，呼吸停止。甚至在9分鐘的低氧狀態(tài)后動(dòng)物仍可蘇醒(參見(jiàn)實(shí)施例)。
ATP-SUV用于創(chuàng)傷因?yàn)榱飨騽?chuàng)傷的血液減少，供給創(chuàng)傷上和創(chuàng)傷周圍細(xì)胞的氧變少。氧的遞送的下降導(dǎo)致ATP產(chǎn)生的下降，這就延緩了創(chuàng)傷愈合許多必需的細(xì)胞過(guò)程，包括蛋白質(zhì)和核酸的合成、離子通道的功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)動(dòng)。
因?yàn)閯?chuàng)傷愈合和ATP消耗的程度而需要將ATP-SUV應(yīng)用于創(chuàng)傷。例如，給創(chuàng)傷的邊緣細(xì)胞提供充足的ATP以促進(jìn)創(chuàng)傷封口。ATP-SUV優(yōu)選一天使用1-12次，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次/天。優(yōu)選地，通過(guò)一個(gè)專門設(shè)計(jì)的涂藥器將ATP-SUV直接置于創(chuàng)傷上，涂藥器可使以水為基質(zhì)的ATP-SUV直接與創(chuàng)傷相接觸。
另外，ATP-SUV的應(yīng)用形式可以是霜?jiǎng)┗蚱渌植拷o藥的局部給藥藥物組合物。
ATP-SUV可以和其它起治愈作用的組合物一起使用，進(jìn)一步促進(jìn)愈合。例如ATP-SUV可以和貝卡勒明聯(lián)用，見(jiàn)于Regranex。貝卡勒明之外的創(chuàng)傷治療成分包括防腐劑、抗生素和麻醉劑。術(shù)語(yǔ)“創(chuàng)傷治療成分”不包括SUVs。
ATP-SUV用于出血性休克內(nèi)傷或外傷所致的出血性休克會(huì)導(dǎo)致大量失血。因?yàn)楣┭怀浞?，主體常會(huì)形成低血壓，導(dǎo)致器官衰竭和猝死。
為了抵消出血性休克的影響，將ATP-SUV通過(guò)靜脈灌注作為輸血法的補(bǔ)充。當(dāng)全身含氧量改善時(shí)可降低ATP-SUV用量。
ATP-SUV用于血小板儲(chǔ)存血小板具有大約5天的貯存期，之后就必須棄去。血小板功能的喪失部分是因?yàn)锳TP的損失。
給予分離出的血小板ATP-SUV以滿足維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平的需求。血小板的貯存期延長(zhǎng)。將ATP-SUV混懸于適當(dāng)?shù)娜芤褐杏糜谘“鍍?chǔ)存，例如鹽水。SUV脂質(zhì)組合物可以改變以優(yōu)化給藥。例如因?yàn)檠“逶谑覝叵聝?chǔ)存(22-24℃)，對(duì)ATP的代謝需求會(huì)低于生理溫度(37C)。即使在該溫度下SUV的融合速率會(huì)降低，但融合速率對(duì)于獲得存活儲(chǔ)存可能還是太高，將SUV脂質(zhì)組合物衍生化將更好地與血小板的代謝需求相匹配。
ATP-SUV用于器官和組織工程組織可以在體外高效生長(zhǎng)。然而，這樣的組織缺乏連接血液供給的脈管系統(tǒng)。ATP-SUV有助于克服這一不足。
ATP-SUV可選擇性地用于分離組織中血管網(wǎng)的保存，例如骨骼肌中的。所制備的ATP-SUV中的脂質(zhì)組合物不會(huì)輕易從血管中逃逸。
給予ATP-SUV以維持脈管系統(tǒng)，但對(duì)實(shí)質(zhì)無(wú)效，它們會(huì)死亡。在合適的條件下用能分化成特定組織的干細(xì)胞接種并培養(yǎng)完整的脈管系統(tǒng)。在體外制備的組織可以通過(guò)這種方式形成血管，例如肝、胰、心、肺和脾。
另外，進(jìn)行體外構(gòu)建的器官也可以通過(guò)相同方式部分地形成血管，不包括器官細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)后采集和處理脈管系統(tǒng)。
在外科手術(shù)中使用ATP-SUV在大部分外科手術(shù)過(guò)程中都會(huì)伴生血流和氧的下降。ATP-SUV可以全身給藥或給予與外科手術(shù)過(guò)程有關(guān)的區(qū)域以使損傷最小化，不產(chǎn)生缺血癥和低氧癥。例如可用到ATP-SUV的外科手術(shù)包括冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、開(kāi)放式心臟手術(shù)，游離瓣轉(zhuǎn)移，和某些整形外科手術(shù)。
在一些外科手術(shù)中，脊髓因?yàn)樵谑中g(shù)過(guò)程中接受不到足夠的氧而導(dǎo)致麻痹。常見(jiàn)于主動(dòng)脈瘤切除。將ATP-SUV應(yīng)用于所波及的區(qū)域或經(jīng)靜脈給藥，使外科醫(yī)生獲得更多時(shí)間進(jìn)行手術(shù)，降低了過(guò)分缺氧所致傷害的可能性，并降低了發(fā)病率。
ATP-SUV用于中風(fēng)目前，中風(fēng)后迅速服用高濃度的葡萄糖溶液，用以降低流向大腦的血液減少的影響。人們期望葡萄糖能提高神經(jīng)細(xì)胞ATP的水平并減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡。但是，當(dāng)氧的供應(yīng)受限制時(shí)，該目標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)。ATP-SUV能更為有效地為神經(jīng)組織提供ATP。
ATP-SUV用于呼吸問(wèn)題許多呼吸性養(yǎng)料降低了生命的質(zhì)量。并經(jīng)常導(dǎo)致死亡。在這些情況下，死亡的主導(dǎo)因素是血液中氧的缺乏，并導(dǎo)致組合和器官死亡。向受治療者灌注以ATP-SUV可以降低血氧水平下降的影響。
ATP-SUV用于癌癥患者末期癌癥患者因并發(fā)癥死亡。是因?yàn)榘┌Y或治療使其變得虛弱，癌癥患者經(jīng)常死于肺炎。導(dǎo)致虛弱的原因是癌細(xì)胞奪取了寶貴的代謝資源因而使健康細(xì)胞枯竭，或非癌健康細(xì)胞在治療中被破壞?；蚨叨加?。癌癥患者每日服用ATP-SUV以補(bǔ)充全身ATP水平，因而能降低癌細(xì)胞侵吞代謝資源的影響。通過(guò)服用ATP-SUV，癌癥的后遺癥減輕，延長(zhǎng)了存活時(shí)間。
ATP-SUV用于化學(xué)毒物通過(guò)用ATP-SUV可以成功地抵制氰化物和其它阻礙了線粒體生產(chǎn)ATP或以其它方式降低細(xì)胞產(chǎn)出ATP的化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞和組織浸泡在氰化物中，ATP-SUV維持了它們的存活和功能。ATP-SUV在線粒體制備的ATP缺失的情況下增加了胞質(zhì)中的ATP。ATP-SUV可以作為氰化物和其它作用方式類似于氰化物的有毒物質(zhì)的解毒劑。ATP-SUV也可用于降低一氧化碳中毒的影響。
ATP-SUV用于蛋白質(zhì)、糖類、核苷酸和其它藥物的遞送。
高度融合的含有ATP-SUV的脂質(zhì)囊泡可以制成水溶液或膜結(jié)合蛋白、糖類、核苷酸和其它藥物的形式，因此得以向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜有效遞送任何前述物質(zhì)。這種給藥方式繞過(guò)了許多傳統(tǒng)的問(wèn)題，和(1)允許導(dǎo)入不能透過(guò)膜的藥物，因而大大拓展了可用藥物的范圍以及提高了膜滲透率較低的藥物的透過(guò)率；和(2)允許直接向細(xì)胞膜內(nèi)導(dǎo)入多肽和糖類。最后的益處在于例如允許進(jìn)行置換療法，繞過(guò)了不確定的基因療法的方式。例如受治療者的細(xì)胞上缺少一個(gè)受體，該受體可以導(dǎo)入ATP-SUV樣的SUVs中，以適當(dāng)方式給藥。
這些方法類似于將ATP導(dǎo)入細(xì)胞的方法，除了SUV用囊泡內(nèi)的物質(zhì)和/或膜能合并的分子裝填之外。
ATP-SUV用于低氧環(huán)境潛水、太空行走、高海拔和其它情況下，氧的稀缺導(dǎo)致遞送到身體的氧減少。為了補(bǔ)償氧的短缺，可經(jīng)靜脈、口服和通過(guò)吸入給予ATP-SUV。
ATP-SUV用于肉類保存在用于組織、器官保存和動(dòng)物、患者之外，ATP-SUV可使肉的細(xì)胞在缺氧條件下成活。宰殺后，動(dòng)物出血且殘留的血從屠體中沖走。通過(guò)頸動(dòng)脈或其它大動(dòng)脈給動(dòng)物灌注ATP-SUV，用ATP-SUV填充血管系統(tǒng)。
含有ATP-SUV的動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)送時(shí)，保持了動(dòng)物細(xì)胞存活因而延長(zhǎng)了肉類的儲(chǔ)存期，類似于ATP-SUV延長(zhǎng)了血液的儲(chǔ)存期。由于ATP-SUV利用的是內(nèi)源性成分，肉的口感和質(zhì)構(gòu)不受影響。
ATP-SUV用于植物植物利用光合作用維持生命和生長(zhǎng)。光合作用可分成兩步光反應(yīng)，該步驟從太陽(yáng)光中獲得能量并將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，即ATP和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；和暗反應(yīng)，該反應(yīng)使用ATP和NADPH固定CO2。
通過(guò)根系統(tǒng)或直接應(yīng)用于葉、莖、花、分生組織和其它植物部分來(lái)給植物提供ATP-SUV。ATP-SUV遞送植物細(xì)胞暗反應(yīng)所需的ATP。使用ATP-SUV進(jìn)行ATP的遞送減少或繞過(guò)了對(duì)陽(yáng)光的需要，使植物在黑暗條件或在少光條件下生長(zhǎng)。此外，ATP-SUV促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，維持了植物生命，重要的方面是在市場(chǎng)、插花業(yè)和水耕園藝上使植物保鮮。
用于生物反應(yīng)器的ATP-SUV對(duì)于生物反應(yīng)器的產(chǎn)率而言，主要的限制因素是細(xì)菌和酵母，這些物質(zhì)的初級(jí)產(chǎn)物，必須具有充足的底物用以制造ATP。因而，細(xì)菌或酵母的數(shù)量在任何一種培養(yǎng)物中都受到限制。ATP-SUV被諸如生物反應(yīng)器以提高微生物的數(shù)量，提高生物反應(yīng)器的產(chǎn)出。該應(yīng)用不限于細(xì)菌和真菌，是因?yàn)榕囵B(yǎng)的昆蟲、動(dòng)物、植物和其它真核細(xì)胞對(duì)于ATP的制備有同樣的需求。
實(shí)施例提供下述實(shí)施例以舉例說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的組合物和方法可以進(jìn)行不顯著的改變。無(wú)論如何實(shí)施例都不能被理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1脂質(zhì)囊泡的構(gòu)造囊泡由1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)；1，2-二油酰-sn-甘油-乙基磷酸膽堿(DOPC-e)和1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸鹽(POPA)脂質(zhì)構(gòu)成。(均購(gòu)自Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL).脂質(zhì)在使用時(shí)不需要進(jìn)一步純化。將脂質(zhì)溶于氯仿，然后置于玻璃試管內(nèi)，在穩(wěn)定的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)除去氯仿，接著進(jìn)行抽真空處理過(guò)夜。在高于相轉(zhuǎn)移溫度(25℃)下，將干燥后的脂質(zhì)在HBSS實(shí)驗(yàn)緩沖液(Sigma；St.Louis，MO)中再次水合30分鐘。將兩個(gè)玻璃珠加入緩沖液/脂質(zhì)混合物，混懸液渦旋5分鐘制成多層囊泡。乳狀液用微末端(microtip)Branson Sonifier 450超聲處理，微末端置于試管內(nèi)。將囊泡在5級(jí)水平、40％負(fù)載循環(huán)條件下超聲5分鐘，以制得小的單層囊泡(SUV)。
實(shí)施例2ATP的包封為了驗(yàn)證實(shí)施例1中的囊泡已摻入ATP，在制備多層囊泡前將30μCi的3H-ATP(Amersham；Arlington Height，IL)加入實(shí)驗(yàn)緩沖液?；鞈乙哼^(guò)Sephadex(Sigma) G-25柱(1cm×40cm)以除去未包封的ATP。在最初的50ml流出液中收集囊泡。包封百分率通過(guò)用液閃計(jì)數(shù)器測(cè)量囊泡中和上清液里的放射性來(lái)確定。含有DOPC，DOPC/COPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)和DOPC/POPA(1∶1)的囊泡均顯示出近乎相同ATP包封百分率，在溶液中ATP原始量的1到2.5％之間變化。
實(shí)施例3囊泡對(duì)HUVEC的融合速率以及包封內(nèi)容物在細(xì)胞質(zhì)中的釋放為了測(cè)定SUV的融合速率，將SUV裝上熒光探針，呈遞至體外的細(xì)胞，沖洗，并分析細(xì)胞的熒光。
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購(gòu)自BioWhitaker(Walkersville，MD)的1代，培養(yǎng)直到8代為止，之后就不能再用。HUVEC是在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)(EGM；BioWhiaker)，在12-孔培養(yǎng)皿的EGM介質(zhì)上生長(zhǎng)融合。然后將HUVEC用HBSS沖洗3次。脂質(zhì)囊泡按實(shí)施例1的方法制備，但囊泡中加入1mM羧基熒光素。囊泡與細(xì)胞一起在潮濕的培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)5、10、30、45、60和90、120和240分鐘，然后將囊泡從細(xì)胞上洗脫，細(xì)胞用胰蛋白酶輕輕從培養(yǎng)皿上除去。羧基熒光素在HUVEC中的熒光用Perkin-Elmer LS5OBLuminescence Spectrophotometer(Wellesly，MA)測(cè)量，在495nm下激發(fā)、在520nm下發(fā)射。在一些試驗(yàn)中，細(xì)胞不用胰蛋白酶處理，拍攝細(xì)胞的顯微照片以證明融合過(guò)程中的同質(zhì)性。該試驗(yàn)熒光單位(Fus)的范圍在0到450個(gè)單位之間。融合速率高度依賴于SUV的脂質(zhì)組合物。在前30分鐘DOPC極少融合或完全不融合，此后融合速率呈對(duì)數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，直至約350Fus。與之對(duì)比，DOPCDOPC-e(1∶1)給出更快的初始融合速度和較低的最終融合率(在5分鐘時(shí)約35Fus；在120分鐘時(shí)約100Fus)。在用DOPCPOPA(1∶1)時(shí)產(chǎn)生了最快的融合速率，表現(xiàn)為在5分鐘內(nèi)遞送了大量的ATP。正如預(yù)期的一樣，三種囊泡的融合速率明顯分為快、中、慢三種。
要解決的一個(gè)問(wèn)題是囊泡是否確實(shí)與細(xì)胞融合還是僅僅聚集在細(xì)胞表面。為了檢驗(yàn)這一點(diǎn)，將HUVEC暴露于脂質(zhì)囊泡，且不從培養(yǎng)孔中除去，通過(guò)熒光顯微鏡法檢查熒光的分布。將細(xì)胞暴露于所有三種組合物，5分鐘后熒光擴(kuò)散遍布細(xì)胞而不是形成熒光斑點(diǎn)，如果是后者則提示脂質(zhì)體正隔離(sequestering)囊泡，阻斷了羧基熒光素進(jìn)入細(xì)胞?；蛘呤?，囊泡聚集于細(xì)胞表面。這些結(jié)果驗(yàn)證了脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞的融合，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋出已包封的內(nèi)容物而不是聚集于細(xì)胞表面或被脂質(zhì)體隔離。
為了測(cè)定是否ATP也象羧基熒光素一樣被導(dǎo)入細(xì)胞，接下來(lái)使用實(shí)施例2的含3H-ATP的囊泡測(cè)定囊泡的融合和在HUVEC中ATP的釋放。囊泡和HUVEC一起培養(yǎng)5、10、15、30、45、60、90、120或240分鐘。結(jié)果見(jiàn)圖1是ATP在細(xì)胞內(nèi)1小時(shí)后的分配系數(shù)。DOPA/POPA在較長(zhǎng)時(shí)間下獲得最大的摻入百分比，其次是DOPC/DOPC-e，然后是單獨(dú)的3H-ATP(非囊泡)。當(dāng)細(xì)胞重復(fù)沖洗，細(xì)胞的放射性發(fā)生顯著變化。DOPC顯示出放射性有輕微但顯著的降低；DOPC/DOPC-顯示出沖洗后放射性沒(méi)有降低，而游離的3H-ATP顯示出放射性完全失去，這證實(shí)了游離的ATP不能穿透細(xì)胞膜。這些數(shù)據(jù)與融合數(shù)據(jù)一起，表明DOPC囊泡被完全胞飲，DOPC/DOPC-e融合，而游離的ATP沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞。DOPCPOPA囊泡也不能沖洗掉，表明了它們也和細(xì)胞發(fā)生了融合并將包封的內(nèi)容物遞送到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
實(shí)施例4內(nèi)皮大分子滲透性與直接將分子遞送到細(xì)胞相比，任何使用本發(fā)明囊泡在體內(nèi)通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)遞送已包封的大分子都要求囊泡和/或細(xì)胞必須穿透血管內(nèi)皮。血管內(nèi)皮構(gòu)成屏障，但細(xì)胞與細(xì)胞之間的屏障可穿越，例如，當(dāng)白細(xì)胞離開(kāi)體循環(huán)進(jìn)入間質(zhì)間隙。為了陳述該論點(diǎn)，需要測(cè)量本發(fā)明脂質(zhì)囊泡的影響。
HUVEC在EGM中的微孔(0.8μm)過(guò)濾器上生長(zhǎng)至匯合。將細(xì)胞置于一個(gè)專用的可以測(cè)量通過(guò)內(nèi)皮單層蛋白流量的室中。用于檢查脂質(zhì)囊泡對(duì)內(nèi)皮滲透性的影響的示蹤劑是FITC-albumin(1mg/ml)。FITC-albumin和脂質(zhì)囊泡一起在零時(shí)間時(shí)加入。每隔5分鐘，收集500μl上清液樣品，用Perkin-Elmer LS5OB LuminescenceSpectrophotometer分析熒光。DOPC囊泡對(duì)滲透性沒(méi)有影響，而HUVEC滲透性在DOPC/DOPC-e存在時(shí)提高，這表明這些囊泡在相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞間生成了小間隙。
實(shí)施例5代謝對(duì)ATP的需求按測(cè)定最佳速率的例子的方法，測(cè)定大鼠肝細(xì)胞代謝對(duì)ATP的需求。分離完整的大鼠肝，置于分離緩沖液(在pH7.2下0.25M蔗糖，0.04M Tris)中，用無(wú)菌剪刀絞碎，結(jié)締組織的碎片仔細(xì)修剪。將肝組織通過(guò)60#不銹鋼絲網(wǎng)篩，將細(xì)胞流出物收集于冰上。混懸液在4℃下離心5分鐘形成片狀細(xì)胞沉淀物。棄去上清液，將細(xì)胞再次懸浮于氧合緩沖液(200mM蔗糖、70mMKCl、5mM馬來(lái)酸鹽和40mMTris，pH7.3)。將五毫升氧合緩沖液置于Yellow SpringsInstruments Oxygen Meter(Yellow Springs，OH)中，使其在37℃達(dá)到平衡。將50ul的細(xì)胞提取物置于反應(yīng)室內(nèi)，得到最終2-3mg/ml的蛋白濃度。監(jiān)控基礎(chǔ)耗氧量1分鐘，然后往細(xì)胞中加入100mM ADP，并測(cè)定狀態(tài)2的呼吸作用。接下來(lái)，加入5mM的谷氨酸鹽并測(cè)定狀態(tài)3的呼吸作用。ADP/O2的比例通過(guò)測(cè)量加入的ADP量和耗氧量來(lái)確定。因而，狀態(tài)3的呼吸作用是細(xì)胞消耗的ATP的量/分鐘/mg的組織的測(cè)量值。
實(shí)施例6ATP-SUV加速創(chuàng)傷愈合在裸鼠的上側(cè)顱區(qū)的外皮制造出淺表創(chuàng)傷(周圍約80mm2)。然后將ATP-SUV施用于創(chuàng)傷，每天兩次，給傷口的邊緣細(xì)胞提供ATP。通過(guò)一個(gè)專門設(shè)計(jì)的涂藥器將ATP-SUV直接置于創(chuàng)傷上，涂藥器可使以水為基質(zhì)的ATP-SUV直接與創(chuàng)傷相接觸。
如圖2所示，用ATP-SUV處理的創(chuàng)傷較之用對(duì)照物質(zhì)處理的創(chuàng)傷愈合得更快。ATP-SUV-治療創(chuàng)傷的曲線標(biāo)繪的是創(chuàng)傷區(qū)域相對(duì)于愈合時(shí)間的曲線，顯示出一條對(duì)數(shù)曲線，而對(duì)照組顯示出愈合更接近線速度。在第四天，觀察到ATP-SUV治療組(≈30mm2；小于原創(chuàng)傷面積的一半)和對(duì)照治療組(≈60mm2)之間存在約30mm2的差異；在第10天，ATP-SUV治療組創(chuàng)傷面積基本消失，但在對(duì)照治療組創(chuàng)傷仍存在(≈25mm2)。定性地，VitalSol治療4天的創(chuàng)傷類似于對(duì)照組治療10天的創(chuàng)傷，而治療10天則類似于對(duì)照組的17天。ATP-SUV治療的創(chuàng)傷在第17天愈合，而對(duì)照組在這時(shí)還沒(méi)有完全愈合。
實(shí)施例7斷肢再續(xù)切斷大鼠后腿，病肢的主要給養(yǎng)動(dòng)脈被切斷并灌注ATP-SUV，一共裝入1mM ATP溶液。每隔3小時(shí)給斷肢灌注一次ATP-SUV和對(duì)照溶液(見(jiàn)表1)，或者根據(jù)組織中ATP水平變化認(rèn)為需要時(shí)進(jìn)行灌注。在灌注期間監(jiān)控?cái)嘀膭?dòng)脈壓以降低流動(dòng)誘導(dǎo)損傷的機(jī)會(huì)，并且全面監(jiān)控病肢的保存情況(高灌注壓可指示肢體的發(fā)病)。
在保存一段時(shí)間后，肢體用Ringers或其它合適的溶液沖洗以除去ATP-SUV的痕跡。通過(guò)外科手術(shù)將肢體再連接上。愈合后以外部指標(biāo)評(píng)估肢體功能(顏色、微血栓的跡象、凝固、斷肢溫度)。再植入之前或之后，用肝素防止止血。此外，動(dòng)物采用抗菌療法以減少感染。給對(duì)照組的斷肢只灌注介質(zhì)、或只灌注介質(zhì)和ATP，或只灌注介質(zhì)和SUV。
在再植入后21小時(shí)，ATP-SUV治療的斷肢呈健康的粉紅色和重新達(dá)到生理溫度。超過(guò)150天后，接受ATP-SUV治療斷肢的動(dòng)物在使用斷肢時(shí)象沒(méi)有被切斷過(guò)一樣。可以被稱為副作用的是趾頭的卷曲，而這很大程度上似乎是沒(méi)有進(jìn)行理療造成的，這個(gè)小的缺陷非常有可能被修復(fù)。但在對(duì)照組，斷肢是黑色的，觸感冰冷，呈壞死跡象。這些結(jié)果的總結(jié)見(jiàn)于表1。定性的結(jié)果見(jiàn)于圖3。
表1斷肢再植入研究結(jié)果的總結(jié)

實(shí)施例8ATP-SUV保護(hù)離體心臟不因低氧受損從大鼠身上摘除心臟，使用Lagendorff心臟灌注儀進(jìn)行監(jiān)控。心臟被切斷后置于專門設(shè)計(jì)的反應(yīng)室內(nèi)，該反應(yīng)室可以對(duì)心臟灌注，并允許注射ATP-SUV。停用在心臟內(nèi)循環(huán)的氧合灌注液，將ATP-SUV注射入心臟。注射高鉀溶液使心跳阻滯。在無(wú)流動(dòng)條件下于37℃將ATP-SUV在心臟中保存120分鐘。然后將心臟用氧合灌注液再次沖洗，監(jiān)控心臟性能。較之對(duì)照組，ATP-SUV治療的心臟功能得到了恢復(fù)。
實(shí)施例9改善血液儲(chǔ)存(預(yù)言的實(shí)施例)為了確認(rèn)是否含ATP的囊泡能保存血液以及是否加入糖酵解中間物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和果糖-1，6-二磷酸鹽(FDP)能進(jìn)一步改善存活能力，進(jìn)行下述試驗(yàn)。按實(shí)施例2的方法，只用DOPC構(gòu)建囊泡。按標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒀菏占诤袠?biāo)準(zhǔn)右旋糖-檸檬酸鹽-腺嘌呤-磷酸鹽混合物(Baxter；Deerfield，IL)的袋中。對(duì)于每組試驗(yàn)，將一個(gè)單位的血液分成幾等分，分別移至不含其它添加物的聚乙烯袋中(對(duì)照組)。按如下所示往其它等分中加入測(cè)試物質(zhì)對(duì)照組，不含添加劑對(duì)照組，含有PEP、FDP和核糖的囊泡ATP-SUVs在30、45、60和90天，回收各等分，根據(jù)下述參數(shù)評(píng)估紅細(xì)胞ATP含量、血細(xì)胞比容、血紅素和細(xì)胞存活能力(用到錐蟲藍(lán)(sigma)分離術(shù)或LIVE/DEAD試劑盒(MolecularProducts；Eugene，OR)).預(yù)期的結(jié)果細(xì)胞在含ATP囊泡存在的條件下存儲(chǔ)狀況好于對(duì)照組；也就是說(shuō)，ATP的含量更高，pH值會(huì)降低(表示較少糖酵解)，并且紅細(xì)胞保持一個(gè)正常紅細(xì)胞的典型兩面凹形。
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權(quán)利要求
1.一種囊泡，包括ATP和一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，囊泡的融合速率至少為20個(gè)囊泡融合/秒。
2.權(quán)利要求1的囊泡，還包括另一種極性脂質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的囊泡，還包括至少一種選自PEG、筏形成物和融合蛋白的成分。
4.權(quán)利要求2的囊泡，其中的磷脂或另一種極性脂質(zhì)具有式(I)的結(jié)構(gòu)X-L-Z2(I)其中X是氫或具有式(II)的結(jié)構(gòu) B是陽(yáng)離子或烷基，A是H或烷基，L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且每一個(gè)Z獨(dú)立地為H、E，或是式(XI)的結(jié)構(gòu)， 其中E是烷基或烯基，并且當(dāng)一個(gè)Z是H時(shí)，另一個(gè)Z不是H。
5.權(quán)利要求1的囊泡，其中融合速率至少為103個(gè)囊泡融合/秒。
6.權(quán)利要求4的囊泡，其中A是H或具有一種選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的結(jié)構(gòu) L具有選自式(VIII)、(IX)和(X)的結(jié)構(gòu) 和E具有選自式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的結(jié)構(gòu)
7.權(quán)利要求6的囊泡，其中的磷脂是1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，或其混合物。
8.一種囊泡，包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，以及至少一種選自PEG、筏形成物和融合蛋白的成分，其中囊泡的融合速率至少為20個(gè)囊泡融合/秒。
9.權(quán)利要求8的囊泡，其中至少一個(gè)成分是另一種極性脂質(zhì)，并且囊泡還包括至少一種選自PEG、筏形成物和融合蛋白的成分。
10.權(quán)利要求8的囊泡，其中的磷脂或另一種極性脂質(zhì)具有式(I)的結(jié)構(gòu)X-L-Z2(I)其中X是氫或具有式(II)的結(jié)構(gòu) B是陽(yáng)離子或烷基，A是H或烷基，L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且每一個(gè)Z獨(dú)立地為H、E，或是式(XI)的結(jié)構(gòu)， 其中E是烷基或烯基，并且當(dāng)一個(gè)Z是H時(shí)，另一個(gè)Z不是H。
11.權(quán)利要求8的囊泡，其中融合速率至少為103個(gè)囊泡融合/秒。
12.權(quán)利要求10的囊泡，其中A是H、或具有選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的結(jié)構(gòu) L具有選自式(VIII)、(IX)或(X)的結(jié)構(gòu) 和E具有選自式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的結(jié)構(gòu)
13.權(quán)利要求12的囊泡，其中的磷脂是1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，或其混合物。
14.一種囊泡，包括ATP，和一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，其中的磷脂具有式(I’)的結(jié)構(gòu)X’-L’-Z’2(I’)其中X’具有式(II’)的結(jié)構(gòu) B’是陽(yáng)離子或烷基，A’是烷基，L’是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且一個(gè)Z’是E”，或是式(XI”)的結(jié)構(gòu) 其中E”是烷基或烯基，并且另一個(gè)Z’是E’，或是式(XI’)的結(jié)構(gòu) 其中E’是烯基。
15.權(quán)利要求14的囊泡，還包括另一種極性脂質(zhì)。
16.權(quán)利要求14的囊泡，還包括至少一種選自PEG、筏形成物和融合蛋白的成分。
17.如權(quán)利要求15所述的囊泡，其中另一種極性脂質(zhì)具有式(I)的結(jié)構(gòu)X-L-Z2(I)其中X是氫或具有式(II)的結(jié)構(gòu) B是陽(yáng)離子或烷基，A是H或烷基，L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且每一個(gè)Z獨(dú)立地為H、E，或是式(XI)的結(jié)構(gòu)， 其中E是烷基或烯基，并且當(dāng)一個(gè)Z是H時(shí)，另一個(gè)Z不是H。
18.權(quán)利要求17的囊泡，其中A是H、或具有選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的結(jié)構(gòu) L具有選自式(VIII)、(IX)或(X)的結(jié)構(gòu) 和E具有選自式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的結(jié)構(gòu)
19.權(quán)利要求18的囊泡，其中的磷脂是1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，或其混合物。
20.一種囊泡，包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，和至少一種選自不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)和PEG的成分，其中作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂具有式(I)的結(jié)構(gòu)X-L-Z2(I)其中X是氫或具有式(II)的結(jié)構(gòu) B是陽(yáng)離子或烷基，A是H或烷基，L是缺少兩個(gè)氫原子的烷基，并且每一個(gè)Z獨(dú)立地為H、E，或是式(XI)的結(jié)構(gòu)， 其中E是烷基或烯基，并且當(dāng)一個(gè)Z是H時(shí)，另一個(gè)Z不是H。
21.權(quán)利要求20的囊泡，其中A是H、或具有選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的結(jié)構(gòu) L具有選自式(VIII)、(IX)或(X)的結(jié)構(gòu) 和E具有選自式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的結(jié)構(gòu)
22.權(quán)利要求20的囊泡，其中的磷脂是1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，或其混合物。
23.權(quán)利要求20的囊泡，還包括至少一種選自筏形成物和融合蛋白的成分。
24.權(quán)利要求19的囊泡，其中囊泡包括不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)，并且所包括的不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)具有選自式(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)、(XXII)、(XXIII)、(XXV)和(XXVI)的結(jié)構(gòu)
25.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1的囊泡相接觸。
27.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求8的囊泡相接觸。
28.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求14的囊泡相接觸。
29.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求20的囊泡相接觸。
30.一種保存組織的方法，包括將組織與囊泡相接觸，其中囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，和ATP。
31.權(quán)利要求30的方法，其中囊泡還包括至少一種選自不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)和PEG的成分。
32.權(quán)利要求30的囊泡，其中的磷脂是1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-廿二碳六烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿，或其混合物。
33.權(quán)利要求30的囊泡，還包括至少一種選自筏形成物和融合蛋白的成分。
34.權(quán)利要求31的囊泡，其中囊泡包括不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)，并且所包括的不是作為穩(wěn)定的囊泡形成物的極性脂質(zhì)具有選自式(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)、(XXII)、(XXIII)、(XXV)和(XXVI)的結(jié)構(gòu)
35.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與囊泡相接觸；其中囊泡包括一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，和ATP，其中遞送到細(xì)胞的ATP的量足以滿足細(xì)胞代謝需求。
36.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1的囊泡相接觸。
37.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求8的囊泡相接觸。
38.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求14的囊泡相接觸。
39.一種把ATP遞送到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求20的囊泡相接觸。
40.一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將創(chuàng)傷與含有囊泡的組合物接觸；其中囊泡包括一種作為囊泡形成物的磷脂，和ATP。
41.一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將細(xì)胞與包含權(quán)利要求1的囊泡的組合物相接觸。
42.一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將細(xì)胞與包含權(quán)利要求8的囊泡的組合物相接觸。
43.一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將細(xì)胞與包含權(quán)利要求14的囊泡的組合物相接觸。
44.一種處理創(chuàng)傷的方法，包括將細(xì)胞與包含權(quán)利要求20的囊泡的組合物相接觸。
45.權(quán)利要求40的方法，其中的組合物還包括貝卡普勒明。
46.一種組合物，包括一種囊泡，和貝卡普勒明，其中囊泡包括一種作為囊泡形成物的磷脂，和ATP。
47.一種提高具有至少一個(gè)細(xì)胞的生物反應(yīng)器的產(chǎn)率的方法，包括將細(xì)胞與囊泡相接觸，其中囊泡包括一種作為囊泡形成物的磷脂，和ATP。
全文摘要
一種直接的細(xì)胞能量遞送系統(tǒng)一種囊泡，其中包括ATP和一種作為穩(wěn)定的囊泡形成物的磷脂，囊泡的融合速率至少為20個(gè)囊泡融合/秒。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1665488SQ03816033
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者威廉·D·埃林格, 錢蘇帆 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)