專利名稱：自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于組織工程產(chǎn)物的自動(dòng)化培養(yǎng)、增殖、分化、生產(chǎn)和養(yǎng)護(hù)的設(shè)備、方法和系統(tǒng)。這種系統(tǒng)、方法和產(chǎn)物在各種臨床和實(shí)驗(yàn)室裝置中具有用途。
背景技術(shù)：
貫穿本申請(qǐng)文本中，各種參考文獻(xiàn)均以括號(hào)方式引用，以更充分描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)狀。這些參考的公開內(nèi)容此處均以參考文獻(xiàn)方式引入本公開內(nèi)容。
過(guò)去幾年中，研究人員已開發(fā)和使用了不同的細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程技術(shù)，用于各種類型細(xì)胞植入物的培養(yǎng)和生產(chǎn)。這些系統(tǒng)如美國(guó)專利5,041,138，5,842,477，5,882,929，5,891,455，5,902,741，5,994,129,6,048,721和6,228,635中所描述。也有將生物反應(yīng)器系統(tǒng)開發(fā)用于細(xì)胞和細(xì)胞植入物的培養(yǎng)，例如美國(guó)專利5,688,687，5,728,581，5,827,729和6,121,042中所描述。
前述方法和系統(tǒng)通常采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)設(shè)備用于將選擇的細(xì)胞群體接種至支架上。由此產(chǎn)生的植入物只含有生長(zhǎng)于某一類型生物高分子支持物上的增殖細(xì)胞群，其中對(duì)細(xì)胞環(huán)境的任何操作都受限于任何標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)中存在的細(xì)胞因子的內(nèi)源性細(xì)胞生產(chǎn)，以及由于細(xì)胞培養(yǎng)基循環(huán)所致的剪切和/或物理應(yīng)力的應(yīng)用，及接種有細(xì)胞的支持物的物理操作。該系統(tǒng)并沒(méi)有致力于也不能夠產(chǎn)生組織植入物，所述組織植入物含有代表體內(nèi)發(fā)育組織的增殖和分化細(xì)胞，并且進(jìn)一步整合入一個(gè)可成功整合于體內(nèi)的選擇支架。并且，已知方法和系統(tǒng)不能在單個(gè)自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)中多功能性地實(shí)施下列所有步驟活檢組織消化以獲得分離細(xì)胞，隨后的細(xì)胞接種于增殖基片(substrate)上，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，控制性分化，組織生成以及組織植入物的產(chǎn)生。這主要因?yàn)橐阎囵B(yǎng)系統(tǒng)不夠高級(jí)，在于它們不能自動(dòng)化評(píng)測(cè)及操作發(fā)育中的植入物周圍的變化環(huán)境，從而使細(xì)胞逐漸增殖與分化成所期望的植入物。
而且，常規(guī)培養(yǎng)方法和系統(tǒng)是勞動(dòng)密集型的，會(huì)遭致污染及由于人為錯(cuò)誤和缺少持續(xù)的性能評(píng)價(jià)而導(dǎo)致的培養(yǎng)成功程度變動(dòng)的缺點(diǎn)。常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)要求，在用于接種的細(xì)胞制備中的大部分初始步驟(即組織消化、細(xì)胞選擇)需要人工操作，這很耗費(fèi)時(shí)間，所產(chǎn)生組織的質(zhì)量也不可靠，并且易引起培養(yǎng)污染問(wèn)題。由于固有的設(shè)計(jì)限制，限制了細(xì)胞和組織培養(yǎng)過(guò)程，不能充分監(jiān)視和改變環(huán)境以支持組織發(fā)育，以及缺少能夠?qū)嵤┯行з|(zhì)量控制檢測(cè)的技術(shù)，因而該系統(tǒng)不能支持從原代或前體細(xì)胞中自動(dòng)化制備組織工程植入物。
由此，對(duì)用于在組織工程植入物的發(fā)育和生產(chǎn)中可連貫滿足與不同步驟有關(guān)的操作需求的離體和體外組織工程的改進(jìn)系統(tǒng)仍存在實(shí)際和尚未滿足的需求。具有特別重要性的是產(chǎn)生功能性組織結(jié)構(gòu)的能力，其中存在的細(xì)胞具有活性，已分化并表達(dá)有胞外基質(zhì)。這不僅僅包括，且顯著不同于對(duì)存在于宿主位置處的成熟體內(nèi)環(huán)境的簡(jiǎn)單模擬。這是因?yàn)楣δ苄孕律M織的制備基本要求為細(xì)胞能通過(guò)一系列發(fā)育階段而發(fā)展，作為離體工序的一部分。
為了同時(shí)解決臨床和研究需求，已開發(fā)了新設(shè)備、方法和系統(tǒng)，避免了一些常規(guī)離體培養(yǎng)技術(shù)和系統(tǒng)的缺點(diǎn)和限制。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用戶友好的細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程自動(dòng)化系統(tǒng)，可用于供人和家畜使用的各種臨床和研究裝置。
此處使用的“組織工程”可定義為“應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，用于生物替代品的基礎(chǔ)理解和開發(fā)，以恢復(fù)、維持和改善組織功能”。該定義旨在包括多步操作，操作中的生物替代品是可植入在由生物相容性材料組成的基片或支架上以生成組織，尤其是可植入組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞或不同細(xì)胞的組合。而且需要指出，組織工程過(guò)程中包含的細(xì)胞可以是自身的，同種異體的或異種的。
本發(fā)明的組織工程系統(tǒng)設(shè)計(jì)成在無(wú)菌操作條件下實(shí)施所有活動(dòng)。該系統(tǒng)在操作中是充分自動(dòng)化，便攜，多功能的，并且可履行/提供一種或多種以下功能-組織活檢的無(wú)菌接收/貯存；-消化過(guò)程的自動(dòng)監(jiān)測(cè)；-消化活檢組織以得到分離細(xì)胞；-細(xì)胞分揀和選擇，包括安全的廢物收集；-細(xì)胞接種于增殖基片或支架上或者其內(nèi)；-增殖細(xì)胞以擴(kuò)增細(xì)胞群體；-細(xì)胞洗滌與細(xì)胞收集；-細(xì)胞接種于組織工程支架或基質(zhì)上或者其內(nèi)；-細(xì)胞分化以達(dá)到細(xì)胞活動(dòng)專門化；-組織生成；-機(jī)械和/或生物化學(xué)刺激以促進(jìn)組織成熟；-收獲組織工程結(jié)構(gòu)/植入物用于重構(gòu)建手術(shù)；以及-可植入組織的貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明組織工程系統(tǒng)可進(jìn)行預(yù)編程，以單獨(dú)地、按順序地或按期望和要求以特定的預(yù)先確定的部分順序執(zhí)行上述每一步驟。而且，每一步驟或任何其組合，是在組織工程模塊上的一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器內(nèi)完成的。該組織工程系統(tǒng)在操作中是預(yù)編程以及自動(dòng)化控制的，由此需要的用戶干預(yù)可達(dá)最小，作為結(jié)果，可增加細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程過(guò)程的效率和重現(xiàn)性，同時(shí)使污染風(fēng)險(xiǎn)減至最小。本發(fā)明的組織工程系統(tǒng)及其組件在微重力和/或零重力條件下可操作，該條件下這種系統(tǒng)和組件用于太空研究。
本發(fā)明系統(tǒng)設(shè)計(jì)成使得原代或前體細(xì)胞可從給體組織中分離用于組織植入物的進(jìn)一步繁殖，分化及生產(chǎn)。作為替代，也可單獨(dú)或與其他來(lái)源細(xì)胞結(jié)合采用細(xì)胞系。
本發(fā)明是一種自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含支托有至少一個(gè)生物反應(yīng)器的外殼，所述生物反應(yīng)器可促進(jìn)生理細(xì)胞功能及來(lái)自細(xì)胞和組織來(lái)源的組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。外殼還支托與生物反應(yīng)器有流體連通的流體安全系統(tǒng)(fluid containment system)。與外殼和/或生物反應(yīng)器相關(guān)聯(lián)的是監(jiān)視流體安全系統(tǒng)內(nèi)流體的生理學(xué)參數(shù)的傳感器。安置于外殼內(nèi)的微處理器與生物反應(yīng)器和流體安全系統(tǒng)連接，作用在于控制它們的運(yùn)行。微處理器也可獨(dú)立控制系統(tǒng)內(nèi)的環(huán)境條件。
本發(fā)明的另一方面提供了一種用于細(xì)胞和組織工程的系統(tǒng)，含有便攜且無(wú)菌的帶有一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器的組織工程模塊，所述生物反應(yīng)器提供了下列基礎(chǔ)組織消化、細(xì)胞接種于增殖基片、細(xì)胞增殖、細(xì)胞接種于分化支架、細(xì)胞分化和組織生成以及隨后成熟為用于植入的功能性組織。生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基流動(dòng)和貯藏系統(tǒng)可操作連接，用于非回流方式的試劑運(yùn)送和廢液收集。生物反應(yīng)器和/或培養(yǎng)基流動(dòng)系統(tǒng)任選地包括采用半滲透膜的氣體交換組件，以允許氣體產(chǎn)物的傳遞，從而控制培養(yǎng)基中的溶解氣體水平。組織工程模塊與中央微處理器控制的基本單元可操作地相互作用，所述基本單元自動(dòng)化監(jiān)視生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)或組織工程過(guò)程的進(jìn)程并調(diào)節(jié)環(huán)境條件以滿足不同階段的細(xì)胞培養(yǎng)和組織發(fā)育的需要。對(duì)理想條件的偏離可被生物反應(yīng)器內(nèi)存在的各種傳感器檢測(cè)出，所產(chǎn)生的信號(hào)被中央微處理器所監(jiān)視。由此，環(huán)境條件的變化可被自動(dòng)化監(jiān)視，并按所需進(jìn)行改變，所述環(huán)境條件例如但不限于pH、溫度以及溶解氣體。另外，細(xì)胞增殖的狀態(tài)通過(guò)檢測(cè)作為時(shí)間函數(shù)的代謝周轉(zhuǎn)率(例如pH，O2，CO2，乳酸和葡萄糖消耗)進(jìn)行間接評(píng)價(jià)。組織工程模塊自身可任選地包括與中央微處理器操作一致的二級(jí)隨車攜帶的微處理器，以進(jìn)一步地通過(guò)中央微處理器控制處理?xiàng)l件。通過(guò)在組織工程模塊上直接執(zhí)行特定功能，組織工程模塊微處理器擴(kuò)展了組織工程系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理能力，從而使對(duì)中央微處理器的需求減至最小。
各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、實(shí)驗(yàn)試劑、藥物、化學(xué)物質(zhì)、培養(yǎng)液及其任意組合可以裝載并貯存于位于組織工程模塊上的任一貯罐內(nèi)，并根據(jù)預(yù)編程順序或按發(fā)育中的組織植入物所需自動(dòng)傳遞至一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器。單個(gè)組織工程模塊可從系統(tǒng)中移除用于轉(zhuǎn)運(yùn)，而不會(huì)對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)存在的組織工程結(jié)構(gòu)的無(wú)菌性產(chǎn)生危害。這種移除不會(huì)影響組織工程系統(tǒng)中存在的任何其他模塊的處理。而且，組織工程工序完成后，組織工程模塊認(rèn)為是可以置換的，這種實(shí)踐防止了由在先使用而引起的污染。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，設(shè)備和系統(tǒng)可用以消化由手術(shù)活檢獲得的組織。在另一實(shí)施方案中，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾并選擇和分離特定群體。在另一實(shí)施方案中，可對(duì)消化細(xì)胞進(jìn)行增殖，以擴(kuò)增細(xì)胞群體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞可接種并培養(yǎng)于所期望的支架或基片(也稱為基質(zhì))上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞可在所需支架或基片上分化，和/或遍布所需支架或基片，直到獲得合適的組織生成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可對(duì)組織進(jìn)行刺激以促進(jìn)組織成熟。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生了適合用于重構(gòu)建手術(shù)的組織植入物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可在細(xì)胞增殖和發(fā)育進(jìn)程的每一階段以無(wú)菌方式進(jìn)行細(xì)胞取樣，而不會(huì)對(duì)培養(yǎng)物本身產(chǎn)生副作用。前述每一實(shí)施方案可按所需單獨(dú)或按次序完成?？赏ㄟ^(guò)中央微處理器和/或基于組件的微處理器對(duì)這些處理事件進(jìn)行追蹤，用于并入質(zhì)量控制記錄中。
一方面，組織工程系統(tǒng)任選地采用一種合成的生物材料化合物SkeliteTM，如在本申請(qǐng)人的美國(guó)專利6,323,146中所描述(其內(nèi)容此處引入作為參考)，以增強(qiáng)生物性能。簡(jiǎn)單的說(shuō)，SkeliteTM是一種絕緣的可生物重吸收的生物材料化合物，含有鈣、氧和磷，其中至少一種所述元素的一部分為具有接近0.1-0.6埃離子半徑的元素所取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，SkeliteTM作為生物反應(yīng)器壁上的包被，作為增殖基片上的薄膜，或作為三維且高表面積的增殖支架，用于增強(qiáng)細(xì)胞增殖。SkeliteTM在增殖階段的用途可陳述為-增加增殖速率；-增加增殖步驟后的細(xì)胞產(chǎn)量；-減少用于目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)量所需的表面積；-減少增殖過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞表型去分化問(wèn)題的趨勢(shì)；以及-增強(qiáng)生長(zhǎng)因子對(duì)增殖基片的結(jié)合。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，SkeliteTM可用作可重吸收支架，以增強(qiáng)細(xì)胞的分化和隨后的組織結(jié)構(gòu)的生成。SkeliteTM在分化階段的用途可陳述為-通過(guò)改進(jìn)分化階段的可靠性，增加產(chǎn)率；-增加組織結(jié)構(gòu)的完整性，由此增加其生物成活力；-在各種支架物格式的基礎(chǔ)上，容許結(jié)構(gòu)構(gòu)造的撓性；-容許增殖、分化和組織生成階段在共同基片上出現(xiàn)；-增強(qiáng)生長(zhǎng)因子對(duì)分化支架的結(jié)合；以及-改進(jìn)手術(shù)植入過(guò)程中組織結(jié)構(gòu)的操作屬性。
另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)原代或前體細(xì)胞的消化、增殖、接種和分化的自動(dòng)化步驟，用于組織結(jié)構(gòu)制備的方法和系統(tǒng)，所述細(xì)胞來(lái)源于患者由此可以免去免疫和疾病傳染問(wèn)題。植入物可由各種細(xì)胞類型的控制培養(yǎng)而生成，包括但不限于軟骨細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，上皮細(xì)胞及其混合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明系統(tǒng)可結(jié)合一種或多種可分離的、便攜的以及可獨(dú)立操作的組織工程模塊，所述組織工程模塊支托一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器，培養(yǎng)基貯罐和流體/培養(yǎng)基流動(dòng)系統(tǒng)。每一模塊以及生物反應(yīng)器都在中央微處理器的自動(dòng)化控制之下。模塊和關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器可加以配置用于各種專業(yè)化應(yīng)用，例如但不限于-組織活檢的無(wú)菌接收/貯存；-消化試劑的自動(dòng)化混合和運(yùn)送；-消化過(guò)程的自動(dòng)化監(jiān)視；-活檢組織的消化以獲得分離細(xì)胞；-細(xì)胞分揀和選擇，包括安全的廢物收集；-細(xì)胞洗滌和細(xì)胞收集；-細(xì)胞在增殖基片或支架上或在其內(nèi)的接種；-增殖試劑的自動(dòng)化混合和運(yùn)送；-細(xì)胞增殖以擴(kuò)增細(xì)胞群體；-細(xì)胞條件的自動(dòng)化監(jiān)視，包括匯合的檢測(cè)；-細(xì)胞從增殖基片或支架上的控制性釋放；-在選擇的表面積尺寸上重復(fù)增殖步驟，以增加細(xì)胞數(shù)量；-細(xì)胞群體朝一個(gè)或多個(gè)組織工程支架或基質(zhì)的溝道作用；-細(xì)胞在增殖基片或支架上或在其內(nèi)的接種；-分化試劑的自動(dòng)化混合與運(yùn)送；-細(xì)胞/組織培養(yǎng)條件的自動(dòng)化監(jiān)視；-細(xì)胞分化，使細(xì)胞活性得以專門化；-組織生成；-機(jī)械和/或生物化學(xué)刺激，以促進(jìn)組織成熟；-收獲組織工程結(jié)構(gòu)/植入物，用于重構(gòu)建手術(shù)；以及-細(xì)胞和/或可植入組織的貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)。
當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)裝備有兩個(gè)或更多個(gè)生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器直接支托于系統(tǒng)外殼內(nèi)，或支托于可插入外殼內(nèi)的組織構(gòu)成模塊上時(shí)，該生物反應(yīng)器可以串聯(lián)形式連接，可單獨(dú)操作并受微處理器控制，或者作為替代，可以根據(jù)使用者對(duì)微處理器的編程進(jìn)行獨(dú)立操作控制，并達(dá)到所期望的結(jié)果。而且，當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)裝備有兩個(gè)或更多個(gè)生物反應(yīng)器時(shí)，生物反應(yīng)器可與內(nèi)室連接，從而從生物反應(yīng)器到生物反應(yīng)器之間有細(xì)胞和/或組織的交換。
生物反應(yīng)器可按要求以任何尺寸和構(gòu)造制作，以支持增殖和分化支架或基片的數(shù)量和尺寸變化。生物反應(yīng)器可作為組織工程模塊的結(jié)構(gòu)組件的一部分而并入其內(nèi)。可替代地，生物反應(yīng)器可以是可分離的，對(duì)于組織工程模塊的剩余組件而言，生物反應(yīng)器可作為獨(dú)立組件。如果作為分離組件，生物反應(yīng)器可單獨(dú)包封裝于無(wú)菌封裝內(nèi)，并在使用時(shí)采用無(wú)菌通路法連接至組織工程模塊。而且，在組織工程過(guò)程完成后，為了便于轉(zhuǎn)運(yùn)至操作室，無(wú)菌通路法使得生物反應(yīng)器可從模塊分開，所述操作室是為新生成的可植入組織結(jié)構(gòu)的回收作準(zhǔn)備的。
經(jīng)由控制傳動(dòng)裝置，生物反應(yīng)器和/或組織工程模塊可在整個(gè)組織工程系統(tǒng)內(nèi)旋轉(zhuǎn)或攪拌。旋轉(zhuǎn)使得能有益利用重力來(lái)完成特殊的生物加工工序，例如基于沉降的細(xì)胞接種以及生物反應(yīng)器內(nèi)的流體交換。
組織工程模塊可以是條形編碼的，或擁有一個(gè)既在組織工程系統(tǒng)內(nèi)部又在其外部作為臨床或?qū)嶒?yàn)環(huán)境一部分的快速和精確追蹤的內(nèi)存芯片。這種引入組織工程設(shè)備內(nèi)的追蹤技術(shù)也使得能進(jìn)行用于患者記錄的電子追蹤，所述電子追蹤經(jīng)由基于臨床的信息系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。這就確保了對(duì)組織工程模塊及由此的相關(guān)細(xì)胞或組織植入物的正確編碼，以保證施用于正確患者，并確保了該過(guò)程的記錄，以用于醫(yī)院結(jié)帳的目的。組件和/或生物反應(yīng)器也可以類似方式使用條形碼和/或內(nèi)存芯片，用于患者和樣品的快速與精確追蹤。
本發(fā)明的一方面是一種自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，含有-外殼；-至少一個(gè)為所述外殼支托的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)了生理學(xué)細(xì)胞功能和/或來(lái)源于細(xì)胞和/或組織的一種或多種組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；-為所述外殼支托的流體安全系統(tǒng)，與所述生物反應(yīng)器流體連通；-一個(gè)或多個(gè)與一個(gè)或多個(gè)所述外殼、生物反應(yīng)器或流體安全系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的傳感器，用于監(jiān)視涉及所述生理學(xué)細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的參數(shù)；以及-與一個(gè)或多個(gè)所述傳感器連接的微處理器。
本發(fā)明的另一方面是一種自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，包含-外殼；-至少一個(gè)容納于所述外殼內(nèi)的可去除的組織工程模塊，所述組織工程模塊含有支托結(jié)構(gòu)，所述支托結(jié)構(gòu)支撐至少一個(gè)生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)了生理細(xì)胞功能和/或一種或多種源自細(xì)胞和/或組織的組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，還含有與所述生物反應(yīng)器有流體連通的流體安全系統(tǒng)，以及一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視涉及所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的參數(shù)；以及-位于所述外殼內(nèi)并與所述組織工程模塊連接的微處理器，所述微處理器控制所述組織工程模塊的操作。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的一方面是便攜和可滅菌的組織工程模塊，所述模塊包含-支撐至少一個(gè)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)支持物，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能；-與所述生物反應(yīng)器流體連通的流體安全系統(tǒng)；以及-一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視涉及所述細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能的參數(shù)。
在本實(shí)施方案的某些方面，生物反應(yīng)器含有生物反應(yīng)器外殼，所述外殼帶有用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口及一個(gè)或多個(gè)出料口，以及至少一個(gè)限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的室，用于接收細(xì)胞和/或組織以及促進(jìn)所述的細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能。所述室可選自細(xì)胞培養(yǎng)/增殖室，細(xì)胞分化/組織形成室，組織消化室以及其組合。而且，所述室內(nèi)裝有一種或多種基片和/或支架。在本發(fā)明實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器內(nèi)裝備的兩個(gè)或多個(gè)室可操作連接。作為替代，兩個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器可獨(dú)立操作或可進(jìn)行協(xié)力操作。進(jìn)一步的某些方面，室和/或生物反應(yīng)器可操作連接，從而為室和/或生物反應(yīng)器之間的流體、細(xì)胞和/或組織提供交換。本發(fā)明中使用的支架選自多孔支架、帶有梯度孔隙率的多孔支架、多孔網(wǎng)狀支架、纖維狀支架、膜環(huán)繞支架及其組合。室也可進(jìn)一步細(xì)分成多個(gè)區(qū)域。例如，分化/組織形成室可擁有多個(gè)區(qū)域，以容納數(shù)個(gè)支架。生物反應(yīng)器內(nèi)的室之間擁有漏斗或類似的通道。而且，可在生物反應(yīng)器內(nèi)任一位置裝備一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器。
本發(fā)明的另一方面是一種生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器提供了用于細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的環(huán)境，所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能選自組織活檢的貯存，組織活檢的消化，細(xì)胞分揀，細(xì)胞洗滌，細(xì)胞濃縮，細(xì)胞接種，細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞貯存，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，組織生成，植入物生成，可植入組織的貯存，可植入組織的轉(zhuǎn)運(yùn)以及其組合。
本發(fā)明的另一方面是一種生物反應(yīng)器，用于促進(jìn)和支持細(xì)胞功能和可植入的組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，所述生物反應(yīng)器包含-生物反應(yīng)器外殼；-用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口及一個(gè)或多個(gè)出料口；-限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的至少一個(gè)室，用于促進(jìn)和支持細(xì)胞功能和/或源自細(xì)胞和/或組織的一種或多種組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；以及-一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視與所述至少一個(gè)室內(nèi)的所述細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生相關(guān)的參數(shù)。
在本發(fā)明實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器外殼含有一個(gè)蓋子，所述蓋可以是可分離的蓋或與生物反應(yīng)器外殼形成整體。
細(xì)胞和組織可以選自骨、軟骨、相關(guān)的骨和軟骨前體細(xì)胞及其組合。更特殊地，適合在本發(fā)明的生物反應(yīng)器、組件和系統(tǒng)內(nèi)使用的細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、髓核細(xì)胞、前軟骨細(xì)胞、來(lái)自骨、骨髓或血液的包括干細(xì)胞在內(nèi)的骨祖細(xì)胞，以及其組合，但不限于此。相對(duì)由本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能生成的植入物的接受者而言，細(xì)胞或組織來(lái)源可以是自身的，同種異體的或異種的。
本發(fā)明的另一方面是于本發(fā)明的生物反應(yīng)器內(nèi)產(chǎn)生的組織植入物。
本發(fā)明的另一方面是通過(guò)本發(fā)明的組織工程系統(tǒng)而產(chǎn)生的組織植入物。
本發(fā)明的另一方面是組織工程可植入結(jié)構(gòu)，用于骨損傷的修復(fù)，其中植入物含有骨生物材料的多孔支架，并與活性骨細(xì)胞和組織工程礦化基質(zhì)相結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面是組織工程植入物，包括-含有組織工程軟骨的軟骨區(qū)，所述軟骨不含任何基于礦物的支架；-含有多孔支架的骨生物材料區(qū)；以及-所述軟骨區(qū)與所述骨生物材料區(qū)域之間的界面區(qū)域。
體內(nèi)植入時(shí)，軟骨區(qū)促進(jìn)與宿主軟骨的側(cè)面整合，而骨生物材料區(qū)域促進(jìn)了與軟骨下骨板的側(cè)面和垂直整合。界面區(qū)域則提供了軟骨區(qū)和骨生物材料區(qū)域之間的結(jié)構(gòu)聯(lián)合。軟骨區(qū)可另外摻入次級(jí)非礦物支架，用以輔助組織工程軟骨的生成，并使得用于具有某種形狀的表面輪廓的形成，所述表面輪廓與植入位點(diǎn)的特定解剖學(xué)特性相一致。
本發(fā)明的另一方面是用于消化組織活檢的方法，所述方法包含-將組織活檢載入與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)相連的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；-提供組織消化酶；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)合適的消化條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到組織消化的期望水平。
本發(fā)明的另一方面是用于細(xì)胞增殖的方法，所述方法包含-將細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的增殖基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)合適的培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到細(xì)胞增殖的期望水平。
本發(fā)明的另一方面是用于細(xì)胞分化的方法，所述方法包含-將細(xì)胞接種于支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的分化基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)合適的培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到細(xì)胞分化的期望水平。
本發(fā)明的另一方面是一種方法，用于消化組織活檢，以提供原代細(xì)胞，所述原代細(xì)胞包括諸如干細(xì)胞在內(nèi)的前體細(xì)胞，然后增殖和分化細(xì)胞使能夠生成組織植入物，所述方法包含-將組織活檢載入與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)相連的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；-提供組織消化酶；
-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)合適的消化條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以獲得分離細(xì)胞。
-將分離細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的分化基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)合適的培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以獲得細(xì)胞增殖和擴(kuò)增的期望水平；-將擴(kuò)增細(xì)胞從增殖基片或支架上釋放；-將擴(kuò)增細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的分化基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)和傳遞所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以獲得組織植入物。
本發(fā)明的另一方面是提供骨骼植入物的方法，所述方法包含-將成骨和/或骨祖細(xì)胞接種至骨生物材料的多孔支架上，所述多孔支架支托于與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，使成骨和/或骨祖細(xì)胞增殖和/或分化于整個(gè)支架，從而提供用于整形術(shù)應(yīng)用的組織植入物。
本發(fā)明的另一方面是用于提供軟骨植入物的方法，所述方法包含-將軟骨生成細(xì)胞和/或軟骨祖細(xì)胞接種至生物材料的多孔支架上，所述多孔支架支托于與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，使軟骨生成細(xì)胞和/或軟骨祖細(xì)胞增殖和/或分化于整個(gè)支架，從而提供軟骨植入物。
本發(fā)明的另一方面是用于洗滌細(xì)胞的方法，所述方法包含-于室內(nèi)載入含有一種或多種非期望化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞懸浮液；-通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾模塊將來(lái)自室的細(xì)胞懸浮液連續(xù)再循環(huán)，所述錯(cuò)流過(guò)濾模塊含有所述細(xì)胞不能透過(guò)而所述不期望的化學(xué)物質(zhì)可以透過(guò)的膜，從而提供洗滌后的細(xì)胞懸浮液；以及-收集洗滌后的細(xì)胞懸浮液。
本發(fā)明的另一方面是用于細(xì)胞富集的方法，所述方法包含-于室內(nèi)載入含有過(guò)量細(xì)胞懸浮液體積的細(xì)胞懸浮液；-通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾模塊將來(lái)自室的細(xì)胞懸浮液連續(xù)再循環(huán)，所述錯(cuò)流過(guò)濾模塊含有所述細(xì)胞不能透過(guò)的膜，而所述膜允許過(guò)量的細(xì)胞懸浮液體積被去除并收集。
本發(fā)明的另一方面是一種提供用于脊椎盤內(nèi)核重建的植入物的方法，所述方法包含-將髓核細(xì)胞接種至支托于連接有培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器內(nèi)生物材料的支架或多孔支架上，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠時(shí)間段，以使髓核細(xì)胞增殖和/分化并表達(dá)具有髓核特性的胞外基質(zhì)組分。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面是用于臨床組織工程中的質(zhì)量評(píng)價(jià)樣品的制備方法，所述方法包含-采用此處描述的本發(fā)明系統(tǒng)并行制備初級(jí)和次級(jí)植入物，其中初級(jí)植入物用于植入，一種或多種次級(jí)植入物用于試驗(yàn)?zāi)康模酝茢喑跫?jí)植入物的口徑。
在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明組織工程系統(tǒng)均在一個(gè)或多個(gè)微處理器的控制之下，所述微處理器可以預(yù)編程使得使用者可在生物反應(yīng)器內(nèi)選擇特定類型的環(huán)境(或環(huán)境工序)，諸如組織消化，細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化和/或組織結(jié)構(gòu)生成。這就消除了操作者的干預(yù)并減少了不經(jīng)意污染的可能性。
本發(fā)明組織工程系統(tǒng)可以“成套部件(kit)”的方式供應(yīng)。設(shè)備、組織工程模塊、生物反應(yīng)器及其任何組件可以這種方式進(jìn)行包裝，并與使用說(shuō)明書和質(zhì)量控制方法一并出售。
本發(fā)明系統(tǒng)對(duì)于醫(yī)院臨床使用是理想的，尤其是用于由于損傷和/或疾病而需要組織工程植入物的手術(shù)裝置中。采用本發(fā)明系統(tǒng)，從經(jīng)由患者活檢獲得的自身組織、同種異體細(xì)胞或異種細(xì)胞中，可安全制備組織工程的可植入結(jié)構(gòu)。這種組織工程可植入結(jié)構(gòu)的規(guī)格可與植入位點(diǎn)的類型、尺寸和條件相匹配。而且，由本系統(tǒng)產(chǎn)生的植入物含有活性細(xì)胞，可促進(jìn)與宿主的整合，從而改善患者的恢復(fù)。
實(shí)際上，采用自身細(xì)胞模型時(shí)，可在手術(shù)室內(nèi)從患者身上獲得組織活檢，并直接置于組織工程模塊上的生物反應(yīng)器內(nèi)。根據(jù)所需組織結(jié)構(gòu)的類型和尺寸可選擇特定生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)。組織工程過(guò)程完成后，產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)仍容納于無(wú)菌生物反應(yīng)器內(nèi)，可轉(zhuǎn)運(yùn)至手術(shù)室，用于植回患者身上。該系統(tǒng)對(duì)于以安全和有效治療方式提供“定制”的自身組織植入物是理想的。
本發(fā)明系統(tǒng)和方法并不限于提供自動(dòng)化的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所描述的組織工程系統(tǒng)已遠(yuǎn)超出細(xì)胞治療中的細(xì)胞擴(kuò)增范圍。組織工程系統(tǒng)可用于產(chǎn)生功能性組織結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞是有活性的，分化的并且表達(dá)胞外基質(zhì)。因而，由此產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)處于高度發(fā)育狀態(tài)，從而加快了植入位點(diǎn)處組織修復(fù)的速度，并改善了組織修復(fù)質(zhì)量。
本發(fā)明系統(tǒng)也適用于藥理學(xué)研究。特別地，本系統(tǒng)在藥物開發(fā)領(lǐng)域也具有用途。新的潛在藥物和分子可在細(xì)胞和組織上進(jìn)行試驗(yàn)，以確定對(duì)細(xì)胞事件和組織發(fā)育的影響。這種試驗(yàn)可在患者自體細(xì)胞/組織上完成，使得在施用前評(píng)價(jià)和可能的避免不利的副作用。此外，在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，以本發(fā)明系統(tǒng)作為關(guān)鍵工具，可采用專門化的細(xì)胞系或組織。系統(tǒng)可進(jìn)行編程，以監(jiān)視和評(píng)價(jià)生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞/組織的各種生理學(xué)條件，并由此提供所選藥物或分子的生物學(xué)效應(yīng)的快速指示。
對(duì)于常規(guī)組織工程技術(shù)難以采用和實(shí)施的領(lǐng)域，和/或在需要廣泛診斷記錄的條件中，也可采用本系統(tǒng)用于研究和開發(fā)。例如，包含組織工程的微重力研究由于該環(huán)境的獨(dú)特屬性而很難施行。由于流體安全問(wèn)題和基于重力的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的缺乏，常規(guī)的細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)在這種環(huán)境中是不可行的。然而本系統(tǒng)是完全密封的從而防止了流體損失，并且作為組織工程過(guò)程一部分的細(xì)胞遷移可通過(guò)受控的流體流動(dòng)而達(dá)到，因此本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可很容易地適應(yīng)微重力環(huán)境。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)可從如下發(fā)明詳述、實(shí)施例和附圖中明顯看出。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，由于本發(fā)明主旨和范圍內(nèi)的各種變化和修改可從所述詳述中明顯看出，因而在說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方案時(shí)，發(fā)明詳述、具體實(shí)施例和附圖僅僅是以例證方式給出。
附圖簡(jiǎn)述參考附圖從如下描述中可進(jìn)一步理解本發(fā)明，圖中

圖1圖解了用于臨床組織工程的常規(guī)方法，如采用自身軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨修復(fù)的實(shí)施例中所應(yīng)用的；圖2所示為本發(fā)明的一種一體化組織工程設(shè)備；圖3所示為圖2組織工程設(shè)備的進(jìn)一步實(shí)施方案；
圖4所示為圖2組織工程設(shè)備的進(jìn)一步實(shí)施方案；圖5所示為圖2組織工程設(shè)備的剖視圖，圖解了內(nèi)部組件和插入設(shè)備內(nèi)的組織工程模塊；圖6所示為圖2組織工程設(shè)備的放大剖視圖，圖解了插入的組織工程模塊；圖7所示為組織工程模塊及其與設(shè)備外殼組件的接口的放大透視圖；圖7(a)所示為生物反應(yīng)器和泵單元的放大透視圖；圖7(b)所示為泵單元和相關(guān)泵管道的放大透視圖；圖8所示為圖7組織工程模塊背側(cè)以及與其相連的流動(dòng)板內(nèi)部構(gòu)造的剖視圖；圖9所示為與配備儀表的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)相關(guān)的混合與微載組件的放大剖視圖；圖10所示為基本的組織工程液體流動(dòng)示意圖；圖11所示為基本的組織工程液體流動(dòng)示意圖的進(jìn)一步實(shí)施方案；圖12所示為備用的生物反應(yīng)器，增殖基片或支架，分化基片及過(guò)程監(jiān)視設(shè)計(jì)，如在不同組織工程方案中可適用的；圖13所示為組織工程模塊的生物反應(yīng)器的放大剖視圖，圖解了生物反應(yīng)器和流體流動(dòng)通道的內(nèi)部構(gòu)造；圖14所示為組織工程模塊的生物反應(yīng)器的進(jìn)一步實(shí)施方案，圖解了生物反應(yīng)器的內(nèi)部構(gòu)造；圖15所示為可旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)；圖16所示為組織工程模塊的無(wú)菌取樣實(shí)施方案；圖17所示為組織工程流體流動(dòng)示意圖的進(jìn)一步實(shí)施方案；圖18所示為組織工程流體流動(dòng)示意圖的進(jìn)一步實(shí)施方案；以及圖19所示為適于組織消化和細(xì)胞收集的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)；圖20所示為適于細(xì)胞增殖的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)；圖21所示為適于細(xì)胞分化和組織結(jié)構(gòu)生成的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)；圖22所示仍為組織工程流體流動(dòng)示意圖的進(jìn)一步實(shí)施方案；以及圖23所示為組織工程模塊的進(jìn)一步實(shí)施方案，所述組織工程模塊帶有用于組織消化/細(xì)胞收集、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分化/組織生成的單獨(dú)生物反應(yīng)器。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種成套、自動(dòng)化的組織工程設(shè)備，用于細(xì)胞，尤其是自身細(xì)胞的離體處理，使之以有效和一致的方式進(jìn)行細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化和組織生成，對(duì)人為干預(yù)的需要減至最小。在該設(shè)備內(nèi)生成的組織結(jié)構(gòu)可整合入宿主，從而幫助組織重建過(guò)程和隨后的患者恢復(fù)。而且，本發(fā)明提供了所述組織工程采用得自許多不同來(lái)源的各種細(xì)胞(例如經(jīng)由患者活檢獲得的自身細(xì)胞，同種異體細(xì)胞或異種細(xì)胞)用于組織工程的自動(dòng)化方法。而且，所述細(xì)胞可以是前體細(xì)胞，原代細(xì)胞，來(lái)自永生細(xì)胞系的細(xì)胞以及其組合。
結(jié)合了本發(fā)明組織工程系統(tǒng)和方法的用于臨床組織工程的常規(guī)方法學(xué)和原理如圖1所示，該圖采用自身軟骨組織工程作為代表實(shí)例。在該實(shí)例中，細(xì)胞(即軟骨細(xì)胞)從患者手術(shù)活檢獲得，并以人工或自動(dòng)化接種至合適的基片或支架上(即SkeliteTM支持物)。軟骨細(xì)胞和支持物存在于自動(dòng)化組織工程模塊的生物反應(yīng)器部分，所述模塊構(gòu)成組織工程系統(tǒng)臨床基地的一部分。組織工程系統(tǒng)內(nèi)存在一個(gè)中央微處理器，用以控制和定制生物反應(yīng)器的內(nèi)部環(huán)境，從而促進(jìn)其內(nèi)的組織生長(zhǎng)，導(dǎo)致刺激細(xì)胞生長(zhǎng)于支持物內(nèi)部和上面，以產(chǎn)生植入物。生物反應(yīng)器內(nèi)的傳感器提供對(duì)微處理器的反饋，以保證細(xì)胞以期望和受控的方式進(jìn)行接種、擴(kuò)增和分化，從而提供自身的組織植入物。植入物一旦產(chǎn)生即從生物反應(yīng)器移去用于患者的手術(shù)植入。本發(fā)明提供了一種有利途徑，用于以無(wú)菌、安全、方便和有效方式提供自身的組織工程植入物。而且，在臨床裝置中制備組織工程植入物的能力允許進(jìn)行組織工程過(guò)程的場(chǎng)所具有相當(dāng)靈活性。雖然系統(tǒng)可在集中化場(chǎng)所使用，系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和操作則使得能夠在區(qū)域化中心進(jìn)行臨床應(yīng)用。這種廣泛的可利用性消除了生物材料轉(zhuǎn)運(yùn)至和自集中化細(xì)胞/組織處理設(shè)備，從而改進(jìn)了組織工程過(guò)程的成本效果和效率，同時(shí)避免了運(yùn)輸、跟蹤和調(diào)控的復(fù)雜情況。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是如圖2所示的組織工程系統(tǒng)，通常以標(biāo)號(hào)100標(biāo)識(shí)。系統(tǒng)100(作為替代，可稱其為設(shè)備)含有外殼102，外殼102帶有用于接收組織工程模塊的插槽104。插槽104帶有可移動(dòng)門106和鎖定機(jī)構(gòu)108。裝備有諸如接觸式屏幕、鍵座及此二者組合的用戶界面110，用于系統(tǒng)操作的控制及用于系統(tǒng)狀態(tài)的顯示。存在有數(shù)據(jù)儲(chǔ)存系統(tǒng)112，使通過(guò)本領(lǐng)域人員熟知的各種介質(zhì)(即ZIP，CDROM，磁盤，閃速卡)記錄信息。計(jì)算機(jī)/通信鏈接114提供了上載新軟件，采用外部計(jì)算機(jī)修改控制參數(shù)，下載數(shù)據(jù)以及故障檢修和測(cè)試設(shè)備的能力。該鏈接也使系統(tǒng)能與臨床中存在的電子信息系統(tǒng)相連接。系統(tǒng)100由電源輸入116提供電源。圖3所示為系統(tǒng)100的進(jìn)一步實(shí)施方案，帶有幾個(gè)彎狀門106以容納若干組織工程模塊。圖4所示為系統(tǒng)100的進(jìn)一步實(shí)施方案，帶有以水平方式朝向的彎狀門106，使得組織工程模塊相對(duì)重力向量能夠優(yōu)先取向。
圖5所示為圖2和圖3描述的系統(tǒng)100的內(nèi)部構(gòu)造，其彎狀門為垂直取向，用于組織工程模塊垂直插入。所示組織工程模塊118用于插入彎狀門106的插槽104內(nèi)。組織工程模塊118經(jīng)由導(dǎo)軌系統(tǒng)(guiderail system)120而進(jìn)入系統(tǒng)外殼102。插入后，模塊118與一個(gè)或多個(gè)泵單元122(即蠕動(dòng)的、活塞的、隔板的或旋轉(zhuǎn)的)，電子連接器(即DIN，AMP，PCB，實(shí)驗(yàn)電路板插口)以及閥傳動(dòng)裝置126(即伺服電機(jī)、線性驅(qū)動(dòng)器，線性傳動(dòng)裝置)接合。任何能夠使模塊正確插入系統(tǒng)內(nèi)的合適引導(dǎo)系統(tǒng)認(rèn)為都是為本領(lǐng)域人員所能理解的。
如圖6中可以更好的看出，組織工程模塊118被插入外殼102，模塊上一系列閥傳動(dòng)裝置126與閥(如圖7和7a更詳細(xì)圖示)連接以提供流動(dòng)控制。電子連接器124經(jīng)由電子底板130提供了模塊118和中央微處理器單元(CPU)128之間的電子連接。CPU128控制操作順序，液體和氣體的轉(zhuǎn)運(yùn)，過(guò)程數(shù)據(jù)的管理，系統(tǒng)狀態(tài)的監(jiān)視，用戶界面以及外部數(shù)據(jù)通信端口。CPU128通過(guò)與有源和無(wú)源電子組件電子鏈接提供控制，所述有源和無(wú)源電子組件存在于底板130和每一插入的組織工程模塊118上。
溫度傳感器132(即熱電偶，RTD或熱敏電阻)，氣體傳感器134(即O2和CO2)以及環(huán)境控制單元(ECU)136通過(guò)CPU128進(jìn)行控制，以采用本領(lǐng)域人員已知標(biāo)準(zhǔn)方法維持外殼102內(nèi)的環(huán)境(即溫度和氣氛)。可對(duì)環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)以滿足組織工程過(guò)程的需要，包括冷藏溫度(即4℃)下的試劑貯存，對(duì)名義體溫(即37℃)的模擬，以及在模塊裝備有氣體交換組件(即膜)時(shí)，用于轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)出模塊118的氣體混合物的可利用度。氣體條件為處于外殼102內(nèi)的氣體傳感器134所監(jiān)視，所得數(shù)據(jù)經(jīng)由電子底板130傳至CPU128。對(duì)ECU的氣體輸入可經(jīng)由氣體供應(yīng)入口140而進(jìn)行，所述氣體供應(yīng)入口140設(shè)在裝配有標(biāo)準(zhǔn)接頭配件的外殼102內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，氣體可貯藏于ECU內(nèi)。設(shè)備內(nèi)使用的氣體包括但不限于氧氣、二氧化碳、氮?dú)庖约捌浠旌衔?。為了在外?02內(nèi)充分容納這些氣體，對(duì)彎狀門106進(jìn)行了配置，使得關(guān)閉時(shí)能提供密封。外殼102采用絕緣材料142進(jìn)行絕緣，以使能對(duì)內(nèi)部溫度(即4℃-37℃)進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，所述絕緣材料142例如聚苯乙烯泡沫塑料，氣凝膠，玻璃纖維等等。
雖然本發(fā)明組織工程系統(tǒng)通常所示為含有方框形外殼，但本領(lǐng)域人員可以理解外殼可做成各種構(gòu)型，只要它能容納此處描述的組件。例如，這包括但不限于開放式構(gòu)型，可以不需要頂部和/或側(cè)邊部分。
組織工程模塊118在圖7-9中有更詳細(xì)圖解。組織工程模塊118含有剛性結(jié)構(gòu)脊骨(structural spine)200，該脊骨200上附接有生物反應(yīng)器202。生物反應(yīng)器202含有帶有蓋子204的生物反應(yīng)器外殼，并可以根據(jù)其內(nèi)所含基片或支架進(jìn)行定制，從而進(jìn)行組織消化、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、組織植入物生成以及其組合。生物反應(yīng)器蓋可以是可分離的，或者作為替代，可與生物反應(yīng)器外殼形成整體。相對(duì)結(jié)構(gòu)脊骨200，結(jié)構(gòu)生物反應(yīng)器202可以是單獨(dú)可分離的及可置換的。為能實(shí)現(xiàn)這種分離，生物反應(yīng)器202和結(jié)構(gòu)脊骨200可采用流體分離配件，包括輸入和輸出線路自我封閉的構(gòu)造，以避免流體損失及預(yù)防生物反應(yīng)器內(nèi)含物的污染。在組織工程工序完成后，整個(gè)組織工程模塊認(rèn)為是可以置換的，因?yàn)樵搶?shí)踐可防止由前次使用引起的污染。作為替代，模塊118中只有選定的組件由于與流體接觸而認(rèn)為是可置換的，而留下不容易污染的組件用于再使用。
如圖7、7a和7b中所見(jiàn)，組織工程模塊118的結(jié)構(gòu)脊骨200上附接有流體安全系統(tǒng)206。流體安全系統(tǒng)206由一系列無(wú)菌的撓性貯罐208和撓性管210構(gòu)成，所述撓性管210用于為生物反應(yīng)器202供應(yīng)，以及從生物反應(yīng)器202取回各種類型的組織及細(xì)胞培養(yǎng)液和藥物。貯罐208的構(gòu)造和數(shù)量可按需要進(jìn)行變化，并且可以容納不同類型的細(xì)胞和組織培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子，藥物試劑，而且也可以容納來(lái)自生物反應(yīng)器202的廢棄培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)基樣品。流體經(jīng)由一系列流體進(jìn)入孔212載入流體安全系統(tǒng)206或從流體安全系統(tǒng)206中去除。管210提供了各種貯罐208和流體控制組件之間的流體連接，所述流體控制組件例如流體流動(dòng)控制閥214。流體流動(dòng)控制閥214通過(guò)閥傳動(dòng)裝置126進(jìn)行開啟和關(guān)閉。類似地，泵單元122與模塊上存在的可置換泵組件進(jìn)行連接。這些泵組件可以是活塞、隔板、旋轉(zhuǎn)元件或蠕動(dòng)管218，條件是在細(xì)胞懸浮液的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，對(duì)這些組件的操作不會(huì)產(chǎn)生危害細(xì)胞成活力的苛刻條件，例如過(guò)度剪切應(yīng)力。泵單元122和閥傳動(dòng)裝置126位于外殼102內(nèi)。作為替代，傳動(dòng)裝置和泵單元可以形成組織工程模塊的一部分，然而，這可導(dǎo)致患者使用后對(duì)這些組件的處置。流體通過(guò)泵單元122在泵管218上的程序性作用而轉(zhuǎn)運(yùn)出貯罐208。流體經(jīng)由管210從撓性流體貯罐208行至流體閥214。流體流動(dòng)板220(如圖8中所示)指引不同流動(dòng)控制閥214和泵單元122的泵管218之間的流體流動(dòng)。流體返回選擇的空貯罐208用于儲(chǔ)存。撓性印刷電路板(PCB)222提供了用于結(jié)構(gòu)脊骨200和/或生物反應(yīng)器202上存在的電子組件(即傳感器)的電子接口。當(dāng)傳感器指示被監(jiān)視參數(shù)(如pH)超出可接受水平時(shí)，CPU可觸發(fā)控制性干預(yù)，例如替換生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)基。
組織工程模塊可任選地包括微處理器224，使得在模塊上直接進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)模塊插入外殼102內(nèi)時(shí)，該信息可傳送至中央CPU128，一旦模塊除去時(shí)，信息可保留在電子內(nèi)存中，用于下一次的訪問(wèn)。除了經(jīng)由微處理器或安置于組織工程模塊上的內(nèi)存芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)儲(chǔ)存外，該模塊還可以任選地包括條形碼226，磁條228，電子內(nèi)存(圖中未示出)和/或ID標(biāo)簽230，以便利臨床內(nèi)的管理跟蹤。
如圖8中所見(jiàn)，流體流動(dòng)板220固定于組織工程模塊118的結(jié)構(gòu)脊骨200。連接流體流動(dòng)板的方法可以是壓配合，滑入配合(snap fit)，超聲焊接，溶劑粘合等等，但不限于此，這是鑒于所采用方法必須使得裝配件密封，以避免流體損失和預(yù)防污染。如圖8a中分解視圖所示，流體流動(dòng)板220帶有整體流體通道232，從而為與流體閥214的致動(dòng)相關(guān)的流動(dòng)指引提供了手段。新的流動(dòng)通道可經(jīng)由對(duì)流動(dòng)板220上存在的通道進(jìn)行修正而得以容納。在一個(gè)實(shí)施方案中，流動(dòng)板220可整合形成結(jié)構(gòu)脊骨200，以形成單個(gè)組件。包括流體加熱與混合室234，以確保導(dǎo)向至生物反應(yīng)器的流體處于合適溫度并被充分混合，從而不會(huì)中斷生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行中的生物學(xué)過(guò)程。而且，組織工程模塊118上存在熱電元件236，使生物反應(yīng)器202內(nèi)的溫度對(duì)比模塊操作溫度而改變，正如按ECU136的操作所規(guī)定。當(dāng)組織工程模塊的剩余組件，尤其是試劑和/或樣品，處于降溫(即冷藏)狀態(tài)以維持物理、化學(xué)和/或生物學(xué)成活力時(shí)，這種溫度改變對(duì)于模擬生物反應(yīng)器內(nèi)的名義生理學(xué)條件是必要的。熱電元件的電源和控制由CPU128執(zhí)行。除了生物反應(yīng)器上存在的傳感器，組織工程模塊上存在的傳感器238給CPU128提供反饋。傳感器和熱電經(jīng)由電纜240和連接器124進(jìn)行連接。
圖9所示為組織工程模塊118的混合和微載方面。生物反應(yīng)器202帶有混合驅(qū)動(dòng)器260，所述混合驅(qū)動(dòng)器260與混合傳動(dòng)裝置262可操作連接并連至混合隔板264?；旌细舭逭献鳛樯锓磻?yīng)器202或生物反應(yīng)器蓋204的一部分，如圖所示。操作中，混合驅(qū)動(dòng)器260結(jié)合混合傳動(dòng)裝置262提供了混合隔板的轉(zhuǎn)換或脈沖，以對(duì)生物反應(yīng)器202內(nèi)含物實(shí)施控制性混合。理想的混合性質(zhì)應(yīng)能避免高流體剪切，所述高流體剪切會(huì)破壞生物反應(yīng)器內(nèi)存在的細(xì)胞的物理整體性。對(duì)于特定的組織工程方案，適度水平的流體剪切對(duì)于組織結(jié)構(gòu)的成功發(fā)育是真正有益的。除了混合組件，還存在沖擊驅(qū)動(dòng)器266和沖擊傳動(dòng)裝置268。當(dāng)增殖工序完成時(shí)，這些組件用于對(duì)生物反應(yīng)器組件進(jìn)行控制性沖擊，以輔助細(xì)胞從位于生物反應(yīng)器內(nèi)的增殖基片或支架上釋放。同時(shí)還裝備有微載驅(qū)動(dòng)器270，可與微載傳動(dòng)裝置272和微載隔板274可操作連接。微載隔板274整合作為生物反應(yīng)器202或生物反應(yīng)器蓋204的一部分，如圖所示。微載隔板的位置和取向使其與基片或支架以及生物反應(yīng)器202內(nèi)存在的任何相關(guān)細(xì)胞或組織有密切接觸。已經(jīng)知道微載的應(yīng)用對(duì)于特定組織工程方案是有利的?；旌向?qū)動(dòng)器260，沖擊驅(qū)動(dòng)器266以及微載驅(qū)動(dòng)器270可以是一系列機(jī)電設(shè)備的任一種，例如螺線管，線性驅(qū)動(dòng)器，旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)器或壓電組件。而且，混合驅(qū)動(dòng)器260，沖擊驅(qū)動(dòng)器266，微載驅(qū)動(dòng)器270，以及相關(guān)的傳動(dòng)裝置也可安裝于外殼200上。作為替代，驅(qū)動(dòng)器和傳動(dòng)裝置可安裝于組織工程模塊或生物反應(yīng)器上，條件是驅(qū)動(dòng)器的設(shè)計(jì)應(yīng)與組織工程模塊的可置換性質(zhì)一致。除了提供機(jī)械刺激，也可對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行配置，以引入對(duì)組織結(jié)構(gòu)的電和/或化學(xué)刺激。特別地，可在生物反應(yīng)器區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生電場(chǎng)，以增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和/或組織形成。電場(chǎng)的產(chǎn)生方法是本領(lǐng)域人員已知的，包括但不限于電線圈的提供。
圖10所示為用于組織工程模塊118的基本流體流動(dòng)示意圖，其中生物反應(yīng)器202內(nèi)有一單個(gè)細(xì)胞或組織培養(yǎng)室(多室生物反應(yīng)器的進(jìn)一步信息可參閱圖12和17的說(shuō)明)。流動(dòng)通道將生物反應(yīng)器202連接至貯罐208，所述貯罐208用于供給流體和收集廢棄物。流體進(jìn)入孔212可用來(lái)裝載試劑或去除樣品或廢液。在泵單元122的操作下產(chǎn)生流動(dòng)，流向由特定流動(dòng)控制閥214的致動(dòng)所規(guī)定。對(duì)生物反應(yīng)器的灌注可以是連續(xù)的或脈動(dòng)的，條件是相關(guān)流動(dòng)不會(huì)導(dǎo)致含細(xì)胞區(qū)域的高流動(dòng)剪切，因?yàn)檫@種情況會(huì)傷害細(xì)胞或新興組織結(jié)構(gòu)。再循環(huán)回路280使得生物反應(yīng)器的液體內(nèi)含物可被外部組件監(jiān)視或更改，而不需要從流體貯罐208運(yùn)送新流體，所述外部組件例如內(nèi)嵌的氣體交換膜282。用于儲(chǔ)藏流體的組織工程模塊118的組件(即貯罐208)在接近4℃下冷藏，以便于在用來(lái)模擬體溫的高溫(即37℃)下會(huì)分解的流體的儲(chǔ)存。根據(jù)預(yù)編程的程序，CPU128控制流體閥214的操作，以使貯存于貯罐208內(nèi)的流體在進(jìn)入生物反應(yīng)器室300(如圖13，14和15詳細(xì)圖解)之前，經(jīng)由泵單元122可運(yùn)送至加熱混合室234。流體經(jīng)由進(jìn)料口302供給生物反應(yīng)器，經(jīng)由出料口304從生物反應(yīng)器移出。為了模擬正常體溫以進(jìn)行最優(yōu)化的細(xì)胞和組織培養(yǎng)，生物反應(yīng)器202，泵單元122和加熱混合室234通過(guò)熱電元件236的操作維持在接近37℃。對(duì)本領(lǐng)域人員顯而易見(jiàn)的是，可采用備用的熱調(diào)節(jié)設(shè)備，以獲得期望的用于組織工程模塊118的熱效應(yīng)。
圖11所示為基本流體流動(dòng)示意圖的變更圖，其中流體流動(dòng)控制閥為多個(gè)泵元件122所取代。這種構(gòu)造增強(qiáng)了操作冗余，并減少了組件數(shù)。這種系統(tǒng)的操作要求任何休止泵單元都應(yīng)防止無(wú)調(diào)節(jié)的貫通流動(dòng)，因?yàn)槌霈F(xiàn)這種情況會(huì)破壞對(duì)流體的控制性運(yùn)送。
圖12a-12d圖解了各種生物反應(yīng)器構(gòu)造，以及用于增殖和分化步驟的基片和支架的備用格式，所述增殖和分化步驟包含于組織工程系統(tǒng)的操作中。圖12a所示為一系列可互換的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)解決不同的生物加工方案。I型方案所指為生物反應(yīng)器202內(nèi)的基本單獨(dú)室300，所述室300容納有增殖支架或基片310，或分化支架或基片(圖中未示出)，并理想地應(yīng)適合于增殖或分化。細(xì)胞可人工接種于支架310上，或經(jīng)由組織工程模塊的流體通道進(jìn)行自動(dòng)化運(yùn)送。
II型方案包含多室生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器為支架310(或基片)和可植入分化支架312的使用提供準(zhǔn)備，所述支架310用于細(xì)胞群體的增殖，所述可植入支架312促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的形成。培養(yǎng)/增殖室300經(jīng)由漏斗314與分化/組織形成室306連接。漏斗用作將從增殖支架310釋放的細(xì)胞引導(dǎo)至可植入分化支架312內(nèi)。生物反應(yīng)器內(nèi)幾個(gè)位置上的過(guò)濾器316用作調(diào)控能自由地從一個(gè)室通過(guò)進(jìn)入下一室的細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的尺寸。過(guò)濾器316a存在于增殖支架上游，目的在于調(diào)節(jié)進(jìn)入的細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體用于細(xì)胞擴(kuò)增步驟。另一過(guò)濾器316b存在于分化支架的上游，仍是控制進(jìn)入該步驟組織工程工序的細(xì)胞群體。另外，在出料口304上面還有一個(gè)過(guò)濾器316c，用于防止細(xì)胞在操作過(guò)程中從分化/組織形成室中損失，所述操作過(guò)程包含通過(guò)生物反應(yīng)器的流體傳遞。過(guò)濾器316可以是濾膜或篩孔或本領(lǐng)域人員熟知的相似類型的過(guò)濾材料。
III型方案將組織消化與隨后的增殖、分化和組織結(jié)構(gòu)形成相結(jié)合。在該方案中，組織活檢320被載入生物反應(yīng)器202內(nèi)存在的消化室322內(nèi)。通過(guò)將消化酶從一個(gè)流體貯罐208運(yùn)送至生物反應(yīng)器內(nèi)，而出現(xiàn)組織活檢的消化，所述流體貯罐208存在于組織工程模塊上。在重力沉降和/或流體穿流培養(yǎng)/增殖室300的影響下，分離細(xì)胞離開消化室322并隨后聚集于增殖支架310上。通過(guò)消化室322和培養(yǎng)/增殖室300之間流動(dòng)通道中存在的濾膜/篩孔316a，組織聚集體被阻止轉(zhuǎn)運(yùn)出消化室322。增殖后，細(xì)胞被釋放并經(jīng)由細(xì)胞漏斗314傳遞至可植入的分化支架312?？芍踩敕只Ъ?12的上游316b和下游316c也存在膜/篩孔濾器，以保證將合適的細(xì)胞群體接種至支架上，以及在流體傳遞操作中不會(huì)使細(xì)胞不經(jīng)意地流失至廢棄物中。
在前述幾種方案中，可存在各種構(gòu)造的增殖基片310或支架，例如圖12b中所示。例如，某一個(gè)構(gòu)造是帶有相對(duì)平均孔梯度的多孔支架310a?？滋荻戎Ъ?10b是帶有孔梯度的多孔支架，其中的孔徑隨細(xì)胞穿行支架而減小。這就在細(xì)胞接種過(guò)程完成時(shí)，促進(jìn)了細(xì)胞在整個(gè)支架中更均勻的分布?？刹捎脦в邢喾慈∠虻目滋荻戎Ъ?10c。作為替代，可采用纖維過(guò)濾支架310d，所述支架是具有纖維基質(zhì)特點(diǎn)的有機(jī)化合物，例如膠原。也可以使用微載體(例如CytodexTM)的包容懸浮液(contained suspension)作為增殖基片。而且，生物反應(yīng)器可帶有為CPU128所支持的光學(xué)探頭324(以與多孔支架310a連接示出)，使得能夠?qū)υ鲋持Ъ軆?nèi)發(fā)生的細(xì)胞接種過(guò)程進(jìn)行檢查，以及進(jìn)一步評(píng)價(jià)增殖事件，特別是朝向獲得匯合細(xì)胞層的進(jìn)程。
與增殖一樣，存在各種可植入的分化支架312，所述分化支架可以不同構(gòu)造和不同材料(即無(wú)機(jī)的基于礦物的支架例如磷酸鈣，有機(jī)生物高分子支架例如膠原，等等)形成，并于組織工程過(guò)程中被采用。圖12c所示為多區(qū)域分化/組織形成室306，含有多達(dá)三個(gè)可植入分化支架312，所有可植入分化支架312可同時(shí)進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)形成。這使得可進(jìn)行不同尺寸可植入組織的制備，以及使得可采用備用的可植入分化支架以評(píng)估組織產(chǎn)量并使之最大化。例如，支架312a是多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由諸如SkeliteTM的骨生物材料形成，用于骨和軟骨的應(yīng)用中，所述應(yīng)用中的組織結(jié)構(gòu)在骨內(nèi)需要硬質(zhì)組織錨定物。支架312a可通過(guò)支架膜/篩孔326的使用而進(jìn)一步增強(qiáng)，所述支架膜/篩孔326環(huán)繞植入物從而產(chǎn)生膜環(huán)繞的支架312b，使得細(xì)胞接種過(guò)程中的細(xì)胞流失出支架312a減至最小，從而使組織工程過(guò)程更有效率。所述膜可優(yōu)選地僅部分環(huán)繞支架或者作為替代，更充分地環(huán)繞支架。由于支架膜/篩孔326的主要目的是容納可植入分化支架312上或內(nèi)部的細(xì)胞，如本領(lǐng)域人員所了解，對(duì)支架膜/篩孔326屬性的仔細(xì)選擇既可允許也可限制特定分子實(shí)體的通行，所述特定分子實(shí)體對(duì)細(xì)胞水平上的組織工程過(guò)程具有顯著影響。
進(jìn)一步實(shí)施方案是梯度孔隙率和膜環(huán)繞的支架312c，它結(jié)合了支架膜/篩孔326和孔梯度的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)梯度進(jìn)行配置，以有意引起細(xì)胞聚集于頂面，而只有極微量細(xì)胞繁殖入支架內(nèi)。一定程度的表面孔隙率認(rèn)為對(duì)于組織穩(wěn)定性以及營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)由支架表面供應(yīng)至發(fā)育中的組織是有利的。該方法導(dǎo)致帶有不同分層區(qū)域的雙極組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育。頂部區(qū)域基本上由新生組織構(gòu)成。底部區(qū)域基本上不含細(xì)胞或組織，只殘存開放的多孔支架。中間界面區(qū)域代表了開放支架和全新組織層之間的結(jié)構(gòu)性穩(wěn)定過(guò)渡。這種雙極組織結(jié)構(gòu)對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨中病灶缺陷的修復(fù)是理想的，因?yàn)轫攲邮菫樗拗鬈浌堑膫?cè)面整合提供準(zhǔn)備的組織工程軟骨，而底層則為軟骨下骨頭的側(cè)面和軸向整合提供準(zhǔn)備。在手術(shù)植入過(guò)程中，通過(guò)將骨髓施用于開放支架，可進(jìn)一步增強(qiáng)底層與周圍軟骨下骨頭的整合。在軟骨修復(fù)應(yīng)用中，重要的一點(diǎn)是基于礦物的支架不會(huì)延伸至關(guān)節(jié)表面，因?yàn)檫@可能危害關(guān)節(jié)功能。相應(yīng)地，在新生軟骨的頂部區(qū)域中可采用繼發(fā)性非礦物支架(圖中未示出)，以輔助形成足夠尺寸的組織結(jié)構(gòu)，用以治療大塊軟骨損傷(即直徑達(dá)到10cm2且厚度2-3mm)。而且，可對(duì)繼發(fā)性支架進(jìn)行定型，以產(chǎn)生帶有關(guān)節(jié)表面輪廓的具一定形狀的結(jié)構(gòu)，所述表面輪廓與植入位點(diǎn)上存在的特定解剖學(xué)特性匹配更接近。用于繼發(fā)性支架的候選材料有合成生物高分子(如PGA，PLA)或天然生物高分子(如藻酸鹽，瓊脂糖，纖維蛋白，膠原，透明質(zhì)酸)。這些繼發(fā)性支架可以是水凝膠或預(yù)先成型的三維支架的形態(tài)。
組織工程系統(tǒng)中可存在用于雙極組織結(jié)構(gòu)制備的備用方法?？芍踩敕只Ъ?12可用可生物再吸收聚合物進(jìn)行部分浸潤(rùn)，所述可生物再吸收聚合物限制細(xì)胞接種至支架的特定區(qū)域。這就在組織結(jié)構(gòu)的制備過(guò)程中產(chǎn)生了新組織形成的優(yōu)選區(qū)域。植入后，聚合物被吸收，從而在多孔支架內(nèi)留下空隙，所述空隙促進(jìn)了宿主組織內(nèi)的錨定。進(jìn)一步的構(gòu)造包含帶有相對(duì)開放孔隙度的可植入支架，其位置遠(yuǎn)離分化/組織形成室的出口。在細(xì)胞接種過(guò)程中，這種開放空間可為遷移穿越開放支架的細(xì)胞的聚集提供準(zhǔn)備。由于細(xì)胞在分化/組織形成室內(nèi)累積，開放空間和一部分支架均為細(xì)胞所浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生新組織形成的優(yōu)選區(qū)域。所產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)含有不帶支架的新生組織區(qū)域，同時(shí)含新生組織和支架的中間過(guò)渡區(qū)域或界面區(qū)域，以及開放的且基本不帶細(xì)胞或組織的多孔支架區(qū)域。
圖12d所示為生物反應(yīng)器監(jiān)視圖，其中傳感器216(即溫度、pH、溶解氣體等)整合入生物反應(yīng)器202的蓋204，以給CPU128提供組織工程過(guò)程進(jìn)度的反饋。另外，可采用CCD攝像儀330來(lái)監(jiān)視增殖支架310(或基片)的光學(xué)屬性，以搜集即將發(fā)生的匯合跡象(例如作為細(xì)胞密度函數(shù)的光學(xué)密度和/或光散射)，使得能進(jìn)行定時(shí)的細(xì)胞釋放，從而使增殖步驟的細(xì)胞產(chǎn)量最大化。
圖13更好的展示了生物反應(yīng)器202內(nèi)的流動(dòng)通道和流體循環(huán)。所示生物反應(yīng)器202帶有進(jìn)料口302，出料口304和內(nèi)部空穴，所述內(nèi)部空穴限定了基本室300。流體經(jīng)由進(jìn)料口302從流體流動(dòng)板220流入生物反應(yīng)器202，而通過(guò)出料口304流出。生物反應(yīng)器蓋204連接至生物反應(yīng)器202?？刹捎酶鞣N不同的裝配硬件使生物反應(yīng)器蓋204和生物反應(yīng)器202固定在一起。室300可設(shè)計(jì)成容納一個(gè)或多個(gè)基片或支架310。而且，生物反應(yīng)器202可細(xì)分成能進(jìn)行組織消化、增殖、分化和組織形成步驟的單獨(dú)室。每一室可裝配有進(jìn)料口和出料口，所述端口經(jīng)由流動(dòng)控制閥而得以獨(dú)立控制，為了更好地控制組織工程工序。在CPU128的控制信號(hào)的基礎(chǔ)上，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)控制閥214以及泵單元122的啟動(dòng)而實(shí)現(xiàn)流體循環(huán)。根據(jù)特定的被啟動(dòng)閥，泵單元122的操作將流體從一個(gè)流體貯罐208輸入生物反應(yīng)器202，或使生物反應(yīng)器內(nèi)的流體進(jìn)行再循環(huán)。再循環(huán)對(duì)于需要穩(wěn)定溶解氣體濃度的生物過(guò)程是有利的，因?yàn)樗沽黧w能夠穿過(guò)促進(jìn)氣體交換的膜。交換的性質(zhì)基于與外部條件相對(duì)的生物反應(yīng)器內(nèi)溶解濃度，所述外部條件為ECU136所建立。所示生物反應(yīng)器蓋204帶有取樣端口332和傳感器探頭216，所示傳感器探頭216可與生物反應(yīng)器的內(nèi)室可操作連接。作為替代，取樣端口可裝備于生物反應(yīng)器外殼上的其他位置。取樣端口使得能將原料添加入生物反應(yīng)器內(nèi)，或?qū)⒃先コ錾锓磻?yīng)器。根據(jù)需要，取樣端口可為氣體交換膜替代，或添加氣體交換膜。
圖14圖解為多室生物反應(yīng)器202，為了圖解清楚除去了生物反應(yīng)器蓋204。進(jìn)料口302連接至組織消化室322。組織消化室322的構(gòu)造使患者活檢組織能載入生物反應(yīng)器內(nèi)，用于隨后的自動(dòng)化消化以獲得分離細(xì)胞。消化室內(nèi)的循環(huán)通道促進(jìn)了活檢組織的輕微攪拌以避免產(chǎn)生不流動(dòng)區(qū)域，所述不流動(dòng)區(qū)域可潛在性地導(dǎo)致活檢組織過(guò)度暴露于循環(huán)中的消化酶。而且，消化室的入口和/或出口可內(nèi)裝有孔隙率不同的濾膜/篩孔316(未示出)，從而為細(xì)胞分揀提供準(zhǔn)備以及阻止部分消化組織聚集體的釋放。生物反應(yīng)器含有容納了增殖基片或支架310的第二室300，用于接收增殖細(xì)胞。增殖支架可形成各種幾何學(xué)形態(tài)，所述幾何形態(tài)可同時(shí)支持二維和三維增殖，并可由各種生物相容的促進(jìn)細(xì)胞增殖的材料構(gòu)成，諸如磷酸鈣生物材料(例如SkeliteTM)，生物高分子或天然基質(zhì)(例如膠原)。從組織消化室322或經(jīng)由任選的細(xì)胞接種口334運(yùn)送來(lái)的細(xì)胞分散于增殖基片或支架310之上或之內(nèi)并進(jìn)行增殖，由此增加了用于隨后的細(xì)胞分化和組織形成的細(xì)胞群體。需指出的是如果目標(biāo)僅為擴(kuò)增細(xì)胞群體而無(wú)需進(jìn)一步分化的話，則增殖后過(guò)程即可終止。在生物反應(yīng)器202基部，分化/組織形成室306內(nèi)存在可植入分化支架312。和增殖支架310一樣，可植入分化支架312可形成不同的幾何形態(tài)，并可由各種生物相容材料構(gòu)成，所述生物相容材料可加以適合選擇以滿足植入位點(diǎn)的生物學(xué)需求(例如SkeliteTM是一種用于骨骼位點(diǎn)的理想植入物)。
在操作中，細(xì)胞通過(guò)自動(dòng)化工序從增殖基片或支架310上釋放，所述自動(dòng)化工序例如酶(如胰蛋白酶)的運(yùn)送，以及經(jīng)由沖擊驅(qū)動(dòng)器226(未示出)對(duì)生物反應(yīng)器定時(shí)施加沖擊。在生物反應(yīng)器內(nèi)存在的控制性流動(dòng)條件下，細(xì)胞懸浮液經(jīng)由細(xì)胞漏斗314遷移入可植入支架312，于是細(xì)胞停留于可植入支架312上并開始分化和組織形成工序。該工序完成后，由此生成的組織可從生物反應(yīng)器移去，以用于隨后的植入。本領(lǐng)域人員可以理解，圖14生物反應(yīng)器的特別實(shí)施方案僅僅是一個(gè)代表性的設(shè)計(jì)實(shí)例。通常，生物反應(yīng)器在總形狀、尺寸和內(nèi)部構(gòu)造方面可以各種方式進(jìn)行裝配，而對(duì)功能不會(huì)產(chǎn)生不利影響。例如，生物反應(yīng)器上存在的氣體交換膜336可以是單獨(dú)的和不連續(xù)的組件，與一個(gè)或多個(gè)組織工程模塊118的流體運(yùn)送管210或流動(dòng)板220串聯(lián)連接。而且，生物反應(yīng)器的室經(jīng)由控制閥可彼此分開，以避免所有流體穿過(guò)所有室的必要性。需要時(shí)，室間的通道可打開，以進(jìn)行流體的傳遞和細(xì)胞懸浮。這種變更能增加生物加工條件和工序中的柔性，其一個(gè)實(shí)例如圖17所示。一種能使可植入分化支架312可控制的暴露于生物反應(yīng)器內(nèi)含物的備用構(gòu)造是采用了梭子318，所述梭子318隔離了可植入支架，直到需要進(jìn)行作為分化步驟一部分的細(xì)胞接種。為能使細(xì)胞接種，梭子318將可植入支架從生物反應(yīng)器內(nèi)的受保護(hù)位置移動(dòng)至流體流中。所述梭子可以是各種構(gòu)造，包括基于旋轉(zhuǎn)的移動(dòng)或采用隔離可植入支架直至需進(jìn)行細(xì)胞接種的可移動(dòng)載體。
圖15所示為旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)采用了重力矢量的方向，以在組織工程過(guò)程不同階段通過(guò)沉降進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。需要指出，雖然該解了生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)，然而通過(guò)組織工程模塊的旋轉(zhuǎn)或?qū)嶋H上通過(guò)整個(gè)外殼102的旋轉(zhuǎn)，可同樣獲得該技術(shù)目的。如圖15所示，生物反應(yīng)器202連接至旋轉(zhuǎn)軸350，所述旋轉(zhuǎn)軸350固定于組織工程模塊118的結(jié)構(gòu)脊骨200。這就提供了用于生物反應(yīng)器202旋轉(zhuǎn)的機(jī)構(gòu)，使得在培養(yǎng)/增殖室300內(nèi)所選定的增殖表面上，經(jīng)由沉降可出現(xiàn)細(xì)胞接種。生物反應(yīng)器的增殖表面上可任選地包被有增強(qiáng)增殖的生物材料(例如SkeliteTM)，或可于室300內(nèi)插入專用增殖基片或支架以提供這種功能。作為消化室322用途的另一選擇，在生物反應(yīng)器202側(cè)邊裝備有第二接種口352，使得能夠進(jìn)行直接的細(xì)胞接種。細(xì)胞可初始接種于相對(duì)較小的增殖表面354(圖15a)上。在所耗增殖時(shí)間或檢測(cè)匯合的基礎(chǔ)上，細(xì)胞可自動(dòng)被釋放，生物反應(yīng)器經(jīng)由旋轉(zhuǎn)軸350旋轉(zhuǎn)使得從增殖表面354釋放的細(xì)胞可沉降于表面356的增加區(qū)域上(圖15b)，從而進(jìn)行進(jìn)一步的增殖。第二增殖步驟完成后，擴(kuò)增的細(xì)胞被釋放，生物反應(yīng)器再次旋轉(zhuǎn)使能進(jìn)行可植入支架312的接種(圖15c)。由此旋轉(zhuǎn)軸350和相關(guān)的撓性管358使生物反應(yīng)器202能按要求進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，以在隨后增殖階段最大化地應(yīng)用重力沉降。在這些條件滿意時(shí)，以某一方式采用旋轉(zhuǎn)軸使生物反應(yīng)器攪拌或振搖是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。
現(xiàn)在參看圖16，可對(duì)組織工程模塊118進(jìn)行修改，以包括用于懸浮細(xì)胞、組織培養(yǎng)液和/或廢棄產(chǎn)物的無(wú)菌取樣的技術(shù)。在本實(shí)施方案中，于組織工程模塊118的結(jié)構(gòu)脊骨200內(nèi)集成入注射器歧管400和無(wú)菌卸料口402。微鏜孔管道406經(jīng)由取樣口332將注射器歧管400連接至生物反應(yīng)器202。注射器404在歧管400處與卸料口402連接，使能進(jìn)行流體樣品或細(xì)胞懸浮液的收集和去除以用于隨后分析，而不會(huì)危害組織工程過(guò)程的操作，整體性或無(wú)菌性。還提供了一個(gè)備用的取樣技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)可熔生物反應(yīng)器取樣管線408與生物反應(yīng)器蓋204連接。由于該管線與生物反應(yīng)器的內(nèi)部物理連接，并且與其內(nèi)進(jìn)行中的生物學(xué)事件非常接近，因而管線內(nèi)含有的流體與生物反應(yīng)器內(nèi)存在的流體的組成基本相同。由此，通過(guò)熔化取樣管線的末端即可得到生物反應(yīng)器流體的代表性樣品，然后將管線從組織工程模塊去除以用于隨后分析。本領(lǐng)域人員顯然可看出，通過(guò)外殼102內(nèi)密封組件的自動(dòng)化操作，這種可熔管線可用作取樣技術(shù)的基礎(chǔ)。
圖17所示為用于組織工程模塊118的更復(fù)雜的流體流動(dòng)示意圖，其中單獨(dú)的生物反應(yīng)器室可提供用于消化、增殖和分化的不同需求。這些室可存在于一系列不連續(xù)生物反應(yīng)器內(nèi)，或結(jié)合于單個(gè)生物反應(yīng)器內(nèi)，所述單個(gè)生物反應(yīng)器可對(duì)每一室內(nèi)的條件維持單獨(dú)控制。存在有容納組織活檢320的組織消化室322。存在有增殖室300，該室配置成接收來(lái)自消化室322的細(xì)胞，并能進(jìn)行增殖基片或支架310的接種。還存在分化/組織形成室306，該室配置成接收來(lái)自增殖室300的擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，并能進(jìn)行可植入支架312的接種。
組織工程試劑(即培養(yǎng)基，酶溶液，洗滌溶液等)載入流體貯罐208a-208e內(nèi)。廢棄產(chǎn)物收集于流體貯罐208f內(nèi)，該貯罐可采用進(jìn)入孔218f進(jìn)行手動(dòng)抽吸，以用于取樣目的。其他流體貯罐可構(gòu)成流體貯罐系統(tǒng)206的一部分，并可按需要容納于組織工程模塊上，以用于不同的組織工程過(guò)程。流體在流體泵122a-122k，流動(dòng)控制閥214a-214c，單向流動(dòng)閥410a-410c(即流體流動(dòng)檢查閥)的操作指引下流穿系統(tǒng)。而且，根據(jù)來(lái)自中央微處理器的控制輸入，泵212a-212k裝配成可作為有源泵或無(wú)源閥(開/關(guān))進(jìn)行操作。過(guò)濾器316a-316d用以在組織工程過(guò)程的洗滌和過(guò)渡階段選擇性地控制系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞懸浮液的運(yùn)動(dòng)，以及限制細(xì)胞聚集體的通行。培養(yǎng)基中溶解氣體水平經(jīng)由內(nèi)嵌的氣體交換膜282a和282b而得以維持。存在任選的注射器404a和404b，以使能經(jīng)由無(wú)菌卸料口402a和402b進(jìn)行細(xì)胞收集和培養(yǎng)基取樣。
在操作中，組織活檢320插入過(guò)濾器316a和316b之間的組織消化室322。將含有酶的消化培養(yǎng)基從流體貯藏系統(tǒng)206泵入組織消化室322，以開始消化過(guò)程。通過(guò)混合隔板輕微攪拌消化室內(nèi)消化培養(yǎng)基可增強(qiáng)消化作用，以使試劑最大化地暴露于活檢組織。消化培養(yǎng)基可經(jīng)由泵122g進(jìn)行連續(xù)或周期性再循環(huán)。再循環(huán)期間，流體流動(dòng)被逆重力矢量地引導(dǎo)至消化室底部，以懸浮和跌落(tumble)組織活檢，從而使消化過(guò)程的效力最大化。過(guò)濾器316a阻止了細(xì)胞和細(xì)胞聚集體遷移入流體通道。再循環(huán)通道包括內(nèi)嵌的氣體交換膜282a，所述氣體交換膜282a為消化培養(yǎng)基內(nèi)溶解氣體水平的一致性提供準(zhǔn)備。將含于流體貯藏系統(tǒng)206內(nèi)的洗滌溶液引入消化室322底部，可沖洗消化室并有效地將消化培養(yǎng)基從分離細(xì)胞和任何殘余細(xì)胞聚集體洗去。單個(gè)或多個(gè)洗滌工序后，采用逆向流動(dòng)將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)運(yùn)至增殖室300或任選的注射器404a，以用于外部檢查或分析。通過(guò)過(guò)濾器316b阻止了部分消化組織轉(zhuǎn)運(yùn)出消化室，所述過(guò)濾器316b的大小做成使分離細(xì)胞通過(guò)，而使細(xì)胞聚集體截留。
從活檢消化過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞或經(jīng)由細(xì)胞懸浮液直接加載得到的細(xì)胞，通過(guò)流體流動(dòng)和/或重力沉降接種至增殖室300內(nèi)存在的增殖基片或支架310上。經(jīng)過(guò)一個(gè)靜止期使細(xì)胞附著于增殖基片或支架310(用于附著依賴細(xì)胞的實(shí)例)，將增殖培養(yǎng)基從流體貯藏系統(tǒng)206引入增殖室300內(nèi)。在增殖階段的特定時(shí)間，該培養(yǎng)基周期性地為來(lái)自貯藏系統(tǒng)206的新鮮增殖培養(yǎng)基所替換。在培養(yǎng)基替換步驟之間，在泵122g，122h和122i加上控制閥214a和214b的控制之下，增殖室內(nèi)的流體連續(xù)地或周期性地再循環(huán)。流體運(yùn)送和再循環(huán)通道包括內(nèi)嵌的氣體交換膜282a，所述氣體交換膜282a為增殖培養(yǎng)基內(nèi)溶解氣體水平的一致性提供準(zhǔn)備。在培養(yǎng)基替換步驟過(guò)程中，來(lái)自流體貯藏系統(tǒng)206的新鮮培養(yǎng)基的供給通過(guò)經(jīng)由泵122f去除流體至廢棄物貯罐208f而得以平衡。由此，通過(guò)周期性的培養(yǎng)基替換步驟和控制性再循環(huán)的結(jié)合，組織工程系統(tǒng)在整個(gè)增殖過(guò)程中保持了增殖室內(nèi)的最優(yōu)條件。
一旦細(xì)胞培養(yǎng)物接近匯合，增殖室300內(nèi)的培養(yǎng)基即通過(guò)泵122f排空至廢物貯罐208f。在該過(guò)程中，流體從增殖室的去除為進(jìn)入的無(wú)菌空氣或從流體貯藏系統(tǒng)206進(jìn)入的PBS洗滌溶液所平衡，所述無(wú)菌空氣經(jīng)由增殖室(未示出)上的無(wú)菌過(guò)濾口運(yùn)送。細(xì)胞通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的洗滌步驟用PBS洗滌溶液進(jìn)行廣泛洗滌，以去除殘留的增殖培養(yǎng)基。隨后通過(guò)自動(dòng)化工序，例如酶(如胰蛋白酶)的運(yùn)送以及經(jīng)由沖擊驅(qū)動(dòng)器定時(shí)給生物反應(yīng)器施加的沖擊，細(xì)胞從增殖基片或支架310上釋放。細(xì)胞釋放后，可通過(guò)運(yùn)送含血清的培養(yǎng)基來(lái)停止酶法過(guò)程，所述血清抑制了酶活性。為了收集細(xì)胞用于最后接種至分化/組織形成室306內(nèi)的可植入支架312上，將細(xì)胞懸浮液從增殖室300傳遞至過(guò)濾器316c。在泵122f控制下，過(guò)濾器316c阻止了細(xì)胞的通行，但卻允許培養(yǎng)基經(jīng)由閥214b繼續(xù)通行至廢物貯罐208f。然后通過(guò)施加逆向流動(dòng)，被收集的細(xì)胞從過(guò)濾器316釋放并運(yùn)送至分化/組織形成室306或任選的注射器404b，用于外部檢查或分析。
經(jīng)由泵122j，通過(guò)將細(xì)胞從過(guò)濾器316c傳遞至支架頂面，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在可植入分化支架312c上的接種。通過(guò)任選的采用支架膜或篩孔326，可使細(xì)胞從支架的流失減至最小。細(xì)胞接種后，可通過(guò)泵122k的操作，經(jīng)二次輸入將新鮮分化培養(yǎng)基引入分化/組織形成室。該二次輸入位于遠(yuǎn)離接種有細(xì)胞的可植入支架的區(qū)域，以使損害性剪切應(yīng)力的潛在性減至最小，所述剪切應(yīng)力可破壞細(xì)胞聚集體的形成。在分化階段過(guò)程的特定時(shí)間，分化培養(yǎng)基周期性地為來(lái)自貯藏系統(tǒng)206的新鮮分化培養(yǎng)基所替代。在培養(yǎng)基替換步驟之間，在泵122j或122k加上控制閥214b的控制之下，分化/組織形成室內(nèi)的流體連續(xù)地或周期性地再循環(huán)。用于新鮮分化培養(yǎng)基和再循環(huán)培養(yǎng)基運(yùn)送的通道包括內(nèi)嵌的氣體交換膜282b，所述氣體交換膜282b為分化培養(yǎng)基內(nèi)溶解氣體水平的一致性提供準(zhǔn)備。在培養(yǎng)基替換步驟過(guò)程中，來(lái)自流體貯藏系統(tǒng)206的新鮮培養(yǎng)基的供給通過(guò)經(jīng)由泵122f去除流體至廢物貯罐208f而得以平衡。在對(duì)組織結(jié)構(gòu)成功形成必要的階段，對(duì)分化/組織形成室內(nèi)的環(huán)境條件進(jìn)行監(jiān)視和控制，組織結(jié)構(gòu)成功形成時(shí)，打開生物反應(yīng)器的分化/組織形成室并回收結(jié)構(gòu)用于隨后的臨床或研究用途。
圖18所示為圖17流體流動(dòng)示意圖的變種，其中增殖室300內(nèi)的增殖支架或基片310替換為具有相對(duì)較大表面積的平面增殖基片?；娜∠蚴沟弥亓ο碌募?xì)胞沉降能將細(xì)胞均勻分布于增殖表面上。假若增殖室能維持正確的取向，則增殖基片的形態(tài)可以是剛性聚合物培養(yǎng)板或撓性壁容器。
圖19所示為含有組織消化室322的組織消化生物反應(yīng)器500，所述組織消化室322帶有合適尺寸，以容納一個(gè)或多個(gè)諸如組織活檢320的組織樣品。生物反應(yīng)器500由四個(gè)主要組件組成基本構(gòu)成組織消化室322的生物反應(yīng)器基部502，可移除的生物反應(yīng)器蓋504，端口過(guò)濾器316b，以及任選的端口過(guò)濾器316a(未示出)。
生物反應(yīng)器蓋504為帶有任選的端口過(guò)濾器316a(未示出)的培養(yǎng)基端口506以及空氣出料口508提供準(zhǔn)備。生物反應(yīng)器底部500容納有過(guò)濾器316b，所述過(guò)濾器316b允許分離細(xì)胞通過(guò)并經(jīng)由培養(yǎng)基端口510移出組織消化室322，而組織聚合體和活檢組織碎片則被截留。
組織活檢320插入后，在自動(dòng)控制下，通過(guò)端口506或端口510，生物反應(yīng)器充滿酶溶液。酶溶液加入至組織消化室322，通過(guò)經(jīng)由端口508的空氣排出而得以平衡。在連續(xù)或間歇的酶溶液再循環(huán)下發(fā)生活檢組織消化，由此保持釋放細(xì)胞處于懸浮，并使活檢組織最大化地暴露于酶試劑。再循環(huán)過(guò)程中，酶溶液通過(guò)端口510進(jìn)入生物反應(yīng)器，經(jīng)由端口506離開。這就產(chǎn)生與重力矢量相反方向的流體流動(dòng)通道，從而使活檢組織被懸浮和跌落，以使酶試劑的效力最大化。通過(guò)混合隔板(未示出)輕微攪拌消化室內(nèi)消化培養(yǎng)基可增強(qiáng)消化作用。端口508在任一再循環(huán)步驟中可關(guān)閉，因?yàn)榇嬖谟诹黧w流動(dòng)系統(tǒng)中的空氣氣泡被捕獲于生物反應(yīng)器的上半部分，在端口506的入口512之上。消化工序完成后，通過(guò)端口506施加空氣或培養(yǎng)基的逆向流動(dòng)，將分離細(xì)胞通過(guò)端口510傳遞至增殖室或細(xì)胞收集容器。
圖20所示為增殖室300提供準(zhǔn)備的增殖生物反應(yīng)器520。增殖室的底部由適合用于細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的增殖基片310組成。為了調(diào)節(jié)或維持培養(yǎng)基內(nèi)溶解氣體水平，可于增殖室頂面集成入氣體可透過(guò)的膜(未示出)，以使能進(jìn)行諸如O2和CO2的氣體轉(zhuǎn)運(yùn)。分離壁522將增殖室內(nèi)部空間分成通道系統(tǒng)，從而迫使培養(yǎng)基沿著預(yù)定通道從進(jìn)料口524到出料口526運(yùn)送。
增殖生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)具有一些重要的操作特征。細(xì)胞懸浮液通過(guò)通道系統(tǒng)的注入可得到相對(duì)均一的細(xì)胞接種。而且，通道構(gòu)造保證了培養(yǎng)基流動(dòng)很好地分布于整個(gè)增殖表面上，由此減少了潛在的低流動(dòng)區(qū)域，所述低流動(dòng)區(qū)域由于減少了營(yíng)養(yǎng)供給或廢棄產(chǎn)物的去除，可能危害局部細(xì)胞活力。增殖工序完成后，合適酶溶液通過(guò)通道系統(tǒng)的連續(xù)或間歇再循環(huán)，由于酶反應(yīng)的作用和由流體流動(dòng)產(chǎn)生的低水平剪切應(yīng)力，誘導(dǎo)出均一的細(xì)胞分離。相應(yīng)地，無(wú)需機(jī)械振搖或增殖室的旋轉(zhuǎn)即可完成細(xì)胞收獲。
圖21所示為設(shè)計(jì)用以促進(jìn)細(xì)胞分化和隨后的組織結(jié)構(gòu)形成的分化生物反應(yīng)器530。該生物反應(yīng)器由四個(gè)主要組件組成基本構(gòu)成分化/組織形成室306的生物反應(yīng)器基部532，可移除的生物反應(yīng)器蓋534，可透過(guò)的膜管326，以及分化支架312。可透過(guò)膜管326緊密環(huán)繞網(wǎng)狀支架以在支架上方形成組織生長(zhǎng)隔室536。根據(jù)支架的孔尺寸以及膜管內(nèi)支架的布置，組織生長(zhǎng)隔室可在支架內(nèi)延伸。膜管也固定于端口542的入口540上，從而使膜真正位于分化/組織形成室306內(nèi)的中心。這就把生物反應(yīng)器分成兩個(gè)獨(dú)立隔室，一個(gè)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)隔室536以及一個(gè)外部的不含細(xì)胞的培養(yǎng)基隔室538，兩隔室都在整個(gè)分化/組織形成室306內(nèi)。膜管的孔尺寸的選擇基礎(chǔ)是細(xì)胞不透過(guò)，而培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物、廢棄產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子等可透過(guò)。如果需要的話，膜孔尺寸可按某一方式進(jìn)行選擇，以阻止具有特定分子量的分子通過(guò)膜。
生物反應(yīng)器蓋534帶有兩個(gè)空氣出料口542和544，以及一個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)料口546。生物反應(yīng)器基部532進(jìn)一步容納有兩個(gè)端口548和550。進(jìn)料口546對(duì)于細(xì)胞懸浮液載入組織生長(zhǎng)隔室536和用培養(yǎng)基灌注生成的組織結(jié)構(gòu)是必需的。在細(xì)胞懸浮液運(yùn)送至空組織生長(zhǎng)隔室內(nèi)過(guò)程中，被捕獲的空氣允許通過(guò)端口542排出。以類似方式，外部不含細(xì)胞的隔室538經(jīng)由端口548或端口550裝載培養(yǎng)基，而被捕獲的空氣經(jīng)由端口544排出。
分化生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)使得能通過(guò)將培養(yǎng)基運(yùn)送至端口546，或者間接地將培養(yǎng)基經(jīng)由端口548供給至周圍的不含細(xì)胞的隔室538，來(lái)進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的直接灌注。典型地，在灌注過(guò)程中端口542和544關(guān)閉，端口550用作為培養(yǎng)基出口；然而，在特定組織工程需求的基礎(chǔ)上，可采用各種備用的培養(yǎng)基供給方案。培養(yǎng)基灌注策略的一個(gè)重要方面是構(gòu)成組織生長(zhǎng)隔室一部分的可透過(guò)膜326，它使得新鮮培養(yǎng)基可透過(guò)組織生長(zhǎng)隔室，而沒(méi)有任何細(xì)胞從支架流失。而且，營(yíng)養(yǎng)物幾乎從所有方向供給細(xì)胞，沒(méi)有來(lái)自任何不透過(guò)的生物反應(yīng)器壁的限制。
圖22所示為流體流動(dòng)示意圖的進(jìn)一步實(shí)施方案，其中可采用圖19-21中的生物反應(yīng)器。存在有組織消化室322用以容納組織活檢。存在有增殖室300，裝配成用以接收來(lái)自消化室322的細(xì)胞并能進(jìn)行增殖基片的接種。氣泡捕獲器560去除從輸入管線到增殖室的空氣氣泡，由此防止這些氣泡進(jìn)入增殖室300并潛在性地危害局部細(xì)胞群體。貯罐562用以接收來(lái)自增殖室300的擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，并在錯(cuò)流過(guò)濾模塊564輔助下進(jìn)行的細(xì)胞洗滌和細(xì)胞濃縮工序過(guò)程中，用作為臨時(shí)性支持容器(holding container)。還存在分化/組織形成室306，裝配成用以接收洗滌和濃縮步驟后來(lái)自貯罐562的細(xì)胞，并能進(jìn)行可植入支架312的接種。
組織工程試劑(即培養(yǎng)基、酶溶液、洗滌溶液等)儲(chǔ)藏于流體貯罐208a-208e。廢棄產(chǎn)物收集于流體貯罐208f。根據(jù)來(lái)自中央微處理器的控制輸入，通過(guò)流體泵122a和122b，流動(dòng)控制閥214a-214v的操作指引，流體得以流穿系統(tǒng)。在操作過(guò)程中，空氣過(guò)濾器566a-566c使空氣按需要傳遞進(jìn)入或傳遞出系統(tǒng)，而不會(huì)危害系統(tǒng)的無(wú)菌性。而且，內(nèi)嵌的氣體交換膜(未示出)可裝配于流體流動(dòng)通道內(nèi)的多種位置，以方便培養(yǎng)基內(nèi)溶解氣體的控制。
操作中，將組織活檢320插入組織消化室322。含有酶的消化培養(yǎng)基從流體貯罐208泵入組織消化室322，以開始消化過(guò)程。消化培養(yǎng)基可經(jīng)由泵122a連續(xù)或周期性地再循環(huán)，由此保持釋放細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，并使試劑最大化地暴露于活檢組織。增殖培養(yǎng)基從一個(gè)流體貯罐208引入消化室322頂部，從而將細(xì)胞懸浮液傳遞至增殖室300，并同時(shí)將增殖室300內(nèi)的酶溶液稀釋成細(xì)胞增殖可承受的濃度。通過(guò)端口過(guò)濾器316b阻止了部分消化組織傳遞出消化室，所述端口過(guò)濾器316b的大小做成使分離細(xì)胞通行，而使細(xì)胞聚集體截留。通過(guò)經(jīng)由閥214h，214j，214I和泵122a的啟動(dòng)再循環(huán)細(xì)胞懸浮液，或通過(guò)增殖生物反應(yīng)器輕微振搖的自動(dòng)化施用，使從活檢消化過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞均一散布于整個(gè)增殖室300。
經(jīng)過(guò)一段靜止期使細(xì)胞附著于增殖基片后，增殖培養(yǎng)基周期性地或連續(xù)地為來(lái)自一個(gè)流體貯罐208的新鮮增殖培養(yǎng)基所替換。在培養(yǎng)基替換步驟過(guò)程中，來(lái)自流體貯藏系統(tǒng)208的新鮮培養(yǎng)基的供給通過(guò)流體經(jīng)由閥214i去除入廢棄物貯罐208f而得以平衡。
一旦細(xì)胞培養(yǎng)物接近匯合，增殖室300內(nèi)的培養(yǎng)基即排空入廢棄物貯罐208f。在該過(guò)程中，來(lái)自增殖室的流體的去除通過(guò)進(jìn)入的無(wú)菌空氣或通過(guò)進(jìn)入的PBS洗滌溶液得以平衡，所述無(wú)菌空氣經(jīng)由無(wú)菌過(guò)濾器566a進(jìn)行運(yùn)送，所述PBS洗滌溶液來(lái)自一個(gè)流體貯罐208。
隨后通過(guò)一個(gè)自動(dòng)化工序，例如酶(例如胰蛋白酶)的運(yùn)送以及細(xì)胞懸浮液的定時(shí)再循環(huán)，或經(jīng)由沖擊驅(qū)動(dòng)器定時(shí)給生物反應(yīng)器施加沖擊或攪拌，使細(xì)胞從增殖基片釋放。為了去除酶，以及收集相對(duì)較小培養(yǎng)基體積的細(xì)胞，以用于隨后傳遞至細(xì)胞分化室306，將細(xì)胞懸浮液從增殖室300傳遞至貯罐562。然后經(jīng)由閥214m，214j，214q和泵122a，通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾模塊564使細(xì)胞懸浮液持續(xù)再循環(huán)。錯(cuò)流過(guò)濾模塊564中的膜可防止細(xì)胞損失，但允許一定百分比的培養(yǎng)基(滲透)經(jīng)由閥214o去除至廢物貯罐208f。其結(jié)果是懸浮液體積的減少和/或存在的任何酶的稀釋，前提是滲透物的去除通過(guò)來(lái)自一個(gè)流體貯罐208的新鮮培養(yǎng)基的供給而得以補(bǔ)償。持續(xù)流動(dòng)減少了細(xì)胞被捕獲入錯(cuò)流模塊564的膜內(nèi)的可能性。
通過(guò)將來(lái)自貯罐562的洗滌后細(xì)胞經(jīng)由閥214m，214j，214p和泵122a傳遞至支架頂面，可完成細(xì)胞于可植入分化支架312上的接種。通過(guò)任選采用支架膜或篩孔326可使細(xì)胞從支架的流失減至最小。細(xì)胞接種后，通過(guò)泵122b的操作將新鮮分化培養(yǎng)基引入分化/組織形成室306。分化培養(yǎng)基周期性或持續(xù)性地被來(lái)自貯藏系統(tǒng)的新鮮分化培養(yǎng)基所替換。在培養(yǎng)基替換步驟過(guò)程中，來(lái)自一個(gè)流體貯罐208的新鮮培養(yǎng)基的供給通過(guò)流體經(jīng)由閥214u去除入廢物貯罐208f而得以平衡。在培養(yǎng)基替換步驟之間，在泵122b，閥214t和閥214r(對(duì)通過(guò)組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行灌注而言)或閥214s(對(duì)運(yùn)送出支架膜326而言)的控制之下，分化/組織形成室內(nèi)的流體持續(xù)或周期性地再循環(huán)。該支架膜外的第二流體運(yùn)送通道位置處于遠(yuǎn)離接種有細(xì)胞的可植入支架的區(qū)域，從而使破壞性剪切應(yīng)力的可能減至最小，所述破壞性剪切應(yīng)力可能危害細(xì)胞聚集體的形成。與前述流體流動(dòng)示意圖實(shí)施方案一樣，在組織結(jié)構(gòu)成功形成的必要階段，分化/組織形成室內(nèi)的環(huán)境條件需進(jìn)行監(jiān)視和控制，在組織結(jié)構(gòu)形成時(shí)，打開生物反應(yīng)器的分化/組織形成室，并回收結(jié)構(gòu)用于隨后的臨床或研究用途。
圖23所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中如此處描述的組織工程模塊包含三個(gè)生物反應(yīng)器。圖23例解了如下生物反應(yīng)器的結(jié)合使用帶有內(nèi)部組織消化室322的圖19的組織消化生物反應(yīng)器，帶有增殖室300的圖20的增殖生物反應(yīng)器，以及帶有分化室306的圖21的分化生物反應(yīng)器。這些生物反應(yīng)器可操作連接于組織工程模塊上，從而為涉及組織消化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和組織形成工序的自動(dòng)化步驟提供準(zhǔn)備。
本領(lǐng)域人員可以理解，自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)可包含一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器通過(guò)結(jié)構(gòu)支持物或通過(guò)同等手段支托于外殼上。當(dāng)含有兩個(gè)或更多個(gè)生物反應(yīng)器時(shí)，生物反應(yīng)器可進(jìn)行有效連接，或作為替代地，可獨(dú)自操作和/或可進(jìn)行協(xié)作操作。而且，每一生物反應(yīng)器可含有不同的內(nèi)部室或相同類型的室。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，室和/或生物反應(yīng)器可操作連接，從而為室和/或生物反應(yīng)器之間的流體、細(xì)胞和/或組織的交換提供準(zhǔn)備。
本發(fā)明的自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)很容易制備備用。以下工序是用于軟骨植入物制備的典型實(shí)施例，所述實(shí)施例基于本發(fā)明組織工程系統(tǒng)的使用，用于關(guān)節(jié)軟骨病灶缺陷的修復(fù)。該應(yīng)用需要組織消化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化/組織形成階段。該組織工程過(guò)程的三個(gè)階段可通過(guò)帶有多室的單個(gè)生物反應(yīng)器完成，或通過(guò)三個(gè)單獨(dú)和不連續(xù)的生物反應(yīng)器完成，如圖17，18和22所示。
開始組織工程工序之前，經(jīng)由貯罐注射口212，在組織工程模塊中將如下試劑組合物載入貯罐208a至208e內(nèi)。試劑A用于消化源自小塊人體關(guān)節(jié)軟骨活檢組織的軟骨細(xì)胞。試劑B，D和E用于細(xì)胞增殖。試劑C用于分化和組織結(jié)構(gòu)形成。
·試劑A-消化培養(yǎng)基DMEM/F-12，5％FCS或自身血清，1μg/mL胰島素，50μg/mL維生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes緩沖液，0.1％(1mg/ml)鏈霉蛋白酶和0.025％(0.25mg/ml)膠原酶，pH7.4·試劑 B-增殖培養(yǎng)基DMEM/F-12，10％FCS或自身血清，10μg/mL維生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes緩沖液，pH7.4·試劑 C-分化培養(yǎng)基DMEM/F-12，10％FCS或自身血清，1μg/mL胰島素，50μg/mL維生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes緩沖液，pH7.4·試劑 D-PBS洗滌溶液137mM NaCl，3.7mM KCl，8mMNa2HPO4*2H2O，1.5mM KH2PO4的水，pH7.4·試劑E-細(xì)胞釋放溶液1×胰蛋白酶溶液當(dāng)4℃下將上述試劑貯存于系統(tǒng)外殼內(nèi)的組織工程模塊上長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)星期的時(shí)間，名義上講是穩(wěn)定的。酶可凍干儲(chǔ)存于組織工程模塊內(nèi)，使用時(shí)進(jìn)行水合。這就使得可對(duì)酶進(jìn)行定制，以適用于特定的組織工程應(yīng)用。
通過(guò)關(guān)節(jié)鏡檢查手術(shù)，從內(nèi)側(cè)股骨髁上部的非承重區(qū)域得到人軟骨活檢組織(100-500mg)。將活檢組織載入消化室前，對(duì)活檢組織稱重并記錄質(zhì)量，隨后數(shù)據(jù)輸入用于基本單元的編程工序。確定質(zhì)量后，將活檢組織置于消化室內(nèi)，關(guān)閉生物反應(yīng)器，準(zhǔn)備將組織工程模塊插入組織工程系統(tǒng)的基本單元。一旦安裝好組織工程模塊，即經(jīng)由用戶界面，根據(jù)活檢組織尺寸和所需的組織工程工序?qū)締卧腃PU進(jìn)行編程。
程序性自動(dòng)化工序開始后，通過(guò)所需流動(dòng)閥的開啟和流體傳送泵的操作，將試劑A注入生物反應(yīng)器的消化室，從而開始活檢組織的鏈霉蛋白酶/膠原酶消化作用。在試劑A的持續(xù)或間歇再循環(huán)作用以保持細(xì)胞處于懸浮及使試劑最大化暴露于活檢組織的條件下，消化作用在37℃下進(jìn)行16小時(shí)以上。然后可用試劑D進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的洗滌步驟。在該消化工序末尾，每100mg活檢組織得到接近200,000-500,000個(gè)細(xì)胞。
此時(shí)，經(jīng)由取樣口可回收消化細(xì)胞的樣品，以用于評(píng)測(cè)細(xì)胞數(shù)量和成活力。該生物學(xué)評(píng)測(cè)典型地在系統(tǒng)外用臺(tái)盼藍(lán)染色后通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行評(píng)測(cè)。
在基本單元的自動(dòng)化控制之下，分離細(xì)胞被運(yùn)送至生物反應(yīng)器的增殖室內(nèi)存在的增殖基片或支架上，以建立2000細(xì)胞/cm2到15000細(xì)胞/cm2之間的細(xì)胞接種密度。為了實(shí)現(xiàn)繼續(xù)增殖至匯合，根據(jù)預(yù)編程的流動(dòng)圖供給試劑B，所述試劑B來(lái)自組織工程模塊上的貯罐。對(duì)培養(yǎng)基的溫度和pH各自進(jìn)行監(jiān)視，以檢測(cè)其對(duì)37℃和pH7.4的偏離。另外，通過(guò)檢測(cè)作為時(shí)間函數(shù)的代謝周轉(zhuǎn)率(例如pH，O2，CO2，乳酸和葡萄糖消耗)，間接地評(píng)測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)。通過(guò)連接至增殖探頭的CCD攝像儀的光學(xué)監(jiān)視，可進(jìn)一步地驗(yàn)證匯合水平，所述增殖探頭嵌入增殖室內(nèi)。一旦由經(jīng)驗(yàn)或通過(guò)基于傳感器的監(jiān)視確定匯合即將發(fā)生，即用試劑D通過(guò)兩個(gè)連續(xù)洗滌步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行廣泛洗滌，以去除所有培養(yǎng)基。
將來(lái)自組織工程模塊內(nèi)的貯罐的試劑E傳遞至增殖室內(nèi)，開始繁殖細(xì)胞從增殖基片或支架的分離。該胰蛋白酶溶液在生物反應(yīng)器內(nèi)存在5分鐘，于是通過(guò)試劑B的自動(dòng)加入終止反應(yīng)，所述試劑B含有抑制酶活性的FCS或自身血清。通過(guò)經(jīng)由沖擊驅(qū)動(dòng)器給生物反應(yīng)器施加低頻率沖擊，或者通過(guò)胰蛋白酶溶液的再循環(huán)，可進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞從增殖基片或支架的釋放。細(xì)胞一旦釋放，即進(jìn)行細(xì)胞洗滌和過(guò)濾步驟，從而去除胰蛋白酶并濃縮細(xì)胞懸浮液，以用于隨后傳遞至分化/組織生成生物反應(yīng)器內(nèi)存在的支架上。
雙極構(gòu)造對(duì)于該應(yīng)用是理想的，因?yàn)檫@為關(guān)節(jié)表面的軟骨層提供了準(zhǔn)備，所述軟骨層連接至由諸如SkeliteTM的骨生物材料構(gòu)成的多孔支架層，用于與軟骨下骨頭整合。雙極結(jié)構(gòu)可通過(guò)幾個(gè)備選操作之一而制備得到。形成的分化支架可帶有孔密度梯度，優(yōu)先在一端捕獲細(xì)胞，產(chǎn)生高細(xì)胞濃度區(qū)域，從而促進(jìn)軟骨層的形成。交替地，支架可先在一端包被纖維蛋白凝膠，以消除該區(qū)域的細(xì)胞附著和軟骨基質(zhì)形成。對(duì)任一種方法，通過(guò)任選采用環(huán)繞膜或篩孔可使細(xì)胞從支架的流失減至最小。細(xì)胞運(yùn)送的流動(dòng)速率較低，以保證流體剪切不會(huì)損傷增殖的細(xì)胞群體。細(xì)胞接種步驟完成后，停止流體流穿分化/組織形成室，使能形成細(xì)胞聚集體，因?yàn)橐阎@對(duì)成功分化是至關(guān)重要的。該重要步驟之后，在組織形成和成熟所必需的整個(gè)階段灌注試劑C，以最優(yōu)化地供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物并去除廢棄產(chǎn)物。該培養(yǎng)階段后，細(xì)胞將產(chǎn)生胞外基質(zhì)，所述胞外基質(zhì)與天然人體關(guān)節(jié)軟骨基本相同。所生成組織的屬性可通過(guò)獨(dú)立的外部生化方法進(jìn)行確認(rèn)，所述生化方法例如經(jīng)由SDS-PAGE和基因表達(dá)進(jìn)行的膠原分類。作為該過(guò)程的最后步驟，組織工程系統(tǒng)通過(guò)用戶界面告知工序完成，可去除組織工程模塊以收獲植入物。可將組織工程模塊或可分離形式的生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)運(yùn)至手術(shù)室，從而在無(wú)菌環(huán)境下移除生物反應(yīng)器蓋，并回收植入物用于手術(shù)使用。
需要指出的是，本發(fā)明系統(tǒng)并不限于特定類型的細(xì)胞或組織。例如，可制備骨骼植入物，用于骨頭缺陷的重建。在該應(yīng)用中，骨髓可用作為組織工程過(guò)程所需的原代和/或前體細(xì)胞的來(lái)源。相應(yīng)地，無(wú)需進(jìn)行組織消化；因此，生物反應(yīng)器類型只需支持增殖和分化。根據(jù)可利用的細(xì)胞群體和植入物的所需尺寸，甚至連增殖都可以不需要。這種情況下，生物反應(yīng)器的配置只涉及單個(gè)細(xì)胞分化階段和進(jìn)行中的組織形成。最終組織結(jié)構(gòu)包含可植入支架，所述可植入支架可由諸如SkeliteTM的骨生物材料構(gòu)成，同時(shí)活性骨細(xì)胞填襯支架的開孔以及有效敷設(shè)新礦化基質(zhì)(骨樣)，這種植入物可在植入位點(diǎn)很快整合，由此加快了恢復(fù)過(guò)程。
作為本系統(tǒng)適應(yīng)性的進(jìn)一步實(shí)施例，采用培養(yǎng)擴(kuò)增的內(nèi)皮細(xì)胞可制備組織工程血管，所述培養(yǎng)擴(kuò)增的內(nèi)皮細(xì)胞于最終分化階段接種至管狀幾何形狀的撓性支架上。
相比較于現(xiàn)有技術(shù)的方法和系統(tǒng)，本發(fā)明的集成組織工程系統(tǒng)具有一些有點(diǎn)。特別地，該設(shè)備的交鑰匙操作(turnkey operation)使臨床中在自動(dòng)化控制下可進(jìn)行復(fù)雜的組織工程操作，由此消除了將細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至一體式設(shè)施用于生物學(xué)加工的必要。本系統(tǒng)使用簡(jiǎn)便，避免了現(xiàn)有的耗時(shí)和昂貴的人體組織培養(yǎng)操作，所述人體組織培養(yǎng)操作常導(dǎo)致植入物污染和失敗。組織工程模塊和相關(guān)的子系統(tǒng)成套裝置可按待培養(yǎng)的細(xì)胞或組織類型進(jìn)行定制，并可用任何合適的生物相容和滅菌耐受性材料進(jìn)行制造。整個(gè)組織工程模塊或其特定組件均可替換，并且認(rèn)為是可以置換的。組織工程模塊可以單獨(dú)用途的無(wú)菌封裝進(jìn)行提供，由此簡(jiǎn)化了臨床設(shè)置中的系統(tǒng)安裝和操作。
本領(lǐng)域人員可以理解，本發(fā)明的組織工程模塊和設(shè)備可按各種尺寸、形狀和取向進(jìn)行制造。設(shè)備可制造成以垂直或水平格式整合入單個(gè)組織工程模塊或多個(gè)模塊。相應(yīng)地，可按與用于組織工程設(shè)備的所選立體格式相對(duì)應(yīng)的方式制造子部件。由此，可在單個(gè)設(shè)備內(nèi)同時(shí)實(shí)施不同類型的組織工程，每一組織工程工序可在單獨(dú)進(jìn)行自動(dòng)化監(jiān)視和控制。在遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)控制之下，使多個(gè)自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)運(yùn)行以及網(wǎng)絡(luò)化也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
雖然此處詳細(xì)描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行變換，而并不背離本發(fā)明主旨或所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，含有-外殼；-至少一個(gè)為所述外殼支托的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)了生理細(xì)胞功能和/或源自細(xì)胞和/或組織的一種或多種組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；-為所述外殼支托的流體安全系統(tǒng)，并與所述生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連通；-一個(gè)或多個(gè)與一個(gè)或多個(gè)所述外殼、生物反應(yīng)器或流體安全系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的傳感器，用于監(jiān)視涉及所述生理細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的參數(shù)；以及-與一個(gè)或多個(gè)所述傳感器連接的微處理器。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器含有-生物反應(yīng)器外殼；-用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口和一個(gè)或多個(gè)出料口；以及-至少一個(gè)限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的室，用于接收各種細(xì)胞和/或組織。
3.權(quán)利要求2的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器外殼含有蓋子，所述一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口和出料口裝配于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)和/或所述蓋子內(nèi)。
4.權(quán)利要求1、2或3的系統(tǒng)，其中所述室選自組織消化室，培養(yǎng)/增殖室，分化/組織形成室及其組合。
5.權(quán)利要求2、3或4的系統(tǒng)，其中生物反應(yīng)器內(nèi)裝備的兩個(gè)或多個(gè)室可操作連接。
6.權(quán)利要求2、3、4或5的系統(tǒng)，其中所述室內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)基片和/或支架。
7.權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述支架選自多孔支架、帶有梯度孔隙率的多孔支架、多孔網(wǎng)狀支架、纖維支架、膜環(huán)繞支架及其組合。
8.權(quán)利要求7的系統(tǒng)，其中所述支架選自天然生物陶瓷、合成生物陶瓷、天然生物高分子、合成生物高分子、可植入生物陶瓷、可植入生物高分子及其混合物。
9.權(quán)利要求8的系統(tǒng)，其中所述材料是絕緣的生物可再吸收生物材料化合物，含有鈣、氧和磷，其中至少一種所述元素的一部分為離子半徑約0.1-0.6埃的元素所取代。
10.權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述基片是微載體的包容懸浮液。
11.權(quán)利要求2-10任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述室含有多個(gè)區(qū)域。
12.權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中所述多個(gè)室每一個(gè)均可容納支架和/或基片。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中兩個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器可操作連接。
14.權(quán)利要求5-13任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述兩個(gè)或多個(gè)室和/或生物反應(yīng)器可獨(dú)立操作和/或可協(xié)力操作。
15.權(quán)利要求5-14任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述室和/或生物反應(yīng)器可操作連接，從而為所述室和/或所述生物反應(yīng)器之間的流體、細(xì)胞和/或組織的交換提供準(zhǔn)備。
16.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述室和/或生物反應(yīng)器經(jīng)由通道、管道、連接器、閥、泵、過(guò)濾器、流體進(jìn)入孔、內(nèi)嵌的氣體交換膜、內(nèi)嵌的傳感器和/或分離壁內(nèi)空隙進(jìn)行連接。
17.權(quán)利要求2的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器進(jìn)一步含有與一個(gè)或多個(gè)所述室有效連接的取樣口。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器經(jīng)由所述進(jìn)料口和所述出料口可移除地容納有所述流體安全系統(tǒng)。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器和所述流體安全系統(tǒng)通過(guò)操作連接至固定于所述外殼的結(jié)構(gòu)支持物上。
20.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器和所述流體安全系統(tǒng)通過(guò)操作連接至可移除地容納于所述外殼內(nèi)的結(jié)構(gòu)支持物上。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述流體安全系統(tǒng)進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)控制閥，以及與所述生物反應(yīng)器和流體安全系統(tǒng)可操作連接的一個(gè)或多個(gè)泵單元。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)進(jìn)一步含有另外的微處理器和/或邏輯控制器，其中對(duì)所述微處理器和/或邏輯控制器進(jìn)行編程，以便利、監(jiān)視和控制所述至少一個(gè)生物反應(yīng)器中不同方面的組織工程。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器提供了用于所述生理細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的環(huán)境，所述功能所自組織活檢儲(chǔ)存、組織活檢消化、細(xì)胞分揀、細(xì)胞洗滌、細(xì)胞濃縮、細(xì)胞接種、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞儲(chǔ)存、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、組織形成、植入物形成、可植入組織的儲(chǔ)存，可植入組織的轉(zhuǎn)運(yùn)及其組合。
23.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞和組織選自骨、軟骨、相關(guān)的骨和軟骨前體細(xì)胞及其組合。
24.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞，成人干細(xì)胞，成骨細(xì)胞，前成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，前軟骨細(xì)胞，髓核細(xì)胞，骨骼細(xì)胞，源自骨、骨髓或血液包括干細(xì)胞在內(nèi)的骨骼祖細(xì)胞，及其組合。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是便攜的。
26.一種自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，含有-外殼；-可移除地容納于所述外殼內(nèi)的至少一個(gè)組織工程模塊，所述組織工程模塊含有支持結(jié)構(gòu)，所述支持結(jié)構(gòu)固定至少一個(gè)生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能，與所述生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連通的流體安全系統(tǒng)，以及一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視涉及所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的參數(shù)；以及-布置于所述外殼內(nèi)并與所述組織工程模塊連接的微處理器，所述微處理器控制所述組織工程模塊的操作。
27.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器含有-生物反應(yīng)器外殼，帶有用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口和一個(gè)或多個(gè)出料口；以及-限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的至少一個(gè)室，用于接收細(xì)胞和/或組織以及促進(jìn)所述細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能。
28.權(quán)利要求27的組織工程系統(tǒng)，其中所述室選自組織消化室，培養(yǎng)/增殖室，分化/組織形成室及其組合。
29.權(quán)利要求28的組織工程系統(tǒng)，其中所述室內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)基片和/或支架。
30.權(quán)利要求27、28或29的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器內(nèi)裝備的兩個(gè)或多個(gè)室可操作連接。
31.權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的組織工程系統(tǒng)，其中的兩個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器可操作連接。
32.權(quán)利要求30或31的組織工程系統(tǒng)，其中所述兩個(gè)或多個(gè)室和/或生物反應(yīng)器可獨(dú)立操作和/或可協(xié)力操作。
33.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器是可分離的。
34.權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)的組織工程系統(tǒng)，其中所述室和/或生物反應(yīng)器可操作連接，從而為所述室和/或生物反應(yīng)器之間的流體、細(xì)胞和/或組織的交換提供準(zhǔn)備。
35.權(quán)利要求29的組織工程系統(tǒng)，其中所述支架選自多孔支架，帶有梯度孔隙率的多孔支架、多孔網(wǎng)狀支架、纖維支架、膜環(huán)繞支架及其組合。
36.權(quán)利要求35的組織工程系統(tǒng)，其中所述室含有多個(gè)區(qū)域，以容納多個(gè)基片和/或支架。
37.權(quán)利要求26-36任一項(xiàng)的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器提供了用于所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的環(huán)境，所述功能所自組織活檢儲(chǔ)存、組織活檢消化、細(xì)胞分揀、細(xì)胞洗滌、細(xì)胞濃縮、細(xì)胞接種、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞儲(chǔ)存、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、組織形成、植入物形成、可植入組織的儲(chǔ)存、可植入組織的轉(zhuǎn)運(yùn)及其組合。
38.權(quán)利要求37的組織工程系統(tǒng)，其中所述組織工程模塊帶有與所述流體安全系統(tǒng)相連接的流動(dòng)控制閥，所述組織工程模塊通過(guò)操作可與裝配在所述外殼內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)閥傳動(dòng)裝置、泵單元和連接器接合。
39.權(quán)利要求38的組織工程系統(tǒng)，其中所述連接器提供了所述組織工程模塊和所述微處理器之間的電子連接，所述連接經(jīng)由裝備于所述外殼內(nèi)的電子底板而實(shí)現(xiàn)。
40.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述流體安全系統(tǒng)含有多個(gè)通過(guò)撓性管連接的撓性貯罐，用于向所述生物反應(yīng)器和自所述生物反應(yīng)器供給和回收流體。
41.權(quán)利要求26-40任一項(xiàng)的組織工程系統(tǒng)，其中所述外殼含有一個(gè)或多個(gè)環(huán)境傳感器以及環(huán)境控制單元，用以維持一個(gè)或多個(gè)所述外殼、組織工程模塊、生物反應(yīng)器、流體安全系統(tǒng)和/或撓性貯罐內(nèi)的所述環(huán)境條件。
42.權(quán)利要求41的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器內(nèi)的所述環(huán)境條件的維持獨(dú)立于所述流體安全系統(tǒng)。
43.權(quán)利要求41的組織工程系統(tǒng)，其中在所述流體安全系統(tǒng)內(nèi)，一個(gè)或多個(gè)撓性貯罐內(nèi)的所述環(huán)境條件的維持是獨(dú)立的。
44.權(quán)利要求42的組織工程系統(tǒng)，其中進(jìn)入所述生物反應(yīng)器的流體的溫度基本上相當(dāng)于生物反應(yīng)器內(nèi)的流體溫度。
45.權(quán)利要求42的組織工程系統(tǒng)，其中所述生物反應(yīng)器內(nèi)的所述環(huán)境條件維持在適合細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的溫度下，并且所述流體安全系統(tǒng)或選定的撓性貯罐內(nèi)的所述環(huán)境條件維持在低于適合所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的溫度下。
46.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述外殼帶有至少一個(gè)用于所述組織工程模塊插入的插槽，所述插入經(jīng)由至少一組用于接收所述支持結(jié)構(gòu)的導(dǎo)向裝置而完成。
47.權(quán)利要求46的組織工程系統(tǒng)，其中所述插槽和所述導(dǎo)向裝置垂直或水平朝向于所述外殼。
48.權(quán)利要求46或47的組織工程系統(tǒng)，其中所述插槽帶有可移動(dòng)門和鎖定機(jī)構(gòu)。
49.權(quán)利要求26-48任一項(xiàng)的組織工程系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)另外含有與所述微處理器操作的用戶界面，所述用戶界面為用戶登陸，對(duì)所述微處理器的輸入和/或系統(tǒng)狀態(tài)的輸出提供準(zhǔn)備。
50.權(quán)利要求49的組織工程系統(tǒng)，其中所述用戶界面選自顯示器、觸摸屏、小鍵盤、計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)介質(zhì)設(shè)備及其組合。
51.權(quán)利要求49或50的組織工程系統(tǒng)，進(jìn)一步含有數(shù)據(jù)系統(tǒng)，以進(jìn)行信息的輸入、輸出、記錄、傳遞和儲(chǔ)存。
52.權(quán)利要求51的組織工程系統(tǒng)，進(jìn)一步含有計(jì)算機(jī)和通信鏈接。
53.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述微處理器控制所述外殼內(nèi)的多組織工程模塊的獨(dú)立操作。
54.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述微處理器執(zhí)行所述細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)。
55.權(quán)利要求54的組織工程系統(tǒng)，其中所述質(zhì)量控制評(píng)價(jià)經(jīng)由用戶界面以質(zhì)量控制記錄的方式呈現(xiàn)。
56.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述微處理器構(gòu)成所述組織工程模塊的一部分。
57.權(quán)利要求26的組織工程系統(tǒng)，其中所述組織工程模塊另外包含一個(gè)或多個(gè)與安置于所述外殼內(nèi)的所述微處理器可操作連接的微處理器。
58.一種便攜且可滅菌的組織工程模塊，所述模塊含有-固定至少一個(gè)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)支持物，所述生物反應(yīng)器促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能；-與所述生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連通的流體安全系統(tǒng)；以及-一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視涉及所述細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能的參數(shù)。
59.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器含有-生物反應(yīng)器外殼，帶有用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口和一個(gè)或多個(gè)出料口；以及-限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的至少一個(gè)室，用于接受細(xì)胞和/或組織以及促進(jìn)所述細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程功能。
60.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述室選自組織消化室，培養(yǎng)/增殖室，分化/組織形成室及其組合。
61.權(quán)利要求59的組織工程模塊，其中所述室內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)基片和/或支架。
62.權(quán)利要求59的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器內(nèi)裝備的兩個(gè)或多個(gè)室可操作連接。
63.權(quán)利要求58-62任一項(xiàng)的組織工程模塊，其中的兩個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器可操作連接。
64.權(quán)利要求62或63的組織工程模塊，其中所述兩個(gè)或多個(gè)室和/或生物反應(yīng)器可獨(dú)立操作以及/或可協(xié)力操作。
65.權(quán)利要求63或64的組織工程模塊，其中所述模塊含有第一生物反應(yīng)器，第二生物反應(yīng)器和第三生物反應(yīng)器，所述第一生物反應(yīng)器含有組織消化室，所述第二生物反應(yīng)器含有培養(yǎng)/增殖室，所述第三生物反應(yīng)器含有分化/組織形成室，其中所述第一、第二和第三生物反應(yīng)器可有效連接。
66.權(quán)利要求62-65任一項(xiàng)的組織工程模塊，其中所述室和/或生物反應(yīng)器可操作連接，從而為所述室和/或生物反應(yīng)器之間的流體、細(xì)胞和/或組織的交換提供準(zhǔn)備。
67.權(quán)利要求61的組織工程模塊，其中所述支架選自多孔支架，帶有梯度孔隙率的多孔支架、多孔網(wǎng)狀支架、纖維支架、膜環(huán)繞支架及其組合。
68.權(quán)利要求59或61的組織工程模塊，其中所述室含有多個(gè)區(qū)域，以容納多個(gè)基片和/或支架。
69.權(quán)利要求58-68任一項(xiàng)的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器提供了用于所述細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程功能的環(huán)境，所述功能所自組織活檢儲(chǔ)存、組織活檢消化、細(xì)胞分揀、細(xì)胞洗滌、細(xì)胞濃縮、細(xì)胞接種、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞儲(chǔ)存、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、組織形成、植入物形成、可植入組織的儲(chǔ)存、可植入組織的轉(zhuǎn)運(yùn)及其組合。
70.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述流體安全系統(tǒng)含有多個(gè)通過(guò)撓性管連接的撓性貯罐，用于向所述生物反應(yīng)器和自所述生物反應(yīng)器供給和回收流體。
71.權(quán)利要求70的組織工程模塊，其中所述撓性貯罐包含各種構(gòu)造和尺寸。
72.權(quán)利要求70的組織工程模塊，其中所述撓性貯罐和/或管道裝備有流體進(jìn)入孔，用于來(lái)自所述流體安全系統(tǒng)的材料的載入或去除。
73.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中裝備的多個(gè)流體流動(dòng)控制閥與流體安全系統(tǒng)可操作連接，從而控制與所述流體安全系統(tǒng)和所述生物反應(yīng)器的流體流動(dòng)。
74.權(quán)利要求73的組織工程模塊，其中所述流體流動(dòng)控制閥通過(guò)閥驅(qū)動(dòng)裝置開啟和關(guān)閉。
75.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述組織工程模塊通過(guò)操作可與裝備于自動(dòng)化組織工程設(shè)備外殼內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)閥傳動(dòng)裝置、泵單元和連接器接合。
76.權(quán)利要求75的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有一個(gè)或多個(gè)與所述流體安全系統(tǒng)連接的泵單元，用于泵送流體遍及流體安全系統(tǒng)。
77.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中流體流動(dòng)板安裝至所述結(jié)構(gòu)支持物或與其形成整體，所述流體流動(dòng)板通過(guò)操作連接至所述流體控制閥，以指引所述流體安全系統(tǒng)和所述生物反應(yīng)器之內(nèi)及其之間的流體流動(dòng)。
78.權(quán)利要求58-77任一項(xiàng)的組織工程模塊，其中所述組織工程模塊另外含有加熱混合室，以加熱并混合流動(dòng)至所述生物反應(yīng)器的流體。
79.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述流體安全系統(tǒng)和/或生物反應(yīng)器之內(nèi)或其之間裝備有一個(gè)或多個(gè)氣體交換膜，所述氣體交換膜使氣體產(chǎn)物能傳遞入或傳遞出流動(dòng)至或停留于所述生物反應(yīng)器內(nèi)的流體。
80.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有與所述生物反應(yīng)器可操作連接的熱電元件。
81.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有一個(gè)或多個(gè)與所述傳感器可操作連接的微處理器。
82.權(quán)利要求80或81的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有印刷電路板，用于為一個(gè)或多個(gè)所述傳感器、微處理器或熱電元件提供電子接口。
83.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有一個(gè)或多個(gè)進(jìn)入孔，所述進(jìn)入孔與所述生物反應(yīng)器和/或流體安全系統(tǒng)有效連接，所述進(jìn)入孔為細(xì)胞、流體、細(xì)胞和組織培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子、藥劑、質(zhì)量控制試劑、質(zhì)量控制樣品和其他材料的無(wú)菌裝載或去除提供準(zhǔn)備。
84.權(quán)利要求83的組織工程模塊，其中所述進(jìn)入孔有效連接至與所述結(jié)構(gòu)支持物集成的注射器歧管。
85.權(quán)利要求84的組織工程模塊，其中所述注射器歧管含有至少一個(gè)連接至注射器的無(wú)菌進(jìn)入孔。
86.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器可旋轉(zhuǎn)地安裝至所述結(jié)構(gòu)支持物。
87.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器整體性地安裝至所述結(jié)構(gòu)支持物。
88.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述生物反應(yīng)器可從所述結(jié)構(gòu)支持物分離。
89.權(quán)利要求58-88任一項(xiàng)的組織工程模塊，其中裝備有攝像儀，用于所述生物反應(yīng)器內(nèi)的目測(cè)。
90.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊另外含有選自條形碼、磁條、ID標(biāo)簽、電子內(nèi)存及其組合的識(shí)別元件。
91.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊使用前可滅菌，使用后可置換。
92.權(quán)利要求58的組織工程模塊，其中所述模塊適合在各種溫度下儲(chǔ)存和/或轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞和組織。
93.權(quán)利要求91的組織工程模塊，其中所述模塊裝備于無(wú)菌封裝內(nèi)。
94.一種促進(jìn)和支持細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器含有-生物反應(yīng)器外殼；-用于培養(yǎng)基流動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)料口及一個(gè)或多個(gè)出料口；-限定于所述生物反應(yīng)器外殼內(nèi)的至少一個(gè)室，用于促進(jìn)和支持細(xì)胞功能和/或一種或多種源自細(xì)胞和/或組織的組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；以及-一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于監(jiān)視涉及所述至少一個(gè)室內(nèi)的所述細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的參數(shù)。
95.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器外殼含有蓋，所述蓋選自可分離蓋和與所述生物反應(yīng)器外殼一體化的蓋。
96.權(quán)利要求94或95的生物反應(yīng)器，其中所述室選自組織消化室，培養(yǎng)/增殖室，分化/組織形成室及其組合。
97.權(quán)利要求97的生物反應(yīng)器，其中所述室支托有一個(gè)或多個(gè)基片和/或支架。
98.權(quán)利要求96或97的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器含有單個(gè)培養(yǎng)/增殖室，室內(nèi)支托有培養(yǎng)/增殖支架和/或基片。
99.權(quán)利要求96或97的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器含有連接至下游分化/組織形成室的培養(yǎng)/增殖室，所述培養(yǎng)/增殖室內(nèi)支托有增殖支架和/或基片，所述分化/組織形成室內(nèi)支托有可植入分化支架。
100.權(quán)利要求96或97的生物反應(yīng)器，其中所述連接通道裝備于所述培養(yǎng)/增殖室和所述分化/組織形成室之間，所述連接通道促進(jìn)了從所述增殖支架和/或基片釋放的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)至所述分化支架。
101.權(quán)利要求100的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器進(jìn)一步含有用于消化組織活檢材料的消化室，所述消化室位于所述培養(yǎng)/增殖室的上游。
102.權(quán)利要求99、100或101的生物反應(yīng)器，其中在某個(gè)位置裝備有一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器，所述位置選自所述增殖支架上游，所述分化支架上游，所述出料口上游，及其組合。
103.權(quán)利要求97-102任一項(xiàng)的生物反應(yīng)器，其中所述支架選自多孔支架，帶有梯度孔隙率的多孔支架、多孔網(wǎng)狀支架、纖維支架、膜環(huán)繞支架及其組合。
104.權(quán)利要求103的生物反應(yīng)器，其中所述支架的材料選自天然生物陶瓷、合成生物陶瓷、天然生物高分子、合成生物高分子、可植入生物陶瓷、可植入生物高分子及其混合物。
105.權(quán)利要求97的生物反應(yīng)器，其中所述增殖基片是微載體的包容懸浮液。
106.權(quán)利要求100的生物反應(yīng)器，其中所述分化/組織形成室含有多個(gè)區(qū)域，以容納多個(gè)分化支架和/或基片。
107.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器帶有取樣口，所述取樣口與一個(gè)或多個(gè)所述室有效連接。
108.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中的氣體交換膜構(gòu)成所述室的一部分。
109.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器經(jīng)由所述進(jìn)料口和所述出料口可移除地容納有流體安全系統(tǒng)。
110.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中的混合隔板構(gòu)成所述室的一部分，并可操作連接至混合傳動(dòng)裝置和/或混合驅(qū)動(dòng)器。
111.權(quán)利要求110的生物反應(yīng)器，其中所述混合隔板合并入所述生物反應(yīng)器內(nèi)。
112.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器與沖擊傳動(dòng)裝置和/或沖擊驅(qū)動(dòng)器有效連接。
113.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述室進(jìn)一步支持對(duì)駐留細(xì)胞和/或組織的生理刺激。
114.權(quán)利要求113的生物反應(yīng)器，其中所述刺激通過(guò)微載隔板而進(jìn)行，所述微載隔板與微載傳動(dòng)裝置和/或微載驅(qū)動(dòng)器可操作連接。
115.權(quán)利要求114的生物反應(yīng)器，其中所述微載隔板合并入所述生物反應(yīng)器內(nèi)。
116.權(quán)利要求113的生物反應(yīng)器，其中所述刺激通過(guò)提供電場(chǎng)而進(jìn)行。
117.權(quán)利要求94-116任一項(xiàng)的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器通過(guò)操作容納于組織工程模塊內(nèi)，所述組織工程模塊含有附接于結(jié)構(gòu)支持物并與所述生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連通的流體安全系統(tǒng)，其中所述流體安全系統(tǒng)含有多個(gè)通過(guò)撓性管連接的撓性貯罐，用于向所述生物反應(yīng)器和自所述生物反應(yīng)器供給和回收流體。
118.權(quán)利要求117的生物反應(yīng)器，其中所述組織工程模塊容納于自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)的外殼內(nèi)，所述系統(tǒng)含有用于對(duì)所述模塊進(jìn)行操作的微處理器，所述微處理器控制所述模塊的功能。
119.權(quán)利要求94-118任一項(xiàng)的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器另外含有光學(xué)探頭。
120.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器可用以在無(wú)菌條件下儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞、組織和/或植入物。
121.權(quán)利要求94-120任一項(xiàng)的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器提供了一種或多種選自如下功能的環(huán)境組織活檢儲(chǔ)存、組織活檢消化、細(xì)胞分揀、細(xì)胞洗滌、細(xì)胞濃縮、細(xì)胞接種、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞儲(chǔ)存、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、組織形成、植入物形成、可植入組織的儲(chǔ)存和可植入組織的轉(zhuǎn)運(yùn)。
122.權(quán)利要求121的生物反應(yīng)器，其中所述細(xì)胞和組織選自骨、軟骨、相關(guān)的骨和軟骨前體細(xì)胞及其組合。
123.權(quán)利要求121的生物反應(yīng)器，其中所述細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞，成人干細(xì)胞，成骨細(xì)胞，前成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，髓核細(xì)胞，骨骼細(xì)胞，前軟骨細(xì)胞，源自骨、骨髓或血液包括干細(xì)胞在內(nèi)的骨骼祖細(xì)胞，及其組合。
124.權(quán)利要求122或123的生物反應(yīng)器，其中所述細(xì)胞或所述組織相對(duì)于植入物的受者屬于自身、同種異體或異種來(lái)源。
125.權(quán)利要求94的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器使用前可消毒，使用后可置換。
126.權(quán)利要求125的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器裝配于無(wú)菌封裝內(nèi)。
127.一種用于組織活檢的自動(dòng)化消化的方法，所述方法包含-將組織活檢載入與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；-將組織消化酶供給在所述生物反應(yīng)器內(nèi)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的消化條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到所期望的組織消化水平。
128.一種用于細(xì)胞自動(dòng)化增殖的方法，所述方法包含-將細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的增殖基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流體系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到所期望的細(xì)胞增殖水平。
129.一種用于細(xì)胞自動(dòng)化分化的方法，所述方法包含-將細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的分化基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流體系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段，以達(dá)到所期望的細(xì)胞分化水平。
130.一種用于生產(chǎn)組織結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包含-將細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流體系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠的時(shí)間段以使所述細(xì)胞表達(dá)胞外基質(zhì)，所述胞外基質(zhì)為組織結(jié)構(gòu)提供結(jié)構(gòu)支持。
131.一種自動(dòng)化方法，用于消化組織活檢以提供包括前體細(xì)胞在內(nèi)的原代細(xì)胞，以及進(jìn)一步增殖和分化細(xì)胞使組織植入物能形成，所述方法包含-將組織活檢載入與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接的生物反應(yīng)器內(nèi)，所述生物反應(yīng)器帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；-供給組織消化酶；-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適消化條件，持續(xù)足夠時(shí)間段以獲得分離細(xì)胞；-將分離細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的增殖基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠時(shí)間段以獲得所期望的細(xì)胞增殖和擴(kuò)增水平；-將擴(kuò)增細(xì)胞從增殖基片或支架上釋放；-將擴(kuò)增細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的分化基片或支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用以檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適培養(yǎng)條件，持續(xù)足夠時(shí)間段以獲得組織植入物。
132.一種提供骨骼植入物的方法，所述方法包含-將成骨細(xì)胞和/或骨祖細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的骨生物材料的多孔支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠時(shí)間段，使成骨細(xì)胞和/或骨祖細(xì)胞增殖和/分化于整個(gè)支架，以提供用于整形應(yīng)用的組織植入物。
133.一種提供軟骨植入物的方法，所述方法包含-將軟骨生成細(xì)胞和/或軟骨祖細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的生物材料的多孔支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件，以便通過(guò)微處理器進(jìn)行評(píng)測(cè)；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠時(shí)間段，使軟骨生成細(xì)胞和/或軟骨祖細(xì)胞增殖和/分化于整個(gè)支架，以提供軟骨植入物。
134.一種提供用于脊椎盤內(nèi)核重建的植入物的方法，所述方法包含-將髓核細(xì)胞接種至支托于生物反應(yīng)器內(nèi)的生物材料的支架或多孔支架上，所述生物反應(yīng)器與培養(yǎng)基貯罐和流動(dòng)系統(tǒng)連接，帶有一個(gè)或多個(gè)傳感器，用于檢測(cè)所述生物反應(yīng)器內(nèi)的生理學(xué)條件并傳至微處理器；以及-監(jiān)視并維持所述生物反應(yīng)器內(nèi)的合適條件，持續(xù)足夠時(shí)間段，以使髓核細(xì)胞增殖和/分化并表達(dá)具有髓核特性的胞外基質(zhì)組分。
135.一種用于臨床組織工程中的質(zhì)量評(píng)價(jià)樣品的制備方法，所述方法包含-采用權(quán)利要求1或26的系統(tǒng)并行制備初級(jí)和次級(jí)植入物，其中初級(jí)植入物用于植入，而一個(gè)或多個(gè)次級(jí)植入物用于試驗(yàn)?zāi)康模酝茢喑跫?jí)植入物的口徑。
136.一種洗滌細(xì)胞的方法，所述方法包含-將含有一種或多種不期望的化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞懸浮液載入室內(nèi)；-通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾模塊將來(lái)自室的細(xì)胞懸浮液連續(xù)再循環(huán)，所述錯(cuò)流過(guò)濾模塊含有所述細(xì)胞不能透過(guò)而所述不期望的化學(xué)物可以透過(guò)的膜，從而提供洗滌后的細(xì)胞懸浮液；以及-收集洗滌后的細(xì)胞懸浮液。
137.一種富集細(xì)胞的方法，所述方法包含-將含有過(guò)量的細(xì)胞懸浮液體積的細(xì)胞懸浮液載入室內(nèi)；-通過(guò)錯(cuò)流過(guò)濾模塊將來(lái)自室的細(xì)胞懸浮液連續(xù)再循環(huán)，所述錯(cuò)流過(guò)濾模塊含有細(xì)胞不能透過(guò)但允許過(guò)量的細(xì)胞懸浮液體積被去除和收集的膜。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于組織工程產(chǎn)品的自動(dòng)化培養(yǎng)、增殖、分化、生產(chǎn)和養(yǎng)護(hù)的系統(tǒng)、模塊、生物反應(yīng)器和方法。其一方面是自動(dòng)化組織工程系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有外殼，至少一個(gè)為外殼所支托的生物反應(yīng)器，生物反應(yīng)器促進(jìn)了生理細(xì)胞功能和/或源自細(xì)胞和/或組織的一種或多種組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。流體安全系統(tǒng)為外殼所支托，并與生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連通。一個(gè)或多個(gè)傳感器與一個(gè)或多個(gè)外殼、生物反應(yīng)器或流體安全系統(tǒng)相關(guān)，用于監(jiān)視涉及生理細(xì)胞功能和/或組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的參數(shù)；以及與一個(gè)或多個(gè)傳感器連接的微處理器。本發(fā)明系統(tǒng)、方法和產(chǎn)品在各種臨床和實(shí)驗(yàn)室裝置中具有用途。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1688686SQ03813267
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者蒂莫西·J.N.·史密斯, 悉尼·M·皮尤, 馬丁·R·佩查里奇, 魯珀特·哈格, 羅伯托·塔馬西尼, 伊夫·拉爾謝, D·洛厄爾·米謝內(nèi)爾 申請(qǐng)人:米列姆·貝爾羅吉克公司