專(zhuān)利名稱(chēng)：生物復(fù)合人工骨及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物復(fù)合人工骨及其制備工藝。具體而言，本發(fā)明涉及采用乳液共混法，使用OPG蛋白、聚乳酸和羥基磷灰石制備生物復(fù)合人工骨。
背景技術(shù)：
眾所周知，骨缺損、骨創(chuàng)傷是臨床上十分普遍的病癥，如何修復(fù)骨缺損、促進(jìn)骨缺損快速愈合是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。目前常用的修復(fù)材料有自體骨、異體骨、人工合成替代物，這些材料均在不同程度上存在一定的不足。例如自體骨移植，雖然它無(wú)免疫排斥反應(yīng)，移植骨中的細(xì)胞和生物活性分子能在受體部位繼續(xù)存活，并發(fā)揮相應(yīng)的功能，促進(jìn)骨缺損的愈合，這是其他材料無(wú)法比擬的，但是，這種材料取材有限，其尺寸和形狀常常受到限制，且供骨區(qū)易出現(xiàn)感染及疼痛等并發(fā)癥，增加病人痛苦；同種異體骨能提供大量不同形狀尺寸的皮質(zhì)骨或松質(zhì)骨，但它容易引起免疫排斥反應(yīng)，在骨缺損邊緣與宿主骨的連接速度較慢，并有傳染病毒性疾病的危險(xiǎn)，而且取樣、處理、存貯的成本高，其應(yīng)用受到很大限制；人工合成替代物，如聚甲丙烯酸甲酯、聚醚迷酮、聚楓、硫化硅橡膠等，這些都是非降解材料，它們雖然來(lái)源豐富，可填充不同尺寸和形狀的骨缺損，并提供重建區(qū)域的力學(xué)強(qiáng)度，但由于材料不可降解，缺損區(qū)不能通過(guò)骨重建來(lái)再生骨，日常生活給填充部位產(chǎn)生的應(yīng)力最終導(dǎo)致修復(fù)失敗，另外，由于這些材料所在的區(qū)域沒(méi)有血管供血，缺乏抗感染能力，所以比自然骨區(qū)域易感染。
目前，國(guó)內(nèi)外研究的主要方向是將某些具有促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的物質(zhì)與具有傳導(dǎo)成骨能力的載體復(fù)合，制成重組合人工骨，以達(dá)到更好地修復(fù)骨缺損的目的。
羥基磷灰石(或磷酸鈣)在體內(nèi)不但不被吸收，還能防止骨吸收，且具有誘導(dǎo)新骨形成能力，與骨牢固結(jié)合，受力時(shí)無(wú)滑動(dòng)及摩擦。有良好的組織相容性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒、無(wú)刺激性，不引起排異反應(yīng)，不老化，不致敏致癌，易于塑形。
OPG蛋白能抑制破骨細(xì)胞的生成、活化，還能引發(fā)破骨細(xì)胞凋亡，能夠誘導(dǎo)血管周?chē)捶只拈g充質(zhì)細(xì)胞向骨和軟骨轉(zhuǎn)化。單獨(dú)OPG蛋白易隨體液流失，無(wú)法充分發(fā)揮其有效作用，故需載體復(fù)合發(fā)揮其作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物復(fù)合人工骨，它由以180～250∶100～160∶0.6～1的重量份配比的聚乳酸羥基磷灰石或磷酸鈣OPG蛋白組成。
本發(fā)明的OPG蛋白可以通過(guò)市售獲得，或者通過(guò)基因工程重組的方法利用細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)獲得。
在本發(fā)明中，所用術(shù)語(yǔ)“OPG蛋白”的含義包括OPG全長(zhǎng)蛋白、其變體或片段，或者是OPG全長(zhǎng)蛋白、其變體或片段與免疫球蛋白Fc段融合產(chǎn)生的OPG融合蛋白。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述OPG蛋白、其變體、片段選自以下(a)SEQ ID NO1所示的OPG蛋白序列；(b)氨基酸序列22-X，其中X為SEQ ID NO1所示的包括位置185-401的任何殘基，尤其是第22-201位氨基酸序列；或(c)在(b)所述的氨基酸序列前加上Met。
在本發(fā)明中，與OPG蛋白、其變體或片段融合的免疫球蛋白Fc段選自(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(A)亞部分(A)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有取代或確失的不同氨基酸，所述位置采用SEQ ID NO2的編號(hào)i.一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；ii.一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴(lài)氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴(lài)氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；x.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除補(bǔ)體(Clq)結(jié)合位點(diǎn)；或xi.亞部分i-x的組合。
在本發(fā)明的實(shí)施方案的重量份配比中，所述OPG融合蛋白的份數(shù)以O(shè)PG蛋白的份數(shù)表示。當(dāng)采用OPG蛋白的變體、片段或它們與Fc片段的融合蛋白時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)其氨基酸數(shù)目的變化來(lái)相應(yīng)地調(diào)整所用蛋白的重量配比。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施例中，宜使用OPG融合蛋白制備本發(fā)明的生物復(fù)合人工骨，因?yàn)樗鋈诤系鞍撞粌H保留了OPG蛋白的活性，而且由于與Fc融合，而使得OPG蛋白的活性半衰期更長(zhǎng)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，聚乳酸是D，L-型聚乳酸，聚乳酸羥基磷灰石或磷酸鈣OPG融合蛋白的重量份比為210∶100∶1。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，聚乳酸是D，L-型聚乳酸，聚乳酸羥基磷灰石或磷酸鈣OPG融合蛋白的重量份比為250∶160∶1。
本發(fā)明的生物復(fù)合人工骨具有以下特性1.具有極好的生物相容性；2.致辭密，不吸收無(wú)炎癥和排斥反應(yīng)；3.能引導(dǎo)新骨的生成，與骨組織形成直接的骨性接合；4.無(wú)毒、無(wú)刺激、有致畸、不致癌、易修刻成型，重量輕；5.其多孔性結(jié)構(gòu)為新骨組織長(zhǎng)入材料中提供通道和容納場(chǎng)所；6.易結(jié)合機(jī)體骨組織，形成機(jī)械性內(nèi)鎖，增強(qiáng)植入材料的結(jié)合，為固位創(chuàng)造了條件。
本發(fā)明另一目的是提供一種使用OPG蛋白、聚乳酸和羥基磷灰石或磷酸鈣生產(chǎn)生物復(fù)合人工骨的方法。該方法包括以下步驟1)分別取粒徑小于250μm的羥基磷灰石或磷酸鈣、OPG蛋白粉末，按羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝100～160∶0.6～1比例混勻，制成懸浮液；2)按聚乳酸∶羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝180～250∶100～160∶0.6～1比例稱(chēng)取聚乳酸，加到上述懸浮液中，得到乳化液；3)在乳化液中加入無(wú)水乙醇脫水，傾去上清液，繼續(xù)用無(wú)水乙醇脫水，直至復(fù)合材料固化；4)將粘彈狀態(tài)的復(fù)合材料瀝干，制模，得到所述生物復(fù)合人工骨。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、聚乳酸(PLA)、羥基磷灰石(或磷酸鈣)均具有公認(rèn)的較好的生物相容性，PLA可生物降解，OPG蛋白能抑制破骨細(xì)胞的生成、活化，還能引發(fā)破骨細(xì)胞凋亡；羥基磷灰石(或磷酸鈣)具有骨傳導(dǎo)作用，OPG蛋白和羥基磷灰石(或磷酸鈣)可作為骨基質(zhì)材料直接轉(zhuǎn)化為骨組織，最終被自身組織替代；2、選用OPG蛋白為骨修復(fù)材料，制備工藝簡(jiǎn)單，制作成本低，骨修復(fù)作用確切；它占復(fù)合材料比例很少，可消除或減輕大量使用OPG蛋白所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)；更佳的可采用OPG融合蛋白，如OPG-Fc融合蛋白，以提高OPG蛋白活性的半衰期；3、羥基磷灰石是一種堿性材料，可中和聚乳酸降解產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物，消除過(guò)高酸性產(chǎn)物的刺激作用，并可為骨組織生長(zhǎng)提供礦物質(zhì)，有明顯的骨傳導(dǎo)作用。羥基磷灰石(或磷酸鈣)在體內(nèi)不但不被吸收，還能防止骨吸收，且具有誘導(dǎo)新骨形成能力，與骨牢固結(jié)合，受力時(shí)無(wú)滑動(dòng)及摩擦。有良好的組織相容性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒、無(wú)刺激性，不引起排異反應(yīng)，不老化，不致敏致癌，易于塑形；4、采用乳液共混法，不需加溫，可保存OPG蛋白中的蛋白活性，且能將PLA、羥基磷灰石(或磷酸鈣)和OPG蛋白一次性復(fù)合，三者滲透分布均勻，這是利用PLA熱塑性升溫熔解復(fù)合和冷凍干燥法所達(dá)不到的，這是因?yàn)镺PG蛋白是一種活性蛋白，高溫(70度以上)易使其變性，失去促進(jìn)骨修復(fù)作用；而冷凍干燥法不可能將PLA和羥基磷灰石(或磷酸鈣)復(fù)合；5、復(fù)合材料有一定支撐強(qiáng)度，可制備成任意大小、形狀，增大了可操作性。
總之，采用本發(fā)明乳液共混法將聚乳酸、OPG蛋白、羥基磷灰石(或磷酸鈣)一次性復(fù)合，沒(méi)有改變?nèi)叩幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，所采用溶劑對(duì)人體無(wú)害，保存了羥基磷灰石(或磷酸鈣)的骨傳導(dǎo)作用和OPG蛋白的骨修復(fù)促進(jìn)作用，所復(fù)合的產(chǎn)物是一種適用臨床使用的，用于骨缺損、治療骨質(zhì)疏松的理想人工骨。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施例。
實(shí)施例1OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨中的應(yīng)用由210∶100∶1聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG融合蛋白制備本實(shí)施例的生物復(fù)合人工骨。
其制備工藝如下首先，分別將羥基磷灰石、OPG融合蛋白粉碎成粉末，過(guò)標(biāo)準(zhǔn)篩，取粒徑小于250μm的顆粒粉末，并按羥基磷灰石∶OPG融合蛋白＝100∶1比例混勻，加入適量蒸餾水?dāng)嚢柚瞥蓱腋∫?；再按聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG融合蛋白＝210∶100∶1比例稱(chēng)取D，L-型聚乳酸，并加入乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯的量以能完全溶解D，L-型聚乳酸為準(zhǔn)；其次，把含D，L-型聚乳酸的乙酸乙酯加入羥基磷灰石和OPG融合蛋白的懸浮液中，邊加入邊攪拌，得到穩(wěn)定的乳化液；再次，在乳化液中加入無(wú)水乙醇脫水，乳化液立即分為兩層，上層為溶劑清液，傾去上清液，繼續(xù)用無(wú)水乙醇脫水2-3次，直至復(fù)合材料呈現(xiàn)固化趨勢(shì)為止；最后，將粘彈狀態(tài)的復(fù)合材料瀝干，轉(zhuǎn)入預(yù)定模具中，放入真空烘箱，在溫度為37℃條件下，快速抽氣，除去殘余溶劑，得到固化的生物復(fù)合人工骨。
本例中的聚乳酸是由重慶大學(xué)生物研究院合成的D，L-型聚乳酸，MW＝5～6萬(wàn)；羥基磷灰石是由北京市意華健科貿(mào)有限責(zé)任公司提供；OPG蛋白與OPG融合蛋白是由上海富純中南生物技術(shù)有限公司自行制備。OPG蛋白參見(jiàn)SEQ IDNO1；OPG融合蛋白為OPG-Fc融合蛋白，其中的OPG蛋白和Fc片段分別參見(jiàn)SEQ ID NO1(N端22-201段)和SEQ ID NO2。
其它試劑均為分析純。
實(shí)施例2OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨的應(yīng)用采用實(shí)施例1所述的方法制備本實(shí)施例的生物復(fù)合人工骨，但聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG融合蛋白＝250∶160∶1。
實(shí)施例3OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨的應(yīng)用采用實(shí)施例1所述的方法制備本實(shí)施例的生物復(fù)合人工骨，但聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG融合蛋白＝180∶120∶1。
實(shí)施例4OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨的應(yīng)用采用實(shí)施例1所述的方法制備本實(shí)施例的生物復(fù)合人工骨，但聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG融合蛋白＝250∶160∶0.6。
實(shí)施例5OPG蛋白在生物復(fù)合人工骨中的應(yīng)用采用實(shí)施例1所述的方法制備本實(shí)施例的生物復(fù)合人工骨，但聚乳酸∶羥基磷灰石∶OPG蛋白＝210∶100∶1。
實(shí)驗(yàn)例1、材料與方法1.1材料制備將上述方法制備的生物復(fù)合人工骨，加工成Φ2.8mm，L-20mm的棒，三層聚乙烯薄膜封裝，環(huán)氧乙烷消毒2小時(shí)，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 1.2動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)方法選用體重2.5-3.5kg家兔20只(雌雄不拘)，分開(kāi)喂養(yǎng)。用0.11mol/L的戊巴比妥鈉(1.0mg/kg)靜脈麻醉20只家兔后，無(wú)菌條件下手術(shù)造成家兔右撓骨上段18mm長(zhǎng)的骨缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?連同骨膜一并切除)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組骨缺損內(nèi)植入本發(fā)明生物復(fù)合人工骨，空白對(duì)照組不做任何處理。手術(shù)后不做內(nèi)、外固定。分別于手術(shù)后定期攝右上肢X線片(曝光條件完全一致)，觀察骨缺損修復(fù)情況。術(shù)后4、8、12周每組各取2只動(dòng)物對(duì)缺損中部組織采用石蠟包埋連續(xù)橫形切片(厚度25um)，HE染色，鏡下觀察。每只動(dòng)物取3張間斷切片觀察新骨形成情況，并用圖像分析新生骨的面積百分比(每組可得6個(gè)數(shù)據(jù))。所得數(shù)據(jù)用方差分析及t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.結(jié)果2.1 X線檢查結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的X線片特點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組，新骨白骨缺損兩端和本發(fā)明生物復(fù)合人工骨棒周?chē)纬?，逐漸向中心生長(zhǎng)，呈現(xiàn)“包圍”生長(zhǎng)?？瞻讓?duì)照組無(wú)明顯骨癡生長(zhǎng)。按Yasko骨缺損修復(fù)分期方法分期，0期無(wú)新骨形成；1期新骨占骨缺損的百分比＜25％，局部骨髓內(nèi)出現(xiàn)了極少量的破骨細(xì)胞；2期25-49％；3期50-74％；4期75-99％，骨髓內(nèi)破骨細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)；5期全部新骨替代。本實(shí)驗(yàn)各組不同時(shí)相骨缺損修復(fù)的X線表現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)表1表1不同時(shí)相2組骨缺損修復(fù)二線表現(xiàn)

注1()內(nèi)為分期2X20.05(5)＝10.98，X20.01(5)＝14.99，V＝(5-1)(2-1)＝43第2周 X2＝20，P＜0.01第4周 X2＝24，P＜0.01第8周 X2＝15，P＜0.01第12周 X2＝13，P＜0.052.2組織學(xué)觀察
4周后，組織觀察可以觀察到實(shí)驗(yàn)組植入的聚乳酸被部分吸收，骨缺損兩斷端主棒側(cè)有大量硬度較高的類(lèi)骨樣組織形成，空白組主要為纖維組織；第8周實(shí)驗(yàn)組聚乳酸大部分降解，生成大量的骨軟骨基質(zhì)，空白組主要為纖維組織；第12周實(shí)驗(yàn)組聚乳酸完全降解，被成熟的骨組織所取代，空白組缺損內(nèi)主要為纖維組織，有少量軟骨基質(zhì)生成；圖像分析顯示兩組不同時(shí)相新生骨在骨缺損中所占面積百分比見(jiàn)表2。
表2兩組不同時(shí)相骨小梁所占面積百分比(X±S％)

經(jīng)方差分析實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)相及不同時(shí)相兩組差異有顯著性意義，P＜0.01。
經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們可以看出，對(duì)于植入體內(nèi)的OPG融合蛋白在生物活性人工骨中的應(yīng)用，其OPG融合蛋白能抑制破骨細(xì)胞的生成、活化，還能引發(fā)破骨細(xì)胞凋亡。局部骨髓周?chē)难仔苑磻?yīng)輕微，僅有少許淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，發(fā)明人認(rèn)為系材料降解刺激產(chǎn)生；同時(shí)，通過(guò)組織學(xué)觀察，鏡下均未見(jiàn)包膜形成，說(shuō)明OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨中的應(yīng)用對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生良好的影響。
本實(shí)驗(yàn)是OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨中的應(yīng)用，OPG融合蛋白能抑制破骨細(xì)胞的生成、活化，還能引發(fā)破骨細(xì)胞的凋亡。骨誘導(dǎo)能力加強(qiáng)；高度多孔狀聚乳酸增加了細(xì)胞長(zhǎng)入的入徑，增加了細(xì)胞粘附的內(nèi)表面積，有利于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分的滲入和代謝產(chǎn)物的排出，有良好的表面活性，為細(xì)胞在表面生長(zhǎng)、增殖和分泌基質(zhì)提供了合適的微環(huán)境。本應(yīng)用是OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨作用十分明顯，2周可見(jiàn)中等量骨痂生長(zhǎng)，4周大量骨痂生長(zhǎng)，局部骨髓內(nèi)出現(xiàn)了極小量的破骨細(xì)胞，8周骨缺損已被骨痂填滿，12周時(shí)，聚乳酸完全降解，被成熟板層骨替代，這也說(shuō)明了OPG融合蛋白在生物復(fù)合人工骨中的應(yīng)用是能抑制破骨細(xì)胞的生成，也能使破骨細(xì)胞凋亡。
序列表<110>上海富純中南生物技術(shù)有限公司<120>生物復(fù)合人工骨及其制備方法<130>032707<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(401)<223>OPG蛋白<400>1Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile1 5 10 15Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp20 25 30Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr35 40 45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro50 55 60Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65 70 75 80Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu85 90 95Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr100 105 110Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe115 120 125Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg130 135 140Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145 150 155 160
Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys165 170 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr180 185 190Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg195 200 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val210 215 220Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu245 250 255Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln260 265 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala275 280 285Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly290 295 300Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys305 310 315 320Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn325 330 335Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser340 345 350Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr355 360 365Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu370 375 380Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys385 390 395 400Leu<210>2<211>232<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(232)<223>Fc蛋白<400>2Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230
權(quán)利要求
1.一種生物復(fù)合人工骨，其特征在于，它由以180～250∶100～160∶0.6～1的重量份配比的聚乳酸∶羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白組成。
2.如權(quán)利要求1所述的生物復(fù)合人工骨，其特征在于，所述聚乳酸是D，L-型聚乳酸。
3.如權(quán)利要求1所述的生物復(fù)合人工骨，其特征在于，所述OPG蛋白包括OPG蛋白、其變體或片段，或者OPG蛋白、其變體或片段與免疫球蛋白Fc段融合產(chǎn)生的OPG融合蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的生物復(fù)合人工骨，其特征在于，所述OPG蛋白、或其變體、片段選自以下(a)SEQ ID NO1所示的OPG蛋白序列；(b)氨基酸序列22-X，其中X為SEQ ID NO1所示的包括位置185-401的任何殘基；(c)在(b)所述的氨基酸序列前加上Met。
5.如權(quán)利要求3所述的生物復(fù)合人工骨，其特征在于，所述的免疫球蛋白Fc段選自以下(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亞部分(A)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有取代或缺失的不同氨基酸，所述位置采用SEQ ID NO2的序列編號(hào)i.一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；ii.一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴(lài)氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴(lài)氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；x.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除補(bǔ)體Clq結(jié)合位點(diǎn)；xi.亞部分i-x的組合。
6.權(quán)利要求1所述的生物復(fù)合人工骨的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟1)分別取粒徑小于250μm的羥基磷灰石或磷酸鈣、OPG蛋白粉末，按羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝100～160∶0.6～1重量比混勻，配制成懸浮液；2)按聚乳酸∶羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝180～250∶100～160∶0.6～1重量比稱(chēng)取聚乳酸，用乙酸乙酯溶解，然后將聚乳酸溶液加入到步驟1)的懸浮液中，得到乳化液；3)在乳化液中加入無(wú)水乙醇脫水，傾去上清液，繼續(xù)用無(wú)水乙醇脫水，直至復(fù)合材料固化；4)將粘彈狀態(tài)的復(fù)合材料瀝干，制模，得到所述生物復(fù)合人工骨。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述聚乳酸∶羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝210∶100∶1。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述聚乳酸∶羥基磷灰石或磷酸鈣∶OPG蛋白＝250∶160∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物復(fù)合人工骨及其制備工藝。該人工骨是由以180～250∶100～160∶0.6～1的重量份比配比的聚乳酸∶羥基磷灰石(或磷酸鈣)∶OPG蛋白制成的生物復(fù)合人工骨。本發(fā)明采用乳液共混法將聚乳酸、羥基磷灰石(或磷酸鈣)、OPG蛋白一次性復(fù)合，沒(méi)有改變?nèi)叩幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)。所采用的乙酸乙酯、無(wú)水乙醇等溶劑對(duì)人體無(wú)害，保存了羥基磷灰石(或磷酸鈣)的骨傳導(dǎo)作用和OPG蛋白抑制破骨細(xì)胞的生成及活化作用，還能引發(fā)破骨細(xì)胞凋亡。所得復(fù)合產(chǎn)物是一種適于臨床使用，用于骨缺損、治療骨質(zhì)疏松的生物復(fù)合人工骨。
文檔編號(hào)A61L27/22GK1565645SQ0312930
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者倪健, 蔣建平, 楊武劍, 羅鵬 申請(qǐng)人:上海富純中南生物技術(shù)有限公司