專利名稱：一種制備預(yù)防流感抗血清的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種制備預(yù)防流感的抗血清的方法。
陳則等將病毒株A/PR/8/34的HA、NA、M1、NP和NS1的編碼基因分別克隆入小雞的β肌動蛋白表達載體(pCAGGSP7)中，比較不同的表達質(zhì)粒在BALB/c小鼠中的免疫保護能力。結(jié)果顯示，接種HA或NA核酸疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染。用同樣的方法，將HA、NA和NP的表達質(zhì)粒接種BALB/c(H-2d)、B10(H-2b)和C3H(H-2k)三個品系的小鼠。結(jié)果顯示，NA表達質(zhì)粒在所有三種小鼠中均表現(xiàn)出很高的保護水平，而HA表達質(zhì)粒只在BALB/c小鼠中有效，NP表達質(zhì)粒則全無效果，只引發(fā)低滴度的抗體反應(yīng)。由此證明，NA基因為流感核酸疫苗的重要組成部分。之后，又用HA和NA的表達質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠，其免疫效果要明顯好于用HA或NA質(zhì)粒單獨免疫小鼠。在此基礎(chǔ)上，對NA表達質(zhì)粒的交叉保護效果做了研究。從A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/Aichi/2/68(H3N2)和A/PR/8/34(H1N1)中獲得3種NA表達質(zhì)粒，對BALB/c小鼠分別接種，加強免疫后用致死量的A/Guizhou/54/89攻擊。結(jié)果顯示接種A/Guizhou NA質(zhì)粒的小鼠能完全抵抗同源病毒的攻擊，接種A/AichiNA質(zhì)粒的小鼠對變異株(A/Guizhou)的攻擊也有很高的交叉保護效果，而接種PR8 NA質(zhì)粒的小鼠則無法抵抗不同亞型病毒株的攻擊。NA對流感變異株的交叉保護效果被再一次證明。
基于以上對比分析，可以看出所述流感生物預(yù)防制品制備的現(xiàn)有技術(shù)中存在的共同不足是制備工藝相對繁瑣，導(dǎo)致生產(chǎn)制備周期增長，生產(chǎn)成本增加。其次，由于這些流感生物預(yù)防制品基本為疫苗產(chǎn)品，其免疫保護機理是在接種者體內(nèi)產(chǎn)生主動應(yīng)答，因此對于老人和嬰幼兒以及免疫腎衰或其他免疫抑制病人，所述疫苗無法誘發(fā)具有保護性水平的抗體反應(yīng)。對于DNA疫苗而言，直接用于人體還存在著安全性問題。
本方法采用流感DNA疫苗免疫動物，產(chǎn)生抗血清，以此抗血清被動免疫動物，起到預(yù)防保護效果。經(jīng)實驗證明，由流感DNA疫苗產(chǎn)生的抗血清具有保護效果。本發(fā)明方法不需制備抗原蛋白，用DNA疫苗免疫動物，獲得抗血清.本流感預(yù)防用抗血清克服了已知流感預(yù)防制品的不足，提供了一種較為安全、有效的流感預(yù)防制品的制備方法。
本發(fā)明方法通過如下技術(shù)方案和步驟實現(xiàn)，1)提取流感病毒抗原HA、NA基因；2)構(gòu)建HA、NA DNA疫苗；3)鑒定HA、NA DNA疫苗；4)選擇實驗動物；5)HA、NADNA疫苗免疫動物；6)測定抗HA、NA抗血清效價；7)采集抗血清；8)抗血清被動免疫；9)流感病毒攻擊實驗。
所述病毒DNA按已知方法從在10日齡雞胚中繁殖得到的PR8病毒中提取。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得單鏈cDNA。以cDNA為模板，對HA和NA基因進行PCR擴增，各自的引物為本領(lǐng)域所公知，均含有Xho I和Sma I酶切位點。PCR產(chǎn)物用Xho I-Sma I消化，克隆入經(jīng)同樣酶切處理的表達載體pCAGGSP7中。PCAGGSP7含雞β-actin啟動子成分和SV40的復(fù)制起始部位(Ori)。
將流感病毒株A/PR/8/34(PR8，H1N1)的HA和NA基因克隆入表達載體pCAGGSP7，獲得重組質(zhì)粒pCAGGSP7/HA，pCAGGSP7/NA。
編碼HA和NA的質(zhì)粒在Escherichia coli XL1-blue中擴增，用純化試劑盒(市購)純化。測序證實HA和NA DNA核酸序列。用紫外風(fēng)光光度法測定質(zhì)粒的濃度和純度。
本發(fā)明所述DNA疫苗的導(dǎo)入方式，有肌肉注射、皮內(nèi)注射、鼻內(nèi)滴注或鼻腔噴霧、脂質(zhì)體法以及基因槍免疫和活體電擊免疫等。本發(fā)明方法涉及的抗血清制備，可根據(jù)動物種屬差異，抗血清量和型的需要及抗原要求，選擇1)動物，包括馬、騾，或家兔、豚鼠，或山羊和家兔；2)免疫劑量、時間和途徑，其中大動物抗原劑量(以蛋白抗原為準(zhǔn))約0.5～1mg/只，小動物約0.1～0.6mg/只。免疫注射的途徑一般采用多點注射，總點數(shù)約為8～10點，包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下。免疫間隔時間以間隔10～20天為好。二次以后每次的間隔為7～10天；3)動物采血在末次免疫后5～7天，采用用頸動脈放血，心臟采血和靜脈多次采血法；4)抗血清分離多采用室溫自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝塊收縮；5)抗血清效價鑒定，采用雙向免疫擴散法或ELISA進行測試以及血凝抑制試驗和放射免疫技術(shù)。
本發(fā)明方法涉及的免疫程序，可采用一次DNA疫苗免疫，兩次DNA疫苗免疫，三次DNA疫苗免疫或先用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加強的多種免疫程序。
HA、NA DNA疫苗免疫動物；選取6～8周齡BALB/c小鼠。
腹腔注射全身麻醉小鼠后，注射溶于TE的DNA溶液入右后腿股四頭肌，在注射部位兩側(cè)插入兩根電擊儀的電極，相距0.5cm，進行電擊(電壓100v，電擊時間50ms，電擊正負各三次，間隔1s)，完成一次免疫。本方法采用3種不同的免疫程序?qū)π∈筮M行免疫1)第0、3周各免疫1次，共2次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。設(shè)未插入基因的載體DNA免疫小鼠為陰性對照。第4周用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。2)第0、3周各免疫1次，共2次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。設(shè)未插入基因的載體DNA免疫小鼠為陰性對照。第6周用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。3)第0、3、6周各免疫1次，共3次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。用未插入基因的載體DNA免疫小鼠作為陰性對照。第9周用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。
取小鼠血清樣本作ELISA，測IgG抗體。用10μg/mL的A/PR/8/34滅活疫苗包被96孔酶標(biāo)板37℃2小時，PBS-T洗三次后加入封閉液，4℃過夜。用封閉液以2的倍數(shù)稀釋血清后，加入酶標(biāo)板，37℃溫育1小時。PBS-T洗三次后，加入用生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃溫育1小時。PBS-T洗三次后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白，37℃溫育1小時。最后，PBS-T洗三次后，加入p-NPP顯色。在30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀利用雙波長(414nm-405nm)測出OD值，最終確定抗體IgG的最高稀釋度，以此來確定抗體量的高低。
用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。收集的血液置于室溫1小時。凝固后析出血清。4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。在無菌條件下吸出血清，混勻后按每管50～200μl分裝，-20度冰箱保存。
實施例2抗血清被動免疫動物用HA、NA抗血清被動免疫6～8周齡的小鼠。注射器吸取抗血清并排氣，溫水浸泡鼠尾使血管擴張，用70％乙醇擦拭并固定鼠尾?？寡逦察o脈注射，24小時后，用A/PR/8/34(H1N1)病毒(20LD50)通過滴鼻法(17μl病毒懸液)攻擊小鼠。觀察小鼠體重變化和存活率判定HA和NA抗血清的保護效果。病毒攻擊后第3天，HA和NA實驗組小鼠平均體重均下降10％左右，對照組小鼠平均體重下降20％左右。病毒攻擊后第6天，實驗組小鼠平均體重均下降20％左右，對照組小鼠平均體重下降35％左右。實驗表明，用100μl HA和NA抗血清被動免疫的小鼠存活率均為90％，用300μl HA和NA抗血清被動免疫的小鼠存活率均為100％。結(jié)果證實，用HA、NA DNA疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的抗血清被動免疫成年小鼠，可使之抵抗致死量流感病毒攻擊，起到保護效果。
本發(fā)明所采用DNA疫苗與傳統(tǒng)用于傳染病預(yù)防的疫苗如滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等相比，有以下特點(1)免疫效果好，與普通蛋白疫苗不同，基因疫苗能在自身細胞中產(chǎn)生外源性蛋白，這種蛋白較之在原核生物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更象天然分子，其遞生過程與自然感染十分相似。因此，這樣的免疫原將含有在構(gòu)象上相關(guān)的表位，誘導(dǎo)產(chǎn)生對應(yīng)于天然抗原的免疫應(yīng)答。另外，核酸疫苗對已有免疫力的個體接種仍可起作用。
(2)核酸疫苗與減毒活疫苗和載體活疫苗一樣引起CTL應(yīng)答，但卻不存在后兩者毒力回升的危險，也不存在散毒，病毒污染及個體傳染源的敏感性相關(guān)的毒力改變，對于常規(guī)疫苗難以培養(yǎng)或危險的致病體，核酸疫苗則易于構(gòu)建。
(3)免疫應(yīng)答持久，由于外源基因可以在體內(nèi)存在較長時間，并不斷表達外源蛋白，它可以持續(xù)地給免疫系統(tǒng)提供刺激，因此，很微量的抗原即可刺激機體產(chǎn)生強而持久的免疫應(yīng)答。
(4)方法簡便，價格低廉。核酸疫苗僅需在細菌中生產(chǎn)，構(gòu)建高效表達質(zhì)粒，與普通疫苗相比，核酸疫苗的制作省去了抗原提取和純化等繁瑣耗時的過程，使得制備周期大大縮短。核酸疫苗用量少，比其它疫苗更經(jīng)濟。
(5)核酸疫苗具有相同的理化性質(zhì)，為聯(lián)合免疫提供了可能。基因免疫只對表達的抗原而不對載體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故同一質(zhì)粒可以用于轉(zhuǎn)運不同的靶基因而多次使用，也可在一個載體上構(gòu)建表達多種抗原的被稱為″復(fù)合疫苗″或多價疫苗的多功能疫苗，達到一次免疫能取得多次不同免疫相同的免疫效果。
(6)核酸疫苗可以加工成干燥的小粒便于貯藏和運輸。干燥的DNA小粒在室溫下相對穩(wěn)定，不需要冷藏設(shè)備，因此對邊遠地區(qū)的使用也較為方便。核酸疫苗在給與前即刻加水就能簡單地恢復(fù)原狀，在經(jīng)濟上和公共衛(wèi)生方面都有利。
權(quán)利要求
1.一種制備預(yù)防流感抗血清的方法，其特征在于采用流感DNA疫苗免疫動物，產(chǎn)生抗血清，以此抗血清被動免疫動物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備預(yù)防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟，1)提取流感病毒抗原HA、NA基因；2)構(gòu)建HA、NA DNA疫苗；3)鑒定HA、NA DNA疫苗；4)選擇實驗動物；5)HA、NA DNA疫苗免疫動物；6)測定抗HA、NA抗血清效價；7)采集抗血清；8)抗血清被動免疫；9)流感病毒攻擊實驗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備預(yù)防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫動物，免疫方式采用活體電擊免疫，基因槍免疫和肌注免疫方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備預(yù)防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫動物，免疫程序采用一次DNA疫苗免疫，兩次DNA疫苗免疫，三次DNA疫苗免疫或先用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加強免疫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的制備預(yù)防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫動物，免疫程序采用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加強免疫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備流感預(yù)防抗血清的方法，其特征是所述方法其中構(gòu)建HA、NA DNA疫苗所述表達載體是pCAGGSP7，重組質(zhì)粒是pCAGGSP7/HA，pCAGGSP7/NA。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種制備預(yù)防流感的抗血清的方法。本方法采用流感DNA疫苗免疫動物，產(chǎn)生抗血清，以此抗血清被動免疫動物，起到預(yù)防保護效果。本發(fā)明方法不需制備抗原蛋白，用DNA疫苗免疫動物，獲得抗血清，制備方法簡便，價格低廉，使用方便，免疫效果好，克服了已知流感預(yù)防制品的不足，提供了一種較為安全、有效的流感預(yù)防制品的制備方法。
文檔編號A61P31/16GK1452984SQ0312887
公開日2003年11月5日 申請日期2003年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者朱威, 陳則 申請人:上海生物制品研究所