專利名稱：重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗(簡稱乙卡聯(lián)合苗)，特別提供了重組乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)與卡介菌(BCG)菌液的配比處方、冷凍干燥工藝，同時還提供了涉及該聯(lián)合疫苗的保護劑、接種劑量、接種途徑，屬于疫苗生產(chǎn)制備工藝技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型肝炎和結(jié)核病均為傳染性疾病，通過接種相應(yīng)的疫苗，預(yù)防乙型肝炎和結(jié)核病一直很有成效。根據(jù)計劃免疫規(guī)定，新生兒在出生24小時內(nèi)必須接種乙型肝炎疫苗和卡介苗。現(xiàn)行使用的卡介苗為凍干制劑，上臂三角肌處皮內(nèi)接種，現(xiàn)行使用的重組乙型肝炎疫苗為液體疫苗，含鋁佐劑和防腐劑，上臂三角肌肌內(nèi)接種，這兩種疫苗均為單價疫苗，需同日分別接種。因為接種途徑不同，以及現(xiàn)行的乙型肝炎疫苗含有防腐劑，因此，與卡介苗不能簡單地混合使用，必須兩針分別接種，這不僅給新生兒帶來痛苦，也給接種增加了許多不便。乙型肝炎疫苗與卡介苗合為一針接種的問題成為本發(fā)明要實現(xiàn)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，使新生兒由原來的兩針接種簡化為一針接種，可達到原來接種兩針的預(yù)防效果。
本發(fā)明還提供一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗的凍干劑型。
本發(fā)明進一步提供了一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗生產(chǎn)工藝，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，其特征在于每支成品含以下組分及含量乙型肝炎表面抗原 5微克～20微克卡介菌80微克～120微克明膠 0.8～1.2毫克蔗糖 8～12毫克氯化鉀0.8～1.2毫克谷氨酸鈉 0.8～1.2毫克氯化鈉0.8～0.9毫克pH6.0～7.5本發(fā)明重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗的具體制備方法，包括以下步驟(1)提供的卡介菌原液每毫升含以下成份及含量卡介菌 800～1200微克明膠8～12毫克蔗糖80～120毫克氯化鉀 8～12毫克谷氨酸鈉8～12毫克余量為注射用水
(2)提供重組乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量重組乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克。
氯化鈉 8～9毫克余量為注射用水(3)在步驟(1)和步驟(2)中所述兩種原液按1∶1比例混合，得到聯(lián)合疫苗半成品。
(4)在步驟(3)中得到的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗半成品進行分裝，每支0.2毫升。
(5)在步驟(4)中得到的分裝品冷凍干燥，步驟為干箱預(yù)凍3～4小時，制品凍結(jié)7～8小時，逐漸升溫真空干燥8～10小時，恒溫真空干燥7～8小時，全過程累計25～30小時，制備出重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗成品。
重組乙型肝炎卡介菌聯(lián)合疫苗的使用劑量及注射部位小劑量重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原5微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外側(cè)三角肌中部略下處的皮膚皮內(nèi)注射。
中劑量重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原10微克和卡介菌8～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外側(cè)三角肌中部略下處的皮膚皮內(nèi)注射。
大劑量重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原20微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外側(cè)三角肌中部略下處的皮膚皮內(nèi)注射。
重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗與單價卡介苗免疫效果比較實驗組分別接種按本發(fā)明方法制備的三種規(guī)格乙卡聯(lián)合苗，對照組接種同批卡介苗，每組接種4只豚鼠。5周時接種結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)，24～72小時判定反應(yīng)局部硬結(jié)直徑。重復實驗三次。
接種PPD后24小時后判定結(jié)果(見表1)，各實驗組與同批對照組相比較，結(jié)果相近，t檢驗p＞0.05，無顯著性差異。重組HBsAg對卡介苗免疫效果無影響。
表1 PPD皮內(nèi)試驗結(jié)果HBsAg組別 疫苗 劑量反應(yīng)直徑(mm)x±s pμg/支實驗1-1組 乙卡聯(lián)合苗5 812148.510.6±2.86p＞0.05實驗1-2組 乙卡聯(lián)合苗10 11.5 9 138.510.5±2.12實驗1-3組 乙卡聯(lián)合苗20 10 1110.5 7 9.6±1.79對照1 卡介苗0 10.5 9.5 9 13 10.5±1.77實驗2-1組 乙卡聯(lián)合苗5 11.5 10129 10.6±1.37p＞0.05實驗2-2組 乙卡聯(lián)合苗10 14 8 128.510.1±2.71實驗2-3組 乙卡聯(lián)合苗20 10.5 14119.511.2±1.93對照2 卡介苗0 14 1210.5 8 11.1±2.52實驗3-1組 乙卡聯(lián)合苗5 98.5 7 10 8.6±1.25 p＞0.05實驗3-2組 乙卡聯(lián)合苗10 6.5 8 129 8.8±2.32實驗3-3組 乙卡聯(lián)合苗20 7.5 8.5 108 8.5±1.08對照3 卡介苗0 7.5 6.51011.5 8.8±2.28重組乙型肝炎卡介菌聯(lián)合疫苗與單價重組乙型肝炎疫苗免疫效果比較按本發(fā)明方法制備的聯(lián)合疫苗取消了原單價重組乙型肝炎疫苗中鋁佐劑及防腐劑，而以卡介苗作為抗原同時又作為HBsAg的佐劑，本研究旨在探討這種改變對重組乙肝表面抗原免疫原性的影響。
對照組按0、1、2程序接種重組乙型肝炎疫苗，按10μg/只劑量，腹腔接種豚鼠。
每次實驗組設(shè)三組，初免時分別皮內(nèi)接種含HBsAg 2.5μg(5μg/支規(guī)格)、5μg(10μg/支規(guī)格)、10μg(20μg/支規(guī)格)三種劑量的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗；對照組初免時，腹腔接種單價重組乙型肝炎疫苗10μg/只。第二針、第三針的加強免疫，各組相同，都是采用單價重組乙型肝炎疫苗10μg/只，。每次免疫后1個月采血，ELISA方法檢測血清抗體滴度。結(jié)果見表1、2、3。
表2實驗組(2.5μg)與對照組(10μg)免疫效果比較血清抗體幾何平均滴度(GMT±S)組別 S1 S2 S3試驗組 66±0.13(n＝9) 9164±0.47(n＝10)17811±0.33(n＝9)對照組 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10)11271±0.23(n＝11)t＝3.14 t＝1.05 t＝1.28p＜0.01 p＞0.05 p＞0.05*S1、S2、S3分別為第一針、第二針、第三針免疫后抗體幾何平均值表3實驗組(5μg)與對照組(10μg)免疫效果比較血清抗體幾何平均滴度(GMT±S)組別 S1 S2 S3試驗組 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9)16882±0.42(n＝8)對照組 151±0.25(n＝8)5596±0.43(n＝10)11271±0.23(n＝11)t＝2.72t＝1.56 t＝1.31P＜0.05P＞0.05 P＞0.05
表4實驗組(10μg)與對照組(10μg)免疫效果比較血清抗體幾何平均滴度(GMT±S)組別 S1 S2 S3試驗組 85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10) 18756±0.43(n＝9)對照組 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10) 11271±0.23(n＝11)t＝2.43 t＝1.82t＝1.56P＜0.05 P＞0.05P＞0.05從表2、表3、表4結(jié)果可見，2.5μg、5μg、10μg三種接種劑量的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗第一針免疫結(jié)果，其抗體幾何平均滴度均低于單價10μg乙型肝炎疫苗腹腔免疫對照組，但第二針、第三針加強免疫后，實驗組(聯(lián)合疫苗組)抗體滴度迅速上升，而且高于對照組，其結(jié)果證明，卡介苗對乙型肝炎疫苗的全程免疫效果不僅無不良影響，而且，還有增強免疫效果的作用。
不同劑量重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗對乙型肝炎病毒表面抗原免疫效果的影響按本發(fā)明方法制備三種規(guī)格的該聯(lián)合疫苗，分別含重組乙型肝炎病毒表面抗原為5μg/支、10μg/支、20μg/支，含卡介苗均為80～120μg/支。三種規(guī)格的聯(lián)合疫苗用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升皮內(nèi)注射，接種“PPD皮內(nèi)試驗”陰性的豚鼠，并按10μg/只劑量腹腔接種重組乙型肝炎疫苗進行加強免疫，ELISA方法檢測血清抗體滴度。結(jié)果從表5可見，三種接種劑量的聯(lián)合疫苗其免疫效果相近，不論初免，還是加強免疫，各組抗體幾何平均滴度均無顯著性差異。
表5重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗三種接種劑量免疫效果比較血清抗體幾何平均滴度(GMT±S)接種劑量 S1 S2S310μg85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10)18756±0.43(n＝9)5μg 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9) 16882±0.42(n＝8)2.5μg 66±0.13(n＝90)9164±0.47(n＝10) 17811±0.33(n＝9)t＝0.68t＝1.04 t＝1.31P＞0.05P＞0.05 P＞0.05重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗安全試驗取該聯(lián)合疫苗及同批原液的卡介苗，注射用水溶解，選用“PPD皮內(nèi)試驗陰性”、體重300～400g的同性豚鼠，試驗組皮下接種50人份聯(lián)合疫苗，對照組皮下接種50人份卡介苗，每兩周稱重一次，觀察6周后，解剖檢查。
三批聯(lián)合疫苗試驗結(jié)果，豚鼠體重增加，解剖觀察肝、脾、肺、腎、大網(wǎng)膜、腸系膜等臟器與卡介菌組無區(qū)別，均無結(jié)核病變。
本發(fā)明的積極效果在于，制備的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，使新生兒接種一針疫苗，可預(yù)防乙型肝炎、結(jié)核病兩種疾病，達到接種兩針原有單價疫苗的效果。
本發(fā)明的積極效果還在于，本發(fā)明在制備重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗過程中，不是簡單地將兩種疫苗混合，而是將重組乙型肝炎病毒表面抗原蛋白與卡介苗菌體兩者自然聯(lián)合，去除了現(xiàn)行使用的乙型肝炎疫苗中鋁佐劑、甲醛和硫柳汞等不良成分，提高安全性；在該聯(lián)合疫苗中，兼用卡介苗的強免疫佐劑作用，既增強體液免疫，又增強細胞免疫，使其效果優(yōu)于單價乙型肝炎疫苗。同時由于卡介菌的特殊性，必須皮內(nèi)接種，這也成為該聯(lián)合疫苗唯一的接種途徑，而皮內(nèi)接種一般為刺激機體免疫反應(yīng)的最有效途徑，它以低劑量接種達到相同或超過其它途徑高劑量接種的效果。
本發(fā)明的積極效果還在于該聯(lián)合疫苗改變了現(xiàn)行使用的乙型肝炎疫苗的液體劑型為凍干劑型，提高了乙型肝炎表面抗原的熱穩(wěn)定性，液體乙型肝炎疫苗通常在37℃15天，效力就顯著下降，甚至降為原始效力的一半。由于該聯(lián)合疫苗含有凍干保護劑，使乙型肝炎病毒表面抗原熱穩(wěn)定性得到提高，37℃30天，ELISA檢測未見下降，結(jié)果見表6。
表6聯(lián)合疫苗37℃30天ELISA檢測結(jié)果樣品組規(guī)格HBsAg量原始結(jié)果 37℃30天結(jié)果ug/支1 5 6.72 6.322 10 10.8311.513 20 19.6521.3具體實施方式
實施例1重組乙型肝炎病毒表面抗原原液的制備按《中國生物制品規(guī)程》2000版“重組(CHO細胞)乙型肝炎疫苗制檢規(guī)程”進行。將適宜代數(shù)的含乙型肝炎病毒表面抗原基因的工程細胞CHO-C28擴增、傳代，接種15L轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器，37℃培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)液，純化HBsAg，其純度達95％以上，除菌過濾，用生理鹽水稀釋至50～200μg/ml。
實施例2
卡介苗原液的制備按《中國生物制品規(guī)程》2000版“皮內(nèi)注射用卡介苗制檢規(guī)程”進行，菌種在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基以及液體蘇通培養(yǎng)基上傳代、培養(yǎng)。收集菌膜壓干，低溫下研磨，加入保護劑稀釋成0.8～1.2mg/m1濃度。
實施例3重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗冷凍干燥保護劑的制備按下列配方配置冷凍干燥保護劑成分 含量(％)明膠 0.8～1.0蔗糖 8～12氯化鉀 0.8～1.2谷氨酸鈉 0.8～1.2余量為注射用水pH 6.0～7.5實施例4重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗半成品的制備其半成品組份及每毫升含量乙型肝炎表面抗原 25微克～100微克卡介菌400微克～600微克明膠 4～6毫克蔗糖 40～60毫克氯化鉀 4～6毫克谷氨酸鈉 4～6毫克余量為注射用水pH 6.0～7.5實施例5重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗成品的制備首先干箱預(yù)凍-40℃3～4小時，再將重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗半成品分裝0.2毫升/支，-40℃冷凍7～8小時，逐漸升溫真空干燥8～10小時，30～35℃恒溫真空干燥7～8小時，全過程累計25～30小時，即得冷凍干燥的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗成品。凍干后成品為白色疏松體，水份≤3％(g/g)。
權(quán)利要求
1.一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，其特征在于由以下組分組成乙型肝炎表面抗原 5微克/支～20微克/支卡介菌 80微克/支～120微克/支凍干保護劑
2.一種用于重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗的凍干保護劑，其特征在于由以下物質(zhì)按重量份數(shù)比制成明膠0.8～1.2％蔗糖8～12％氯化鉀 0.8～1.2％谷氨酸鈉0.8～1.2％余量為注射用水pH 6.0～7.5
3.權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)權(quán)利要求2所述的聯(lián)合疫苗凍干保護劑稀釋卡介菌，提供卡介菌原液每毫升含以下成份及含量卡介菌 800～1200微克明膠 8～12毫克蔗糖 80～120毫克氯化鉀 8～12毫克谷氨酸鈉8～12毫克余量為注射用水pH 6.0～7.5。(2)提供重組乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量重組乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克氯化鈉 8～9毫克余量為注射用水pH 6.0～7.5。(3)在步驟(1)和步驟(2)中所述兩種原液按1∶1比例混合，得到聯(lián)合疫苗半成品。(4)在步驟(3)中得到的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗半成品進行分裝，每支0.2毫升。(5)在步驟(4)中得到的分裝品冷凍干燥，步驟為干箱預(yù)凍3～4小時，制品凍結(jié)7～8小時，逐漸升溫真空干燥8～10小時，恒溫真空干燥7～8小時，全過程累計25～30小時，制備出凍干劑型的重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗成品。
4.權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗為凍干劑型。
5.一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，其特征在于皮內(nèi)接種，用于預(yù)防乙型肝炎和結(jié)核病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗，特別提供了重組乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)與卡介苗(BCG)菌液的配比處方、冷凍干燥工藝，同時還提供了涉及該聯(lián)合疫苗的保護劑、接種劑量、接種途徑，屬于疫苗生產(chǎn)制備工藝技術(shù)領(lǐng)域。該聯(lián)合疫苗使新生兒接種一針疫苗，可預(yù)防乙型肝炎、結(jié)核病兩種疾病。該聯(lián)合疫苗含有凍干保護劑，使乙型肝炎病毒表面抗原穩(wěn)定性提高；并去除單價乙型肝炎疫苗中的鋁佐劑、甲醛和硫柳汞等不良成分，安全性提高；兼用卡介苗的強免疫佐劑作用，既增強體液免疫，又增強細胞免疫，使其效果優(yōu)于單價乙型肝炎疫苗的效果。該聯(lián)合疫苗采用皮內(nèi)接種，以低劑量達到相同或超過其它途徑高劑量接種的效果。
文檔編號A61P31/00GK1460521SQ0312706
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者金立杰, 楊麗華, 陳萬革, 王志, 趙小琳, 鄭曉麗, 王洪飛, 于愛東, 孫俊業(yè), 鄒福學, 劉延明, 王玉武, 周長軍, 李德娟, 楊彤, 喬宏雷, 劉艾紅, 于漫輪, 羅璇, 蔡巖, 李利, 袁麗 申請人:長春生物制品研究所