專利名稱:一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的角燕提取物、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及魚類有效組分提取物及制備方法,具體涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的角燕有效組分提取物、制備方法和應(yīng)用。
角燕為晚近藥材,在我國多種本草中提到了其藥用價值。1976年林呂何編著的《廣西藥用動物》和1977年由中國人民解放軍海軍后勤部衛(wèi)生部,上海醫(yī)藥工業(yè)研究院編寫的《中國藥用海洋生物》中最早收載了雙吻前口蝠鲼,其后在《中國動物藥》、《中國有毒魚類和藥用魚類》、《中國動物藥志》、《海洋趣談》、《中藥藥名詞典》等書籍均有收載。在上述著作中,對角燕的尾刺、肝、腦、鰓等的藥用價值進行了詳細的描述。
角燕具有活血化瘀、消腫散結(jié)、清熱透疹、解毒等功效,其尾刺可用來治療牙痛、婦科疾病、癤瘡、治乳腺炎、咽喉炎、痢疾等;肝可以制魚肝油;腦可以浸酒服,治療跌打損傷。特別是角燕鰓具有活血化淤、消腫散結(jié)、清熱透疹、解毒等功效,在治療小兒麻疹上有相當好的效果,還可治瘡癤。但到目前為止,關(guān)于角燕的研究僅限于其分布、形態(tài)、解剖、化學(xué)成分分析等,關(guān)于角燕治療各種疾病的作用機制的研究報道極少,僅有本發(fā)明人在中國專利申請02136089.8中公開了一種具有抗腫瘤活性成份的角燕提取物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是采用現(xiàn)代生化技術(shù),從角燕中分離純化得到一種對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用的有效組分。
本發(fā)明公開的角燕有效組分提取物是選用角燕頭部部位,用鹽溶液抽提,有機溶劑沉淀獲得的蛋白質(zhì)及多糖類提取物。
本發(fā)明所述角燕有效組分提取物中蛋白質(zhì)含量大于40%,多糖含量大于0.3%。蛋白質(zhì)含量按GB/T14771-1993規(guī)定的方法測定,多糖含量按衛(wèi)生部內(nèi)統(tǒng)法“保健食品中粗多糖的測定方法的實施細則”檢驗測定。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述角燕有效組分提取物的制備方法。
本發(fā)明角燕有效組分提取物是通過下述技術(shù)方案獲得的取角燕頭部,清洗干凈后勻漿于2~5倍體積的含鹽酸鹽的緩沖溶液中,高速離心,得沉淀(一)及上清液;上清液用有機溶劑沉淀,得沉淀(二);沉淀(一)用堿水解,酸中和后,有機溶劑沉淀,得沉淀(三);合并沉淀(二)及沉淀(三),加水溶解,真空冷凍干燥,即得角燕有效組分提取物。
本發(fā)明所述的含鹽酸鹽的緩沖溶液可選用10mmol/L PB溶液或其它磷酸鹽緩沖液,其中含0.1~2mol/L鹽酸鹽和1~5mmol/LEDTA;所述的鹽酸鹽可選自NaCl、KCl等;所述的有機溶劑可選用乙醇、丙酮等;堿可為NaOH、KOH等;酸可為鹽酸、醋酸等。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述角燕有效組分提取物在制備免疫調(diào)節(jié)功能藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述角燕有效組分提取物具有增加NK細胞殺傷活性、巨噬細胞吞噬能力、提高細胞免疫及體液免疫活性的功能。
本發(fā)明角燕有效組分提取物可作為機體免疫調(diào)節(jié)保健食品及藥物的活性組分,根據(jù)保健及治療需要,與食用及藥用輔料制成各種制劑。
本發(fā)明選用ICR小鼠為研究對象,根據(jù)角燕提取物的人體推薦劑量為每日0.52g/60kg,本次實驗設(shè)立低、中、高三個劑量組,分別為0.043、0.087、0.26g/kg,分別相當于人體推薦劑量的5、10、30倍,對照組以蒸餾水灌胃。結(jié)果顯示,本品對動物體重?zé)o明顯影響,在劑量為0.087、0.26g/kg的中、高劑量組,可明顯提高小鼠的血清溶血素含量、增加脾細胞的溶血空斑數(shù)、明顯增強小鼠的碳廓清能力、促進小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)、促進ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、提高NK細胞的殺傷活性及腹腔巨噬細胞的吞噬能力。提示角燕提取物可明顯提高機體NK細胞活性、巨噬細胞吞噬能力、提高細胞免疫及體液免疫功能。
下面通過本發(fā)明角燕有效組分提取物的詳細功效試驗,進一步描述本發(fā)明角燕提取物的免疫調(diào)節(jié)作用。
1.樣品性狀樣品為角燕提取物,內(nèi)容物為灰色或淺褐色粉末。
2.動物來源ICR種小白鼠,合格證號02-22-1,體重18~22克,雄性,由復(fù)旦大學(xué)實驗動物部提供的清潔級動物(SPF動物房飼養(yǎng))。實驗動物飼養(yǎng)溫度為22±2℃,相對濕度50-70%,動物房合格證號02-28,動物飼養(yǎng)料,由蘇杭實驗動物科技發(fā)展公司提供。
3.劑量設(shè)計角燕提取物的人體推薦劑量為每日0.52g/kg,本次實驗設(shè)立低、中、高三個劑量組,分別為0.043、0.087、0.26g/kg,分別相當于人體推薦劑量的5、10、30倍,對照組以蒸餾水灌胃。
4.樣品處理取角燕提取物0.043、0.087、0.26g分別加蒸餾水至20ml,即為低、中、高三個劑量組的供試液。
5.給樣途徑灌胃,灌胃容積為0.4ml/20g.d。
6.實驗方法和結(jié)果7.體重動物稱重,按體重隨機分組,分為16組,每組10只,每四組為一實驗組,按劑量設(shè)計連續(xù)喂養(yǎng)30天,在實驗中期和實驗?zāi)┓謩e稱重一次,結(jié)果見表1-4。
表1角燕提取物(免疫一組)對動物體重(克)的影響組別動物數(shù)(只) 初始體重 中期體重 終期體重 增重對照10 20±1.1 27±1.132±1.512±1.1低劑量 10 19±1.2 26±1.031±1.112±0.6中劑量 10 19±1.1 27±1.432±2.113±1.3高劑量 1019±1.026±0.830±1.611±1.8由上表可見,角燕提取物各劑量組與對照組相比,均無顯著性差異。
表2 角燕提取物(免疫二組)對動物體重(克)的影響組別動物數(shù)(只) 初始體重 中期體重 終期體重 增重對照10 19±1.326±1.430±1.811±0.7低劑量 10 19±1.426±1.331±1.612±0.7中劑量 10 20±1.327±2.132±3.212±2.4高劑量 10 19±1.626±2.130±2.813±1.8由上表可見,角燕提取物各劑量組與對照組相比,均無顯著性差異。
表3 角燕提取物(免疫三組)對動物體重(克)的影響組別動物數(shù)(只) 初始體重 中期體重 終期體重 增重對照10 19±1.327±1.032±2.013±2.0低劑量 10 19±1.026±0.731±1.012±0.9中劑量 10 19±1.026±1.131±1.812±1.8高劑量 10 19±1.226±1.231±1.712±0.7由上表可見,角燕提取物各劑量組與對照組相比,均無顯著性差異。
表4 角燕提取物(免疫四組)對動物體重(克)的影響組別動物數(shù)(只) 初始體重 中期體重 終期體重 增重對照10 19±1.026±1.132±2.2 13±2.3低劑量 10 19±1.327±1.432±2.4 13±1.4中劑量 10 20±1.127±1.233±1.8 13±1.6高劑量 10 20±1.427±2.032±2.0 12±0.7由上表可見,角燕提取物各劑量組與對照組相比,均無顯著性差異。
6.2血清溶血素試驗動物連續(xù)給樣30天后,眼眶采血,頸椎脫臼處死,分離血清。在96孔微量血凝板上加25μl血清,以后各排對倍稀釋,每孔加1%SRBC1滴,振蕩后室溫放置3小時,當血球出現(xiàn)沉落后觀察結(jié)果。
表5 血清溶血素試驗結(jié)果組別 動物數(shù)(只)時間(天) 抗體積數(shù)對照 103075.4±35.1低劑量103090.8±25.7中劑量1030115.4±22.2*高劑量1030132.8±37.8**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比均有顯著性差異。
6.3抗體生成檢測試驗動物連續(xù)給樣30天后,將脫纖維綿羊紅細胞免疫5天后,動物頸椎脫臼處死,取脾臟,制成脾細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml。將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水100ml)加熱溶解后,放入45℃水浴保溫,與等量pH7.2-7.4,2倍濃度的Hanks液混合,分裝小試管,每管0.5ml,再向管內(nèi)加入50μl 10%SRBC,20μl脾細胞懸液,迅速混勻,傾倒入已刷瓊脂薄層的6cm平皿上,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h,然后用SA緩沖液稀釋的補體(1∶10)加入到平皿中,繼續(xù)溫育1.5h后,計數(shù)溶血空斑數(shù)。結(jié)果用方差分析進行統(tǒng)計。
表6 抗體生成檢測試驗組別動物數(shù)(只)時間(天) 溶血空斑數(shù)(103個/全脾)對照10307.3±2.45低劑量 10308.5±3.03中劑量 103017.9±2.62*高劑量 103022.1±2.02**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比均有顯著性差異。
6.4胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定動物連續(xù)給樣30天后每鼠稱重,頸椎脫臼處死,取胸腺、脾臟稱重,分別計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。
表7 胸腺指數(shù)和脾指數(shù)試驗結(jié)果組別 動物數(shù)(只)胸腺指數(shù)(%)脾指數(shù)(%)對照 100.28±0.04 0.47±0.06低劑量100.29±0.04 0.47±0.04中劑量100.30±0.03 0.46±0.07高劑量100.29±0.04 0.52±0.12經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物各劑量組與對照組相比均無顯著性差異。
6.5小鼠碳廓清試驗小鼠尾靜脈注射1∶3稀釋的印度黑汁,待墨汁注入,立即計時。注入墨汁后2、10分鐘,分別從眼靜脈叢取血20μl,并將其加到2mlNa2CO3溶液中,用分光光度計在600nm波長處測吸光度值A(chǔ),以Na2CO3溶液作空白對照。根據(jù)動物體重、肝重和脾重計算吞噬指數(shù),結(jié)果以方差分析進行統(tǒng)計。
表8 碳廓清試驗組別動物數(shù)(只)時間(天)吞噬指數(shù)對照1030 5.08±0.49低劑量 1030 5.53±0.35中劑量 1030 6.99±1.23*高劑量 1030 6.72±0.94**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比,均有顯著性差異。
6.6 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗動物連續(xù)給樣30天后,頸椎脫臼處死,取脾臟,制成脾細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml,將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml,一孔加50μl ConA液(相當于5μg/ml),另一孔作為對照,置5%CO2,37℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔輕輕吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,同時加入MTT(5mg/ml)50μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1ml酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解后,以570nm波長進行比色,結(jié)果用方差分析統(tǒng)計。
表9 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗組別 動物數(shù) 加ConA的 不加ConA 差值(只) A值 的A值對照103.022±0.200 2.798±0.141 0.224±0.135低劑量 103.132±0.171 2.819±0.082 0.313±0.130中劑量 103.353±0.214 2.796±0.095 0.557±0.201*高劑量 103.443±0.165*2.779±0.089 0.664±0.153**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比,均有顯著性差異。
6.7 DTH測定致敏動物連續(xù)給樣30天后,每鼠腹部去毛,范圍3×3cm,將1%的DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏。DTH的產(chǎn)生與測定5日后,用1%的DTH溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊。24小時后,頸椎脫臼處死小鼠,用打孔器取下直徑8mm的左右耳片,稱重并計算腫脹度。
表10 DTH測定結(jié)果組別動物數(shù)耳重均值(mg) 差值(只) 右 左對照 10 30.6±4.9 17.1±2.4 13.5±2.8低劑量10 29.2±3.8 16.3±1.9 12.9±3.1中劑量10 33.6±3.9 15.6±2.0 18.0±3.2*高劑量10 33.8±3.3 15.4±1.8 18.4±2.3**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)
經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比,均有顯著性差異。
6.8Nk細胞活性測定動物連續(xù)給樣30天后,頸椎脫臼處死,取脾臟,制成脾細胞懸液(效應(yīng)細胞),取傳代后24h的YAC-1細胞加入1640完全培養(yǎng)液,調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml(靶細胞),取靶細胞和效應(yīng)細胞各100μl(效靶比50∶1),加入U型96孔培養(yǎng)板,靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μl,最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100μl,上述各項均設(shè)三個復(fù)孔,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min,每孔吸取上清液100μl置平底96孔培養(yǎng)板中,同時加入LDH基質(zhì)液100l,反應(yīng)3min,每孔加入1mol/L的HCl30μl,用酶標儀在490nm處測定吸光度值A(chǔ)。
表11 NK細胞活性測定組別動物數(shù)(只)時間(天)NK細胞活性對照 10 30 19.79±1.66低劑量10 30 21.20±1.22中劑量10 30 36.83±2.80*高劑量10 30 40.82±1.45**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組與對照組相比,均有顯著性差異。
6.9小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗動物連續(xù)給樣30天后,每鼠腹腔注射20%雞紅細胞懸液1ml,間隔30分鐘,頸椎脫臼處死,固定于鼠板上,剪開腹壁皮膚,注射生理鹽水2ml,轉(zhuǎn)動鼠板1min,吸出腹腔洗液1ml,分滴于2片玻片上,37℃孵箱濕孵30min,用生理鹽水漂洗,晾干,以1∶1丙酮甲醇溶液固定,4%Giemsa-磷酸鹽緩沖液染色3min,再用蒸餾水漂洗晾干,用油鏡鏡檢,計算吞噬%和吞噬指數(shù)。
表12 巨噬細胞吞噬試驗組別 動物數(shù)(只)吞噬% 吞噬指數(shù)對照 1020±3.40.31±0.05低劑量1022±2.90.35±0.06中劑量1031±2.8*0.50±0.07*高劑量1041±8.2*0.67±0.14**P<0.05與對照組相比(經(jīng)方差分析)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析角燕提取物中、高劑量組吞噬%和吞噬指數(shù)與對照組相比,均存在顯著性差異。
7結(jié)論動物經(jīng)口給予角燕提取物30天后,本品對動物體重?zé)o明顯影響,在劑量為0.087、0.26g/kg的中、高劑量組,可明顯提高小鼠的血清溶血素含量、增加脾細胞的溶血空斑數(shù)、明顯增強小鼠的碳廓清能力、促進小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)、促進ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、提高NK細胞的殺傷活性及腹腔巨噬細胞的吞噬能力。提示角燕提取物可明顯提高機體NK細胞活性、巨噬細胞吞噬能力、提高機體細胞免疫及體液免疫功能,因此對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用。
角燕提取物含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖,蛋白質(zhì)是機體生命活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ),是提供機體組織蛋白的主要原料,是構(gòu)成機體的主要結(jié)構(gòu)成分,是體內(nèi)的一個重要載體;同時蛋白質(zhì)作為酶、抗體、激素等,在生命活動中對細胞的生長分化的調(diào)控以及遺傳信息的表達,起著重要的作用;是各種代謝不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)。多糖類化合物廣泛存在于動物、植物和微生物中,作為生命物質(zhì)的重要組成成分,廣泛參予細胞的各種生命現(xiàn)象和生理過程的調(diào)節(jié)。大量的藥理和臨床研究表明,多糖大都具有免疫促進作用,多糖類主要影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),巨噬細胞、淋巴細胞及白細胞、RNA、DNA、蛋白質(zhì)的合成、抗體的生成、cAMP與cGMP的含量、補體的生成及對干擾素的誘生作用等。因此人們利用多糖增強機體的免疫功能,提高抗病能力來達到抗衰老、抗癌、抗放、以及抗肝炎等。對植物多糖的研究相對較多,近年來動物多糖對機體免疫促進作用的研究也有了不少進展,發(fā)現(xiàn)動物多糖與植物多糖一樣對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用。
B細胞、T細胞、NK細胞和單核吞噬細胞是調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)的重要活性細胞,它們可通過分泌抗體、分泌細胞因子、細胞毒作用、吞噬作用等來抑制和殺傷靶細胞。測定血清溶血素水平,溶血空斑試驗可反應(yīng)機體的體液免疫能力,測定ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH)、NK細胞殺傷活性及腹腔巨噬細胞的吞噬活性可反映體內(nèi)的細胞免疫狀態(tài)及NK細胞及吞噬細胞的活性。本研究發(fā)現(xiàn),角燕提取物在劑量為0.087、0.26g/kg的中、高劑量組,可明顯提高小鼠的血清溶血素含量、增加脾細胞的溶血空斑數(shù)、明顯增強小鼠的碳廓清能力、促進小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)、促進ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、提高NK細胞的殺傷活性及腹腔巨噬細胞的吞噬能力。提示角燕提取物可明顯提高機體的細胞免疫及體液免疫功能,促進機體的NK細胞殺傷活性及巨噬細胞吞噬能力,因此對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用。
權(quán)利要求
1.一種角燕有效組分提取物,其特征在于該提取物是選用角燕頭部部位,用鹽溶液抽提,有機溶劑沉淀,干燥后獲得蛋白質(zhì)和多糖提取物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的角燕有效組分提取物,其特征在于其中所述的提取物蛋白質(zhì)含量大于40%,多糖含量大于0.3%。
3.一種如權(quán)利要求1所述的角燕有效組分提取物的制備方法,其特征在于該提取物通過下述方法獲得取角燕頭部,清洗干凈后勻漿于2~5倍體積的含鹽酸鹽的緩沖溶液中提取24~48小時,高速離心,得沉淀(一)及上清液,上清液用有機溶劑沉淀,得沉淀(二);沉淀(一)用堿水解,酸中和后,有機溶劑沉淀,得沉淀(三),合并沉淀(二)及沉淀(三),真空抽干或加水溶解后真空冷凍干燥,得角燕有效組分提取物。
4.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效組分提取物的制備方法,其特征在于其中所述的含鹽酸鹽的緩沖溶液選自10mmol/L PB溶液或其它磷酸緩沖液,其中含鹽酸鹽0.1~2mol/L和EDTA1~10mmol/L,所述的鹽酸鹽選自NaCl或KCl。
5.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效組分提取物的制備方法,其特征在于其中所述有機溶劑可選自乙醇或丙酮。
6.一種如權(quán)利要求2所述的角燕有效組分提取物的制備方法,其特征在于其中所述的堿可選自氫氧化鈉或氫氧化鉀,酸選自鹽酸或醋酸。
7.一種如權(quán)利要求1所述的角燕有效組分提取物在制備免疫調(diào)節(jié)功能藥物中的應(yīng)用,其特征在于所述的藥物具有增加NK細胞殺傷活性、巨噬細胞吞噬能力、提高細胞免疫及體液免疫活性的功能。
8.一種如權(quán)利要求6所述的角燕有效組分提取物的應(yīng)用,其特征在于該角燕有效組分提取物可作為機體免疫調(diào)節(jié)保健食品及藥物的活性組分,與食用或藥用輔料制成各種制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的角燕有效組分提取物及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的角燕有效組分提取物是選用角燕頭部部位,用鹽溶液抽提,有機溶劑沉淀,干燥后獲得蛋白質(zhì)和多糖提取物。該提取物對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用該提取物經(jīng)口給予動物30天后,對動物體重?zé)o明顯影響,在劑量為0.087、0.26g/kg的中、高劑量組,可明顯提高小鼠的血清溶血素含量、增加脾細胞的溶血空斑數(shù)、明顯增強小鼠的碳廓清能力、促進小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)、促進ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、提高NK細胞的殺傷活性及腹腔巨噬細胞的吞噬能力。提示角燕提取物可明顯提高機體NK細胞活性、巨噬細胞吞噬能力、提高機體細胞免疫及體液免疫功能,因此對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用。
文檔編號A61P37/00GK1430973SQ03114949
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者蔣定文, 沈先榮, 賈福星, 儲智勇, 李樹林, 陳美華, 周菊珍, 張敏 申請人:上海澳博海洋生物技術(shù)開發(fā)有限公司