專利名稱：褐藻膠裂合酶的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種褐藻膠裂合酶的制備方法及其應(yīng)用。
現(xiàn)有的褐藻膠裂合酶制備方法中，經(jīng)常采用硫酸銨分級(jí)沉淀，凝膠色譜等手段，并且最后進(jìn)行離心冷凍干燥，這些方法的缺點(diǎn)是試驗(yàn)步驟復(fù)雜，流程長(zhǎng)，成本高。
一種褐藻膠裂合酶的制備方法，其特征是配制培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，以弧菌進(jìn)行接種，然后恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液除菌，超過濾，對(duì)上清液超濾濃縮；所述的弧菌為Vibrio sp.QY101。
由本發(fā)明的方法制備的褐藻膠裂合酶用于將褐藻膠酶解生產(chǎn)褐藻寡糖。
由本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶用于恢復(fù)耐藥性病原菌對(duì)抗生素的敏感性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)量高，發(fā)酵液中雜蛋白含量少，提取無需其它化學(xué)試劑，直接采取膜分離(超濾)，簡(jiǎn)單易行，得到的酶制劑活力高，無需進(jìn)一步加工，可直接應(yīng)用，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；2.按本方法制得的褐藻膠裂合酶溫度穩(wěn)定性好，在0℃仍然能保證90％的酶活力，適合長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸與保藏；3.應(yīng)用由本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶生產(chǎn)褐藻寡糖，反應(yīng)條件溫和，作用時(shí)間短，專一性強(qiáng)，易于控制；4.按本發(fā)明能制備出同時(shí)具有降解多聚古羅糖醛酸(poly(G))和多聚甘露糖醛酸(poly(M))活性的褐藻膠裂合酶，用于具有褐藻膠生物膜的耐藥性病原菌，可恢復(fù)耐藥性病原菌對(duì)抗生素的敏感性。
用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶分子量為39Kd，其最適反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)pH范圍為5-10，同時(shí)具有降解多聚古羅糖醛酸(poly(G))及多聚甘露糖醛酸(poly(M))的活性，在0℃下保藏半年，活性保持90％。用本發(fā)明的方法制備的褐藻膠裂合酶同時(shí)具有降解poly(G)和poly(M)活性，其優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，決定了其應(yīng)用的良好前景。
用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶由褐藻膠生產(chǎn)褐藻寡糖時(shí)，將褐藻膠(平均分子量10000)配成重量百分濃度為1-5％的水溶液，按重量比1∶100的比例將褐藻膠裂合酶加入褐藻膠水溶液中，在30℃下培育8-16小時(shí)，可獲得聚合度為2-10的褐藻寡糖。其中褐藻膠裂合酶的用量為褐藻膠水溶液的1-5∶100(重量比)，酶解溫度為25-35℃，酶解反應(yīng)時(shí)間為8-16小時(shí)。用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶制備褐藻寡糖，反應(yīng)條件溫和，易于控制。并且根據(jù)酶解的時(shí)間不同，其產(chǎn)生的褐藻寡糖相應(yīng)的集中在不同范圍，在寡糖制備各方面明顯優(yōu)于化學(xué)和物理降解，適合于工業(yè)化生產(chǎn)褐藻寡糖。
用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶可用于恢復(fù)具有褐藻膠生物膜的耐藥性病原菌對(duì)抗生素的敏感性。選擇產(chǎn)生褐藻膠生物膜的耐藥性假單孢菌Pseudomonas sp.QDA，在含有氯霉素(100微克/毫升)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)8小時(shí)，刮取菌體，懸浮于生理鹽水中，使其OD值為0.6，按重量比5∶100的比例將本發(fā)明的褐藻膠裂合酶加入菌懸液中，30℃溫育2小時(shí)，13000g離心10分鐘，以生理鹽水洗滌菌體2-3次，重新懸浮于生理鹽水中，涂布含有氯霉素的LB培養(yǎng)基，觀察24小時(shí)，未發(fā)現(xiàn)有菌落生長(zhǎng)，證明本發(fā)明的褐藻膠裂合酶恢復(fù)了氯霉素抗性的Pseudomonas sp.QDA對(duì)氯霉素的敏感性。
本實(shí)施例中褐藻膠裂合酶的用量為菌體懸濁液用量的5-10％(按重量)，反應(yīng)溫度為25-35℃，反應(yīng)時(shí)間為2-4小時(shí)，所述的抗生素根據(jù)需要可以選擇氯霉素、四環(huán)素或氨芐青霉素等。
應(yīng)用本發(fā)明的方法得到的同時(shí)具有降解poly(G)和poly(M)活性的褐藻膠裂合酶有助于降解一些耐藥病原菌形成的生物膜中的褐藻膠，恢復(fù)病原菌對(duì)抗生素的敏感性。對(duì)于導(dǎo)致肺部囊性纖維化(CF)的銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aerugmosa)，其耐藥性機(jī)制與Pseudomonas sp.QDA相同，均為分泌胞外褐藻膠形成生物膜，從而產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥性。應(yīng)用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶與一定的抗生素聯(lián)用治療囊性纖維化(CF)患者肺部感染具有良好的開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一種褐藻膠裂合酶的制備方法，其特征是配制培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，以弧菌進(jìn)行接種，然后恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液除菌，超過濾，對(duì)上清液超濾濃縮，所述的弧菌為Vibriosp.QY101。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述的培養(yǎng)基含有褐藻酸鈉、MgSO4、FeSO4、(NH4)28O4、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaCl，它們的重量比例為1∶0.03-0.06∶0.03-0.06∶0.4-1∶0.6-1.5∶1-3∶2-6。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述的弧菌Vibrio sp.QY101與培養(yǎng)基的重量比1-5∶100。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述的滅菌的溫度為121-125℃。
5.由本發(fā)明的方法制備的褐藻膠裂合酶用于將褐藻膠酶解生產(chǎn)褐藻寡糖。
6.由本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶用于恢復(fù)耐藥性病原菌對(duì)抗生素的敏感性。
全文摘要
一種褐藻膠裂合酶的制備方法，其特征是配制培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，以弧菌進(jìn)行接種，然后恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液除菌，對(duì)上清液超濾濃縮；所述的弧菌為Vibrio sp.QY101。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)量高，提取無需試劑，直接采取超濾，簡(jiǎn)單易行，得到的酶制劑活力高，可直接應(yīng)用，適合工業(yè)生產(chǎn)；按本方法制得的褐藻膠裂合酶溫度穩(wěn)定性好，0℃下仍有90％的酶活力，適合長(zhǎng)時(shí)間保藏；應(yīng)用本方法制得的褐藻膠裂合酶生產(chǎn)褐藻寡糖，條件溫和，作用時(shí)間短，專一性強(qiáng)，易于控制；本發(fā)明制備的同時(shí)具有降解多聚古羅糖醛酸和多聚甘露糖醛酸活性的褐藻膠裂合酶，可恢復(fù)具有褐藻膠生物膜的耐藥性病原菌對(duì)抗生素的敏感性。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1445365SQ0311232
公開日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者于文功, 宋凱, 韓峰, 路新枝, 宮倩紅 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)