專利名稱：一種誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用胰島細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞具有相似發(fā)育機(jī)制的特點(diǎn)，分階段誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化，并將獲得的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)治療糖尿病的方法。
背景技術(shù)：
近幾年，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細(xì)胞來源不足、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)等困難卻極大的限制了這種療法的應(yīng)用。干細(xì)胞作為一類具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島細(xì)胞的新資源。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)易于分離培養(yǎng)擴(kuò)增，遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種中胚層組織細(xì)胞，還可跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞。利用神經(jīng)細(xì)胞與胰島細(xì)胞發(fā)育的相似性，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化是尋找胰島細(xì)胞來源的重要途徑。
近年來，隨著胚胎干細(xì)胞的建系，神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增方法的建立，胰腺干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增方法的建立等，使得體外操縱干細(xì)胞成為可能。另外，各種營養(yǎng)素和細(xì)胞因子功能的揭示，促胰腺增殖分化基因的發(fā)現(xiàn)與克隆等，又使我們可以在體外部分模擬體內(nèi)的胰腺發(fā)育微環(huán)境，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化、功能激活與調(diào)控及目的基因轉(zhuǎn)染等，以獲得大量胰島樣細(xì)胞，滿足臨床所需，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了一種新的模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細(xì)胞團(tuán)以用于糖尿病細(xì)胞治療的方法。采用以下技術(shù)方案1)分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度特性及粘附在培養(yǎng)皿上的特性，達(dá)到分離純化擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。
2)本發(fā)明的重要內(nèi)容是分兩階段誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化通過添加特異的神經(jīng)生長因子，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為nestin陽性的胰島干、祖細(xì)胞，再添加促進(jìn)胰島增殖分化的幾種重要因子誘導(dǎo)nestin陽性的細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。
3)將獲得的胰島樣細(xì)胞以一定數(shù)量植入糖尿病患者體內(nèi)(腎包囊下或經(jīng)肝門脈移植)，可以發(fā)揮一定的降血糖作用。
本發(fā)明的內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增無菌條件下，擠出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系統(tǒng)疾病胸外科手術(shù)后獲得；或由非血液系統(tǒng)疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓，約5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(GIBICO)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5mL完全培養(yǎng)液混勻后輕輕疊加到密度為1.073的percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細(xì)胞膜層以上的部分，加入完全培養(yǎng)液洗兩遍。按1×106/mL密度接種于完全培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后更換培養(yǎng)液，以后每4d換液一次。細(xì)胞達(dá)80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
實(shí)施例2、分兩階段誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化第一階段的誘導(dǎo)取培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按2×104/mL密度接種于6孔板中，每孔加2.5mL誘導(dǎo)液1。誘導(dǎo)液1的配方為添加10ng/mL或20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF，10ng/mL或20ng/mL表皮細(xì)胞生長因子EGF及2％B27的IMDM培養(yǎng)液。MSC經(jīng)誘導(dǎo)液1誘導(dǎo)3天后，逐漸分化為nestin陽性的胰腺干、祖細(xì)胞。此階段的細(xì)胞可以反復(fù)傳代培養(yǎng)幾周至幾月。第二階段的誘導(dǎo)取第一階段誘導(dǎo)分化出的nestin陽性的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗細(xì)胞，添加誘導(dǎo)液2。誘導(dǎo)液2的配方為添加10mmoL/L尼克酰胺，10ng/mLβ細(xì)胞調(diào)節(jié)素Betacellulin，10ng/mL活化素Activin A和10ng/mL肝細(xì)胞生長因子HGF或胰高糖素樣肽GLP-1 10nmol/L的2％B27的IMDM培養(yǎng)液(或添加一定葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)一周。
實(shí)施例3、胰島樣細(xì)胞團(tuán)的鑒定利用RT-PCR鑒定nestin，ngn3(neurogenin3)，IPF-1，胰島素，胰高血糖素基因的表達(dá)。利用primer 3軟件設(shè)計(jì)基因引物，序列如下

結(jié)果表明經(jīng)第一階段誘導(dǎo)的細(xì)胞(1周)強(qiáng)表達(dá)nestin及ngn3基因，微弱表達(dá)IPF-1，胰島素，胰高血糖素基因。第二階段誘導(dǎo)的細(xì)胞中nestin及ngn3基因的表達(dá)逐漸減弱至消失，高表達(dá)IPF-1，胰島素，胰高血糖素基因。
利用免疫組化鑒定nestin、胰島素、胰高血糖素抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示第一階段誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)nestin，第二階段誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)胰島素、胰高血糖素、生長抑素蛋白。
利用放射免疫分析法檢測胰島素水平。挑取第二階段誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)，置24孔板中，分3孔，每孔約90～100個(gè)細(xì)胞團(tuán)，直徑約150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液，置37℃孵箱中孵育1h。棄掉舊緩沖液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的細(xì)胞團(tuán)，加入酸乙醇溶液，4℃過夜，用細(xì)胞超聲破碎儀破細(xì)胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法檢測各上清中的胰島素含量。用BCA(Bicinchoninic acid)測定法檢測細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量。結(jié)果誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)在5.6mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反應(yīng)性。
實(shí)施例4、體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重約180-200g。按70mg/kg劑量給每只大鼠腹腔注射鏈脲霉素。鏈脲霉素粉劑用0.1M檸檬酸緩沖液(Ph＝4.5)配制成液體使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)大鼠血糖升高(≥16.7mmmol/L)且穩(wěn)定一周，表明糖尿病模型已經(jīng)建成。無菌條件下，向糖尿病大鼠腎包囊下或肝門脈小分支注入1000個(gè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)。術(shù)后，定期觀測血糖情況。
結(jié)果糖尿病大鼠在植入細(xì)胞后第二周時(shí)血糖平均下降5.6mmol/L。表明誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有一定的降血糖作用。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法，其特征在于利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化的特點(diǎn)，采用分兩階段誘導(dǎo)的方法獲得胰島樣細(xì)胞團(tuán)。
2.按照權(quán)利要求1的誘導(dǎo)分化方案，其特征在于利用胰島細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞具有相似的發(fā)育機(jī)制，采用一或兩種促神經(jīng)細(xì)胞生長的因子誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為nestin陽性的胰島干、祖細(xì)胞，即第一階段的誘導(dǎo)。
3.按照權(quán)利要求1的誘導(dǎo)分化方案，其特征在于獲得nestin陽性的胰島干、祖細(xì)胞后，采用三種促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)，即第二階段的誘導(dǎo)。
4.按照權(quán)利要求3的方案，其特征在于獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有一定的降血糖作用。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于糖尿病患者可以實(shí)現(xiàn)以自身細(xì)胞治療自身的疾病，使得部分糖尿病患者避免了異體細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。
全文摘要
一種誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細(xì)胞團(tuán)以用于糖尿病細(xì)胞治療的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1)分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；2)分階段誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，通過添加特異的生長因子，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為nestin陽性的胰島干、祖細(xì)胞，再添加促進(jìn)胰島增殖分化的因子誘導(dǎo)其分化為胰島樣細(xì)胞；3)將獲得的胰島樣細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)(腎包囊下或經(jīng)肝門脈移植)，可以發(fā)揮一定的降血糖作用。本發(fā)明為糖尿病細(xì)胞治療提供了新的胰島細(xì)胞來源，為糖尿病患者實(shí)現(xiàn)自體干細(xì)胞治療自身疾病奠定了基礎(chǔ)，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了一種新的模型。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1536075SQ0310926
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者裴雪濤, 李艷華, 謝超, 岳 文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸