專利名稱：繁縷總黃酮、制備方法、用途以及含有它的制劑的制作方法
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本發(fā)明涉及繁縷總黃酮、制備方法、用途以及含有繁縷總黃酮的制劑。
繁縷是石竹科植物Stellaria media(L.)Cyr.的干燥全草。歷代本草及書籍多處記載它有治療惡瘡、皮膚病的功效。《美國化學文摘》從1920年到2001年第134卷為止，所報道的繁縷屬植物的化學成分主要是黃酮及黃酮甙類、皂甙及皂甙原類、環(huán)縮氨酸類、阿魏酸及其酯類、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、奎寧酸、抗壞血酸類、草酸及草酸鈣、單?；肴樘穷愔铩⑸飰A類等等。CN 1377680A公開了一種廣譜抗病毒藥物的制備方法及其用途，它是從植物繁縷或其同屬植物中提取的含易溶于水的硫、氮、鈣的總有機酚酸或/和總有機酚酸鹽及其糖苷類大極性化合物的組合物，可以抑制艾滋病病毒、肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、皰疹病毒等?，F(xiàn)有文獻中還報導了有關繁縷與其它藥物組合制成治療濕疹的膏劑，皮膚再生的化妝品，也有繁縷預防脫發(fā)、牙槽炎、腸粘連疾病及用于口腔清潔等方面的用途。
本發(fā)明人按照植物化學的提取分離程序對繁縷屬植物進行提取分離，以抗皰疹病毒和艾滋病病毒的藥效學為指標進行篩選，發(fā)現(xiàn)繁縷總黃酮含有結構被確定為6-C-木糖-8-C-葡萄糖-芹黃素苷，即新西蘭牡荊甙-1(vicenin-1)，其結構如下圖。上述理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，與Yasukawa K，etal Yakugaku Zasshi 1986，106(6)517-519和蘇亞倫，王玉蘭，楊俊山 中草藥1993，24(7)343-344，378中報道的基本一致。
6-C-木糖-8-C-葡萄糖-芹黃素苷研究還發(fā)現(xiàn)繁縷總黃酮不僅具有抗皰疹病毒和艾滋病病毒的功效，并且毒副作用小，這是現(xiàn)有抗病毒西藥所不具備的最大優(yōu)點；與此同時它還具有良好的止痛作用，可很快減輕患者痛苦，又避免了西藥易產生耐藥毒株的缺點。從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的就是提供含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮。
本發(fā)明的又一個目的是提供制備含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮在制備治療抗病毒藥物的用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮作為活性成分的藥物。
本發(fā)明的又一個目的是提供含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮作活性成分的噴霧劑。
本發(fā)明所述的含新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮可以按照提取黃酮的常用方法從繁縷屬植物或其它屬植物中提取獲得的。它們包括繁縷屬植物薄葉繁縷Stellaria leptohylla Hance、長瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsine var.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellariaanhwiensis Migo.、細尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellaria arisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellariaborealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellariadavidii Hemsl.、沙生繁縷Stellaria arenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellariabrachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellariaarisanensis Hayata.、東北繁縷Stellaria cherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsineGrimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellariadichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.LanceolataBge.、西南繁縷Stellaria delavayi Franch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifoliaWilliams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.EtHook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotomavar.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressa Schnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellariaduthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellaria filicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellariadiversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipes Komar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellariamaximowixziana Franch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellariagyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellariahsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellaria media(L.)Cyr.、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitans Williams.、鵝腸繁縷Stellarianeglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellaria octandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellaria peduncularis Bge.、臺灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellaria turkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifoliaKitagawa.、假石生繁縷Stellaria pseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺繁縷Stellaria wutaica Hand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestris Hemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilis var.Amplexicaulis Hand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準葛爾繁縷Stellariasoongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellaria souliei Williams.、星毛繁縷Stellariastellato-pilosa Hayata.、園萼繁縷Stellaria stronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellaria uda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensisWilliams.、傘花繁縷Stellaria umbellate Turcz.、云南繁縷Stellaria yunnanensisfranch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachium aquaticum(L.)Fries。
優(yōu)選通過下列步驟獲得含新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮取繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量30～40％的低級醇，于提取罐中加溫到40～50℃減壓回流提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；向上述濃縮液中加入95％乙醇，使醇濃度達到60-70％，醇沉(醇沉物另用)，過濾得到濾液，將濾液濃縮，真空干燥，得干燥原料藥。
本發(fā)明所述的繁縷總黃酮的另外一種制備方法包括取繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量30～40％的低級醇，于提取罐中加溫到40～50℃提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓回收溶媒后再以減壓將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；將濃縮后的濾液上D101大孔樹脂床分離，以蒸餾水洗脫并棄去該部分洗脫液，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，對洗脫液采用薄層層析法用對照品新西蘭牡荊甙-I作對照進行監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液。該部分洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得繁縷總黃酮原料藥，其中總黃酮含量為50-90％。
本發(fā)明所述的繁縷總黃酮的又一種制備方法包括取繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量30～40％的低級醇，于提取罐中加溫到40～50℃減壓回流提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓回收溶媒將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；將濃縮的濾液上聚酰胺柱分離，先以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，對洗脫液采用薄層層析法用對照品新西蘭牡荊甙-I作對照進行監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液。該部分洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得繁縷總黃酮原料藥，其中總黃酮含量為70-90％。
其中的低級醇選自于乙醇、甲醇、異丁醇或正丁醇，優(yōu)選乙醇。
本發(fā)明所述的繁縷總黃酮具有抗病毒的活性，本發(fā)明所述的病毒包括艾滋病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒、腸道病毒、尖銳濕疣病毒、感冒病毒和腺病毒。本發(fā)明所述的繁縷總黃酮尤其對艾滋病病毒和皰疹病毒有較好的療效。所以本發(fā)明所述的繁縷總黃酮作為活性成分可以制備成藥物治療上述病毒所引起的疾病，其中的皰疹病毒還包括單純皰疹病毒-1、單純皰疹病毒-2和水痘-帶狀皰疹病毒。單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹病毒引起的疾病包括皮膚皰疹、性皰疹、眼角膜皰疹或水痘和帶狀皰疹。
本發(fā)明所述的繁縷屬總黃酮可以作為活性成分與藥學上可接收的載體或賦型劑制備成各種劑型，優(yōu)選外用劑型。這些劑型包括噴霧劑、乳劑、霜劑、膏劑、貼劑、滴眼劑、滴鼻劑、栓劑、膜劑等，優(yōu)選噴霧劑。
本發(fā)明所述的噴霧劑是由繁縷總黃酮作為活性成分和噴霧劑輔料組成。噴霧劑輔料優(yōu)選丙二醇、薄荷腦和乙醇。
本發(fā)明所述的噴霧劑中繁縷總黃酮的濃度可以是0.25-4％，優(yōu)選0.25％的濃度。取繁縷總黃酮加水分別配成0.25％、0.5％、1％、2％、4％的成品，其中尼泊金乙酯濃度為0.1％，丙二醇含量為10％，經(jīng)過藥效學篩選確定繁縷總黃酮的濃度為0.25％。
本發(fā)明所述的噴霧劑中所用的配液溶媒可以是水或20-75％濃度的乙醇。優(yōu)選40％乙醇。取總黃酮分別配成含量為4％、20％、40％、60％、75％乙醇溶液，其中水液中加入0.1％尼泊金乙酯，觀察各溶液的穩(wěn)定性、噴霧性、溶液揮發(fā)性，放置一段時間后，水液、20％乙醇溶液、40％乙醇溶液均較穩(wěn)定，而60％和70％乙醇配制成的溶液則均有明顯沉淀產生。水液與20％乙醇溶液由于醇含量較低，作為噴霧劑藥液噴于皮膚后不宜揮發(fā)、吸收，因此選擇最終配液濃度40％乙醇。
本發(fā)明所述的噴霧劑中所用的助溶劑可以是丙二醇、丙三醇，優(yōu)選丙二醇，更優(yōu)選20％丙二醇。分別添加20％丙二醇和20％丙三醇在40％乙醇溶液中，按照噴霧劑的評價方法用直觀分析方法分析試驗結果選擇合適的助溶劑，結果表明，不添加助溶劑的噴霧劑澄明度較好，溶液噴霧性較好，溶液噴于皮膚上分布均勻，但引濕性較差，皮膚觸感無粘性；以丙三醇為助溶劑配成的噴霧劑溶液渾濁，溶液噴霧性較好，溶液噴于皮膚上分布均勻，引濕性較好，皮膚觸感粘性較大；加丙二醇為助溶劑的噴霧劑溶液澄明度好，溶液噴霧性較好，溶液噴于皮膚上分布均勻，引濕性較好，皮膚觸感有輕微粘性?？梢姳甲鳛橹軇┡涑傻膰婌F劑溶液澄明度好，引濕性好，丙二醇粘度較小，毒性和刺激性較小，溶解性能良好，增加制劑的產品穩(wěn)定性，并且有一定的透皮吸收作用，可增強有效成分的吸收，提高療效。
助溶劑濃度可以選擇丙二醇10-30％，優(yōu)選10％。
本發(fā)明所述的噴霧劑任選可以加入芳香劑。優(yōu)先選用的芳香氣味的冰片和薄荷腦。
實施例1取200g繁縷用60％乙醇提取，揮去乙醇后，加500ml水溶解，以等量正丁醇萃取七次，合并萃取液，減壓回收正丁醇得含繁縷總黃酮。
實施例2取200g繁縷用60％乙醇提取，揮去乙醇后，加200ml水溶解，上已預處理過的大孔樹脂，先用水洗脫，水洗脫液棄去，再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，回收乙醇后，得到含繁縷總黃酮。
實施例3用8倍量的40％乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合并提取液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.10-1.15，上預處理的大孔樹脂柱，每10克大孔樹脂上樣0.8克，先用水洗脫，洗脫至水液近無色，紫外檢測無明顯吸收峰，再用40％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.25，干燥即得繁縷總黃酮。
實施例4取繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量40％的甲醇，于提取罐中加溫到40～50℃提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓回收溶媒后再以減壓將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；將濃縮的濾液上聚酰胺柱分離，先以蒸餾水洗脫，再以80％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，對洗脫液采用薄層層析法用對照品新西蘭牡荊甙-I作對照進行監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液。該部分洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得繁縷總黃酮原料藥，得率為1.73％，其中總黃酮含量為70-90％。
實施例5按照實施例4所述的方法，不同之處是用小花繁縷取代繁縷，得率為1.37％。
實施例6按照實施例4所述的方法，不同之處是用沙生繁縷取代繁縷，得率為1.18％。
實施例7
按照實施例4所述的方法，不同之處是用安徽繁縷取代繁縷，得率為1.69％。
實施例8按照實施例4所述的方法，不同之處是用多葉繁縷取代繁縷，得率為1.52％。
實施例9按照實施例4所述的方法，不同之處是用湖北繁縷取代繁縷，得率為1.39％。
實施例10按照實施例4所述的方法，不同之處是用薄葉繁縷取代繁縷，得率為1.70％。
實施例11按照實施例4所述的方法，不同之處是用華繁縷取代繁縷，得率為1.37％。
實施例12按照實施例4所述的方法，不同之處是用石竹葉繁縷取代繁縷，得率為1.59％。
實施例13取200g長瓣繁縷用60％乙醇提取，揮去乙醇后，加200ml水溶解，上已預處理過的大孔樹脂，先用水洗脫，水洗脫液棄去，再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，回收乙醇后，得到含繁縷總黃酮。
實施例14將長毛繁縷用8倍量的40％乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合并提取液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.10-1.15，上預處理的大孔樹脂柱，每10克大孔樹脂上樣0.8克，先用水洗脫，洗脫至水液近無色，紫外檢測無明顯吸收峰，再用40％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.25，干燥即得繁縷總黃酮。
實施例15取皺葉繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量40％的甲醇，于提取罐中加溫到40～50℃減壓回流提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；將濃縮的濾液上聚酰胺柱分離，先以蒸餾水洗脫，再以80％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，對洗脫液采用薄層層析法用對照品新西蘭牡荊甙-I作對照進行監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液。該部分洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得繁縷總黃酮原料藥，其中總黃酮含量為70-95％。
實施例16取200g展葉繁縷用60％乙醇提取，揮去乙醇后，加500ml水溶解，以等量正丁醇萃取七次，合并萃取液，減壓回收正丁醇得含繁縷總黃酮。
實施例17取200g臺灣繁縷用60％乙醇提取，揮去乙醇后，加200ml水溶解，上已預處理過的大孔樹脂，先用水洗脫，水洗脫液棄去，再用40％乙醇洗脫，收集40％乙醇洗脫液，回收乙醇后，得到含繁縷總黃酮。
實施例18取200g的云南繁縷用8倍量的40％乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合并提取液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.10-1.15，上預處理的大孔樹脂柱，每10克大孔樹脂上樣0.8克，先用水洗脫，洗脫至水液近無色，紫外檢測無明顯吸收峰，再用40％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至40℃測相對密度為1.25，干燥即得繁縷總黃酮。
實施例19取傘葉繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍量40％的甲醇，于提取罐中加溫到40～50℃減壓回流提取三次，每次1～3小時，合并提取液；減壓回收溶媒將提取物濃縮至40℃下測定密度為1.05-1.1的提取液；將濃縮的濾液上聚酰胺柱分離，先以蒸餾水洗脫，再以80％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，對洗脫液采用薄層層析法用對照品新西蘭牡荊甙-I作對照進行監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液。該部分洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥得繁縷總黃酮原料藥，其中總黃酮含量為70-90％。
實施例20噴霧劑的制備用40％的乙醇溶解實施例4中制備的繁縷總黃酮得到澄明均勻的溶液，再加入10％丙二醇作助溶劑和0.5％薄荷腦作芳香劑，配成溶液系統(tǒng)，然后將上述溶液溶入20-65％的拋射劑，裝入容器制成。
實施例21乳霜劑繁縷總黃酮5g加親水性乳劑基質至1000g，分裝成15g/支。用于健膚抗病毒。
實施例22凝膠劑取繁縷總黃酮2.5g、冰片10g和尼泊金乙酯1g，加水溶性基質至1000g，分裝成15g/瓶。用于單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹、尖銳濕疣等病毒性疾病的治療。
實施例23滴眼劑取繁縷總黃酮2.5g、尼泊金乙酯0.3g和氯化鈉5.6g，增溶劑適量，加注射用水1000ml，分裝成5ml/支。用于治療由病毒引起的角膜皰疹。
實施例24滴鼻劑取繁縷總黃酮3.0g和丙二醇200g，其它輔料適量配成1000ml，分裝成10ml/瓶，用于治療鼻粘膜單純皰疹。
實施例25栓劑取繁縷總黃酮5.0g、維生素E 10g和半合成脂肪酸酯1477g，制成1000枚。用于治療單純性皰疹-2型、尖銳濕疣等病毒性疾病。
實施例26膜劑取PVA17-8882g，加5-7倍量的蒸餾水，浸泡膨脹后移至水浴上加熱，使全部溶解后，另取二氧化鈦3g用膠體研磨后加入上清液中，攪勻，然后在攪拌下逐漸加入聚山梨酸酯-80 5g、甘油5g和繁縷總黃酮10g，制成10％乙醇溶液。攪拌均勻后放置過夜，除去氣泡，制成膜劑。每張含繁縷總黃酮0.5mg。用于治療單純性皰疹-2型、尖銳濕疣等病毒性疾病的治療。
試驗例1含新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮在細胞培養(yǎng)內對HIV-1、HSV-I、HSV-II和VZV病毒的抑制試驗在非洲綠猴腎細胞(VERO)和人胚肺二倍體細胞(2BS)培養(yǎng)內，檢測繁縷總黃酮抗水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)和單純皰疹病毒I型、II型(HSV-I、HSV-II)的作用。證明它具有體外抗上述三種病毒的作用。
采用病毒細胞病變(CPE)法和噻唑藍(MTT)染色法進行試驗，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。試驗分一次給藥組和三次給藥組，并重復三次。
1.1試驗1.1.1一次給藥組①病毒CPE法VERO細胞和2BS細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)24小時，分別加入HSV-I、HSV-II和VZV病毒的10-100TCID50的病毒液，每孔100μl，37℃吸附1小時，棄掉病毒液。加入藥液，均以藥物的最大無毒濃度二倍稀釋10個濃度，每濃度4孔，每孔100μl。即繁縷總黃酮為5000μg/ml、2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml、156.2μg/ml、78.1μg/ml、39.1μg/ml、19.5μg/ml、9.8μg/ml。無環(huán)鳥苷為2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml、156.3μg/ml、78.1μg/ml、39.1μg/ml、19.5μg/ml、9.8μg/ml、4.9μg/ml。同時設病毒對照和正常細胞對照，37℃、5％CO2培養(yǎng)5-7天，每24小時倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，至病毒對照細胞病變(CPE)出現(xiàn)“+++-++++”，計算IC50。
②病毒MTT染色法觀察細胞病變CPE結果后，加入MTT染色液每孔10μl，置37℃培養(yǎng)4小時，然后加入10％SDS 100μl使細胞裂解，裂解后用酶標儀波長570nm測定，記錄OD值，計算IC50。
1.1.2三次給藥組三次給藥組方法同一次給藥組。三次給藥組每24小時將舊藥液棄掉，重新加入同濃度藥液，病毒對照和細胞對照換維持液，連續(xù)三天。
1.2實驗結果1.2.1預備試驗結果藥物細胞的毒性作用繁縷總黃酮和陽性對照藥物無環(huán)鳥苷，在VERO細胞和2BS細胞培養(yǎng)內比較其對細胞的毒性結果見附表2.及附照1～14。
①繁縷總黃酮對VERO細胞的毒性結果驗證藥物繁縷總黃酮CPE法最大無毒濃度(TD0)為5000μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為7496.7μg/ml。MTT法最大無毒濃度(TD0)為5000μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為7811.4g/ml。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法最大無毒濃度(TD0)為2500μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為3878.7μg/ml。MTT法最大無毒濃度(TD0)為2500μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為3945.1μg/ml。
②繁縷總黃酮對2BS細胞的毒性結果驗證藥物繁縷總黃酮CPE法最大無毒濃度(TD0)為5000μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為7833.1μg/ml。MTT法最大無毒濃度(TD0)為5000μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為7750.6μg/ml。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法最大無毒濃度(TD0)為2500μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為3916.8μg/ml。MTT法最大無毒濃度(TD0)為2500μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為3892.8μg/ml。
在VERO和2BS細胞培養(yǎng)內測定HSV-I、HSV-II和VZV病毒半數(shù)感染量(TCID50)，采用病毒細胞病變CPE法①HSV-I病毒半數(shù)感染量(TCID50)為10-7②HSV-II病毒半數(shù)感染量(TCID50)為10-7③VZV病毒半數(shù)感染量(TCID50)為10-31.2.2正式試驗結果(見附表3)本發(fā)明所述的繁縷總黃酮和無環(huán)鳥苷在VERO和2BS細胞培養(yǎng)內對HSV-I、HSV-II型和VZV病毒的抑制作用。
1.2.2.1繁縷總黃酮對HSV-I型病毒的抑制作用①一次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為10.6μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為10.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為＜4.9μg/ml，治療指數(shù)(TI)為＞510.2。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為＜4.9μg/ml，治療指數(shù)(TI)為＞510.2。
②三次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜9.8μg/ml，最小有效濃度(MIC)為19.5μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256.4。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜9.8μg/ml，最小有效濃度(MIC)為19.5μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256.4。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為＜4.9μg/ml，治療指數(shù)(TI)為＞510.2。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為＜4.9μg/ml，治療指數(shù)(TI)為＞510.2。
1.2.2.2繁縷總黃酮對HSV-II型病毒的抑制作用①一次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為18.6μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為15.7μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。
②三次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為14.0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為13.8μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。
1.2.2.3繁縷總黃酮對VZV病毒的抑制作用①一次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為13.5μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為14.7μg/ml，最小有效濃度(MIC)為39.1μg/ml，治療指數(shù)(TI)為127.8。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。
②三次給藥組驗證藥物繁縷總黃酮CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為12.6μg/ml，最小有效濃度(MIC)為19.5μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256.4。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為12.8μg/ml，最小有效濃度(MIC)為19.5μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256.4。
陽性對照藥物無環(huán)鳥苷CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為＜4.9μg/ml，最小有效濃度(MIC)為9.8μg/ml，治療指數(shù)(TI)為255.1。以上試驗結果表明繁縷總黃酮在體外抗病毒藥效試驗(細胞培養(yǎng)內)中，采用病毒細胞病變CPE法和MTT法，證明它具有抗單純皰疹病毒I、II型和水痘-帶狀皰疹病毒的作用。
試驗例2含有新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮抗HIV-1的體外活性試驗1材料和方法病毒HIV-1018a是從AZT治療前的HIV-1感染的個體獲得。它由美國加州大學圣地亞哥分校的Douglas Richmen教授提供。
細胞外周血單核細胞(PBMC)使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法，從未感染HIV的健康供血者的外周血分離得到的。
試驗設計抗病毒活性的測定將2×105PBMC/100微升的含新西蘭牡荊甙-1的繁縷總黃酮暴露于用接種50微升的HIV-1的100TCID50。同時，給每個孔中加入各種濃度的新西蘭牡荊甙100微升。感染4天培后，取上清液測定p24抗原產生。按照操作說明通過完整病毒抗原捕獲ELISA(CoulterCorp.，Hialeah FL)復制來定量HIV-1p24抗原。
細胞毒性測定使用包括3H-胸腺嘧啶所測定的細胞增生描述可能的藥物細胞毒性作用。在含有各種濃度的新西蘭牡荊甙-1的96孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)4天后，將1μ Ci胸腺嘧啶(DuPont NEN，Boston MA)加入到2×105細胞/200微升培養(yǎng)基。加入3H-胸腺嘧啶后，在37℃培養(yǎng)6小時并測定3H-TdR。用SigmaPlot Scimtific Graphing System計算50％抑制濃度(IC50)和50％毒性濃度(TC50)，計算治療指數(shù)TI值＝TC50/IC50。
試驗結果HIV-1018a p24抗原產生(pg/ml)(感染后4天，用病毒將細胞感染2小時)
結論繁縷總黃酮對相同時間病毒接種的細胞的IC50為20.8μg/ml，TC50為475.5μg/ml，治療指數(shù)為22.8。繁縷總黃酮對HIV-1018a預感染PBMCs3小時的IC50為22.9μg/ml，TC50為475.5μg/ml，治療指數(shù)為20.8。
試驗例3本發(fā)明噴霧劑對小鼠陰道感染II型單純皰疹病毒的治療效果。
1.1試驗觀察指標(1)小鼠陰道感染HSV-II病毒后，引起病毒性陰道炎，局部紅腫，后肢癱瘓死亡，經(jīng)驗證藥物和陽性對照藥物治療后，計算其發(fā)病率，死亡率，平均生活日，藥物保護率和延長生命率與病毒對照組比較，并經(jīng)統(tǒng)計學處理，計算t值及P值，判斷治療效果。
(2)將治療前和治療后所取陰道棉拭子標本，制成1∶5的懸液在VERO細胞培養(yǎng)內采用細胞病變(CPE)法。觀察記錄試驗結果，以25％細胞病變記“+”以26％～50％細胞病變記“++”以51％～75％細胞病變記“+++”以76％～100％細胞病變記“++++”用Reed-Muench法計算50％感染劑量(TCID50)。試驗結果與病毒對照組比較，計算藥物對HSV-II的抑制率，判斷藥物治療效果。
1.1.1感染病毒BaIb/c鼠，雌性，18-20克，隨機分組，每組10只。將消毒1毫升注射器配自制的倒刺針頭，吸入HSV-II病毒液，旋轉插入小鼠陰道內多次劃傷陰道內壁，并同時注入10LD50病毒液0.03ml/只。
2.1.2藥物分組驗證藥物本發(fā)明噴霧劑選用以最大無毒劑量(TD0)以下二倍稀釋2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％，5個劑量組。
陽性對照藥物3％阿昔洛韋軟膏，1個劑量組。
同時設驗證藥物組對照，陽性藥物組對照(不感染病毒劃傷陰道內壁后，用藥涂抹)。
正常小鼠對照(不感染病毒，不用藥)。
病毒對照(感染病毒液為10LD50后，不用藥物治療)。
2.1.3藥物治療小鼠陰道感染HSV-II病毒后第3天出現(xiàn)病毒性陰道炎癥狀，表現(xiàn)為陰道紅腫，排尿困難等現(xiàn)象。隨即進行藥物治療，本發(fā)明噴霧劑藥物劑量選用毒性試驗的最大無毒濃度(TD0)以下的2％、1％、0.5％、025％、0.125％五個劑量組。陽性對照藥物3％阿昔洛韋軟膏。試驗采用棉簽粘藥液和藥膏在陰道內涂抹的方法，每組10只小鼠。每日二次，連續(xù)治療六天。另一組感染病毒后第3天出現(xiàn)病毒性陰道炎癥狀，用藥前取陰道棉拭子標本放在(裝有0.5毫升的生理鹽水的小塑料管中)置-25℃保存。隨即用驗證藥物和陽性對照藥物進行治療，每日二次，連續(xù)治療六天。停藥后1天再取陰道標本，(治療后)將所取標本制成1∶5的懸液在Vero細胞培養(yǎng)內分離測定病毒。試驗重復三次。
1.2實驗結果1.2.1本發(fā)明噴霧劑對小鼠病毒性陰道炎的治療效果(以保護率、延長生命率為指征，判斷藥效)小鼠經(jīng)陰道感染HSV-II病毒，病毒感染量為10LD50，每組10只。病毒感染后第3天出現(xiàn)病毒性陰道炎癥狀。隨即進行藥物治療，驗證藥物組選用以最大無毒劑量(TD0)以下二倍稀釋5個劑量組即2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％和3％阿昔洛韋藥膏1個劑量組，每日二次，連續(xù)治療6天。三次試驗結果見附表4。其藥物保護率(％)分別為63％、56％、48％、44％、30％，延長生命率(％)分別為59％、58％、55％、52％、45％，半數(shù)有效劑量(ED50)為0.89％。3％阿昔洛韋藥膏其保護率(％)為81％，延長生命率(％)為63％。兩種藥物經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異，P值＜0.01(除0.125％＜0.05外)。說明本發(fā)明噴霧劑具有體內抗II型單純皰疹病毒的作用，與病毒對照組比較效果顯著。依據(jù)上述試驗結果本發(fā)明噴霧劑的治療指數(shù)為32。
1.2.2本發(fā)明噴霧劑對小鼠病毒性陰道炎的治療效果(以試驗治療前后采取的小鼠陰道標本懸液在細胞培養(yǎng)內分離病毒測定TCID50的結果為指標，判斷藥效)小鼠陰道感染HSV-II病毒后，第三天出現(xiàn)明顯的病毒性陰道炎癥狀，進行藥物治療。治療前采取陰道棉試子標本，隨即用驗證藥物和陽性對照藥物進行治療，每日二次，連續(xù)治療六天。停藥后1天再取陰道標本，并制成1∶5的懸液在VERO細胞培養(yǎng)內，采用細胞病變(CPE)法，測定病毒滴度，以判斷藥效。三批試驗結果見附表5.本發(fā)明噴霧劑對小鼠陰道感染HSV-II病毒的抑制率(％)分別為73％、67％、63％、57％、40％。陽性對照藥物3％阿昔洛韋對小鼠陰道感染HSV-II病毒的抑制率(％)為90％。兩種藥物經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異，P值均＜0.01。說明本發(fā)明噴霧劑具有體內抗II型單純皰疹病毒的作用，與病毒對照組比較結果顯著。依據(jù)上述試驗結果本發(fā)明噴霧物劑的治療指數(shù)為32。
1.3小結根據(jù)試驗結果表明本發(fā)明噴霧劑劑量在0.25％以上具有抗II單純皰疹病毒的作用。
2.本發(fā)明眼藥水體內抗單純皰疹病毒藥效試驗(家兔眼角膜試驗)檢測不同濃度的本發(fā)明眼藥水對家兔病毒性角膜炎的治療效果，為臨床提供試驗依據(jù)。
2.1試驗2.1.1感染病毒家兔雄性，體重500～100克，隨機分組。感染前先用無菌的1％的卡因滴入家兔眼內，每只眼滴入0.04ml，約25秒鐘后眼球麻醉，使用消毒的眼角膜環(huán)鉆輕輕在眼角膜上劃痕，然后將100ID50的病毒感染家兔角膜，每只眼角膜0.2ml，每組5只家兔。病毒感染后第三天出現(xiàn)病毒性角膜炎癥狀，表現(xiàn)為眼角膜渾紅，眼瞼腫大，隨即進行藥物治療，驗證藥物選用外用藥物試驗的最大無毒濃度(TD0)以下的2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％五個劑量，每劑量組外用滴眼5只家兔，每眼滴入約0.15ml。陽性藥物阿昔洛韋1mg/ml，每眼滴2滴約0.15ml，外用滴眼5只家兔。每日二次，連續(xù)治療六天。同時設驗證藥物和陽性藥物對照(不給病毒，照常給藥，劑量同治療組)。同時設正常家兔眼角膜對照(不給病毒，滴生理鹽水)每眼滴入2滴，約0.15ml，滴眼5只家兔，同時設病毒對照(100ID50病毒量)5只家兔。另一組試驗于病毒感染后第三天取眼角膜棉拭子標本(標本放在裝有0.5ml的生理鹽水的塑料管中)置-25℃保存。隨即進行藥物治療，驗證藥物選用外用藥物試驗的最大無毒濃度以下的2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％五個劑量，每劑量組外用滴眼5只家兔，每眼滴入約0.15ml。陽性藥物阿昔洛韋1mg/ml，每眼滴2滴約0.15ml，外用滴眼5只家兔。每日二次，連續(xù)治療六天。停藥后第二天再取眼角膜標本。制成1∶5病毒懸液，在Vero細胞培養(yǎng)內，采用細胞變(CPE)法測定病毒滴度(TCID50)。試驗重復三次。
2.1.2試驗觀察2.1.2.1家兔I型單純皰疹病毒滴眼，引起病毒性角膜炎，隨即采用藥物治療，每日二次，連續(xù)治療六天，計錄每日病損程度與病毒對照組比較，計算保護率，并經(jīng)統(tǒng)計學處理以X值P值判斷效果。
2.1.2.2家兔I型單純皰疹病毒滴眼，引起病毒性角膜炎，于病毒感染后第三天(用藥前)和停藥后第二天(治療后)分別采取眼角膜棉拭子標本，并制成1∶5病毒懸液，在Vero細胞培養(yǎng)內，采用細胞變(CPE)法測定病毒滴度(TCID50)。(見附表6)與病毒對照組比較，計算藥物對皰疹病毒的抑制率，并經(jīng)統(tǒng)計學處理，以X值P值判斷效果。
2.2實驗結果2.2.1本發(fā)明眼藥水對家兔眼角膜感染單純皰疹病毒藥效試驗結果。
家兔經(jīng)100ID50病毒滴入損傷角膜，三天后引起病毒性角膜炎，隨即進行藥物治療，驗證藥物選用外用藥物試驗的最大無毒濃度以下的2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％五個劑量，每劑量組外用滴眼5只家兔，每眼滴入約0.15ml。陽性藥物阿昔洛韋1mg/ml，每眼滴2滴約0.15ml，外用滴眼5只家兔。每日二次，連續(xù)治療六天。計錄每日病損程度與病毒對照組比較，計算保護率，并經(jīng)統(tǒng)計學處理以X值P值判斷效果。三次試驗結果見表明不同濃度的本發(fā)明眼藥水對家兔眼角膜感染HSV-I病毒的保護率(％)分別為100％、100％、100％、93％、40％。陽性對照藥物阿昔洛韋對家兔眼角膜感染HSV-I病毒的保護率(％)為100％。兩種藥物經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異。P值＜0.01。說明本發(fā)明眼藥水濃度在0.25％以上具有抗I型單純皰疹病毒的作用。與病毒對照組比較其結果顯著。
2.2.2本發(fā)明眼藥水對家兔眼角膜感染單純皰疹病毒藥效試驗結果。
家兔經(jīng)100ID50病毒滴入損傷角膜，病毒感染后三天(用藥前)和停藥后第二天(治療后)分別采取眼角膜棉拭子標本。并制成1∶5病毒懸液，在Vero細胞培養(yǎng)內，采用細胞變(CPE)法測定病毒滴度(TCID50)。與病毒對照組比較，計算藥物對皰疹病毒的抑制率，并經(jīng)統(tǒng)計學處理，以X值P值判斷效果。三次試驗結果(見附表8)不同濃度的本發(fā)明眼藥水對家兔眼角膜感染HSV-I病毒的保護率(％)分別為100％、100％、100％、100％、13％。陽性對照藥物阿昔洛韋對家兔眼角膜感染HSV-I％、100％、13％。陽性對照藥物阿昔洛韋對家兔眼角膜感染HSV-I病毒的保護率(％)為100％。兩種藥物經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異。P值＜0.01。說明本發(fā)明眼藥水濃度在0.25％以上具有抗I型單純皰疹病毒的作用。與病毒對照組比較其結果顯著。
2.3小結根據(jù)試驗結果表明不同濃度本發(fā)明眼藥水具有抗I型單純皰疹病毒的作用。
3本發(fā)明噴霧劑體內抗單純皰疹I型病毒藥效試驗檢測本發(fā)明噴霧劑對豚鼠皮膚感染I型單純皰疹病毒藥效試驗，為臨床應用提供試驗依據(jù)。
3.1預備試驗3.1.1藥物毒性測定根據(jù)本發(fā)明噴霧劑對動物皮膚毒性試驗結果，其最大無毒濃度大于5g/kg。
3.1.2 I型單純皰疹病毒(HSV-I，SM44株)病毒毒力測定先用脫毛劑(8％Bas)將豚鼠背部皮膚(4cm2)脫毛，再用37℃溫水將皮膚洗凈拭干，然后用“梅花針”重刺已脫毛的皮膚，將已刺過的皮膚分成4份(每塊皮膚的面積為1cm2)。將新制備的細胞病毒懸液用生理鹽水稀釋5個濃度，即10-0、10-1、10-2、10-3、10-4，每濃度5只。每塊皮膚用30μl的病毒液涂抹感染皮膚。觀察14天，同時設正常豚鼠對照。以Reed Muench法計算半數(shù)感染量(LD50)。試驗重復三次。
3.2正式試驗本發(fā)明噴霧劑對豚鼠皮膚感染I型單純皰疹病毒的療效測定①豚鼠分組按性別、體重平均分組，每組10只。先用脫毛劑(8％Bas)將豚鼠背部皮膚(4cm2)脫毛，再用37℃溫水將皮膚洗凈拭干，然后用“梅花針”重刺已脫毛的皮膚，將已刺過的皮膚分成4份(每塊皮膚的面積為1cm2)，每塊皮膚用30μl的HSV-I病毒原液涂抹感染皮膚。
②感染病毒后第4天，豚鼠背部皮膚即出現(xiàn)典型的皰疹病灶，面積達3.6-4.0cm2(見附照)。隨既用本發(fā)明噴霧劑進行治療，本發(fā)明噴霧劑藥物選用對動物的外用皮膚試驗的最大無毒濃度(TD0)以下二倍稀釋4個劑量，既2％、1％、0.5％、0.25％和3％阿昔洛韋軟膏噴灑和涂抹皮膚皰疹處，每日治療四次，連續(xù)治療6天。
③同時設病毒對照組(感染病毒后不給藥)及正常豚鼠對照組(不感病毒用生理鹽水)試驗重復三次。
3.3試驗結果藥物治療效果觀察指標
用藥后每日觀察記錄豚鼠背部皮膚皰疹病灶的變化情況，記錄標準如下皮膚皰疹病灶面積為1/4時，病變程度(cm2)記1.0-1.6皮膚皰疹病灶面積為2/4時，病變程度(cm2)記1.8-2.4皮膚皰疹病灶面積為3/4時，病變程度(cm2)記2.6-3.2皮膚皰疹病灶面積為4/4時，病變程度(cm2)記3.4-4.0皮膚皰疹結痂達1/4為記，病變程度(cm2)記0.8-1.0皮膚皰疹結痂達2/4為記，病變程度(cm2)記0.6 0.8皮膚皰疹結痂達3/4為記，病變程度(cm2)記0.4 0.6皮膚皰疹結痂達4/4為記，病變程度(cm2)記0.2 0.4皮膚皰疹脫痂痊愈記03.3.1預備試驗結果藥物毒性測定本發(fā)明噴霧劑藥物對動物皮膚外用藥的最大無毒濃度為大于5g/kg。
病毒毒力測定I型單純皰疹病毒(HSV-I)，經(jīng)對豚鼠皮膚感染試驗測定，半數(shù)感染量(LD50)為10-0.5，藥效試驗時用病毒原液。
3.3.2正式試驗結果3.3.2.1.本發(fā)明噴霧劑對豚鼠皮膚感染單純皰疹病毒I型的治療效果豚鼠背部皮膚感染HSV-1皰疹病毒后，第2天即出現(xiàn)1cm2左右的皰疹病灶，第3天達到2-3cm2左右，第4天時病灶面積已達到3.8cm2左右，隨即用不同劑量的本發(fā)明噴霧劑藥物進行治療。本發(fā)明噴霧劑藥物選用對動物的外用皮膚試驗的最大無毒濃度(TD0)以下二倍稀釋4個劑量，既2％、1％、0.5％、0.25％和3％阿昔洛韋軟膏噴灑和涂抹皮膚皰疹處，每日治療四次，連續(xù)治療6天。停藥后再觀察2天。試驗結果見附表9及附照25～33，本發(fā)明噴霧劑治療組與病毒對照組比較其病變抑制率(％)分別為100％、100％、100％、81％。經(jīng)統(tǒng)計學處理本發(fā)明噴霧劑劑量在0.25％以上有明顯的治療作用，P值＜0.01。
3.3.2.2.阿昔洛韋軟膏對豚鼠皮膚感染單純皰疹病毒I型的治療效果阿昔洛韋軟膏對豚鼠皮膚皰疹的病變抑制率為100％。
3.3.2.3.病毒對照組豚鼠背部皮膚感染HSV-1病毒后，第4天背部皮膚即出現(xiàn)典型皰疹病灶，其病變程度達3.8cm2左右，第5-7天病變程度達4.0cm2，并拌有大面積潰爛，及少數(shù)(6只)豚鼠出現(xiàn)下肢癱瘓，說明有個別豚鼠病毒感染較重，病毒已侵及下肢神經(jīng)。
3.3.3試驗結果分析本發(fā)明噴霧劑藥物與病毒對照組比較，用藥第2天，豚鼠的皮膚皰疹即有所減輕，用藥第3天皮膚皰疹的病變程度(面積)已由3.6cm2縮小到2.0cm2左右，用藥第4天皰疹病灶開始干癟，并出現(xiàn)結痂，用藥第6天皰疹病灶部位已全部結痂病變程度(面積)已縮小到0.7cm2左右，皮膚皰疹基本痊愈。而病毒對照組試驗第5-7天其病變程度(面積)已發(fā)展到4.0cm2，第9天皰疹病灶面積雖也逐漸減小，但病程時間長。陽性對照藥物阿昔洛韋軟膏的試驗結果與本發(fā)明噴霧劑的試驗結果一致。
3.4小結根據(jù)試驗結果表明不同劑量的本發(fā)明噴霧劑對豚鼠背部皮膚皰疹有明顯的治療作用，與陽性對照藥物阿昔洛韋軟膏的試驗結果一致。證明此藥有明顯的抗I型單純皰疹病毒的作用。連續(xù)治療六天，不僅能夠降低發(fā)病率，而且可明顯縮短皮膚感染的病程，與病毒對照組比較有顯著性的療效。
權利要求
1.繁縷總黃酮，含有新西蘭牡荊甙-1，其特征在于它可以用下列方法獲得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收溶媒濃縮提取液至40℃測定密度為1.05-1.1。
2.按照權利要求1所述的繁縷總黃酮，其特征在于向權利要求1所得的繁縷總黃酮濃縮液中加乙醇使醇濃度達到60-70％，醇沉(沉淀物另用)，過濾，濾液濃縮，真空干燥，得到。
3.按照權利要求1所述的繁縷總黃酮，其特征在于將權利要求1的提取濃縮液上大孔樹脂床分離，以蒸餾水洗脫，棄去水洗脫液再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，以新西蘭牡荊甙-I作對照對洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃以下真空干燥，得到。
4.按照權利要求1所述的繁縷總黃酮，其特征在于將權利要求1所述的提取濃縮液上聚酰胺柱分離，以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時，以新西蘭牡荊甙-I作對照對洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對應色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃以下真空干燥，得到。
5.權利要求1-4中任何一項所述的繁縷總黃酮，其中低級醇為乙醇、甲醇、異丁醇或正丁醇。
6.權利要求1-5中任何一項所述的繁縷總黃酮，還可以從下列植物中提取得到繁縷屬植物薄葉繁縷Stellaria leptohyllaHance、長瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellariaalsine var.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensisMigo.、細尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellaria arisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellaria borealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellaria arenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensisRegel.、阿里山繁縷Stellaria arisanensis Hayata.、東北繁縷Stellariacherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsine Grimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioidesWilliams.、窄葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayi Franch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifoliaWilliams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.Et Hook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellariadichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversifloraMaxim.、凹脈繁縷Stellaria depressa Schnid.、翻白繁縷Stellariadiscolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellariadiffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellaria filicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipes Komar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellariagraminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixziana Franch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellaria gyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryiWilliams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellaria media(L.)Cyr、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內曲繁縷Stellaria infractaMaxim.、柔繁縷Stellaria mitans Williams.、鵝腸繁縷Stellarianeglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellaria octandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoidesKomar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellariapeduncularis Bge.、臺灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellaria turkestanicaSchischk.、展葉繁縷Stellaria patentifolia Kitagawa.、假石生繁縷Stellaria pseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺繁縷Stellaria wutaicaHand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellariarupestris Hemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilis var.AmplexicaulisHand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorpha Nakai.、小繁縷Stellariapusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準葛爾繁縷Stellariasoongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellaria souliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosa Hayata.、園萼繁縷Stellaria stronglosepalaHand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellaria uda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellariaumbellate Turcz.、云南繁縷Stellaria yunnanensis franch.j。
7.權利要求1-6中任何一項所述的繁縷總黃酮在制備治療艾滋病病毒和皰疹病毒I型，皰疹病毒II型和水痘帶狀皰疹的藥物的用途。
8.一種治療艾滋病病毒和皰疹病毒I型，皰疹病毒II型和水痘帶狀皰疹的藥物，它含有權利要求1-6所述的繁縷總黃酮作為活性成分和/或藥學上可接受的載體或賦型劑。
9.按照權利要求8所述的藥物，其中所含的繁縷總黃酮為0.25-4％。
10.按照權利要求9所述的藥物，其中所含的繁縷總黃酮為0.25％。
11按照權利要求8-10中任何一項所述的藥物，它是噴霧劑。
12.按照權利要求11所述的噴霧劑，其中它用20-75％的乙醇作配液溶液。
13.按照權利要求12所述的噴霧劑，其中它用40％的乙醇作配液溶液。
14.按照權利要求11-13中的任何一項所述的噴霧劑，其中它含有助溶劑丙二醇。
15.按照權利要求14所述的噴霧劑，其中它所含的丙二醇濃度是10％。
16.按照權利要求8-15中任何一項所述的噴霧劑，其中它還含有0.5％的薄荷腦。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有新西蘭牡荊甙－1的繁縷總黃酮、繁縷總黃酮的提取方法及其在制備抗艾滋病病毒和皰疹病毒的藥物的用途。本發(fā)明還公開了含有繁縷總黃酮的各種藥物劑型，尤其是含有繁縷總黃酮的噴霧劑。
文檔編號A61P31/00GK1521179SQ03103609
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權日2003年1月30日
發(fā)明者樓金, 張龍清, 張興權, 樓 金 申請人:海南亞洲制藥有限公司