專利名稱:用于預(yù)防和治療早老性癡呆和淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗的制作方法
背景技術(shù):
本發(fā)明涉及基于新型立體化學(xué)的“非自身”抗原疫苗,以預(yù)防和/或治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。
淀粉狀蛋白病涉及特征為存在淀粉狀蛋白纖維的病理病癥。淀粉狀蛋白是通用術(shù)語(yǔ),是指一組不同的但在許多不同疾病中所見(jiàn)到的特異性蛋白沉積(胞內(nèi)和/或胞外)。雖然其存在不同,但是所有淀粉狀蛋白沉積都具有共同的形態(tài)特征,被特定染料(例如剛果紅)染色并且具有染色后在偏振光中出現(xiàn)特征性紅綠雙折射。它們也享有共同的超微結(jié)構(gòu)特征和共同的X射線衍射和紅外光譜。
淀粉狀蛋白相關(guān)疾病可以或者局限于一種器官或者散布至數(shù)種器官。第一種情況被稱為“局限性淀粉狀蛋白病”,而第二種情況則被稱為“系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病”。
某些淀粉狀蛋白性疾病可以是特發(fā)性的,但這些疾病中的大多數(shù)似乎為之前已存在疾病的并發(fā)癥。例如,原發(fā)性淀粉狀蛋白病可以在無(wú)任何其它病理的情況下發(fā)生或者可以在漿細(xì)胞性惡液質(zhì)或多發(fā)性骨髓瘤之后發(fā)生。繼發(fā)性淀粉狀蛋白病通常見(jiàn)到與慢性感染(例如結(jié)核病)或慢性炎癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)相關(guān)。家族性形式的繼發(fā)性淀粉狀蛋白病也在家族性地中海熱(FMF)中見(jiàn)到。該家族性形式的淀粉狀蛋白病,同其它類型的家族性淀粉狀蛋白病之一一樣,在遺傳學(xué)上是可遺傳的并且在特定的人群中被發(fā)現(xiàn)。在這兩種類型的淀粉狀蛋白病中,在數(shù)種器官中發(fā)現(xiàn)沉積,并因此認(rèn)為是系統(tǒng)性淀粉狀蛋白性疾病。在長(zhǎng)期血透患者中發(fā)現(xiàn)另一種類型的系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病。在這些情況的每種情況下,一種不同的成淀粉樣蛋白涉及淀粉狀蛋白沉積。
“局限性淀粉狀蛋白病”是往往涉及一個(gè)器官系統(tǒng)的那些疾病。不同的淀粉狀蛋白的特征也在于沉積中存在的蛋白類型。例如羊瘙癢病、牛海綿狀腦病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)等神經(jīng)變性性疾病的特征為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中出現(xiàn)并累積蛋白酶抗性形式的朊病毒蛋白(稱為AScr或PrP-27)。同樣,早老性癡呆(另一種神經(jīng)變性性疾病)的特征為神經(jīng)炎性病斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。在這種情況下,由于原纖維Aβ淀粉狀蛋白的沉積而形成所述病斑和血管淀粉狀蛋白。其它疾病例如成年發(fā)病型糖尿病(II型糖尿病)的特征為淀粉狀蛋白在胰臟中局部累積。
一旦形成了這些淀粉狀蛋白,則沒(méi)有已知的廣泛認(rèn)可的顯著原位溶解所述沉積的療法或治療。
各種成淀粉樣蛋白具有組構(gòu)成多個(gè)β折疊并且在胞內(nèi)或胞外沉積以形成不溶性原纖維的能力。各種成淀粉樣蛋白雖然在氨基酸序列方面不同,但是都具有相同的形成原纖維并結(jié)合于其它元件例如蛋白聚糖、淀粉狀蛋白P和補(bǔ)體組分的特性。此外,各種成淀粉樣蛋白的氨基酸序列雖然不同但是仍將顯示相似性,例如具有能夠結(jié)合于蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)部分(稱為GAG結(jié)合部位)的區(qū)域以及將啟動(dòng)β折疊形成的其它區(qū)域。
在特定的情況下,淀粉狀蛋白性原纖維一旦沉積則可能變成對(duì)周圍細(xì)胞有毒性。作為每一實(shí)例,已經(jīng)表明,以老年斑形式存在的Aβ原纖維與早老性癡呆患者的神經(jīng)元細(xì)胞死亡和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生有關(guān)。當(dāng)在體外進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),顯示Aβ肽能夠觸發(fā)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(腦巨噬細(xì)胞)的活化過(guò)程,這將解釋早老性癡呆患者腦中發(fā)現(xiàn)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和腦部炎癥的存在。
在II型糖尿病患者中所見(jiàn)到的另一種類型的淀粉狀蛋白病中,已經(jīng)表明成淀粉樣蛋白IAPP在體外誘導(dǎo)β-胰島細(xì)胞毒性。因此,IAPP原纖維在II型糖尿病患者胰臟中的出現(xiàn)可以引起β胰島細(xì)胞(郎格罕氏島(Langerhans))的喪失和器官機(jī)能障礙。
早老性癡呆病人在成年時(shí)發(fā)生進(jìn)行性癡呆,并在腦中伴隨有三種主要的結(jié)構(gòu)改變神經(jīng)元在腦的多個(gè)部位中彌散性喪失;胞內(nèi)蛋白沉積的累積,稱為神經(jīng)纖維纏結(jié);和胞外蛋白沉積的累積,稱為淀粉狀蛋白性病斑或老年斑,被畸形神經(jīng)末稍所包圍(營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突)。這些淀粉狀蛋白性病斑的主要成分是淀粉狀蛋白-β肽(Aβ)即通過(guò)β-淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的切割所產(chǎn)生的40-42個(gè)氨基酸的蛋白。雖然對(duì)早老性癡呆進(jìn)行對(duì)癥治療,但是該病目前既不可預(yù)防也不可治愈。
應(yīng)用疫苗治療早老性癡呆原則上是可行的(Schenk,D.等,(1999)Nature 400,173-177)。Schenk等表明,在腦淀粉狀蛋白病(如在早老性癡呆中所見(jiàn)到的)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,用Aβ肽免疫抑制淀粉狀蛋白性病斑和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突的形成。在該項(xiàng)研究中,用人聚集全-L肽作為免疫原的疫苗在接種疫苗的轉(zhuǎn)基因小鼠中防止β-淀粉狀蛋白性病斑的形成、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)不良。
然而,顯而易見(jiàn)的是,應(yīng)用內(nèi)源蛋白作為疫苗(或待免疫動(dòng)物中天然存在的蛋白)有許多缺陷。這些缺陷中的某些包括·可能發(fā)生自身免疫病,由于產(chǎn)生針對(duì)“自身”蛋白的抗體。
·難以激發(fā)免疫應(yīng)答,由于宿主免疫系統(tǒng)不能突破耐受性。
·可能發(fā)生腦部急性炎癥反應(yīng),由于小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抗體介導(dǎo)的吞噬作用。
·產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及基于立體化學(xué)的“非自身”抗原疫苗,以預(yù)防和/或治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種用于預(yù)防和治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗,該疫苗克服了與應(yīng)用天然存在的肽、蛋白或免疫原例如原纖維蛋白(例如β淀粉狀蛋白)相關(guān)的缺陷。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“原纖維和/或淀粉狀蛋白肽”包括本文中所討論的單體、寡聚體和可溶性β-淀粉狀蛋白或任何原纖維蛋白以及可以天然存在的、合成構(gòu)建的或相當(dāng)于已知原纖維蛋白的任何其它結(jié)構(gòu)變異體。具體地說(shuō),原纖維和/或淀粉狀蛋白肽由來(lái)自原纖維肽例如淀粉狀蛋白或其任何結(jié)構(gòu)變異體的至少3個(gè)氨基酸組成。本文所用的術(shù)語(yǔ)“相當(dāng)于”是指多核苷酸序列與參比多核苷酸序列的全部或一部分同源(即相同,在進(jìn)化上不緊密相關(guān)的),或者多肽序列與參比多肽序列相同。截然相反的是,本文所用的術(shù)語(yǔ)“與……互補(bǔ)”是指互補(bǔ)序列與參比多核苷酸序列的全部或一部分同源。舉例說(shuō)明,核苷酸序列″TATAC″相當(dāng)于參比序列″TATAC″,而與參比序列″GTATA″互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)“淀粉狀蛋白相關(guān)疾病”包括與或者可溶性形式或者不溶性(病斑)形式的淀粉狀蛋白累積相關(guān)的疾病,所述疾病可以或者局限于一種器官即“局限性淀粉狀蛋白病”或者散布至數(shù)種器官即“系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病”。繼發(fā)性淀粉狀蛋白病可能與慢性感染(例如結(jié)核病)或慢性炎癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)相關(guān),包括也在家族性地中海熱(FMF)中所見(jiàn)到的家族性形式的繼發(fā)性淀粉狀蛋白病。在長(zhǎng)期血透患者中發(fā)現(xiàn)另一種類型的系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病。局限性形式的淀粉狀蛋白病包括但不限于II型糖尿病及其任何相關(guān)障礙、神經(jīng)變性性疾病例如羊瘙癢病、牛海綿狀腦病、克-雅病、早老性癡呆、腦淀粉狀蛋白性血管病和朊病毒蛋白相關(guān)疾病。
本發(fā)明的疫苗可以用于預(yù)防和/或治療淀粉狀蛋白相關(guān)疾病,并且可以用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的藥物。如本文中所述,原纖維肽或蛋白可以衍生自已知與某些形式的淀粉狀蛋白性疾病相關(guān)的原纖維前體蛋白。這樣的前體蛋白包括但不限于血清淀粉狀蛋白A蛋白(ApoSAA)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、ApoAl、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原α鏈、凝溶膠蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、淀粉狀蛋白β蛋白前體(β-APP)、β2微球蛋白、朊病毒前體蛋白(PrP)、心房鈉尿因子、角蛋白、胰島淀粉狀蛋白多肽、肽類激素和synuclein。這樣的前體也包括這類前體的突變蛋白、蛋白片段和蛋白水解肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,關(guān)于原纖維前體蛋白,所述肽有效誘導(dǎo)針對(duì)由成淀粉樣蛋白或肽所形成的表位的免疫應(yīng)答。也就是說(shuō),正如本文中更詳細(xì)地描述一樣,許多形成原纖維的肽或蛋白是這類前體蛋白的片段,例如以上列舉的那些片段。當(dāng)例如通過(guò)蛋白酶切割形成這樣的片段時(shí),可以揭示出在所述前體上并不存在表位,因此當(dāng)該片段是前體蛋白的一部分時(shí),該表位在免疫學(xué)上不可用于免疫系統(tǒng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述肽有效誘導(dǎo)由針對(duì)成淀粉樣蛋白或肽所形成的表位的免疫應(yīng)答。成淀粉樣蛋白或肽與淀粉狀蛋白肽或蛋白同義,包括能夠形成原纖維、病斑或淀粉狀蛋白沉積的蛋白或肽。如本文中所述,術(shù)語(yǔ)“Aβ”、“Aβ肽”、“β-淀粉狀蛋白肽”和“淀粉狀蛋白β肽”是同義語(yǔ),是指衍生自β淀粉狀蛋白前體蛋白(β-APP)的約38-43個(gè)氨基酸的一種或多種肽組合物。解聚的Aβ是指Aβ的可溶性單體和寡聚體肽單位。單體Aβ的一種制備方法是用超聲處理將凍干肽溶于純DMSO中。將所得的溶液離心,以去除任何不溶性微粒。聚集的Aβ是其中單體單位通過(guò)非共價(jià)鍵連接在一起的寡聚體的混合物。此外,APP695、APP751和APP770分別指由人APP基因編碼的長(zhǎng)695個(gè)、751個(gè)和770個(gè)氨基酸殘基的多肽。參見(jiàn)Kang等,Nature 325,773(1987);Ponte等,Nature 331,525(1988);和Kitaguchi等,Nature 331,530(1988)。人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)中的氨基酸的編號(hào)依照APP770同種型的序列的編號(hào)指定。術(shù)語(yǔ)例如Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43分別指含有氨基酸殘基1-39、1-40、1-41、1-42和1-43的Aβ肽。優(yōu)選Aβ肽含有氨基酸殘基10-21。更優(yōu)選所述Aβ肽含有氨基酸殘基13-21。
因此,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種用根據(jù)非天然D-構(gòu)型氨基酸合成的“非自身”肽或蛋白產(chǎn)生的疫苗,以避開(kāi)使用“自身”蛋白的缺陷。與現(xiàn)有技術(shù)的疫苗相反,所述肽不需要聚集成可操作性的或免疫原性的。因此,“免疫原性肽”、 免疫原”或“抗原”是能夠在給予患者后(加有或不加佐劑)誘導(dǎo)針對(duì)本身的免疫應(yīng)答的分子。這樣的分子包括例如與載體蛋白綴合的成淀粉樣肽或其片段,所述載體蛋白例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、C3d、多糖、牛血清白蛋白(BSA)、破傷風(fēng)類毒素、熱激蛋白(HSP)、卵清蛋白或霍亂毒素。
術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”或“免疫原性應(yīng)答”是指在脊椎動(dòng)物個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)抗原的體液(抗體介導(dǎo)的)和/或細(xì)胞(由抗原特異性T細(xì)胞或其分泌物介導(dǎo)的)應(yīng)答。這樣的應(yīng)答可以是由給予免疫原所誘導(dǎo)的主動(dòng)應(yīng)答或者是由給予抗體或可以作為抗原呈遞細(xì)胞起作用的免疫細(xì)胞例如致敏T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞NK或NKT細(xì)胞或致敏樹(shù)突細(xì)胞所誘導(dǎo)的被動(dòng)應(yīng)答。通過(guò)呈遞與I類或II類MHC分子締合的多肽表位以激活抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞,從而激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。所述應(yīng)答也可以包括激活免疫細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或先天免疫的其它組分。通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)增殖測(cè)定(CD4+T細(xì)胞)或CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)測(cè)定,可以測(cè)定細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的存在。通過(guò)從免疫的第一種哺乳動(dòng)物中獨(dú)立地分離出免疫球蛋白(IgG)和T細(xì)胞部分并且測(cè)量在第二個(gè)受治療者中的保護(hù)或治療效應(yīng),可以分辨體液應(yīng)答或細(xì)胞應(yīng)答對(duì)免疫原的保護(hù)或治療效應(yīng)的相對(duì)貢獻(xiàn)。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以互換使用,是指具有支持堿基通過(guò)氫鍵與典型多核苷酸連接的骨架的聚合分子,其中聚合物骨架中的堿基以允許在聚合分子和典型多核苷酸(例如單鏈DNA)之間以序列特異性方式通過(guò)這樣的氫鍵連接的方式存在。這樣的堿基通常是肌苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷。聚合分子包括雙鏈和單鏈RNA和DNA及其骨架修飾物例如甲基膦酸酯鍵。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指由通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基的單鏈構(gòu)成的化合物。術(shù)語(yǔ)“蛋白”可以與術(shù)語(yǔ)“多肽”同義,或者可以指兩種或多種多肽的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“肽”也指由通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基組成的化合物。一般而言,肽由100個(gè)或少于100個(gè)氨基酸組成,而多肽或蛋白具有超過(guò)100個(gè)氨基酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白片段”也可以用來(lái)指肽。
除非在本文中以其它表示進(jìn)行限定,否則本文所用的指定給氨基酸和保護(hù)基的縮寫(xiě)基于IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)的建議(Biochemistry,1972,111726-1732)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,其特征在于給予所述受治療者抗原量的一種全-D肽,所述全-D肽激發(fā)所述受治療者產(chǎn)生針對(duì)所述全-D肽的抗體并且激發(fā)免疫應(yīng)答,因此預(yù)防原纖維生成、相關(guān)細(xì)胞毒性和神經(jīng)變性,其中所述抗體與誘發(fā)淀粉狀蛋白病的淀粉狀蛋白、原纖維蛋白或另一種非淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)相互作用?!霸w維肽”或“原纖維蛋白”是指形成在淀粉狀蛋白病斑中存在的原纖維的蛋白或肽的單體或寡聚體或聚集形式。這類肽和蛋白的實(shí)例在本文中提供。含有“非淀粉狀蛋白”的制劑包括但不限于產(chǎn)生針對(duì)凝溶膠蛋白片段的免疫應(yīng)答的組合物,以治療遺傳性系統(tǒng)性淀粉狀蛋白??;產(chǎn)生針對(duì)突變?nèi)芫傅鞍?Alys)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療遺傳性神經(jīng)?。划a(chǎn)生針對(duì)纖維蛋白原的突變?chǔ)伶?AfibA)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療非神經(jīng)病性形式的淀粉狀蛋白病表現(xiàn)如腎病;以及產(chǎn)生針對(duì)突變抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療在冰島(Iceland)報(bào)道的一種遺傳性腦血管病形式。另外,某些遺傳性形式的朊病毒病(例如克-雅病(CJD)、格-施-沙綜合征(Gerstmann-Strussler-Scheinker syndrome)(GSS)和致死性家族性失眠癥(FFI))的特征為朊病毒蛋白的突變同種型PrPsc。按照本發(fā)明,該蛋白可以用于治療和預(yù)防PrP病斑沉積的治療組合物中。這些疫苗可以用于預(yù)防和/或治療淀粉狀蛋白相關(guān)疾病,并且可以用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的藥物。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中,用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗包含至少一種與淀粉狀蛋白相互作用的抗體或其片段,以預(yù)防原纖維生成,其中所述抗體是針對(duì)這種蛋白的抗原量的全-D肽產(chǎn)生的,所述全-D肽例如β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、Aβ(1-42,全-D)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域Aβ(10-16)、其免疫原性片段、其蛋白綴合物、其免疫原性衍生肽、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物(peptidomimetics)或具有與任一上述肽有大致同一性的肽。
以下術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述兩個(gè)或兩個(gè)以上的多核苷酸之間的序列關(guān)系“大致同一性”、“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“參比序列”?!皡⒈刃蛄小笔怯米餍蛄斜容^標(biāo)準(zhǔn)的明確序列;參比序列可以是較大序列的一個(gè)亞組,如序列表中給出的全長(zhǎng)cDNA序列或基因序列的一個(gè)區(qū)段等或者可以包含完整的cDNA序列或基因序列。一般而言,參比序列的長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸,通常長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸,一般長(zhǎng)度為至少50個(gè)核苷酸。由于兩個(gè)多核苷酸可以各自(1)包含在該兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即完整多核苷酸序列的一部分),和(2)可以還包含在這兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列,在兩個(gè)或(兩個(gè)以上)多核苷酸之間的序列比較通過(guò)比較“比較窗”內(nèi)的兩個(gè)多核苷酸的序列以鑒定和比較序列相似的局部區(qū)域來(lái)進(jìn)行。本文所用的術(shù)語(yǔ)“比較窗”是指至少20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念區(qū)段(conceptual segment),其中可以將一個(gè)多核苷酸序列與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的參比序列進(jìn)行比較,并且其中所述多核苷酸序列在所述比較窗中的部分相對(duì)于參比序列(不包含添加或缺失)可以包含20%或20%以下的添加或缺失(即空位),以對(duì)該兩個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)。用于比對(duì)比較窗的最佳序列比對(duì)可以按照下述方法進(jìn)行局部同源性算法,Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482;同源性序列比對(duì)算法,Needleman和Wunsch (1970)J.Mol.Biol.48443;相似性搜索方法,Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444;這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行程序(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.);或者檢驗(yàn),并且從中選出通過(guò)各種方法產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在比較窗內(nèi)產(chǎn)生同源性的最高百分比)。
術(shù)語(yǔ)“序列同一性”是指比較窗內(nèi)的兩個(gè)多核苷酸序列是相同的(即基于核苷酸對(duì)核苷酸是相同的)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”通過(guò)以下方法計(jì)算通過(guò)比較比較窗內(nèi)的兩個(gè)最佳比對(duì)序列,測(cè)定在這兩個(gè)序列中存在的相同核酸堿基(例如A、T、C、G、U或I)位置數(shù)目,以得出匹配位置的數(shù)目,將匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)(即窗的大小),結(jié)果再乘以100,從而得出序列同一性百分比。本文所用的術(shù)語(yǔ)“大致同一性”表示多核苷酸序列的特征,其中用至少20個(gè)核苷酸位置的比較窗、通常至少25-50個(gè)核苷酸的比較窗與參比序列相比,所述多核苷酸包含具有至少85%序列同一性、優(yōu)選至少90%-95%序列同一性、更優(yōu)選至少99%序列同一性的序列,其中用比較窗將參比序列與多核苷酸序列進(jìn)行比較,計(jì)算序列同一性百分比,其中所述多核苷酸序列可能包含總計(jì)為比較窗參比序列的20%或20%以下的缺失或添加。
當(dāng)用于指多肽時(shí),術(shù)語(yǔ)“大致同一性”是指兩個(gè)肽序列當(dāng)進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)(例如通過(guò)運(yùn)用缺省空位加權(quán)(default gap weights)的程序GAP或BESTFIT)共享至少80%序列同一性,優(yōu)選至少90%序列同一性,更優(yōu)選至少95%序列同一性或更高(例如99%序列同一性)。優(yōu)選不具有同一性的殘基位置的差別是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是指具有相似側(cè)鏈的互換性殘基。例如一組具有脂族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;一組具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸;一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一組具有芳族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸;和一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基團(tuán)是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
術(shù)語(yǔ)“抗體”或“免疫球蛋白”包括完整抗體及其片段。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體,并且可以通過(guò)重組技術(shù)制備、從血清或腹水中收集或者從雜交瘤獲得。通常,片段與衍生這些片段的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)以與抗原片段特異性結(jié)合。片段通過(guò)重組DNA技術(shù)或者完整抗體的酶促或化學(xué)切割而產(chǎn)生。抗原結(jié)合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和單鏈抗體,還包括獨(dú)立的重鏈或輕鏈??贵w片段通過(guò)重組DNA技術(shù)或者完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)分離而產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白鏈,所述免疫球蛋白鏈與其它蛋白化學(xué)綴合或者表達(dá)為與其它蛋白的融合蛋白。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括雙特性抗體。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同重鏈/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合部位的人工雜交抗體。雙特異性抗體可以通過(guò)各種各樣的方法產(chǎn)生,所述方法包括雜交瘤的融合或Fab′片段的連接。參見(jiàn)例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990);Kostelny等,J. Immunol.148,1547-1553(1992)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中這些結(jié)構(gòu)域以一種多肽鏈存在。所述Fv多肽最好在VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭,該接頭使所述sFv形成所需的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。有關(guān)sFv的綜述參見(jiàn)Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies.第113卷.Rosenburg和Moore編著,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(yè)(1994)。
兩個(gè)實(shí)體之間的特異性結(jié)合是指親和力為至少106M-1、107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1。優(yōu)選親和力大于108M-1。如本文中所討論的,考慮了本發(fā)明包括抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小變異,條件是氨基酸序列的變異保持至少75%,更優(yōu)選至少80%、90%、95%,最優(yōu)選99%。尤其考慮了保守氨基酸取代。保守取代是在其側(cè)鏈上相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些取代。遺傳編碼的氨基酸一般分為以下類別(1)酸性氨基酸=天冬氨酸、谷氨酸;(2)堿性氨基酸=賴氨酸、精氨酸、組氨酸;(3)非極性氨基酸=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不帶電荷的極性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂族-羥基家族;天冬酰胺和谷氨酰胺是含有酰胺的家族;丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂族家族;而苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如,可以預(yù)期以下獨(dú)立取代亮氨酸被異亮氨酸或纈氨酸取代、天冬氨酸被谷氨酸取代、蘇氨酸被絲氨酸取代或一個(gè)氨基酸被另一結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的相似取代將對(duì)所產(chǎn)生的分子的結(jié)合或特性沒(méi)有太大的影響,如果所述取代在構(gòu)架位點(diǎn)內(nèi)并不涉及氨基酸尤其如此。氨基酸改變是否產(chǎn)生功能性肽可以容易地通過(guò)測(cè)定所述多肽衍生物的比活來(lái)確定。在本文中詳細(xì)地描述了各種測(cè)定。片段或類似物的優(yōu)選氨基末端和羧基末端存在于功能域的邊界附近。通過(guò)將所述核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共的或私有的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,可以鑒定出結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。最好用計(jì)算機(jī)化比較法來(lái)鑒定序列基序或已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其它蛋白中存在的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。折疊成已知的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的鑒定方法是已知的。Bowie等Science 253164(1991)。因此,前面的實(shí)例證明,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照本發(fā)明知道可用來(lái)確定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。優(yōu)選的氨基酸取代是以下的氨基酸取代(1)降低對(duì)蛋白水解的敏感性,(2)降低對(duì)氧化作用的敏感性,(3)改變對(duì)形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力,(4)改變結(jié)合親和力,和(4)賦予或改進(jìn)這種類似物的其它物理化學(xué)特性或功能特性。類似物可以包括非天然存在的肽序列的序列的各種突變蛋白。例如,可以在天然存在的序列(最好在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的多肽部分中)中進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(最好是保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代應(yīng)該基本上不改變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例如取代氨基酸不應(yīng)該破壞親代序列中存在的螺旋,或者破壞表征親代序列的其它類型的二級(jí)結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域公知的多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編著,W.H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to ProteinsStructure(C.Branden和J.Tooze編著,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991));和Thornton等Nature 354105(1991),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化”形式的非人類(例如嚙齒動(dòng)物)抗體是含有從非人類免疫球蛋白中獲得的基本序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它抗原-結(jié)合亞序列)。人源化抗體多半是人免疫球蛋白(受體抗體),其中來(lái)自受體的高變區(qū)的殘基被來(lái)自非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或兔、具有所需特異性、親和性和容量的高變區(qū)取代。在某些情況下,人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類殘基取代。此外,人源化抗體可以包含既沒(méi)有在受體抗體也沒(méi)有在供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精修和使抗體表現(xiàn)最大化。一般而言,人源化抗體將基本上完整包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū),其中高變環(huán)的完整或基本上完整對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋白的可變區(qū),完整或基本上完整的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗體也將任選包含至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分,通常為人免疫球蛋白的一部分。有關(guān)更詳細(xì)的描述參見(jiàn)Jones等,Nature,32215222 525(1986);Reichmarm等,Nature,332323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2593-596(1992)。
術(shù)語(yǔ)“綴合”或“與……綴合的”意指結(jié)合在一起、偶聯(lián)、鍵合和/或融合。“蛋白綴合物”或“綴合蛋白”一般意指蛋白與非蛋白的化合物?!熬Y合蛋白”除含有所述氨基酸外還含有永久相關(guān)的化學(xué)組分。綴合蛋白的非氨基酸部分一般是指其輔基。綴合蛋白可根據(jù)其輔基的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分類(Lehninger Principles of Biochemistry,3d ed.Worth Publishers 2000),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在綴合物疫苗中,抗原分子與“載體”蛋白或多肽共價(jià)連接。所述連接用以增加綴合分子的抗原性。從抗原分子和“載體”蛋白或多肽制備綴合物疫苗的方法是本領(lǐng)域已知的(Jacob,C.O等,Eur.J.Immunol.161057-1062(1986);Parker J.M.R.等,載于ModemApproaches to Vaccines,Chanock,R.M.等編著,第133-138頁(yè),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1983);Zurawski,V.R等,J.Immunol.121122-129(1978);Klipstein,F(xiàn).A等,Infect.Immun.37550-557(1982);Bessler,W.G,Immunobiol.170239-244(1985);Posnett,D.N等,J.Biol.Chem.2631719-1725(1988);Ghose,A.C等,Molec.Immunol.25223-230(1988);所有所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。蛋白和多糖的綴合可以提供其它有利的結(jié)果。例如,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白-多糖綴合物不僅增強(qiáng)針對(duì)多糖組分的抗體應(yīng)答,而且增強(qiáng)針對(duì)蛋白組分的抗體應(yīng)答。該效應(yīng)描述于例如Mond和Lees的雙綴合物專利申請(qǐng)即美國(guó)專利第5,955,079號(hào)和第5,585,100號(hào),這兩個(gè)專利文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。該效應(yīng)也描述于A.Lees等,″EnhancedImmunogenicity of Protein-Dextran ConjugatesI.Rapid Stimulation ofEnhanced Antibody Respones to Poorly Immunogenic Molecules(蛋白質(zhì)-葡聚糖綴合物的免疫原性增強(qiáng)I.快速刺激針對(duì)差免疫原性分子的增強(qiáng)抗體應(yīng)答),″Vaccine,Vol.12,No.13,(1994),第1160-1166頁(yè)。該文章通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。載體蛋白的實(shí)例包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、C3d、多糖、牛血清白蛋白(BSA)、破傷風(fēng)類毒素、熱激蛋白(HSP)、卵清蛋白或霍亂毒素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括給予一種包含至少兩種抗體或其片段與原纖維蛋白和/或非淀粉狀蛋白的兩個(gè)或多個(gè)部分結(jié)合的一種組合的藥用組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述藥用組合物還包含免疫細(xì)胞,更優(yōu)選致敏淋巴細(xì)胞。
“藥用組合物”是指適合于給予哺乳動(dòng)物個(gè)體(最好是人類)的化學(xué)或生物學(xué)組合物。這樣的組合物于可以具體配制用于通過(guò)許多途徑中的一種或多種途徑給予,所述途徑包括但不限于經(jīng)口、胃腸外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、舌下、脊柱內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等?!八幱觅x形劑”或“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是配制活性治療肽所用的載體,通常為液體。所述賦形劑對(duì)制劑而言一般不提供任何藥理活性,雖然它可以提供化學(xué)和/或生物學(xué)穩(wěn)定性、釋放特征等。示例性的制劑可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences,19th Ed.,Grennaro,A.編著,1995中找到。
再者,在再一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括給予所述受治療者抗原量的一種全-D肽,所述全-D肽可以與淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)域例如例如β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、Aβ(1-42)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域Aβ(10-16)、其免疫原性片段、其蛋白綴合物、其免疫原性衍生肽、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物進(jìn)一步相互作用,其中所述化合物激發(fā)所述受治療者的免疫應(yīng)答,因而防止原纖維生成。
按照另一個(gè)相關(guān)的方面,本發(fā)明包括一種預(yù)防或治療特征為哺乳動(dòng)物受治療者的淀粉狀蛋白沉積的疾病的方法。按照本發(fā)明的該方面,給予所述受治療者一劑有效產(chǎn)生針對(duì)所述受治療者罹患的淀粉狀蛋白性疾病特征性淀粉狀蛋白肽的免疫應(yīng)答的肽。從本質(zhì)上講,所述方法包括給予含有對(duì)所述疾病(例如上述的那些疾病)特異性的免疫原性淀粉狀蛋白肽的藥用組合物。這樣的方法的特征還在于其有效誘導(dǎo)受治療者的免疫原性應(yīng)答。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案,所述方法有效產(chǎn)生特征為關(guān)于所述免疫原性肽所針對(duì)的淀粉狀蛋白肽的血清效價(jià)為至少1∶1000的免疫應(yīng)答。在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,關(guān)于所述淀粉狀蛋白組分的血清效價(jià)為至少1∶5000。按照一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案,所述免疫應(yīng)答的特征為約4倍以上的血清免疫反應(yīng)性量要比治療前對(duì)照血清樣品測(cè)量的血清免疫反應(yīng)性水平高。后一種特征當(dāng)通過(guò)ELISA技術(shù)測(cè)定血清免疫反應(yīng)性尤其合適,但是適用于任何相對(duì)或絕對(duì)血清免疫反應(yīng)性檢測(cè)。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案,以約1∶100至1∶10,000的血清稀釋度測(cè)量所述免疫反應(yīng)性,以確定抗體效價(jià)。
按照再一個(gè)相關(guān)的方面,本發(fā)明包括一種測(cè)定接受淀粉狀蛋白性疾病治療的患者的預(yù)后的方法。在此,測(cè)量針對(duì)選定疾病特征性淀粉狀蛋白肽的患者血清免疫反應(yīng)性量,患者血清免疫反應(yīng)性量至少4倍于血清免疫反應(yīng)性基線對(duì)照水平說(shuō)明特定淀粉狀蛋白性疾病的改進(jìn)狀態(tài)的預(yù)后。按照優(yōu)選的實(shí)施方案,針對(duì)患者血清中存在的所選淀粉狀蛋白肽的免疫反應(yīng)性量的特征為關(guān)于所述淀粉狀蛋白肽的血清效價(jià)為至少約1∶1000或至少1∶5000。
本文所用的“被動(dòng)免疫”是指將抗體、其片段或免疫細(xì)胞(即T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或補(bǔ)體途徑的組分)給予個(gè)體,以賦予免疫??梢允寡a(bǔ)體途徑的組分與蛋白綴合,以結(jié)合主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫增強(qiáng)先天(inate)免疫應(yīng)答。根據(jù)制備中所用的人血漿庫(kù),從人血中獲得的免疫球蛋白(Ig)可以含有多種抗各種組分的抗體。特異性免疫球蛋白從具有高水平的抗特定抗原的抗體的供體血漿或者經(jīng)免疫以產(chǎn)生這種應(yīng)答的供體血漿中獲得(Immunization,Cecil Textbook of Medicine,19th ed.Vol.1,W.B.Saunders Company 1992;Harrison′s Principles ofInternal Medicine,14th ed,McGraw Hill,1998)。在WO01/62801中描述了螯合血漿、腦和腦脊髓液中淀粉狀蛋白-β肽的人源化單克隆抗體,所述抗體用于防止腦和腦血管內(nèi)淀粉狀蛋白-β肽的累積,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。EP0613007描述了對(duì)主要為β折疊構(gòu)象的β-淀粉狀蛋白肽有特異性的抗體。這樣的抗體可用于本文所述的發(fā)明中。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,提供用于被動(dòng)免疫哺乳動(dòng)物以預(yù)防或治療淀粉狀蛋白性疾病的方法和組合物。按照本發(fā)明的該方面,給予患者有效劑量的抗體或其片段或者免疫細(xì)胞,所述抗體或其片段與淀粉狀蛋白肽的所選區(qū)域、最好是負(fù)責(zé)β折疊形成的所述肽的中央核心區(qū)域內(nèi)或其附近的區(qū)域特異性地結(jié)合,所述免疫細(xì)胞最好是致敏免疫細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞。一般而言,這樣的抗體根據(jù)其特異性地結(jié)合各種蛋白、肽和該部分前面段落中介紹藥用組合物以及方法中所介紹的組分的能力進(jìn)行選擇。按照一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案,這樣的方法和組合物可以包括結(jié)合至少兩個(gè)淀粉狀蛋白組分的抗體的組合。一般而言,給予藥用組合物使得針對(duì)靶淀粉狀蛋白肽的血清免疫反應(yīng)性量比對(duì)照血清樣品中測(cè)量的針對(duì)所述組分的血清免疫反應(yīng)性水平高至少約4倍以上。如本文所述,所述抗體也可以與載體一起給予。一般而言,按照本發(fā)明的該方面,這樣的抗體將腹膜內(nèi)、經(jīng)口、鼻內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、局部或靜脈內(nèi)給予(或配制用于給藥),但可以通過(guò)任何藥學(xué)上有效的途徑給予或配制用于給藥(即有效產(chǎn)生規(guī)定治療水平,如以上和此中所述的)。
術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”是指抗體或抗體結(jié)合片段特異性地結(jié)合或者B細(xì)胞和/或T細(xì)胞應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可以通過(guò)蛋白質(zhì)的三次折疊連接的連續(xù)氨基酸或非連續(xù)氨基酸而形成。從連續(xù)氨基酸形成的表位通常保留暴露于變性溶劑中,而通過(guò)三次折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理后喪失。表位在獨(dú)特空間構(gòu)象中通常包括至少3個(gè)、更常見(jiàn)至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。表位空間構(gòu)象的測(cè)定方法包括例如X射線結(jié)晶術(shù)和二維核磁共振。參見(jiàn)例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn且Morris編著(1996)。在一個(gè)簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定中可以鑒定出識(shí)別同一表位的抗體,表明一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結(jié)合的能力。L-細(xì)胞對(duì)于CD8細(xì)胞識(shí)別約9個(gè)氨基酸的連續(xù)表位或者對(duì)于CD4細(xì)胞識(shí)別約13-15個(gè)氨基酸的連續(xù)表位。識(shí)別所述表位的T細(xì)胞可以通過(guò)測(cè)量抗原依賴性增殖的體外測(cè)定進(jìn)行鑒定,如摻入表位作用下的致敏T細(xì)胞的3H-胸苷測(cè)定(Burke等,J.Inf Dis.170,1110-19(1994))、抗原依賴性殺傷測(cè)定(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞測(cè)定,Tigges等,J Immunol.156,3901-3910)或細(xì)胞因子分泌物測(cè)定。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“化合物”是指本發(fā)明的肽或含有依照本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述化合物是以下的式I化合物R′-(P)-R″(I),其中P是淀粉狀蛋白的一種全-D肽,例如β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、Aβ(1-42,全-D)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域(10-16,全-D)、其免疫原性片段、其免疫原性衍生物、其蛋白綴合物、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物;R′是一個(gè)N末端取代基,例如·氫;·低級(jí)烷基,例如具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基,帶有或不帶有官能團(tuán),例如羧酸酯基、磺酸酯基和膦酸酯基;·芳族基團(tuán);·雜環(huán)基;和·?;?,例如烷基羰基、芳基羰基、磺?;挽Ⅴ;?;且R″是一個(gè)C末端取代基,例如羥基、烷氧基、芳氧基、未取代或取代的氨基。
在一個(gè)實(shí)施方案中,R′和R″相同或不同,其中R′和R″的烷基或芳基被諸如以下的官能團(tuán)進(jìn)一步取代鹵化物(例如F、Cl、Br和I)、羥基、烷氧基、芳氧基、羥基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲酰基、未取代或取代的氨基、磺基或烷氧基磺?;㈧Ⅴ;蛲檠趸Ⅴ;?br>
當(dāng)所述化合物具有酸官能團(tuán)時(shí),它可以為藥學(xué)上可接受的鹽形式或酯形式。當(dāng)所述化合物具有堿性官能團(tuán)時(shí),它可以為藥學(xué)上可接受的鹽形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中,P是一種能夠與淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)域相互作用的肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述受治療者是人類。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病可以是早老性癡呆。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中,所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病可以是腦淀粉狀蛋白性血管病(CAA)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括給予所述受治療者抗原量的式I化合物R′-(P)-R″(I),其中P是淀粉狀蛋白的一種全-D肽,例如β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、Aβ(1-42,全-D)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域(10-16,全-D)、其免疫原性片段、其免疫原性衍生物、其蛋白綴合物、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物;R′是一個(gè)N末端取代基,所述取代基選自·氫;·低級(jí)烷基,例如具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基,帶有或不帶有官能團(tuán),例如羧酸酯基、磺酸酯基和膦酸酯基;·芳族基團(tuán);·雜環(huán)基;和·?;缤榛驶?、芳基羰基、磺?;挽Ⅴ;磺襌″是一個(gè)C末端取代基,例如羥基、烷氧基、芳氧基、未取代或取代的氨基。
按照該方法,所述化合物誘發(fā)所述受治療者的免疫應(yīng)答,以預(yù)防原纖維生成、神經(jīng)變性或細(xì)胞毒性。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,提供一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗,所述疫苗包含抗原量的一種全-D肽,所述全-D肽可以與以下的區(qū)域進(jìn)一步相互作用淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)域例如β折疊區(qū)域(16-21)、GAG-結(jié)合部位區(qū)域(13-16)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域(10-16,全-D)、其免疫原性片段、其蛋白綴合物、其免疫原性衍生肽、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物,其中所述化合物誘發(fā)所述受治療者的免疫應(yīng)答或者防止原纖維生成或者有利于清除原纖維形成之前的淀粉狀蛋白。一方面,所述疫苗改變哺乳動(dòng)物血漿中的可溶性Aβ水平,從而降低哺乳動(dòng)物腦中的可溶性Aβ水平并且防止原纖維病斑的形成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,某些方法需要針對(duì)可溶性Aβ或原纖維Aβ的被動(dòng)免疫。一方面,本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和/或治療需要這種預(yù)防和/或治療的第一種哺乳動(dòng)物的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括將抗原量的一種全-D淀粉狀蛋白-β肽給予第二種哺乳動(dòng)物,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽誘導(dǎo)所述第二種哺乳動(dòng)物針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的免疫應(yīng)答,從所述第二種哺乳動(dòng)物中回收所述抗體或免疫細(xì)胞,并且為所述第一種哺乳動(dòng)物提供治療或預(yù)防有效量的所述抗體或免疫細(xì)胞。在該實(shí)施方案中,所述全-D淀粉狀蛋白-β肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO1-70的序列有至少80%相同??捎糜诋a(chǎn)生按照本發(fā)明的抗體或免疫細(xì)胞的Aβ的其它反應(yīng)性表位包括Aβ的殘基1-42內(nèi)的表位、Aβ的殘基16-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基13-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-16內(nèi)的表位、Aβ的殘基25-35內(nèi)的表位和包含Aβ的游離N末端殘基或游離C末端殘基的表位。一方面,將免疫細(xì)胞即致敏淋巴細(xì)胞例如B細(xì)胞或T細(xì)胞從如所描述的針對(duì)Aβ的主動(dòng)免疫的第二種哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)移至第一種哺乳動(dòng)物,實(shí)現(xiàn)針對(duì)Aβ的被動(dòng)免疫,從而緩解或預(yù)防所述第一種哺乳動(dòng)物的Aβ相關(guān)疾病。另一方面,通過(guò)轉(zhuǎn)移能夠與Aβ特異性結(jié)合的抗體或其片段,實(shí)現(xiàn)針對(duì)Aβ的被動(dòng)免疫。再一方面,將人抗體、人源化抗體或嵌合抗體給予所述第一種哺乳動(dòng)物,從而緩解或預(yù)防Aβ相關(guān)疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括給予所述受治療者抗原量的一種全-D淀粉狀蛋白-β肽,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽誘導(dǎo)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的免疫應(yīng)答,并且其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO1-70的序列有至少80%相同或者與以下的表位特異性結(jié)合的至少一種抗體或片段的序列有至少80%相同Aβ的殘基1-42內(nèi)的表位、Aβ的殘基16-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基13-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-16內(nèi)的表位、Aβ的殘基25-35內(nèi)的表位和包含Aβ的游離N末端殘基或游離C末端殘基的表位。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及改變需要改變的哺乳動(dòng)物(例如人)的血清Aβ水平,即通過(guò)給予治療或預(yù)防量的至少一種與以下的表位特異性結(jié)合的抗體或片段Aβ的殘基1-42內(nèi)的表位、Aβ的殘基16-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基13-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-21內(nèi)的表位、Aβ的殘基10-16內(nèi)的表位、Aβ的殘基25-35內(nèi)的表位和包含Aβ的游離N末端殘基或游離C末端殘基的表位。一方面,改變所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血清Aβ水平將改變所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的可溶性Aβ水平或原纖維Aβ水平。再一方面,改變所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血清Aβ水平將改變所述哺乳動(dòng)物腦中的可溶性Aβ水平或原纖維Aβ水平。另一方面,改變所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血清Aβ水平將有利于清除所述哺乳動(dòng)物腦中的Aβ水平。
所述方法既可以用在無(wú)癥狀的患者身上,又可以用在當(dāng)前表現(xiàn)疾病癥狀的那些患者身上。以這樣的方法給予的抗體可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或非人類抗體或其片段,并且可以來(lái)自單克隆源或多克隆源、可以得自哺乳動(dòng)物或者通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生。在某些方法中,所述抗體從用Aβ肽免疫的人中制備。在其它方法中,給予人源化抗體。
在某些方法中,將所述抗體與藥用載體一起作為藥用組合物給予。在某些方法中,給予抗體的劑量為0.0001-100mg/kg體重抗體,優(yōu)選至少1mg/kg體重抗體。在某些方法中,在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)例如至少6個(gè)月內(nèi)以多個(gè)劑量給予所述抗體。在某些方法中,所述抗體作為緩釋組合物給予??梢酝ㄟ^(guò)例如腹膜內(nèi)、經(jīng)口、皮下、顱內(nèi)、肌內(nèi)、局部、鼻內(nèi)、經(jīng)皮或靜脈內(nèi)給予所述抗體。
根據(jù)以下的詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū),本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述
圖1說(shuō)明抗原片段的靶位點(diǎn)。
圖2說(shuō)明1mg/ml針對(duì)D和L形式的Aβ(16-21)產(chǎn)生的多克隆抗體對(duì)原纖維生成的影響。
圖3說(shuō)明0.5mg/ml針對(duì)D和L形式的Aβ(16-21)產(chǎn)生的多克隆抗體對(duì)原纖維生成的影響。
圖4A-4C說(shuō)明電子顯微鏡照片,顯示抗D KLVFFA肽抗體(圖4B)和抗L KLVFFA肽抗體(圖4C)相對(duì)于對(duì)照(圖4A)對(duì)原纖維生成的影響。
圖5A-5D說(shuō)明抗D KLVFFA對(duì)壓后皮質(zhì)(retrosplenial cortex)(圖5A)和頂皮質(zhì)(圖5C)的腦切片中的聚集Aβ肽的免疫組織化學(xué)以及抗D KLVFFA對(duì)后脊皮質(zhì)(retrospinal cortex)(圖5B)和頂皮質(zhì)(圖5D)的相同腦切片中的聚集Aβ肽的組織化學(xué)(Thioflavin S測(cè)定)。
圖6A-6D說(shuō)明抗L KLVFFA抗體對(duì)頂皮質(zhì)(圖6A)和內(nèi)嗅皮質(zhì)(圖6C)的腦切片中的聚集Aβ肽的免疫組織化學(xué)以及抗L KLVFFA抗體對(duì)頂皮質(zhì)(圖6B)和內(nèi)嗅皮質(zhì)(圖6D)的相同腦切片中的聚集Aβ肽的組織化學(xué)(Thioflavin S測(cè)定)。
圖7說(shuō)明兔子對(duì)KLH-綴合的全-L和全-D KLVFFA的應(yīng)答。
圖8A和圖8B說(shuō)明用D13-21-KLH免疫的TgCRND8小鼠腦中的可溶性和不溶性Aβ40水平的降低。
圖9說(shuō)明用D13-21-KLH免疫的TgCRND8小鼠腦中的可溶性Aβ42水平的降低。
圖10A和圖10B說(shuō)明用D13-21-KLH免疫的TgCRND8小鼠腦中的總Aβ水平(Aβ40和Aβ42)的降低發(fā)明詳述淀粉狀蛋白性疾病或淀粉狀蛋白病包括許多具有各種各樣的表面癥狀的疾病狀態(tài)。這些疾病的共同特征為存在蛋白原纖維的異常胞外沉積,稱為“淀粉狀蛋白沉積”或“淀粉狀蛋白病斑”,通常其直徑約10-100nm,位于特定器官或組織區(qū)域內(nèi)。這樣的病斑主要由天然存在的可溶性蛋白或肽構(gòu)成,它們聚集在一起形成不溶性原纖維沉積。這些不溶性沉積由直徑約10-15nm的原纖維的普遍橫向聚集物構(gòu)成。淀粉狀蛋白原纖維當(dāng)用剛果紅染料染色時(shí)在偏振光中產(chǎn)生特征性的蘋(píng)果綠雙折射。
形成病斑沉積的肽或蛋白通常從較大的前體蛋白產(chǎn)生。更準(zhǔn)確地講,淀粉狀蛋白原纖維沉積的發(fā)病機(jī)理一般涉及“異?!鼻绑w蛋白被蛋白酶切割成片段。這些片段一般聚集在一起形成反平行β折疊;然而,據(jù)報(bào)道,在家族性淀粉狀蛋白性多神經(jīng)病(變異型甲狀腺素運(yùn)載蛋白原纖維)和透析相關(guān)淀粉狀蛋白病(β2微球蛋白原纖維)中某些未降解形式的前體蛋白聚集并形成原纖維(Tan,S.Y.和Pepys,M.B.Amyloidosis.Histopathology 25403-414(1994))。具體地說(shuō),已知Aβ(16-21)位點(diǎn)在起動(dòng)Aβ肽成淀粉樣有害過(guò)程中起重要作用。也知道,當(dāng)這些肽由D-氨基酸構(gòu)成時(shí),它們保留其與天然全-L-同源序列相互作用的能力,從而防止淀粉狀蛋白生成??梢杂糜诒景l(fā)明的其它淀粉狀蛋白包括但不限于IAPP的β折疊區(qū)域(例如24-29,全-D)、β2-微球蛋白、淀粉狀蛋白A蛋白和朊病毒相關(guān)蛋白。
所述疾病傳統(tǒng)上根據(jù)形成病斑沉積的主要原纖維組分進(jìn)行分類,如下文所述。然而,雖然不希望受理論的束縛,但是有證據(jù)支持Aβ可以可以在腦和血液之間來(lái)回運(yùn)輸(Ghersi-Egea,J.等,J.Neurochem.,67880-883,(1996))并且病斑中的Aβ(不溶性或原纖維Aβ)處于與可溶性Aβ的平衡之中(Kawarabayashi,T.等,J.Neurosci.21372-381,(2001),這兩個(gè)文獻(xiàn)均通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。因而,為根據(jù)主要原纖維組分鑒定疾病提供了方便,并且通過(guò)靶向或者原纖維Aβ或者可溶性Aβ,按照本文描述的組合物和方法可以實(shí)現(xiàn)緩解所述疾病。通過(guò)主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫可以實(shí)現(xiàn)靶向原纖維Aβ或可溶性Aβ,如本文中所述并且描述于PCT公開(kāi)號(hào)WO 01/62801、WO01/90182、WO 01/18169、WO 00/77178、WO 00/72880、WO 00/72876、WO 99/60024和WO 99/27944,每個(gè)專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。靶Aβ的水平、尤其是可溶性Aβ的水平可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法和此中公開(kāi)的方法(參見(jiàn)美國(guó)專利5,766,846、5,837,672和5,593,846,每個(gè)專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)來(lái)測(cè)定。這些水平可以在預(yù)防性或治療性治療的過(guò)程中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)疾病狀態(tài)得到減輕時(shí)則達(dá)到治療終點(diǎn)。
淀粉狀蛋白性疾病本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)淀粉狀蛋白性疾病可以通過(guò)給予用來(lái)刺激針對(duì)各種疾病特異性淀粉狀蛋白沉積的一個(gè)或多個(gè)組分的免疫應(yīng)答的肽進(jìn)行治療。以下小節(jié)用來(lái)舉例說(shuō)明主要形式的淀粉狀蛋白病,并不是用來(lái)限制本發(fā)明。
AA(反應(yīng)性)淀粉狀蛋白病一般而言,AA淀粉狀蛋白病是許多刺激持續(xù)急性期應(yīng)答的疾病的表現(xiàn)。這樣的疾病包括慢性炎性疾病、慢性局部或系統(tǒng)性微生物感染和惡性腫瘤。
AA原纖維一般由血清淀粉狀蛋白A蛋白(ApoSAA)的蛋白酶切割所形成的8000道爾頓片段(AA肽或蛋白)組成,ApoSAA為HDL復(fù)合體中存在的循環(huán)載脂蛋白并且在肝細(xì)胞對(duì)如IL-1、IL-6和TNF等細(xì)胞因子應(yīng)答時(shí)合成。沉淀可以在生物體內(nèi)廣泛分布,但優(yōu)先分布在實(shí)質(zhì)器官中。脾臟通常是沉積部位,而腎臟也可能受到影響。沉積也常常在心臟和胃腸道中。
AA淀粉狀蛋白性疾病包括但不限于炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、賴特綜合征(Peiter′s syndrome)、成人斯蒂爾病(Adult Still′s disease)、貝赫切特綜合征(Behcet′s syndrome)和節(jié)段性回腸炎(Crohn′sdisease)。AA沉積也由于慢性微生物感染而產(chǎn)生,例如麻瘋病、結(jié)核病、支氣管擴(kuò)張、褥瘡性潰瘍、慢性腎盂腎炎、骨髓炎和惠普爾病(Whipple′s disease)。某些惡性腫瘤也可以導(dǎo)致AA原纖維淀粉狀蛋白沉積。這些腫瘤包括如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、腎癌、腸癌、肺癌和泌尿生殖道癌、基底細(xì)胞癌和毛細(xì)胞白血病等病癥。
AL淀粉狀蛋白病AL淀粉狀蛋白沉積一般與B淋巴細(xì)胞譜系的幾乎任何惡液質(zhì)相關(guān),其范圍從漿細(xì)胞惡性腫瘤(多發(fā)性骨髓瘤)至良性單克隆γ球蛋白病。淀粉狀蛋白沉積的存在時(shí)常是潛在惡液質(zhì)的主要指標(biāo)。
AL淀粉狀蛋白沉積的原纖維由單克隆免疫球蛋白輕鏈或其片段組成。更準(zhǔn)確地講,所述片段衍生自輕鏈(κ或λ)的N末端區(qū)域并且含有其可變區(qū)(VL)的全部或一部分。沉積一般發(fā)生在間充質(zhì)組織,引起周圍神經(jīng)病和自主神經(jīng)病、腕管綜合征、巨舌、限制性心肌病、大關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)病、免疫不調(diào)癥、骨髓瘤以及隱性惡液質(zhì)。然而,應(yīng)該注意到,可以涉及幾乎任何組織,特別是內(nèi)臟器官例如心臟。
遺傳性系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病存在許多形式的遺傳性系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病。雖然它們是比較罕見(jiàn)的病癥,但是癥狀的成年發(fā)病型及其遺傳模式(通常是常染色體顯性)導(dǎo)致這類疾病在普通人群中持續(xù)存在。一般而言,所述癥狀歸因于前體蛋白的點(diǎn)突變,導(dǎo)致產(chǎn)生變異型asnyloidogenic肽或蛋白。表1總結(jié)了這些疾病示例形式的原纖維組成。
表1
數(shù)據(jù)來(lái)源于Tan & Pepys,1994,參見(jiàn)上文。
表1中提供的數(shù)據(jù)是示例性的,并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。例如,在甲狀腺素運(yùn)載蛋白基因中的超過(guò)40個(gè)獨(dú)立點(diǎn)突變已有描述,所有的點(diǎn)突變都產(chǎn)生臨床上相似形式的家族性淀粉狀蛋白性多神經(jīng)病。
甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)是一種14千道爾頓蛋白,有時(shí)也被稱為前白蛋白。它是由肝臟和脈絡(luò)膜叢產(chǎn)生的,它在轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺激素和維生素A中起作用。該蛋白的至少50種變異形式(每種的特征為單個(gè)氨基酸改變)負(fù)責(zé)各種形式的家族性淀粉狀蛋白性多神經(jīng)病。例如,在特定進(jìn)行性形式的神經(jīng)病中,55位的脯氨酸被亮氨酸取代;在丹麥嚴(yán)重心臟病患者中,111位的甲硫氨酸被亮氨酸取代。從系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病患者心臟組織中分離的淀粉狀蛋白沉積已經(jīng)揭示出,沉積由TTR及其片段的異源混合物(統(tǒng)稱為ATTR,已表征的全長(zhǎng)序列)組成。可以從這樣的病斑中提取ATTR原纖維組分,并且其結(jié)構(gòu)和序列依照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)定(例如Gustavsson,A.等,Laboratory Invest.73703-708,1995;Kametani,F(xiàn).等,Biochem.Biophys.Res.Commun.125622-628,1984;Pras,M.等,PNAS 80539-42,1983)。
分子載脂蛋白Al中具有點(diǎn)突變(例如Gly→Arg26;Trp 4→Arg50;Leu→4 Arg60)的病人表現(xiàn)出特征為載脂蛋白AI或其片段(AApoAI)沉積的淀粉狀蛋白病形式(″stertag型″)。這些患者的高密度脂蛋白(HDL)水平低并且伴有周圍神經(jīng)病或腎衰竭。
溶菌酶α鏈的突變(例如Ile→Thr56或Asp→His57)是基于英國(guó)家庭中報(bào)道的另一種形式的stertag型非神經(jīng)病性遺傳性淀粉狀蛋白。在此,突變?nèi)芫傅鞍?Alys)的原纖維沉積,患者一般表現(xiàn)出腎功能受損。該蛋白與本文中描述的大多數(shù)原纖維形成蛋白不同,通常以全(非片段化)形式存在(Benson,M.D.等,CIBA Fdn.Symp.199104-131,1996)。
β-淀粉狀蛋白肽(Aβ)是一種通過(guò)蛋白水解從稱為β淀粉狀蛋白前體蛋白(βAPP)的大蛋白獲得的39-43個(gè)氨基酸的肽。βAPP中的突變引起家族性形式的早老性癡呆、唐氏綜合征(Down′s syndrome)和/或老年癡呆,其特征在于由Aβ原纖維和其它組分組成的病斑的腦部沉積,在下文有更加詳細(xì)的描述。與早老性癡呆相關(guān)的APP中的已知突變發(fā)生在β或γ分泌酶的切割位點(diǎn)附近或者在Aβ內(nèi)。例如,位置717在其加工為Aβ中的APP的γ分泌酶的切割位點(diǎn)附近,而位置670/671在β分泌酶的切割位點(diǎn)附近。這些殘基中的任一殘基的突變都可能引起早老性癡呆,大概是由于引起從APP產(chǎn)生的Aβ的42/43氨基酸形式的量增加。各種長(zhǎng)度的Aβ肽的結(jié)構(gòu)和序列是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的肽可以依照本領(lǐng)域已知的方法制備(例如Glenner和Wong,Biochem Biophys.Res.Comm.129885-890,1984;Glenner和Wong,Biochem Biophys.Res.Comm.1221131-1135,1984)。另外,所述肽的各種形式都是市售的。
Synuclein是一種類似于載脂蛋白的突觸相關(guān)蛋白,其在神經(jīng)元胞質(zhì)溶膠和突觸前末稍中是高豐度的。衍生自α-synuclein的肽片段(稱為NAC)也是一種早老性癡呆淀粉狀蛋白病斑的組分。(Clayton等,1998)。該組分也用作本發(fā)明基于免疫學(xué)治療的靶,如下文詳述。
凝溶膠蛋白是一種與各種片段和肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合的鈣結(jié)合蛋白。該蛋白187位的突變(例如Asp→Asn;Asp→Tyr)引起一種形式的遺傳性系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病,通常在芬蘭患者以及荷蘭患者或日本患者中被發(fā)現(xiàn)。在各患者中,從凝溶膠蛋白片段形成的原纖維(Agel),通常由氨基酸173-243(68kDa羧基末端片段)組成并且沉積在血管和基底膜中,引起角膜營(yíng)養(yǎng)不良和發(fā)展為周圍神經(jīng)病的顱神經(jīng)病、營(yíng)養(yǎng)不良性皮膚改變以及沉積在其它器官中。(Kangas,H.等,Human Mol.Genet.5(9)1237-1243,1996)。
其它突變蛋白例如纖維蛋白原的突變?chǔ)伶?AfibA)和突變抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)也形成原纖維并且發(fā)生特征性遺傳性疾病。AfibA原纖維形成伴有腎病的非神經(jīng)病性遺傳性淀粉狀蛋白的特征性沉積;Acys沉積是冰島報(bào)道的遺傳性腦淀粉狀蛋白性血管病特征性的。(Isselbacher,Ct at.,Harrison′s Principles of Internal Medicine,McGraw-Hill,San Francisco,1995;Benson等,參見(jiàn)上文)。至少在某些情況下,已經(jīng)表明,腦淀粉狀蛋白性血管病(CAA)患者具有含有非突變形式的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C與β蛋白連接的淀粉狀蛋白原纖維。(Nagai,A.等,Molec.Chem.Neuropathol.3363-78,1998)。
現(xiàn)在已認(rèn)為某些形式的朊病毒病是可遺傳的,至多占病例的15%,先前認(rèn)為主要是自然感染的。(Baldwin等,Research Advances inAlzheimer′s Disease and Related Disorders,John Wiley and Sons,NewYork,1995)。在這樣的朊病毒病中,患者發(fā)生由正常朊病毒蛋白的異常同種型(PrPSc)組成的病斑。一種主要的突變同種型PrPSc,也稱為AScr,在其抗蛋白酶降解、去垢劑抽提后的不溶性、次級(jí)溶酶體中的沉積、翻譯后合成和高β折疊含量方面與正常細(xì)胞蛋白不同。已經(jīng)確定引起克-雅病(CJD)、格-施-沙綜合征(GSS)和致死性家族性失眠癥(FFI)的至少5個(gè)突變是遺傳連鎖的。從羊瘙癢病原纖維中提取原纖維肽、測(cè)序和制備這類肽的(Baldwin)方法是本領(lǐng)域已知的。(例如Beekes,M.等,J.Gen.Virol.762567-76,1995)。
例如,已經(jīng)使一種形式的GSS與密碼子102的PrP突變相關(guān),而端腦GSS與密碼子117的突變分離。密碼子198和217的突變引起一種形式的GSS,其中早老性癡呆特征性神經(jīng)炎性病斑含有PrP,而不含Aβ肽。某些形式的家族性CJD與密碼子200和210的突變相關(guān);在家族性CJD和FFI中均發(fā)現(xiàn)了密碼子129和178的突變。(Baldwin,參見(jiàn)上文)。
老年系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病系統(tǒng)性或病灶性淀粉狀蛋白沉積隨年齡的增加而增加。例如,野生型甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)的原纖維常常在老年人的心臟組織中被發(fā)現(xiàn)。這些疾病可以是無(wú)癥狀的即臨床上無(wú)癥狀的,或者可以引起心力衰竭。無(wú)癥狀原纖維病灶沉積也可以發(fā)生在腦(Aβ)、前列腺淀粉樣體(β2微球蛋白)、關(guān)節(jié)和精囊中。
腦淀粉狀蛋白病淀粉狀蛋白的局部沉積常常發(fā)生在腦中,特別是在老年人的腦中。淀粉狀蛋白在腦中最常見(jiàn)的形式主要由Aβ肽原纖維組成,引起癡呆或散發(fā)性(非遺傳性)早老性癡呆。事實(shí)上,散發(fā)性早老性癡呆的發(fā)生率大大超過(guò)遺傳性早老性癡呆的發(fā)生率。形成這些病斑的原纖維肽與以上關(guān)于遺傳性形式的早老性癡呆(AD)的那些肽非常相似。
透析相關(guān)淀粉狀蛋白病由β2微球蛋白(β2M)原纖維組成的病斑常常發(fā)生在接受長(zhǎng)期血透或腹膜透析的患者中。β2微球蛋白是一種11.8千道爾頓多肽并且是I類MHC抗原的輕鏈,存在于所有去核的細(xì)胞上。在正常情況下,不斷地從細(xì)胞膜上脫落并經(jīng)腎臟正常濾過(guò)。不能清除例如在腎功能受損的情況下,導(dǎo)致在腎臟和其它部位(主要在富含膠原蛋白的關(guān)節(jié)組織中)沉積。與其它原纖維蛋白不同,β2M分子一般以非片段化形式存在于原纖維中。(Benson,參見(jiàn)上文)。
激素源性淀粉狀蛋白病內(nèi)分泌器官可以帶有淀粉狀蛋白沉積,在老年人中尤其如此。分泌激素的腫瘤也可以含有激素源性淀粉狀蛋白病斑,其原纖維由多肽激素例如降鈣素(甲狀腺的髓樣癌)、胰島淀粉狀蛋白多肽(淀粉不溶素;存在于大多數(shù)II型糖尿病患者中)和心房鈉尿肽(獨(dú)立的心房淀粉狀蛋白病)構(gòu)成。這些蛋白的序列和結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域眾所周知的。
其它的淀粉狀蛋白病存在各種各樣的其它形式的淀粉狀蛋白性疾病,正常情況下表現(xiàn)為淀粉狀蛋白的局部沉積。一般而言,這些疾病可能是因?yàn)榫植慨a(chǎn)生特定原纖維前體和/或?qū)μ囟ㄔw維前體分解代謝存在缺陷或者特定組織(例如關(guān)節(jié))對(duì)原纖維沉積易感。這樣的特發(fā)病性沉積的實(shí)例包括結(jié)節(jié)性AL淀粉狀蛋白、皮膚淀粉狀蛋白、內(nèi)分泌性淀粉狀蛋白和腫瘤相關(guān)淀粉狀蛋白。
藥用組合物本發(fā)明的藥用組合物是指用原纖維肽制備的疫苗,所述原纖維肽的氨基酸殘基至少50%為右旋型(D-異構(gòu)體)。優(yōu)選所述疫苗用以下肽制備全D-Aβ(10-21)、D-Aβ(13-21)、D-Aβ(25-35)、D-Aβ(16-21)、D-Aβ(10-16)、D-Aβ(1-40)、D-Aβ(1-42)、D-Aβ(10-22)、D-Aβ(13-22)或D-Aβ(16-22)或D-Aβ(1-42)的N末端區(qū)域或C末端區(qū)域。一般認(rèn)為所述疫苗誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答或者產(chǎn)生識(shí)別天然存在的靶的抗體。本文所用的“全-D”包括具有至少50%D-構(gòu)型氨基酸的肽?!叭?D”最好也包括具有大于或等于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%D-構(gòu)型氨基酸的肽。
依照本發(fā)明的疫苗能夠通過(guò)以下兩個(gè)可能的方案預(yù)防腦淀粉狀蛋白病的發(fā)生1)抗Aβ抗體在淀粉狀蛋白沉積部位起作用,和2)高循環(huán)抗Aβ水平對(duì)血漿Aβ濃度的系統(tǒng)效應(yīng)。
具體地說(shuō),升高的血漿抗Aβ抗體水平可以通過(guò)降低Aβ正常血漿水平而系統(tǒng)地起作用,從而產(chǎn)生Aβ正常水平的系統(tǒng)不平衡。這樣的不平衡可能導(dǎo)致負(fù)責(zé)將Aβ從腦清除到外周的機(jī)制激活,以在Aβ腦水平和Aβ血漿水平之間重新建立正常的平衡關(guān)系。
因此,可以通過(guò)測(cè)定主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫對(duì)這種免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿和腦Aβ40水平的影響而利用這種可能性。Aβ免疫也可以針對(duì)發(fā)生腦淀粉狀蛋白病發(fā)揮系統(tǒng)保護(hù)效應(yīng)。Aβ水平在血漿和腦中的比率在經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中仍保持恒定,同時(shí)它應(yīng)該在對(duì)照動(dòng)物中降低。另外,B細(xì)胞或骨髓細(xì)胞從免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)移至原初轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中應(yīng)該具有與利用抗Aβ抗體的被動(dòng)免疫相同的作用。
此外,本發(fā)明的疫苗不存在利用“自身”蛋白的缺陷并且不需要聚集以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如,預(yù)期針對(duì)全-D-Aβ(16-21)肽產(chǎn)生的抗體可以識(shí)別全-L-Aβ(16-21)肽序列。本發(fā)明的藥用組合物除包括免疫原性肽外,還可以包括有效量的佐劑和/或賦形劑。藥學(xué)上有效的有用佐劑和賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的,在下文有更加詳細(xì)的描述。
按照本發(fā)明,能夠誘發(fā)或提供針對(duì)淀粉狀蛋白病斑的某些組分的免疫應(yīng)答的組合物對(duì)于治療或預(yù)防淀粉狀蛋白性疾病的發(fā)生是有效的。具體地說(shuō),按照本文提供的發(fā)明,當(dāng)將免疫刺激劑量的抗淀粉狀蛋白肽或相應(yīng)的抗淀粉狀蛋白免疫肽給予患者時(shí),可以預(yù)防所述患者的淀粉狀蛋白沉積過(guò)程的進(jìn)程、緩解其癥狀和/或減慢所述淀粉狀蛋白沉積過(guò)程。本小節(jié)描述產(chǎn)生針對(duì)淀粉狀蛋白的主動(dòng)免疫應(yīng)答以及被動(dòng)免疫應(yīng)答的示例性抗淀粉狀蛋白肽,并且提供表明利用這種組合物進(jìn)行治療對(duì)腦淀粉狀蛋白濃度的影響的示例性數(shù)據(jù)。
抗淀粉狀蛋白肽淀粉狀蛋白的抗體、類似物和片段一般而言,本發(fā)明的抗淀粉狀蛋白肽由特定病斑組分、優(yōu)選淀粉狀蛋白組分或成淀粉樣組分組成,該組分通常是特征性蛋白、肽或其片段。人形式的Aβ被稱為Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。這些肽的序列及其與APP前體的關(guān)系由Hardy等,TINS 20,155-158(1997)中的圖1加以說(shuō)明。例如Aβ42具有以下的序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH(SEQ ID NO1)Aβ41、Aβ40和Aβ39由于分別從C末端起缺失了Ala、Ala-Ile和Ala-Ile-Val而與Aβ42不同。Aβ43由于在C末端存在一個(gè)蘇氨酸殘基而與Aβ42不同。
基于多個(gè)原因,Aβ的免疫原性片段相對(duì)于本發(fā)明方法中的完整分子是有利的。第一,因?yàn)橹挥蠥β內(nèi)的某些表位誘導(dǎo)有用的治療早老性癡呆的免疫原性應(yīng)答,所以同樣劑量的含有這類表位的片段混合物比一劑完整的Aβ提供更高摩爾濃度的有效免疫原性表位。第二,Aβ的某些免疫原性片段產(chǎn)生針對(duì)淀粉狀蛋白的免疫原性應(yīng)答,而不產(chǎn)生針對(duì)衍生Aβ的APP蛋白的顯著免疫原性應(yīng)答。第三,Aβ的片段就生產(chǎn)而論由于其大小較短而比完整Aβ簡(jiǎn)單。第四,Aβ的片段不以與完整Aβ相同的方式聚集,使藥用組合物的制備及其給藥簡(jiǎn)單化。第五,全長(zhǎng)Aβ對(duì)細(xì)胞有毒性,但片段卻沒(méi)有毒性,并且Aβ聚集物可以作為種子起作用以加速病斑沉積,但未聚集的片段則不會(huì)。第六,Aβ具有其可以固定和激活經(jīng)典和替代補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的獨(dú)特特性。具體地說(shuō),它先與Clq結(jié)合,最終與C3bi結(jié)合。該締合促進(jìn)與巨噬細(xì)胞的結(jié)合,導(dǎo)致B細(xì)胞的活化。另外,C3bi進(jìn)一步降解,然后以依賴T細(xì)胞的方式與B細(xì)胞上的CR2結(jié)合,導(dǎo)致這些細(xì)胞的活化增加10,000倍。該機(jī)制使Aβ產(chǎn)生的免疫應(yīng)答超過(guò)其它抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(Bradt等,Complement-dependent Proinflammatory Properties of theAlzheimer′Disease β-Peptide(早老性癡呆β-肽的補(bǔ)體依賴性促炎特性),J.Exp.Med.Vol.188,第431-438頁(yè)(1998);Thornton等,Clin.Exp.Immunol.Vol.104,第531-7頁(yè)(1996);Jacquier-Sarlin等,Immunologyvol.84,第164-70頁(yè)(1995)。
Aβ的某些免疫原性片段具有來(lái)自天然肽的至少2、3、5、6、10或20個(gè)連續(xù)氨基酸的序列。某些免疫原性片段具有來(lái)自Aβ不超過(guò)10、9、8、7、5或3個(gè)連續(xù)殘基。優(yōu)選的免疫原性片段包括Aβ的殘基1-42。在某些方法中,所述抗體與Aβ的殘基16-21內(nèi)的表位特異性地結(jié)合。在某些方法中,所述抗體與Aβ的殘基13-21內(nèi)的表位特異性地結(jié)合。在某些方法中,所述抗體與Aβ的殘基10-21內(nèi)的表位特異性地結(jié)合。在某些方法中,所述抗體與Aβ的殘基10-16內(nèi)的表位特異性地結(jié)合。在某些方法中,所述抗體與Aβ的殘基25-35內(nèi)的表位特異性地結(jié)合。標(biāo)識(shí)符Aβ16-21例如表示包括Aβ的殘基16-21而缺失Aβ的其它殘基的片段。其它次優(yōu)選的片段包括Aβ1-5、1-6、1-7、1-10、3-7、1-3和1-4。這些片段要求臨用前根據(jù)所述實(shí)施例中描述的清除或防止淀粉狀蛋白沉積的活性進(jìn)行篩選。在某些方法中使用在天然存在形式的Aβ中存在的缺失至少1個(gè)、有時(shí)缺失至少5個(gè)或10個(gè)N末端或C端氨基酸的片段。例如,從Aβ43的C末端起缺失5個(gè)氨基酸的片段包括從Aβ的N末端起前38個(gè)氨基酸。除非另有說(shuō)明,對(duì)于Aβ包括上述的天然人氨基酸序列以及類似物,包括等位基因變異體、物種變異體和誘導(dǎo)變異體。類似物通常在1個(gè)、2個(gè)或幾個(gè)位置上常常由于保守取代而與天然存在的肽不同。類似物通常表現(xiàn)出與天然肽有至少50%序列同一性,優(yōu)選60%、70%、80%序列同一性,最優(yōu)選90%序列同一性。某些類似物也包括非天然氨基酸或N端或C端氨基酸在1個(gè)、2個(gè)或幾個(gè)位置上的修飾物。例如,Aβ的1位和/或7位的天然天冬氨酸殘基可以被異天冬氨酸取代。非天然氨基酸的實(shí)例是D-氨基酸、α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸和異天冬氨酸。如下所述,片段和類似物可以根據(jù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中相對(duì)于未治療或安慰劑對(duì)照的預(yù)防或治療功效進(jìn)行篩選。
Aβ、其片段和類似物可以通過(guò)固相肽合成或重組表達(dá)來(lái)合成,或者可以從天然來(lái)源獲得。自動(dòng)肽合成儀是市售的,可得自許多供應(yīng)商,例如Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,California。重組表達(dá)可以在細(xì)菌例如大腸桿菌(E.coli)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。重組表達(dá)方法描述于Sambrook等,Molecular CloningALaboratory Manual(C.S.H.P.Press,NY 2d ed.,1989)。某些形式的Aβ肽也是市售的(例如American Peptides Company,Inc.,Sunnyvale,CA和California Peptide Research,Inc.Napa,CA)。
治療肽也包括較長(zhǎng)的多肽,包括例如Aβ肽的活性片段加上其它氨基酸。其它氨基酸可以包括具有佐劑特性或免疫刺激特性的那些氨基酸以及用來(lái)增加所述肽的穩(wěn)定性的那些氨基酸。例如,優(yōu)選的肽包括含Aβ區(qū)段與異源氨基酸序列融合的融合蛋白,所述融合蛋白誘導(dǎo)針對(duì)所述異源氨基酸序列的輔助T細(xì)胞應(yīng)答,從而誘導(dǎo)針對(duì)所述Aβ區(qū)段的B細(xì)胞應(yīng)答。如下所述,這樣的多肽可以在動(dòng)物模型中相對(duì)于未治療或安慰劑對(duì)照的預(yù)防或治療功效進(jìn)行篩選。所述Aβ肽、類似物、活性片段或其它多肽可以以締合形式、多聚體形式或解離形式給予。治療肽也包括單體和寡聚體免疫原性肽的多聚體。更具體地講,可供本發(fā)明用的治療肽產(chǎn)生或誘導(dǎo)針對(duì)淀粉狀蛋白的免疫應(yīng)答。抗體也可以結(jié)合外周的可溶性形式以用作庫(kù),并且驅(qū)動(dòng)Aβ從腦轉(zhuǎn)移到外周,通過(guò)調(diào)節(jié)從CNS至外周的Aβ平衡或者與外周的Aβ形成穩(wěn)定的復(fù)合物,而促進(jìn)從腦中清除Aβ。因此,這樣肽包括但不限于組分本身及其變異體、誘導(dǎo)抗所述組分抗體和/或與抗所述組分抗體交叉反應(yīng)的所述組分的類似物和模似物以及誘導(dǎo)和/或與所述淀粉狀蛋白肽特異性地反應(yīng)的抗體或T細(xì)胞。免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以是主動(dòng)的,如當(dāng)給予免疫原以在患者體內(nèi)誘導(dǎo)與所述組分反應(yīng)的抗體或T細(xì)胞,或者是被動(dòng)的,如當(dāng)給予本身與患者體內(nèi)的淀粉狀蛋白肽結(jié)合的抗體時(shí)。用于誘導(dǎo)或產(chǎn)生針對(duì)淀粉狀蛋白的免疫應(yīng)答的示例性肽如下所述。
一大類優(yōu)選的抗淀粉狀蛋白肽由衍生自淀粉狀蛋白的肽組成。如上所述,淀粉狀蛋白性疾病的標(biāo)志是主要由原纖維組成的淀粉狀蛋白病斑在一種或多種器官中的沉積,該原纖維進(jìn)而構(gòu)成特征性淀粉狀蛋白或肽。按照本發(fā)明,這樣的淀粉狀蛋白或肽組分是有效用于誘導(dǎo)抗淀粉狀蛋白免疫應(yīng)答的肽。表1總結(jié)了為各種淀粉狀蛋白性疾病特征性的示例性原纖維形成蛋白。按照本發(fā)明的該方面,給予患者或易感個(gè)體一種包括合適淀粉狀蛋白或肽(包括其同系物或片段)的免疫刺激性組合物,達(dá)到對(duì)所述淀粉狀蛋白性疾病的治療或預(yù)防。
用于治療上述遺傳性形式的淀粉狀蛋白病的其它制劑包括產(chǎn)生針對(duì)凝溶膠蛋白片段的免疫應(yīng)答的組合物,以治療遺傳性系統(tǒng)性淀粉狀蛋白?。划a(chǎn)生針對(duì)突變?nèi)芫傅鞍?Alys)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療遺傳性神經(jīng)?。划a(chǎn)生針對(duì)纖維蛋白原的突變?chǔ)伶?AfibA)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療非神經(jīng)病形式的淀粉狀蛋白病表現(xiàn)如腎病;和產(chǎn)生針對(duì)突變抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)的免疫應(yīng)答的組合物,以治療冰島中報(bào)道的一種遺傳性腦血管病。另外,某些遺傳形式的朊病毒病(例如克-雅病(CJD)、格-施-沙綜合征(GSS)和致死性家族性失眠癥(FFI))的特征為朊病毒蛋白的突變同種型PrPSc。按照本發(fā)明,該蛋白可用于治療和預(yù)防PrP病斑的沉積的治療組合物中。
如上所述,系統(tǒng)性或病灶性淀粉狀蛋白沉積也與衰老有關(guān)。本發(fā)明的再一方面是這樣的沉積可以通過(guò)給予易感個(gè)體由與這種衰老相關(guān)的一種或多種蛋白組成的組合物進(jìn)行預(yù)防或治療。因此,通常在老年人的心臟組織中發(fā)現(xiàn)由衍生自野生型TTR的ATTR組成的病斑。同樣,某些老年人可以發(fā)生Aβ在其腦中的無(wú)癥狀纖維病灶性沉積;Aβ肽療法(如本文詳述的)可經(jīng)批準(zhǔn)后用于這樣的個(gè)體中。作為再一個(gè)實(shí)例,但并不限于此,有許多作為本發(fā)明治療方法的候選疾病的另外的非遺傳性形式的淀粉狀蛋白性疾病。β2微球蛋白原纖維病斑通常發(fā)生在接受長(zhǎng)期血透或腹膜透析的患者中。按照本發(fā)明,這樣的患者可以用針對(duì)β2微球蛋白或更優(yōu)選其免疫原性表位的治療組合物進(jìn)行治療。
分泌激素的腫瘤也可以包括激素性淀粉狀蛋白病斑,所述病斑的構(gòu)成一般為受影響的特定內(nèi)分泌器官的特征。因此,這樣的原纖維可能由多肽激素例如降鈣素(甲狀腺的髓樣癌)、胰島淀粉狀蛋白多肽(存在于大多數(shù)II型糖尿病患者中)和心房鈉尿肽(獨(dú)立的心房淀粉狀蛋白病)構(gòu)成。本發(fā)明也考慮針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的主動(dòng)脈內(nèi)膜中形成的淀粉狀蛋白沉積的組合物。例如,Westermark等描述了形成這種病斑的載脂蛋白A的69個(gè)氨基酸N末端片段(Westermark等Am.J.Path.1471186-92,1995);本發(fā)明的治療組合物包括針對(duì)這種片段以及該片段本身的免疫肽。
上面的討論集中在可以用作治療肽以治療或預(yù)防各種形式的淀粉狀蛋白性疾病的淀粉狀蛋白原纖維組分。
所述治療肽也可以是天然存在的或突變的原纖維肽或蛋白的活性片段或類似物,所述活性片段或類似物含有給予人后誘導(dǎo)相似的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答的表位。免疫原性片段通常具有來(lái)自天然肽的至少3、5、6、10或20個(gè)連續(xù)氨基酸的序列。示例性的Aβ肽免疫原性片段包括Aβ殘基16-21、殘基13-21、殘基10-21、殘基10-16、殘基25-35殘基10-22、殘基13-22、殘基16-22。在某些方法中,所述抗體與包含Aβ的游離N末端殘基或C末端殘基的表位結(jié)合。
在某些方法中使用在天然存在形式的原纖維組分中存在的缺失至少1個(gè)、有時(shí)缺失至少5個(gè)或10個(gè)N端或C端氨基酸的片段。例如,從Aβ43的C末端起缺失5個(gè)氨基酸的片段包括從Aβ的N末端起前38個(gè)氨基酸。在某些方法中優(yōu)選Aβ N端一半的片段。類似物包括等位基因變異體、物種變異體和誘導(dǎo)變異體。類似物通常在1個(gè)或幾個(gè)位置上常常由于保守取代而與天然存在的肽不同。類似物通常表現(xiàn)出與天然肽有至少80%或90%的序列同一性。某些類似物也包括非天然氨基酸或N端或C端氨基酸的修飾物。非天然氨基酸的實(shí)例是α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、T-N-甲基精氨酸。
一般而言,本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到,按照本發(fā)明該方面設(shè)計(jì)的片段和類似物可以根據(jù)如下所述的與天然存在的原纖維組分的交叉反應(yīng)性和/或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中的預(yù)防或治療功效進(jìn)行篩選。這樣的片段或類似物可以用于本發(fā)明的治療組合物中,如果其免疫反應(yīng)性和動(dòng)物模型功效大致等于或大于對(duì)淀粉狀蛋白原纖維組分所測(cè)定的相應(yīng)參數(shù)。
這樣的肽、蛋白、或片段、類似物和其它成淀粉樣肽可以按照本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)固相肽合成或重組表達(dá)來(lái)合成,或者可以從天然來(lái)源獲得。本文中引用的多個(gè)參考文獻(xiàn)并結(jié)合本文中提供的有關(guān)特定原纖維組分的描述提供了示例性的原纖維組合物、原纖維的提取方法、原纖維肽或蛋白組分的序列。另外,其它組合物、提取方法和測(cè)序方法是本領(lǐng)域已知的,希望制備和使用這種組合物的人員可利用這些已知技術(shù)。自動(dòng)肽合成儀可以用來(lái)制備這樣的組合物,并且在市場(chǎng)上可從多個(gè)生產(chǎn)商例如Applied Biosystems(Perkin Elmer;Foster City,California)獲得,并且合成肽的制備程序是本領(lǐng)域已知的。重組表達(dá)可以在細(xì)菌例如大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行;或者,可以利用本領(lǐng)域已知的無(wú)細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)各種蛋白。重組表達(dá)方法描述于Sambrook等,Molecular CloningA Laboratory Manual(C.S.H.P.Press,NY 2d ed.,1989)。某些肽和蛋白也是市售的;例如某些形式的Aβ肽可得自以下供應(yīng)商American Peptides Company,Inc.,Sunnyvale,California和California Peptide Research,Inc.Napa,California)。
治療肽也可以由包括例如活性肽淀粉狀蛋白片段或類似物加上其它氨基酸在內(nèi)的較長(zhǎng)多肽組成。例如,Aβ肽可以為完整的APP蛋白或其區(qū)段例如始于Aβ N末端并持續(xù)至APP末端的C-100片段。這樣的多肽可以根據(jù)如下所述的在動(dòng)物模型中的預(yù)防或治療功效進(jìn)行篩選。所述Aβ肽、類似物、活性片段或其它多肽可以以締合形式(即作為淀粉狀蛋白肽)或解離形式例如寡聚體、單體或可溶性形式給予。治療肽也可以包括單體和寡聚體免疫原性肽或綴合物或載體蛋白的多聚體,和/或如上所述,可以將其加入到其它原纖維組分中,以提供范圍更廣的抗淀粉狀蛋白病斑活性。
在再一個(gè)變異中,免疫原性肽例如Aβ的片段可以通過(guò)作為免疫原性組合物的組成部分的病毒或細(xì)菌來(lái)呈遞。將編碼免疫原性肽的核酸摻入到病毒或細(xì)菌的基因組或附加體中,任選的是,所述核酸以使所述免疫原性肽作為分泌型蛋白或者作為與病毒外表面蛋白或細(xì)菌的跨膜蛋白的融合蛋白表達(dá)的方式摻入,致使所述肽被展示。這樣的方法中所用的病毒或細(xì)菌應(yīng)該是非致病性的或者是減毒的。合適的病毒包括腺病毒、HSV、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)和其它甲病毒、皰疹性口腔炎病毒(vesicularstomatitis virus)和其它彈狀病毒、痘苗病毒和禽痘病毒。合適的細(xì)菌包括沙門氏菌屬(Salmonella)和志賀氏菌屬(Shigella)。免疫原性肽與HBV的HBsAg的融合尤其適合。治療肽也包括不一定與Aβ有顯著氨基酸序列相似性但仍然用作Aβ的模擬物并且誘導(dǎo)相似的免疫應(yīng)答的肽和其它化合物。例如,任何形成β折疊的肽和蛋白可以根據(jù)適應(yīng)性進(jìn)行篩選。也可以使用針對(duì)Aβ或其它成淀粉樣肽的單克隆抗體的抗獨(dú)特型抗體。這樣的抗獨(dú)特型抗體模擬所述抗原并且產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答(參見(jiàn)Essential Immunology(Poit編著,BlackwellScientific Publications,Palo Alto,6th ed.),第181頁(yè))。非Aβ肽的肽應(yīng)該誘導(dǎo)針對(duì)以上列舉的Aβ的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選區(qū)段(例如10-16、10-21、13-21、16-21和25-35)的免疫原性應(yīng)答。這樣的肽最好誘導(dǎo)特異性地針對(duì)這些區(qū)段之一而不針對(duì)Aβ的其它區(qū)段的免疫原性應(yīng)答。
肽或其它化合物的隨機(jī)文庫(kù)也可以根據(jù)適應(yīng)性進(jìn)行篩選。組合文庫(kù)可以根據(jù)可以以分步方式合成的許多類型的化合物來(lái)產(chǎn)生。這樣的化合物包括多肽、β-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮雜、寡聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)。所述化合物的大組合文庫(kù)可以通過(guò)在以下專利文獻(xiàn)中描述的編碼合成文庫(kù)(ESL)方法來(lái)構(gòu)建Affymax的WO 95/12608、Affymax的WO 93/06121、ColumbiaUniversity的WO 94/08051、Pharmacopeia的WO 95/35503和Scripps的WO 95/30642(每個(gè)專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中用于所有目的)。肽文庫(kù)也可通守噬菌體展示法來(lái)產(chǎn)生。參見(jiàn)例如Devlin的WO91/18980。
組合文庫(kù)和其它化合物根據(jù)適應(yīng)性進(jìn)行初篩,即通過(guò)測(cè)定其與已知對(duì)Aβ或其它成淀粉樣肽例如ATTR特異性的抗體或淋巴細(xì)胞(B或T)結(jié)合的能力。例如,可以用抗Aβ或任何其它目標(biāo)成淀粉樣肽的多克隆血清或單克隆抗體進(jìn)行初篩。然后對(duì)通過(guò)這樣的篩選鑒定的化合物誘導(dǎo)針對(duì)Aβ或其它成淀粉樣肽的抗體或反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的能力進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如,可以在用淀粉狀蛋白肽預(yù)包被的微量滴定板上對(duì)多個(gè)稀釋度的血清進(jìn)行測(cè)試,并且可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA,以測(cè)試抗Aβ的反應(yīng)性抗體。然后如實(shí)施例中描述,可以在有發(fā)生產(chǎn)生淀粉狀蛋白性疾病傾向的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中測(cè)試化合物的預(yù)防和治療功效。這樣的動(dòng)物包括例如攜帶Games等(參見(jiàn)上文)描述的APP的717突變的小鼠和攜帶APP的670/671 Swedish突變的小鼠,如以下文獻(xiàn)所描述的McConlogue等,US 5,612,486和Hsiao等,Science 274,99(1996);Staufenbiel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,13287-13292(1997);Sturchler-Pierrat等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,13287-13292(1997);Borchelt等,Neuron 19,939-945(1997))。同樣的篩選方法可以用在其它潛在肽例如上述Aβ的片段、Aβ的類似物和較長(zhǎng)的肽(包括Aβ)上。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到,針對(duì)其它淀粉狀蛋白病斑組分的免疫應(yīng)答也可有效用于預(yù)防、阻止或減慢淀粉狀蛋白性疾病的病斑沉積。這樣的組分可以是病斑中原纖維的次要組分或者與原纖維結(jié)合或原纖維形成相關(guān),需要說(shuō)明的是,在整個(gè)機(jī)體中是普遍存在的或者對(duì)淀粉狀蛋白沉積是相對(duì)非特異性的組分,一般不太適合用作治療靶。
因此,本發(fā)明的再一發(fā)現(xiàn)是誘導(dǎo)針對(duì)特定病斑組分的免疫應(yīng)答的肽在治療或預(yù)防淀粉狀蛋白性疾病的進(jìn)程中是有用的。本小節(jié)提供有關(guān)幾個(gè)示例性淀粉狀蛋白病斑相關(guān)分子的背景。按照本發(fā)明,誘導(dǎo)針對(duì)任何上述分子的免疫應(yīng)答單獨(dú)或結(jié)合免疫治療組合物,所述免疫治療組合物針對(duì)上述原纖維組分或針對(duì)下述任何其它非原纖維形成組分,提供另外的抗淀粉狀蛋白治療方案。如本文中所述,基于這樣的病斑組分的被動(dòng)免疫方案也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
作為實(shí)例,synuclein是一種在結(jié)構(gòu)上與載脂蛋白相似的但存在于神經(jīng)元胞質(zhì)溶膠、特別是在突觸前末梢附近的蛋白。該蛋白至少有3種形式,稱為α、β和γ synuclein。最近,已經(jīng)表明,α和β synuclein在某些淀粉狀蛋白性疾病、特別是早老性癡呆中參與淀粉狀蛋白沉積的成核作用。(Clayton,D.F.等,TINS 21(6)249-255,1998)。更具體地講,α和β synuclein的NAC結(jié)構(gòu)域的片段(殘基61-95)已從早老性癡呆患者的淀粉狀蛋白病斑中分離出來(lái);事實(shí)上,該片段約包含所述病斑的10%,在用十二烷基硫酸鈉(SDS)增溶后仍是不溶性的。(George,J.M.等,Neurosci.News 112-17,1995)。此外,據(jù)報(bào)道,全長(zhǎng)αsynuclein及其NAC片段在體外加速β-淀粉狀蛋白肽聚集成不溶性淀粉狀蛋白。(Clayton,參見(jiàn)上文)。
與淀粉狀蛋白病斑相關(guān)的其它組分包括非肽組分。例如,基底膜聚糖和基底膜聚糖源性糖胺聚糖是在早老性癡呆和其它CNS和系統(tǒng)性淀粉狀蛋白病的含有Aβ的淀粉狀蛋白病斑(包括與糖尿病相關(guān)的淀粉不溶素病斑)中存在的硫酸肝素大蛋白聚糖。已經(jīng)表明這些化合物增加Aβ原纖維形成。已經(jīng)表明基底膜聚糖的核心蛋白和糖胺聚糖鏈參與結(jié)合Aβ。另外的糖胺聚糖、準(zhǔn)確地說(shuō)是硫酸皮膚素、軟骨素-4-硫酸和聚硫酸戊聚糖常常在各種類型的淀粉狀蛋白病斑中被發(fā)現(xiàn),并且也顯示其增加原纖維形成。硫酸葡聚糖也具有這一特性。當(dāng)使所述分子去硫酸時(shí),這種增加顯著降低。針對(duì)硫酸化形式的糖胺聚糖(包括特定的糖胺聚糖本身)的免疫原性治療藥物或者作為一期治療或者作為二期治療構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。這樣的分子以及含有所述分子的合適治療組合物的生產(chǎn)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
免疫程序接受本發(fā)明疫苗的宿主中存在的激發(fā)抗體結(jié)合在Aβ(16-21)表位或其它表位例如Aβ(10-21)、Aβ(13-21)、Aβ(10-22)、Aβ(13-22)、Aβ(16-22)和Aβ的N末端區(qū)域或C末端區(qū)域并且可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)淀粉狀蛋白生成。本發(fā)明的疫苗使免疫宿主產(chǎn)生有效的抗成淀粉樣抗體。
建議的免疫程序如下a)用全-D肽制備疫苗,所述全-D肽具有與天然存在的β淀粉狀蛋白肽即Aβ(全-L)的序列基本相同的序列。所述全-D肽包括一種全長(zhǎng)Aβ(1-42,全-D)、一種衍生自Aβ(1-42,全-D)的免疫原性片段的肽和一種相關(guān)的肽模擬物;b)用所述疫苗免疫宿主,以在所述宿主體內(nèi)產(chǎn)生具有能夠防止原纖維生成、相關(guān)細(xì)胞毒性和神經(jīng)變性的結(jié)合部位的抗體。
合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于適合于以下給藥途徑的任何非免疫原性藥用佐劑例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)經(jīng)口、胃腸外、經(jīng)鼻、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、血管內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)(IA)、肌內(nèi)(IM)和皮下(SC)。
所述藥用載體可以含有將抗原呈遞給抗原呈遞細(xì)胞的溶媒。溶媒的實(shí)例是脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物、微流體化水包角鯊烯型乳劑、可以由聚乳酸/乳乙醇酸(PLGA)組成的微球體。已確定尺寸規(guī)格的微粒(<5微米)包括但不限于水包油型微乳劑(MF59)和聚合微粒。
本發(fā)明的載體也可以包括化學(xué)和基因佐劑或免疫刺激劑,以增強(qiáng)免疫應(yīng)答或增加免疫原的抗原性。這些佐劑或免疫刺激劑通過(guò)數(shù)種機(jī)制如淋巴樣細(xì)胞募集、細(xì)胞因子誘導(dǎo)和促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞等發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)特性。細(xì)胞因子佐劑包括但不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-12、GM-CSF、合成胞壁酰二肽類似物或單磷脂酰脂質(zhì)A。其它化學(xué)佐劑或免疫刺激劑包括但不限于乳酸菌、Al(OH)3、胞壁酰二肽和皂苷。微生物佐劑的實(shí)例包括但不限于CpG基序、弗氏佐劑、胞壁酰二肽、LPS衍生物、熱激蛋白(HSP)、脂質(zhì)A衍生物、多糖、霍亂毒素、滅活百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和LT(淋巴毒素大腸桿菌)。非微生物佐劑的實(shí)例包括但不限于鋁鹽、明礬、礦物油、免疫刺激復(fù)合體(iscoms)、脂質(zhì)體、病毒體、archaeosomes、轉(zhuǎn)鐵體、非離子表面活性劑囊泡、蝸牛殼形物(cochleates)、蛋白體、磷酸鈣、DDA(二甲基二(十八烷基)溴化銨)、細(xì)胞因子、激素和C3d。這樣的佐劑是本領(lǐng)域眾所周知的。
可以將所述肽與調(diào)節(jié)循環(huán)肽的半壽期的載體偶聯(lián)。這將會(huì)使保護(hù)周期受到控制。所述肽-載體也可以在佐劑中乳化并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)免疫途徑給予。
可以給予本發(fā)明的組合物和方法,以治療性或預(yù)防性地治療與淀粉狀蛋白-β原纖維形成、聚集或沉積相關(guān)的疾病。本發(fā)明的組合物和方法也可以利用任一下述機(jī)制用來(lái)減緩淀粉狀蛋白-β相關(guān)疾病的病程,以下所述機(jī)制是說(shuō)明性的但并不限于此,即通過(guò)減慢淀粉狀蛋白-β原纖維形成或沉積的速率;通過(guò)降低淀粉狀蛋白-β沉積的程度;通過(guò)抑制、防止或減少淀粉狀蛋白-β原纖維形成;通過(guò)抑制由淀粉狀蛋白-β誘導(dǎo)的神經(jīng)變性或細(xì)胞毒性;通過(guò)抑制淀粉狀蛋白-β誘導(dǎo)的炎癥;通過(guò)增加從腦中清除淀粉狀蛋白-β;或者通過(guò)降低淀粉狀蛋白β40或淀粉狀蛋白-β42肽在腦或血漿中的水平。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述方法用來(lái)治療早老性癡呆(例如散發(fā)性或家族性AD)。所述方法也可以用來(lái)預(yù)防性或治療性地治療淀粉狀蛋白-β沉積的其它臨床表現(xiàn)例如在唐氏綜合征患者中以及在腦淀粉狀蛋白性血管病、遺傳性腦淀粉狀蛋白性血管病、遺傳性腦出血或出血性中風(fēng)的患者中的臨床表現(xiàn)。
另外,APP(β-淀粉狀蛋白前體蛋白)以及淀粉狀蛋白-β蛋白在肌肉纖維中的異常累積涉及散發(fā)性包涵體肌炎(IBM)的病理(Askanas,V.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931314-1319;Askanas,V.等(1995)Current Opinion in Rheumatology 7486-496)。因此,本發(fā)明的化合物可以用來(lái)預(yù)防性或治療性地治療其中淀粉狀蛋白-β蛋白異常沉積在非神經(jīng)部位的疾病,例如通過(guò)使所述化合物傳遞至肌肉纖維而治療IBM。
本發(fā)明的疫苗多半通過(guò)胃腸外例如血管內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)(IA)、肌內(nèi)(IM)、皮下(SC)、經(jīng)皮等途徑給予。在某些情況下,給藥可以是經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、經(jīng)皮或氣霧劑,其中所述疫苗的性質(zhì)使得可以傳遞至血管系統(tǒng)。通常,使用一次注射,雖然必要時(shí)可以使用不止一次注射。通常,初次免疫后,還經(jīng)數(shù)周間隔時(shí)間,采用同一抗原或者必要時(shí)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步修飾的抗原進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫。所述佐劑或免疫刺激劑也可以相同或者必要時(shí)也可以不同。所述疫苗可以通過(guò)任何合適手段給予,包括注射器、套管針、導(dǎo)管等。給藥最好是血管內(nèi),其中給藥部位對(duì)于本發(fā)明并不是關(guān)鍵性的,優(yōu)選血液快速流動(dòng)的部位例如靜脈內(nèi)即外周或中央靜脈。當(dāng)給藥與緩釋技術(shù)或保護(hù)性基質(zhì)結(jié)合使用時(shí),可以發(fā)現(xiàn)其它途徑。
本發(fā)明疫苗在預(yù)防和/或治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病中的用途可以通過(guò)產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)全-D肽的抗體并且測(cè)試所述抗體是否可以有效地抑制或防止天然淀粉狀蛋白肽(全-L)的原纖維生成加以證實(shí)。
制備依照本發(fā)明的疫苗所用的化合物具有以下式I的共同結(jié)構(gòu)R′-(P)-R″(I),其中P是一種原纖維或淀粉狀蛋白的全-D肽,例如β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、Aβ(1-42,全-D)和巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域(10-16,全-D)、其免疫原性片段、其免疫原性衍生物、其蛋白綴合物、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物;R′是一個(gè)N末端取代基,所述取代基選自·氫;·低級(jí)烷基,例如具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基,帶有或不帶有官能團(tuán),例如羧酸酯基、磺酸酯基和膦酸酯基;·芳族基團(tuán);·雜環(huán)基;和·酰基,例如烷基羰基、芳基羰基、磺?;挽Ⅴ;?;且R″是一個(gè)C末端取代基,例如羥基、烷氧基、芳氧基、未取代或取代的氨基。
R′和R″可以相同或不同;R′和R″的烷基或芳基可以被選自以下的有機(jī)官能團(tuán)進(jìn)一步取代鹵化物(F、Cl、Br和I)、羥基、烷氧基、芳氧基、羥基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲?;?、未取代或取代的氨基、磺基或烷氧基磺酰基、膦?;蛲檠趸Ⅴ;取?br>
術(shù)語(yǔ)“烷基”包括飽和脂族基,包括直鏈烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基)、支鏈烷基(例如異丙基、叔丁基、異丁基)、環(huán)烷基(例如脂環(huán)基)(例如環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基?!巴榛边€包括具有氧原子、氮原子、硫原子或磷原子取代一個(gè)或多個(gè)烴主鏈碳原子的烷基。在某些實(shí)施方案中,直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有6個(gè)或更少的碳原子(例如直鏈為C1-C6,支鏈為C3-C6),更優(yōu)選具有4個(gè)或更少的碳原子。同樣,優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-8個(gè)碳原子,更優(yōu)選在所述環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5個(gè)或6個(gè)碳原子?!癈1-C6”包括含有1-6個(gè)碳原子的烷基。
術(shù)語(yǔ)“烷基”既包括“未取代的烷基”,也包括“取代的烷基”,后者是指在所述烴主鏈的一個(gè)或多個(gè)碳上具有取代氫的取代基的烷基部分。這樣的取代基可以包括例如烷基、鏈烯基、鏈炔基、鹵素、羥基、烷羰氧基、芳羰氧基、烷氧羰基氧基、芳氧羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧羰基、氨羰基、烷基氨羰基、二烷基氨羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲?;碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亞硫酰基、磺酸酯基、氨磺?;?、亞磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳族或雜芳族部分。環(huán)烷基可以例如被上述取代基進(jìn)一步取代?!巴榛蓟被颉胺纪榛辈糠质潜环蓟〈耐榛?例如苯甲基(芐基))?!巴榛币舶ㄌ烊缓头翘烊话被岬膫?cè)鏈。
本文所用的“酰基”包括含有?;鶊F(tuán)(CH3CO-)或羰基基團(tuán)的化合物和部分?!叭〈孽;卑ㄒ粋€(gè)或多個(gè)氫原子被例如以下的基團(tuán)取代的酰基烷基、鏈炔基、鹵素、羥基、烷羰氧基、芳羰氧基、烷氧羰基氧基、芳氧羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧羰基、氨羰基、烷基氨羰基、二烷基氨羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、膦酰基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲?;碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亞硫?;⒒撬狨セ?、氨磺?;?、亞磺酰氨基、磺?;趸?、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳族或雜芳族部分即芳基羰基。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”包括閉環(huán)結(jié)構(gòu),例如包括一個(gè)或多個(gè)雜原子的3-10元環(huán)或4-7元環(huán)。雜環(huán)基可以是飽和或不飽和的雜環(huán)基,包括吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺例如氮雜環(huán)丁烷酮和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等。如上所述,所述雜環(huán)可以在一個(gè)或多個(gè)位置上被上述的取代基取代,例如鹵素、羥基、烷羰氧基、芳羰氧基、烷氧羰基氧基、芳氧羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、烷氧羰基、氨羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲?;碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?;?、亞磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基或芳族或雜芳族部分。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳族基團(tuán)”意指包括“芳基”取代基?!胺蓟卑ň哂蟹枷阈缘幕鶊F(tuán),包括可以包含0-4個(gè)雜原子的5元或6元單環(huán)芳族基團(tuán)以及具有至少一個(gè)芳族環(huán)的多環(huán)體系。芳基的實(shí)例包括苯、苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、異噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。此外,術(shù)語(yǔ)“芳基”包括多環(huán)芳基,例如三環(huán)、二環(huán),例如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亞甲二氧基苯基、喹啉、異喹啉、1,5-二氮雜萘(napthridine)、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脫氮嘌呤或吲嗪。在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的那些芳基也可以被稱為“芳基雜環(huán)基”、“雜環(huán)基”或“雜芳基”。如上所述,所述芳族環(huán)可以在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置上被上述取代基取代,例如鹵素、羥基、烷氧基、烷羰氧基、芳羰氧基、烷氧羰基氧基、芳氧羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、烷基氨羰基、芳烷基氨羰基、鏈烯基氨羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、鏈烯基羰基、烷氧羰基、氨羰基、烷硫基羰基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亞硫?;?、磺酸酯基、氨磺?;喕酋0被?、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或芳族或雜芳族部分。芳基也可以與非芳香的脂環(huán)或雜環(huán)稠合或橋連,以形成多環(huán)體系(例如四氫化萘、亞甲二氧基苯基)。
在官能團(tuán)為酸性的情況下,其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在官能團(tuán)為堿性的情況下,其藥學(xué)上可接受的鹽在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,P是一種能夠與淀粉狀蛋白或原纖維的至少一個(gè)區(qū)域相互作用的肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述優(yōu)選的化合物選自全長(zhǎng)肽、Aβ(1-42,全-D)及其由Aβ(1-40,全-D)、Aβ(1-35,全-D)、Aβ(1-28,全-D)和Aβ(10-21,全-D)組成的低級(jí)同系物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述優(yōu)選的化合物選自短肽,例如Aβ(1-7,全-D)、Aβ(10-16,全-D)、Aβ(13-21,全-D)、Aβ(16-21,全-D)、Aβ(36-42,全-D)AB(10-22全-D)、AB(13-22全-D)或AB(16-22全D)。所述肽可以通過(guò)去除任一末端或兩個(gè)末端的一個(gè)或多個(gè)殘基而被進(jìn)一步縮短。
所述優(yōu)選的化合物也可以是衍生自上述肽的全-D肽,即通過(guò)用其它氨基酸殘基或非氨基酸片段例如氨基烷烴磺酸殘基取代序列中的一個(gè)或多個(gè)殘基。
在再一個(gè)實(shí)施方案中,所述優(yōu)選的化合物可以與調(diào)節(jié)所述化合物的生物分布、免疫原性特性和半壽期的載體偶聯(lián)。
下列化合物是用于制備預(yù)防或治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗的示例性化合物
SEQ ID NO1Aβ(1-42,全-D)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIASEQ ID NO2Aβ(1-40,全-D)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVSEQ ID NO3Aβ(1-35,全-D)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMSEQ ID NO4Aβ(1-28,全-D)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKSEQ ID NO5Aβ(1-7,全-D)DAEFRHDSEQ ID NO6Aβ(10-16,全-D)YEVHHQKSEQ ID NO7Aβ(16-21,全-D)KLVFFASEQ ID NO8Aβ(10-21,全-D)YEVHHQKLVFFASEQ ID NO9Aβ(13-21,全-D)HHQKLVFFASEQ ID NO10 Aβ(36-42,全-D)VGGVVLASEQ ID NO11 Lys-Ile-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)
SEQ ID NO12Lys-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO13Lys-Phe-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO14Ala-Phe-Phe-Val-Leu-Lys(全-D)SEQ ID NO15Lys-Leu-Val-Phe(全-D)SEQ ID NO16Lys-Ala-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO17Lys-Leu-Val-Phe-Phe(全-D)SEQ ID NO18Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO19Lys-Ile-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO20Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO21Lys-Phe-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO22Ala-Phe-Phe-Val-Leu-Lys-NH2(全-D)SEQ ID NO23Lys-Leu-Val-Phe-NH2(全-D)SEQ ID NO24Lys-Ala-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO25Lys-Leu-Val-Phe-Phe-NH2(全-D)SEQ ID NO26Lys-Val-Val-Phe-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO27Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu全-D)SEQ ID NO28Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2(全-D)SEQ ID NO29His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(全-D)SEQ ID NO30Asp-Asp-Asp(全-D)SEQ ID NO31Lys-Val-Asp-Asp-Gln-Asp(全-D)
SEQ ID NO32His-His-Gln-Lys(全-D)SEQ ID NO33Phe-Phe-NH-CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO34Phe-Phe-NH-CH2CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO35Phe-Phe-NH-CH2CH2CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO36Phe-Tyr-NH-CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO37Phe-Tyr-NH-CH2CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO38Phe-Tyr-NH-CH2CH2CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO39HO3SCH2CH2-Phe-Phe(全-D)SEQ ID NO40HO3SCH2CH2CH2-Phe-Phe(全-D)SEQ ID NO41HO3SCH2CH2CH2CH2-Phe-Phe(全-D)SEQ ID NO42HO3SCH2CH2-Phe-Tyr(全-D)SEQ ID NO43HO3SCH2CH2CH2-Phe-Tyr(全-D)SEQ ID NO44HO3SCH2CH2CH2CH2-Phe-Tyr(全-D)SEQ ID NO45HO3SCH2CH2-Leu-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO46HO3SCH2CH2CH2-Leu-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO47HO3SCH2CH2CH2CH2-Leu-Val-Phe-Phe-Ala(全-D)SEQ ID NO48Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH-CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO49Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH-CH2CH2CH2SO3H(全-D)SEQ ID NO50Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH-CH2CH2CH2CH2SO3H(全-D)
SEQ ID NO51Aβ([L]10-15[D]16-21)Y[L]-E[L]-V[L]-H[L]-H[L]-Q[L]-K[D]-L[D]-V[D]-F[D]-F[D]-A[D]SEQ ID NO52Aβ([D]16-21[L]22-28)K[D]-L[D]-V[D]-F[D]-F[D]-A[D]-E[L]-D[L]-V[L]-G[L]-S[L]-N[L]-K[L]SEQ ID NO53His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val(全-D)SEQ ID NO54Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(全-D)SEQ ID NO55Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phc-Phe-Ala(全-D)以上列舉的化合物可以通過(guò)去除或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾,或者通過(guò)用其它氨基酸或非氨基酸部分或片段取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾。
下列化合物是通過(guò)用其它氨基酸取代一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基而衍生自化合物18(全-D KLVFFA-NH2;SEQ ID NO18)的示例性化合物SEQ ID NO56Lys-Leu-Val-Trp-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO57Lys-Leu-Val-Phe-Trp-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO58Lys-Leu-Val-Trp-Trp-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO59Lys-Leu-Val-Tyr-Phe-Ala-NFH2(全-D)SEQ ID NO60Lys-Leu-Val-Phe-Tyr-Ala-NH2(全-D)
SEQ ID NO61Lys-Leu-Val-Tyr-Tyr-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO62Lys-Leu-Bal-Thi-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO63Lys-Leu-Val-Phe-Thi-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO64Lys-Leu-Val-Thi-Thi-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO65Lys-Leu-Val-Cha-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO66Lys-Leu-Val-Phe-Cha-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO67Lys-Leu-Val-Cha-Cha-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO68Lys-Leu-Val-Pgly-Phe-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO69Lys-Leu-Val-Phe-Pgly-Ala-NH2(全-D)SEQ ID NO70Lys-Leu-Val-Pgly-Pgly-Ala-NH2(全-D).
對(duì)于上述化合物,術(shù)語(yǔ)Thi、Cha和Pgly分別是指噻吩丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸和苯甘氨酸。
用全-D或全-L KLVFFA免疫兔子。所得抗體效價(jià)的結(jié)果示于圖7。如圖7所示,本發(fā)明的疫苗引起抗體產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,用全-D或全-L KLH-淀粉狀蛋白-β片段([L]-淀粉狀蛋白-β 13-21和[D]淀粉狀蛋白-β 13-21)免疫成年TgCRND8小鼠??贵w效價(jià)的結(jié)果示于表2。
表2
本發(fā)明包括用本發(fā)明的疫苗觸發(fā)的各種類型的免疫應(yīng)答,例如應(yīng)用所述疫苗方法的淀粉狀蛋白療法。
按照本發(fā)明,也提供一種按照所用的免疫類型優(yōu)先觸發(fā)TH-2應(yīng)答或TH-1應(yīng)答的疫苗。通過(guò)誘發(fā)TH-2應(yīng)答,主要產(chǎn)生諸如IL-4、Il-10和TGF-β的抗炎細(xì)胞因子以及主要產(chǎn)生IgG1和IgG2b抗體類別。優(yōu)選這種類型的應(yīng)答,因?yàn)榭梢员苊釧D患者腦中的主要炎癥反應(yīng)。另一方面,即TH-1應(yīng)答,產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子例如IL-1、IL-6、TNF和IFN γ的促炎應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)。該類型的應(yīng)答更有可能觸發(fā)巨噬細(xì)胞群體的激活。然后,這些巨噬細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)體活化過(guò)程以及通過(guò)抗體介導(dǎo)的過(guò)程吞噬任何顆粒性沉積(例如病斑)。該方案對(duì)清除已形成的老年斑并且防止新原纖維沉積的形成將是有益的。然而,該應(yīng)答也將伴隨有可能對(duì)宿主有害的炎癥反應(yīng)。
這兩種方案(即TH-1和TH-2)都是有價(jià)值的。所用的抗原可以是含有以下區(qū)域的肽負(fù)責(zé)細(xì)胞粘著的區(qū)域即區(qū)域10-16、負(fù)責(zé)GAG結(jié)合部位的區(qū)域即13-16、負(fù)責(zé)β折疊的區(qū)域即16-21或C末端特異性區(qū)域即40-42。這些肽可以以優(yōu)選獲得TH-1應(yīng)答或TH-2應(yīng)答的方式呈遞,這取決于所用的佐劑類型或者取決于疫苗的給藥途徑。例如,通過(guò)經(jīng)鼻給藥的粘膜免疫是可行的,由于已知這樣的給藥途徑有利于產(chǎn)生TH-2應(yīng)答。
參考以下實(shí)施例,將更加容易地理解本發(fā)明,所給出的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明,而不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I在兔子或小鼠中進(jìn)行測(cè)試從原纖維生成淀粉狀蛋白中獲得的全-D肽疫苗的有效性的體外驗(yàn)證程序,以證明可以產(chǎn)生抗Aβ 16-21(全-D)的抗體(參見(jiàn)圖7)。對(duì)所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行測(cè)試,以證明所述抗體有效地防止天然Aβ(1-40,全-L)在體外的原纖維生成。用原纖維生成的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定評(píng)價(jià)活性,例如基于Thioflavine T、循環(huán)二向色性和溶解度的那些活性。
該方案也用來(lái)證實(shí)當(dāng)以全-D肽形式使用時(shí)最有效的是哪些Aβ肽區(qū)域,以制備抗原纖維生成的疫苗。所述實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行a)用一系列從Aβ(1-42)序列例如Aβ(16-21)、Aβ(10-21)、Aβ(13-21)等產(chǎn)生的重疊全-D肽免疫兔子或小鼠。
b)用免疫兔子或小鼠制備抗血清。
c)用上述原纖維生成的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定對(duì)這些抗血清進(jìn)行測(cè)試,以觀察Aβ序列的哪些部分產(chǎn)生最有效防止原纖維生成的抗血清。
實(shí)施例II抗D-Aβ(16-21)和L-Aβ(16-21)肽疫苗的抗體對(duì)原纖維生成的影響進(jìn)行一個(gè)用以測(cè)試針對(duì)D-Aβ(16-21)和L-Aβ(16-21)肽產(chǎn)生的抗體的抗原纖維生成活性的驗(yàn)證程序。
用D-Aβ(16-21)或L-Aβ(16-21)肽免疫兔子。通過(guò)ThT測(cè)定和電子顯微鏡(EM)測(cè)試所產(chǎn)生的抗體的抗原纖維生成活性。
通過(guò)Thioflavin T測(cè)定(ThT)(圖2和圖3)以及通過(guò)EM(圖4A-4C)看出,針對(duì)D和L形式的KLVFFA產(chǎn)生的抗體能夠阻斷原纖維生成過(guò)程。在ThT測(cè)定中,通過(guò)熒光隨時(shí)間的增加監(jiān)測(cè)原纖維的形成。如附圖所示,所述抗體能夠抑制這樣的熒光增加,證明這些抗體正在抑制原纖維生成。
從這些圖(圖2-4)中可以看出,針對(duì)D-肽產(chǎn)生的抗體的抗原纖維生成活性要比抗L抗體高。
這些結(jié)果也通過(guò)EM(圖4A-4C)加以證實(shí),其中當(dāng)與對(duì)照(圖4A)相比時(shí),抗D和抗L KLVFFA肽均阻斷原纖維形成。此外,抗D肽的抗原纖維生成活性(圖4B)再次比抗L肽(圖4C)高。這與ThT測(cè)定的結(jié)果一致,其中抗D肽抗體比抗L肽抗體在熒光減少方面更高。
實(shí)施例III抗體結(jié)合測(cè)定用針對(duì)KLVFFA肽(D型和L型)產(chǎn)生的抗體對(duì)腦切片進(jìn)行染色。如圖5A-5D和圖6A-6D所示,所述抗體不能與聚集的(ThioS陽(yáng)性)Aβ結(jié)合。從這兩組圖即對(duì)病斑(用ThioS)和Aβ肽(用所產(chǎn)生的抗體)染色的圖中可以看出,所述抗體識(shí)別細(xì)胞表面的Aβ,但不能與病斑結(jié)合。這些結(jié)果表明,抗KLVFFA肽抗體不與聚集的Aβ結(jié)合。這些結(jié)果清楚地證明,所述抗體僅識(shí)別非聚集的形式并且阻斷原纖維生成。由于具有這樣的活性,因此本發(fā)明的疫苗1)防止Aβ本身組構(gòu)成原纖維和2)防止由于這樣的抗體與不溶性形式結(jié)合所觸發(fā)的炎癥反應(yīng),因?yàn)樗隹贵w不能與聚集的Aβ結(jié)合所致。此外,由于Aβ保持可溶性形式,因此這樣的抗體可促進(jìn)在Aβ組構(gòu)成原纖維之前從腦中清除Aβ。這樣的抗體也將保持Aβ腦濃度與Aβ血漿濃度之間的有益平衡。
實(shí)施例IV抗D-和L-Aβ(13-21-KLH)肽疫苗的抗體對(duì)淀粉狀蛋白-β在腦和血漿中累積的影響用D或L肽免疫9周齡成年TgCRND8小鼠(該小鼠帶有表達(dá)人淀粉狀蛋白前體蛋白(hAPP)的轉(zhuǎn)基因),此后每2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫(總共注射5次)。最后一次加強(qiáng)免疫后10-14天處死所述小鼠,然后測(cè)定淀粉狀蛋白-β在所述小鼠腦和血漿中的累積。將腦組織如下勻漿首先,將腦組織冷凍,給冷凍組織稱重。然后將組織在4倍體積的含有1x蛋白酶抑制劑混合劑(Calbiochem#539131)的50mM Tris-HClpH 8.0的溶液中用Wheaton Overhead Stirrer(速度3.6)勻漿。將樣品渦旋,然后在Eppendorf離心機(jī)中以16,000xg于4℃離心20分鐘。將150μL上清液加入到250μL 8M guanidium/50mM Tris-HCl pH 8.0中。將混合物渦旋并貯存于-80℃。將沉淀解凍,渦旋下重懸于7倍體積的5M guanidium/50mM Tris pH8.0中并貯存于-80℃。將上清液和沉淀解凍并在Elma Ultrasonic浴中于80℃超聲處理15分鐘,然后在干冰上冷凍15分鐘,然后解凍并且在Elma Ultrasonic浴中于80℃超聲處理10分鐘。然后將樣品以16,000xg于4℃離心20分鐘,對(duì)上清液中的淀粉狀蛋白-β定量。用人β淀粉狀蛋白ELISA試劑盒(Biosource International,產(chǎn)品目錄號(hào)88-344),對(duì)淀粉狀蛋白-β40和淀粉狀蛋白-β42進(jìn)行定量。
用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測(cè)定具體的血漿抗體效價(jià)(示于表2,參見(jiàn)上文)。表2中的數(shù)據(jù)表明,用[D]13-21肽免疫要比用[L]13-21肽免疫在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效性方面高得多。
所得結(jié)果也表明,在用[D]13-21-KLH免疫后的TgCRND8小鼠腦中的可溶性和原纖維(不溶性)Aβ40水平(圖8A和圖8B)均降低、可溶性和原纖維Aβ42水平(圖9)均降低以及總Aβ水平(圖10A和圖10B)降低。所得結(jié)果表明,用D肽免疫在降低Aβ水平方面是有效的。此外,D肽比L肽的有效性高得多,因?yàn)閮H用D肽免疫降低Aβ水平,而用L肽免疫不降低Aβ水平。
實(shí)施例V針對(duì)淀粉狀蛋白-β的被動(dòng)免疫通過(guò)使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如Xenomouse(Abgenix,F(xiàn)reemont,CA)接觸抗原量的全-D淀粉狀蛋白-β(10-22)產(chǎn)生人源化抗體,并從所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中獲得所述人源化抗體??乖康姆秶鸀?0ng至10mg全-D淀粉狀蛋白-β肽??梢酝ㄟ^(guò)使用所述佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答,從而可以使用較低濃度的免疫原。通過(guò)ELISA或其它測(cè)定免疫應(yīng)答效價(jià)的方法監(jiān)測(cè)血清抗體水平??梢灾苯訌膭?dòng)物血清中回收所述抗體,或者可以從供產(chǎn)生雜交瘤系的免疫動(dòng)物中回收表達(dá)這種抗體的B細(xì)胞。通過(guò)G蛋白層析或類似的抗體純化法,從血清、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液中純化所述人源化抗體。
可以用第二種哺乳動(dòng)物或供體哺乳動(dòng)物直接產(chǎn)生的抗體或者用從來(lái)自供體哺乳動(dòng)物的免疫細(xì)胞中獲得的雜交瘤系間接產(chǎn)生的抗體免疫罹患淀粉狀蛋白相關(guān)疾病或障礙的第一種或受治療哺乳動(dòng)物,或者用所述抗體預(yù)防淀粉狀蛋白相關(guān)疾病或障礙。給第一種哺乳動(dòng)物提供治療或預(yù)防有效量的抗Aβ抗體??贵w片段或致敏免疫細(xì)胞例如B細(xì)胞、T細(xì)胞或致敏抗原呈遞細(xì)胞可以從供體、優(yōu)選人供體、更優(yōu)選同源人供體中獲得。根據(jù)所述技術(shù)和測(cè)定法的測(cè)量,治療有效劑量定義為使第一種哺乳動(dòng)物中的原纖維病斑的形成或質(zhì)量減少至少5-50%或更高的劑量。病斑形成或量減少100%或更高被認(rèn)為是治療終點(diǎn)。主治醫(yī)師或其它醫(yī)學(xué)專業(yè)人員可以監(jiān)測(cè)給藥方案,以達(dá)到所需的治療效應(yīng)或終點(diǎn)。
盡管結(jié)合具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明,但是應(yīng)當(dāng)明確的是可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步修改,并且本申請(qǐng)包括總體上按照本發(fā)明原理進(jìn)行的、包含屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知技術(shù)或常規(guī)技術(shù)的偏離本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容而可用于本發(fā)明上述必要特征以及屬于后附權(quán)利要求書(shū)范疇的任何變化、應(yīng)用或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療受治療者的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括給予所述受治療者抗原量的一種全-D淀粉狀蛋白-β肽,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽誘導(dǎo)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的免疫應(yīng)答,并且其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO1-70的序列有至少80%相同。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述全-D肽與淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)域相互作用,所述區(qū)域選自N末端區(qū)域或C末端區(qū)域、β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域、其免疫原性片段、其蛋白綴合物、其免疫原性衍生肽、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物。
3.權(quán)利要求2的方法,其中所述全-D肽還包含(a)一個(gè)N末端取代基,所述取代基選自氫;低級(jí)烷基,所述低級(jí)烷基為具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基;芳族基團(tuán);雜環(huán)基;和?;?;以及(b)一個(gè)C末端取代基,所述取代基選自羥基、烷氧基、芳氧基、未取代和取代的氨基。
4.權(quán)利要求3的方法,其中所述烷基或芳族基團(tuán)被選自以下的基團(tuán)進(jìn)一步取代鹵化物、羥基、烷氧基、芳氧基、羥基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲?;?、未取代的氨基、取代的氨基、磺基、烷氧基磺酰基、膦酰基和烷氧基膦酰基。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述全-D肽還包含酸官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式或酯形式。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述全-D肽還包含堿官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述全-D肽激發(fā)可溶性淀粉狀蛋白-β的清除,從而預(yù)防或降低淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、神經(jīng)變性或者降低或抑制病斑的形成。
8.一種用于預(yù)防和/或治療需要這種預(yù)防和/或治療的第一種哺乳動(dòng)物的淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法,所述方法包括將抗原量的一種全-D淀粉狀蛋白-β肽給予第二種哺乳動(dòng)物,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽誘導(dǎo)所述第二種哺乳動(dòng)物針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的免疫應(yīng)答,從所述第二種哺乳動(dòng)物回收所述抗體或免疫細(xì)胞,并且為所述第一種哺乳動(dòng)物提供治療或預(yù)防有效量的所述抗體或免疫細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO1-70的序列有至少80%相同。
10.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D肽與淀粉狀蛋白的至少一個(gè)區(qū)域相互作用,所述區(qū)域選自C末端區(qū)域、β折疊區(qū)域、GAG-結(jié)合部位區(qū)域、巨噬細(xì)胞粘著區(qū)域、其免疫原性片段、其蛋白綴合物、其免疫原性衍生肽、其免疫原性肽及其免疫原性肽模擬物。
11.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D肽還包含(a)一個(gè)N末端取代基,所述取代基選自氫;低級(jí)烷基,所述低級(jí)烷基為具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基;芳族基團(tuán);雜環(huán)基;和?;灰约?b)一個(gè)C末端取代基,所述取代基選自羥基、烷氧基、芳氧基、未取代和取代的氨基。
12.權(quán)利要求8的方法,其中所述烷基或芳族基團(tuán)被選自以下的基團(tuán)進(jìn)一步取代鹵化物、羥基、烷氧基、芳氧基、羥基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲?;?、未取代的氨基、取代的氨基、磺基、烷氧基磺?;㈧Ⅴ;屯檠趸Ⅴ;?。
13.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D肽還包含酸官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式或酯形式。
14.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D肽還包含堿官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式。
15.權(quán)利要求8的方法,其中所述全-D肽激發(fā)可溶性淀粉狀蛋白-β的清除,從而預(yù)防或降低淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、神經(jīng)變性或者降低或抑制病斑的形成。
16.一種用于改變哺乳動(dòng)物體內(nèi)淀粉狀蛋白-β的血清水平的方法,所述方法包括給予所述受治療者抗原量的一種全-D淀粉狀蛋白-β肽,其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽誘導(dǎo)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的免疫應(yīng)答,并且其中所述全-D淀粉狀蛋白-β肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO1-70的序列有至少80%相同。
17.權(quán)利要求16的方法,其中改變哺乳動(dòng)物體內(nèi)淀粉狀蛋白-β的血清水平有利于清除哺乳動(dòng)物體內(nèi)的可溶性淀粉狀蛋白-β或原纖維淀粉狀蛋白-β。
18.權(quán)利要求17的方法,其中清除所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的可溶性淀粉狀蛋白-β或原纖維淀粉狀蛋白-β,從而降低或抑制所述哺乳動(dòng)物腦中病斑的形成。
19.權(quán)利要求16的方法,其中所述全-D肽還包含(a)一個(gè)N末端取代基,所述取代基選自氫;低級(jí)烷基,所述低級(jí)烷基為具有1-8個(gè)碳原子的無(wú)環(huán)烷基或環(huán)烷基;芳族基團(tuán);雜環(huán)基;和酰基;以及(b)一個(gè)C末端取代基,所述取代基選自羥基、烷氧基、芳氧基、未取代和取代的氨基。
20.權(quán)利要求16的方法,其中所述烷基或芳族基團(tuán)被選自以下的基團(tuán)進(jìn)一步取代鹵化物、羥基、烷氧基、芳氧基、羥基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基甲?;⑽慈〈陌被?、取代的氨基、磺基、烷氧基磺?;?、膦酰基和烷氧基膦?;?。
21.權(quán)利要求16的方法,其中所述全-D肽還包含酸官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式或酯形式。
22.權(quán)利要求16的方法,其中所述全-D肽還包含堿官能團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽形式。
23.權(quán)利要求16的方法,其中所述全-D肽激發(fā)可溶性淀粉狀蛋白-β的清除,從而預(yù)防或降低淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性或神經(jīng)變性。
24.權(quán)利要求1的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是一種包含過(guò)量的淀粉狀蛋白-β肽的疾病,并且誘發(fā)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的所述免疫應(yīng)答,從而降低過(guò)量水平的所述淀粉狀蛋白-β肽,以治療或預(yù)防所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。
25.權(quán)利要求24的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是早老性癡呆。
26.權(quán)利要求24的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是腦淀粉狀蛋白性血管病。
27.權(quán)利要求8的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是一種包含過(guò)量的淀粉狀蛋白-β肽的疾病,并且誘發(fā)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的所述免疫應(yīng)答,從而降低過(guò)量水平的所述淀粉狀蛋白-β肽,以治療或預(yù)防所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是早老性癡呆。
29.權(quán)利要求27的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是腦淀粉狀蛋白性血管病。
30.權(quán)利要求16的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是一種包含過(guò)量的淀粉狀蛋白-β肽的疾病,并且誘發(fā)所述受治療者針對(duì)所述淀粉狀蛋白-β肽的所述免疫應(yīng)答,從而降低過(guò)量水平的所述淀粉狀蛋白-β肽,以治療或預(yù)防所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。
31.權(quán)利要求30的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是早老性癡呆。
32.權(quán)利要求30的方法,其中所述淀粉狀蛋白相關(guān)疾病是腦淀粉狀蛋白性血管病。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于立體化學(xué)的“非自身”抗原疫苗,用于預(yù)防和/或治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病。本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療早老性癡呆和其它淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的疫苗,所述疫苗克服了與使用天然存在的肽、蛋白或免疫原相關(guān)的缺陷。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1662554SQ02814967
公開(kāi)日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2002年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月29日
發(fā)明者F·格爾維斯, L·赫伯特, R·J·查利福爾, 孔憲起 申請(qǐng)人:神經(jīng)化學(xué)(國(guó)際)有限公司