專利名稱：Adamalysin的解離素結(jié)構(gòu)域在抗血管生成、抗侵入和抗轉(zhuǎn)移組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制在許多病理學(xué)情況如癌、炎癥、動脈硬化癥、和視網(wǎng)膜病理性血管生成中所涉及的血管生成(angiogenesis)、侵入(invasion)和轉(zhuǎn)移過程中的事件。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了人的內(nèi)皮細(xì)胞上存在的一種分子的一種片段具有抗血管生成、抗侵入和抗轉(zhuǎn)移的功能。本發(fā)明涉及由全部或部分解離素(disintegrin)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Adamalysin片段的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及Metargidin的解離素結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用(Krtzschmar等，1996)，下面將該結(jié)構(gòu)域的“抗血管生成的Metargidin肽”表示為“AMEP”。
與文獻(xiàn)中曾描述過的其它抗血管生成物質(zhì)相比，這個片段具有獨創(chuàng)性-同時抑制血管生成的所用階段內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖、其在不同的基質(zhì)底物上的粘附、毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成，和-誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(apoptosis)。
此外，出乎意外地，這種片段一方面具有抑制癌細(xì)胞侵入的能力，另一方面具有阻止轉(zhuǎn)移形成、特別是在其表面表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移形成的能力。
血管生成表示一種形態(tài)形成的過程，通過這種過程，通過對刺激發(fā)生的反應(yīng)，已經(jīng)存在的血管萌生形成了新的毛細(xì)血管。在體內(nèi)血管生成時，這些新生毛細(xì)血管由毛細(xì)血管或后毛細(xì)血管小靜脈產(chǎn)生，但不會由動脈、小動脈或靜脈產(chǎn)生。因此，血管生成因子是一種有可能引發(fā)和/或保持血管生成的分子，例如像FGF2?？寡苌梢蜃右蚨且环N通過作用于血管生成的一個或多個關(guān)鍵階段而抑制血管生成的分子。
粘附包括細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的能力。這種現(xiàn)象涉及存在于細(xì)胞表面的多種粘附分子。
細(xì)胞遷移的過程涉及能夠讓細(xì)胞降解基質(zhì)化合物的酶，以及保證細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合的粘附分子。此外，細(xì)胞骨架的動態(tài)結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞能夠改變運動所必需的粘附和脫離時間。
增殖是一種涉及隨著時間推移細(xì)胞發(fā)生分裂的現(xiàn)象。
凋亡(apoptosis)包括正常細(xì)胞按照復(fù)雜的程序啟動其固有自殺(稱之細(xì)胞死亡)的內(nèi)在能力。而Anoikis是由正常細(xì)胞發(fā)生凋亡后失去與基質(zhì)粘附所造成的一種形式。
侵入是一類解剖成分的過分增殖，由此導(dǎo)致鄰近的成分被該成分取代。
轉(zhuǎn)移是一種癌細(xì)胞病灶，它與先前存在的癌——所謂原發(fā)的癌——有關(guān)，但在遠(yuǎn)離后者的部位進(jìn)展，而不與后者相連。通過淋巴或血液途徑擴(kuò)散這些繼發(fā)的癌細(xì)胞病灶。
腫瘤的進(jìn)展與在不同器官中的擴(kuò)散取決于血管內(nèi)和血管周圍的血管化，也稱之血管生成(Folkman，1984)。針對血管生成過程進(jìn)行定向是一種新的治療方法，也是一場癌治療的革命。許多抗血管生成的分子正處于臨床實驗階段。
Vitaxin是人源化的抗整聯(lián)蛋白αvβ3抗體，其誘導(dǎo)對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制以及促凋亡作用(Brooks等，1994；Hammes等，1996)，但其不改變它們的遷移。整聯(lián)蛋白αvβ3是一種優(yōu)選地表達(dá)于新血管內(nèi)皮細(xì)胞和某些癌細(xì)胞的粘附分子。其與細(xì)胞外基質(zhì)中的某些化合物相互作用，具體地是玻連蛋白(vitronectin)、纖連蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白(laminin)、IV型膠原和纖維蛋白，因此誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附和遷移。大量地描述過整聯(lián)蛋白αvβ3在血管生成中的主要作用(綜述，Eliceori和Cheresh，2000)。
Marimastat可阻斷金屬蛋白酶的蛋白水解活性，因此抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，而對其細(xì)胞增殖沒有任何影響。這些金屬蛋白酶(MMP)事實上屬于一個大的酶家族，它們都能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)化合物，對內(nèi)皮細(xì)胞遷移是必需的。其它屬于絲氨酸蛋白酶的酶也參與細(xì)胞遷移，如尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)——當(dāng)它與膜表面錨定的受體(u-PAR)和纖溶酶發(fā)生結(jié)合。
所有這些藥物的目的是阻斷血管生成，但它們的作用限于這個過程的一個或兩個階段，AMEP則相反，它是多能性的。因此，AMEP不僅阻斷其最初所針對的整聯(lián)蛋白αvβ3的全部血管生成功能，即內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與粘附，而且它還令人驚奇地誘導(dǎo)完全抑制這些細(xì)胞的遷移，以及抑制毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成。它對這些細(xì)胞的促凋亡作用與它們的細(xì)胞周期改變不相關(guān)，這種促凋亡作用也成為其獨到之處。
此外，出乎意料地，AMEP同時具有很強(qiáng)的抗侵入和抗轉(zhuǎn)移能力。
Adamalysin，也稱ADAM(即“解離素和金屬蛋白(A Disintegrin AndMetalloprotein)”)，或MDC(即“富金屬蛋白、富解離素和富半胱氨酸蛋白(Metalloprotein-rich，Disintegrin-rich and Cysteine-rich protein)”)，是一類在細(xì)胞質(zhì)膜中錨定的蛋白質(zhì)。全部29個已經(jīng)描述的Adamalysin的共同結(jié)構(gòu)組成如下-金屬蛋白結(jié)構(gòu)域，其蛋白酶的催化活性依賴于鋅，-解離素結(jié)構(gòu)域，以及-富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和富EGF型重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Wolfsberg等，1995)。
但應(yīng)該提起，在全部Adamalysin中，僅十個含有一種具有催化活性的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。不同Adamalysin的生理學(xué)作用是極不相同的調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、釋放配體、激活受體、細(xì)胞融合(綜述，Primakoff和Myles，2000)。這些分子的作用方式還不得而知。
應(yīng)該將AMEP與蛇的解離素進(jìn)行區(qū)別，這在文獻(xiàn)中分兩個方面作過描述
-蛇的解離素對血管生成的不同步驟施加有限作用。例如，Accutin(Yeh等，1998)抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附在不同的基質(zhì)化合物上，并誘導(dǎo)其凋亡，而Salmosin(Kang等，1999)誘導(dǎo)抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附及其由FGF2誘導(dǎo)的增殖。
-AMEP還有一個優(yōu)點是源于人，因此它不具有蛇的解離素抗原特性，后者具有免疫原性，因此阻止把它們用作在抗癌治療需要長期治療中的藥物。
因此，本發(fā)明的目的是一種活性劑在制備用于抑制血管生成或侵入和/或形成轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，所述活性劑選自一種蛋白物質(zhì)或核酸分子，所述蛋白物質(zhì)包含Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物或由Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物組成；所述核酸分子包含編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列或由編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列組成。
優(yōu)選地，所述的Adamalysin是Metargidin。因此，本發(fā)明特別涉及一種蛋白物質(zhì)的應(yīng)用，所述的蛋白物質(zhì)包含Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物或由Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物組成，該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列列在序列表中，其序號為SEQ IDNO2。
AMEP片段值得注意之處在于它能夠抑制腫瘤侵入、形成轉(zhuǎn)移和血管生成的所有階段，即內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖——這與某些作者(Zhang等，1998)的觀點相反，他們認(rèn)為，通過與整聯(lián)蛋白αvβ3結(jié)合，解離素結(jié)構(gòu)域可能只是涉及在血管生成期間的內(nèi)皮細(xì)胞的同型聚集(homotypic aggregation)。另外，在沒有加任何血管生成因子時觀察到AMEP對血管生成的抑制作用。
相反，在試圖證明抗αvβ3抗體的抗血管生成作用時，則需要使用外源血管生成因子。僅在用FGF2(一種在保持血管生成時必不可少的血管生成因子)誘導(dǎo)后，它們才抑制血管所生成(Klein等，1993)。與其它具有RGD序列的肽——它們僅作為內(nèi)皮細(xì)胞粘附的抑制劑被描述過(Kostetsky和Artemjev，2000)——相比，AMEP的治療意義仍然是基于其作用譜內(nèi)。
本發(fā)明涉及Adamalysin、更具體地為Metargidin的解離素結(jié)構(gòu)域及其衍生物。這些衍生物構(gòu)成具有抗血管生成、抗侵入和抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)的功能等價物，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用本發(fā)明說明書，更具體地在下面實驗部分中涉及的方式和實驗直接對其進(jìn)行確定。此類衍生物可以是截短形式的片段、或通過缺失、添加、抑制或取代一個或多個氨基酸而修飾的序列。此類衍生物還可能涉及相應(yīng)于由化學(xué)修飾的氨基酸所構(gòu)成的所述衍生物的片段，這些修飾的目的是使這些衍生物變得更穩(wěn)定。同樣地，本發(fā)明也涉及編碼所述衍生物的多核苷酸序列。
本發(fā)明因此還特別涉及包含編碼Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列的核酸分子，編碼該結(jié)構(gòu)域的序列列在序列表中，其序號為SEQ ID NO1。這個結(jié)構(gòu)域的編碼序列由276個核苷酸構(gòu)成(Met-420至Glu-511)。
所述的序列有利地置于其表達(dá)調(diào)控序列控制之下。這樣一種核酸分子例如是一種載體，如-編碼抗血管生成片段AMEP或其衍生物的表達(dá)質(zhì)粒，無論其轉(zhuǎn)移技術(shù)怎樣，-編碼由所述片段或衍生物與利于純化(pGEX型質(zhì)粒)或利于組織定向的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間形成的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒。
-編碼所述AMEP片段或其衍生物的質(zhì)?；蚱渌愋偷谋磉_(dá)載體，特別是除細(xì)菌外的宿主生物體，例如昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒或真核細(xì)胞中的質(zhì)粒。
這樣的核酸分子可以用于基因治療或細(xì)胞治療方案中，其方案在于給個體施用所述分子或用所述分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以便在待治療部位表達(dá)全部或部分的解離素結(jié)構(gòu)域。
這樣的核酸分子也可用于制備本發(fā)明的蛋白物質(zhì)。因此，用編碼AMEP的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化細(xì)菌和真核細(xì)胞合成人的AMEP。更確切地，使用大腸桿菌(DH5α克隆)作為細(xì)菌生產(chǎn)系統(tǒng)，脛骨顱骨肌(muscle tibiacranial)作為真核細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)，但酵母或所有其它生產(chǎn)系統(tǒng)也都能夠使用。
證明AMEP對血管生成的所有階段(內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、粘附、凋亡和形成毛細(xì)血管結(jié)構(gòu))和腫瘤侵入與形成轉(zhuǎn)移的抑制作用，可以提供一種治療癌癥的新的抗腫瘤藥物。事實上，與迄今為止在文獻(xiàn)中描述的其它血管生成抑制劑相反，AMEP發(fā)揮了一種內(nèi)在的抗侵入、抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成活性，這種活性是多能性的和獨特的。它同時抑制各種來源的內(nèi)皮細(xì)胞(無論是大血管或微血管，無論是轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的)的遷移和增殖、以及細(xì)胞(在纖維蛋白原、玻連蛋白和纖連蛋白上)的粘附和在體外三維模型中毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成。還證明了AMEP的促凋亡作用。在體內(nèi)，AMEP通過抑制形成血管和轉(zhuǎn)移散布，特別是表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移散布而阻斷了腫瘤的生長。
本發(fā)明因此涉及提供一種治療和/或預(yù)防一般癌癥疾病以及發(fā)病機(jī)理歸因于血管生成的疾病(例如炎癥、牛皮癬、動脈硬化癥、黃斑變性等)的新方法。
在本發(fā)明的藥物中，所述活性劑與任何藥學(xué)可接受的載體相配合，這些載體是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并適合于其用藥方式。因此，本發(fā)明的藥物可以采用下述方式用藥-單獨施用，通過全身、局部、或口服或作為植入體，-采用細(xì)胞或基因治療，-與其它活性組分配合，
-以任何制藥形式，例如納米顆粒形式。
由下面參照附圖所作的說明可體現(xiàn)出本發(fā)明的其它優(yōu)點和特征，這種說明涉及AMEP的制備及其在體外與體內(nèi)的抗血管生成、抗侵入和抗轉(zhuǎn)移活性，其附圖中-

圖1表示在a中，可見在純化后SDS-PAGE中的融合蛋白(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-AMEP)。Coomassie藍(lán)染色后在36kDa可見到單一條帶。b中所示為純化的AMEP的免疫印跡?？梢姷酵玫目菇怆x素抗血清在10kDa處的單一條帶。
-圖2表明AMEP對CPAE粘附在纖維蛋白原(30微克/毫升)、玻連蛋白(10微克/毫升)和纖連蛋白(40微克/毫升)上的影響。在粘附實驗(在材料與方法中說明)前，這些細(xì)胞用AMEP或14氨基酸片段預(yù)處理24小時。這些實驗以三份進(jìn)行，重復(fù)三次。這些結(jié)果用與對照相比的百分?jǐn)?shù)表示(平均值±SEM)。
-圖3表明AMEP對內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)與遷移的影響。在照片B、D、E上表示出遷移的前沿，分別為對照條件、5微克/毫升和10微克/毫升的AMEP(相差顯微鏡)。
-圖4表示AMEP抑制CPAE遷移的劑量關(guān)系。在3天期間內(nèi)每天測量細(xì)胞遷移的前沿位置。這些結(jié)果是五次實驗的平均值，以與對照相比的百分?jǐn)?shù)表示(平均值±SEM)。
-圖5表示AMEP抑制CPAE增殖的劑量關(guān)系。在AMEP或含有RGDC序列的這個結(jié)構(gòu)域的片段存在下，這些細(xì)胞培養(yǎng)48小時，用1μCi氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)18小時。然后測量摻入的放射性。這些結(jié)果是五次實驗的平均值，用與對照相比的百分?jǐn)?shù)表示(平均值±SEM)。
-圖6表示使用HMEC-1時AMEP對毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成的影響。在沒有AMEP(照片A、B)或有AMEP(5微克/毫升)(照片C、D)的情況下，被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的cytodex珠摻入纖維蛋白凝膠中。
-圖7表明相對于對照(A、D)，在有5微克/毫升AMEP(照片B)或有10微克/毫升AMEP(照片C、E)的情況下，使用CPAE時AMEP對纖維蛋白凝膠中毛細(xì)血管形成的影響。
-圖8表明AMEP抑制腫瘤生長。曲線的每個點表示裸鼠的測量的腫瘤體積。這個實驗的對照組以及AMEP組均使用了五只動物，對它們處理了14天。柱狀圖表示每個組5只鼠的平均腫瘤體積。這個圖代表了3個不同的實驗。
-圖9表明使用黑素瘤細(xì)胞時，AMEP抑制肺的轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。每個點表示在C57B1/6鼠的肺中計算的轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。該實驗使用了每組12只動物。柱狀圖表明對照組與處理組轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量的平均值。這個實驗是兩個不同的實驗的代表。
-圖10表明，與對照鼠的肺相比，用AMEP處理的C57B1/6鼠肺的肺轉(zhuǎn)移灶(黑斑點)的數(shù)量的抑制狀況。
下面的說明使用了在文獻(xiàn)中通常描述的分子生物學(xué)技術(shù)，例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，分子克隆(Molecular Cloning)；實驗室手冊，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor紐約，(Sambrook等人，1989)；DNA克隆實用方法(Practical Approch)，第I和II卷(D.N.Glover等，1985)；B.Perdal，分子克隆的實用指南(Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，分子生物學(xué)的現(xiàn)行規(guī)程(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley andSons，Inc.(1994)。
于是，核酸應(yīng)該理解是一種嵌合化合物，它含有稱之為核苷酸的共價結(jié)合的亞單位。這些核苷酸包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，其均可以是單鏈的或雙鏈的。DNA包括cDNA(互補(bǔ)的)、基因組DNA、合成DNA和半合成DNA。編碼蛋白質(zhì)的核苷酸或核酸序列稱之有義序列。重組DNA分子應(yīng)該理解是一種采用分子生物學(xué)技術(shù)處理的DNA分子。
DNA編碼序列應(yīng)該理解是一種雙螺旋DNA序列，它們處在適當(dāng)?shù)恼{(diào)控基因序列控制之下，這種序列在體外或在體內(nèi)的細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。由氨基末端5′的起始密碼子決定編碼序列的起始，由羧基端3′的終止密碼子決定翻譯的終止。聚腺苷酸化信號(轉(zhuǎn)錄終止)一般定位在編碼序列的3′處?？刂妻D(zhuǎn)錄和翻譯的這些序列是調(diào)控DNA序列，例如啟動子、刺激因子(stimulator)，因此使得宿主細(xì)胞中的編碼序列能夠表達(dá)。
啟動子序列是一個能結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并能啟動編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。
編碼序列在細(xì)胞中處在轉(zhuǎn)錄和翻譯序列控制之下，其中RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA(信使RNA)，后者然后翻譯成蛋白質(zhì)。
表達(dá)質(zhì)粒是一種染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它含有調(diào)控序列，其間插入結(jié)構(gòu)基因(相應(yīng)于所需蛋白質(zhì)的DNA序列)。它可獨立地在細(xì)菌中復(fù)制。
表達(dá)載體是一種核酸分子，它含有至少一個獨立的復(fù)制起始位點和誘導(dǎo)型啟動子，并且其可被引入宿主細(xì)胞中，例如細(xì)菌或真核細(xì)胞。在這種載體中，可以插入稱之為插入序列的編碼序列，這種序列相應(yīng)于所需的蛋白或肽。
I-方法1)細(xì)胞培養(yǎng)J.Badet博士(真核細(xì)胞生物技術(shù)實驗室，Créteil大學(xué)，法國)提供CPAE細(xì)胞(牛的肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞)。這些細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基添加了20％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100UI/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素(Gibco，Paisley，UK)。所有下面列出的培養(yǎng)基(“完全培養(yǎng)基”)都含有同樣濃度的青霉素/鏈霉素和CPAE細(xì)胞使用的L-谷氨酰胺。它們可以用于傳代12-20次。Ades博士(控制與預(yù)防疾病中心，Atlanta，GA)提供HMEC-1細(xì)胞(人的微血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞)，在用SV40基因和T大抗原轉(zhuǎn)染人的真皮內(nèi)皮細(xì)胞時，該博士確定了這種細(xì)胞系。在全MCDB131培養(yǎng)基(Sigma，St.Louis，MO)中培養(yǎng)HMEC-1細(xì)胞，該培養(yǎng)基添加了10％FCS、10納克/毫升EGF(Collaborative BiomedicalProducts)和1微克/毫升氫化可的松(Sigma)。按照J(rèn)affe等描述的方法，在實驗室中從臍帶提取了HUVEC細(xì)胞(人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)。這些臍帶用0.2％膠原酶進(jìn)行控制消化(Boehringer Manneheim GmbH，Manneheim，Allemagne)。原代細(xì)胞在M199全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了20％FCS、75mM HEPES、3.7mM pH 7.5的碳酸氫鈉和5微克/毫升兩性霉素B(Life technologies，法國)。HMVEC-d細(xì)胞(真皮微血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞，Biowhittaker Europe，比利時)在由生產(chǎn)商提供的全培養(yǎng)基(EGM-2MV)中傳代4-6次，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10％FCS。C51細(xì)胞(鼠的結(jié)腸癌)在RPMI+10％FCS全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3T3細(xì)胞(鼠的成纖維細(xì)胞瘤)在DMEM+10％FCS全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MDA MB 231細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)使用DMEM全培養(yǎng)基，其中添加了10％FCS，如3T3成纖維細(xì)胞癌一樣。B16F10細(xì)胞(鼠的黑素瘤細(xì)胞)在DMEM+10％FCS和1.5克/升碳酸氫鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
根據(jù)Herren等(Néosystéme，法國)描述的方法，兔在接種AMEP片段后得到了抗解離素的抗體。這個片段由12個氨基酸構(gòu)成，并且含有RGDC序列；其分子量是1.4kDa。
2)在細(xì)菌系統(tǒng)中構(gòu)建與合成人的AMEP制備AMEP與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白質(zhì)。為此，編碼AMEP(Met-420至Glu-511)的SEQ ID NO1的276個核苷酸的cDNA片段采用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增。這個cDNA在pGEX-6P質(zhì)粒中在BamH1位點進(jìn)行亞克隆(Amersham Pharmacia Biotech)。使用異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(1mM)在大腸桿菌(DH5α)中誘導(dǎo)合成GST-AMEP融合蛋白質(zhì)，例如采用Smith和Johnson(1988年)描述的方法。簡要地，在用1％Triton X100溶解細(xì)菌，接著采用超聲波降解法處理后，使用谷胱甘肽-瓊脂糖進(jìn)行親合層析，使用還原型谷胱甘肽(5mMTris，HCl，pH8.0)洗脫，其中含有5mM還原型谷胱甘肽(Sigma)(最終為pH7.5，臨時制備)，以純化GST-解離素。檢測SDS-PAGE的單一條帶，該條帶相應(yīng)于這種融合蛋白質(zhì)的分子量(36kDa)(圖1a)。
為了檢測相應(yīng)于在體外不同血管生成模型上AMEP的肽活性，我們根據(jù)Amersham說明書，用特定的蛋白酶“PreSccisionTM蛋白酶”從GST裂解出AMEP，這種酶本身是與GST偶聯(lián)的蛋白酶(AmershamBuckinghashire)。
然后，根據(jù)Sigma的說明書，使用谷胱甘肽-瓊脂糖柱的親合層析純化AMEP。AMEP由91個氨基酸構(gòu)成，其估計的分子量是9.7kDa。
采用免疫印跡法(圖lb)和采用高效液相層析法(HPLC)分析了AMEP的純度。蛋白質(zhì)濃度通過BCA實驗測定(Pierce，Perbio，Science，法國)。
3)免疫印跡法100微克已純化的AMEP放在電泳凝膠上，該凝膠由聚丙烯酰胺-12％SDS構(gòu)成，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Schleicher和Schuell)。該膜用TBS緩沖液飽和1小時(Tris緩沖液10mM Tris，pH7.5；200mM NaCl/吐溫(0.05％)，含有10％奶粉)，然后使用以1∶1000稀釋的抗AMEP多克隆兔抗血清(Néosystem，法國)孵育，或用抗-GST抗體(Amersham)孵育。在五次TBS/吐溫洗滌后，根據(jù)生產(chǎn)者的說明書(DAKO)，使用以1∶2000稀釋的與過氧化物酶偶聯(lián)的適當(dāng)?shù)诙贵w孵育該膜1小時。該膜在同樣漂洗緩沖液中洗滌五次，再根據(jù)化學(xué)發(fā)光方法ECL(Amersham)檢測信號。
4)纖維蛋白原與玻連蛋白和纖連蛋白的粘附-第一種技術(shù)實驗過程中內(nèi)皮細(xì)胞與AMEP點狀培養(yǎng)。
通過用1.5mM EDTA培養(yǎng)，從培養(yǎng)箱分離下CPAE，再按照5×105細(xì)胞/毫升在粘附緩沖液中(140mM NaCl、10mM Hepes、5mM葡萄糖、5.4mM KCL、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MnCl2、pH7.4)制成懸浮液。然后，在室溫下，100微升細(xì)胞懸浮液與AMEP(5微克/毫升)放在一起，然后放入96孔板的孔中(Greiner，D.Dutcher)，與50微升純化的纖維蛋白原(40微克/毫升，在PBS中；Kabi)、10微克/毫升玻連蛋白(Sigma)、30微克/毫升纖連蛋白(Sigma)、或1％BSA(牛血清白蛋白)作為陰性對照，在4℃預(yù)先培養(yǎng)一夜。CPAE細(xì)胞在37℃培養(yǎng)20分鐘后，該板用200微升粘附緩沖液洗滌兩次，非特異性位點用添加1％BSA的PBS在37℃飽和1小時。接著，該板再用含有1％BSA的粘附緩沖液洗滌兩次。用200微升含有1％BSA的粘附緩沖液洗滌孔三次，除去未粘附的細(xì)胞。測量細(xì)胞的磷酸酶活性能夠定量粘附細(xì)胞。簡要地，100微升的3毫克/毫升的對硝基酚磷酸酯(溶于含有0.1％triton X100的pH5.5乙酸鹽緩沖液中的溶液)添加到這些孔中，再在37℃培養(yǎng)2小時。添加1N NaOH終止該反應(yīng)。采用ELISA閱讀器(Titertek Twinreader)，讀取在405nm吸收后測量出釋放的對硝基酚(它表示粘附細(xì)胞數(shù))。每個實驗進(jìn)行三次。
-第二種技術(shù)在分離之前，在終濃度為5微克/毫升AMEP下培養(yǎng)CPAE細(xì)胞24小時。方案的后續(xù)部分與前面描述的相同，但后續(xù)部分沒有加入AMEP進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)。
5)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移模型在24孔板中實施遷移模型。將1.5％瓊脂糖溶于培養(yǎng)基中，以便在孔中形成凝膠。一半的瓊脂糖圓柱體這時插入孔中。把CPAE細(xì)胞添加到孔的余下空間中，并培養(yǎng)直到其融合。取出瓊脂糖片，以便有可能使細(xì)胞遷移，再往培養(yǎng)基添加AMEP，達(dá)到所要求的濃度。然后，透明的毫米方格紙放在培養(yǎng)箱下面，以便借助目鏡測微器在倒置顯微鏡下測定細(xì)胞遷移速度。這些成對進(jìn)行的實驗重復(fù)三次。用與對照相比的百分?jǐn)?shù)表示這些結(jié)果。
6)細(xì)胞增殖模型按照每個孔(96孔板，Greiner)20000個細(xì)胞在全培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞。在24小時后，這些細(xì)胞在不足相應(yīng)于全培養(yǎng)基濃度一半的濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以便在增補(bǔ)的24小時內(nèi)誘導(dǎo)這些細(xì)胞達(dá)到G0/G1期。然后，在有或沒有AMEP的條件下，這些細(xì)胞用全培養(yǎng)基培養(yǎng)30小時。這時，向這些細(xì)胞中添加氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(每個孔1μCi)，再培養(yǎng)18小時。根據(jù)所描述的使用Skatron的方案(Skatron，Lier，Norvége)，借助濾紙，定量分析通過細(xì)胞加入的氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷，這時添加閃爍液體，其后采用計數(shù)方法測定放射性。用與對照相比的百分?jǐn)?shù)表示這些結(jié)果。
7)分析凋亡和細(xì)胞周期(使用Hoechst 33342)和量化早期凋亡(使用膜聯(lián)蛋白V(Annexine V))-使用Hoechst 33342(Sigma)的活細(xì)胞DNA特異性染色技術(shù)。
這些內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)進(jìn)行胰蛋白酶化，細(xì)胞懸浮液調(diào)整到1×106個細(xì)胞/毫升。添加Hoechst 33342染料達(dá)到20微克/毫升，并且在室溫與攪拌下，將這些細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘。采用流式細(xì)胞儀(FACS)分析凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。這些細(xì)胞在暗處(37℃)孵育30分鐘，再進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
-使用膜聯(lián)蛋白V的技術(shù)(R&D系統(tǒng))在1毫升反應(yīng)緩沖液(100微升10×結(jié)合緩沖液(100mM Hepes/NaOH pH7.4，1.5MNaCl、50mM KCl、10mM MgCl2、18mM CaCl2)、100微升碘化丙啶(起始濃度50微克/毫升)、10微升膜聯(lián)蛋白V-FITC和790微升去離子水)中將1×106個內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)的沉淀物重懸。該懸浮液在室溫暗處培養(yǎng)15分鐘，再采用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
8)在兩種纖維蛋白凝膠的血管生成模型中毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的形成其中一種模型使用CPAE細(xì)胞群落，并且根據(jù)Pepper等(1999)描述的方法使用。簡要地，10000個CPAE在96孔板的2％瓊脂糖上聚集達(dá)24小時。取出三個聚集物，放在纖維蛋白凝膠中純化的纖維蛋白原(3毫克/毫升，Kabi)向MEM培養(yǎng)基滲析，然后與20％FCS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素、2μM抑酶肽(aprotinin)和所需濃度的AMEP混合。這時加入人的凝血酶(1UI/毫升，Sigma)，以便在表面得到纖維蛋白凝膠，在其表面添加了增添抑酶肽(2μM)的全培養(yǎng)基，每三天更換培養(yǎng)基。從培養(yǎng)24小時開始可以觀察到毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成。在倒置顯微鏡下拍照這些毛細(xì)血管照片，再用照片測量這些結(jié)構(gòu)的尺寸。統(tǒng)計分析(Mann-Whtney方法)能夠確定這些結(jié)構(gòu)的尺寸是否不同。
第二個模型使用根據(jù)Nehl等描述技術(shù)的約150微米的珠。使用的細(xì)胞是HMEC-1，CPAE不能用于這個模型中。在前述模型中也不能使用HMEC-1。HMEC-1細(xì)胞經(jīng)過與這些珠在全培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4小時，它們粘附在Cytodex 3珠(Sigma)上。這些珠這時再在大體積的全培養(yǎng)基中制成懸浮液，達(dá)到30個細(xì)胞/珠，并且每30分鐘攪拌5分鐘，以30轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?2小時，接著以同樣速度繼續(xù)培養(yǎng)4天。整個珠表面覆蓋細(xì)胞時，這些珠在800g下離心5分鐘，以便濃縮這些珠并將其加入到與所述前面模型的相同纖維蛋白凝膠中，定量方法與結(jié)果分析方法也相同。與使用CPAE的模型相反，毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)僅在37℃培養(yǎng)3天后出現(xiàn)。
9)制備電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒AMEP的cDNA在pBi載體的Eco RV位點進(jìn)行亞克隆(Clonetech，Palo Alto，CA USA)。這種載體中，所需基因的表達(dá)在含有Tet-On真核細(xì)胞基因的表達(dá)系統(tǒng)中受四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子的控制下。Tet-On載體表達(dá)rtTA反式激活子(反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活子)，且Tet-tTS載體表達(dá)tTS沉默子(四環(huán)素轉(zhuǎn)錄沉默子)。純化質(zhì)粒以便除去任何內(nèi)毒素(Maxi endo freeKit，Quiagen)。純化的質(zhì)粒DNA以要求的濃度溶于無內(nèi)毒素的0.9％無菌NaCl中。
10)在裸鼠和C57B1/6鼠的肌肉中電轉(zhuǎn)編碼人AMEP的基因20微克pBi-AMEP質(zhì)粒、10微克Tet-off質(zhì)粒和20微克tet-On質(zhì)粒溶于30微升0.9％無菌NaCl中，再注入鼠齡8周的裸鼠或C57B1/6鼠的脛骨顱骨肌肉中，如Mir等(Mir等，1999)描述的，通過腹膜內(nèi)接種戊巴比妥使這些鼠預(yù)麻醉。簡要地，使用一種合適的鼠腳墊，并有兩塊鋼板的電極，以頻率1Hz施加8個200伏/厘米電脈沖達(dá)20毫秒。該電極與PS-15電脈沖發(fā)生器(Jouan，St Herblain，法國)相連。不含有AMEP的基因的同樣質(zhì)粒構(gòu)成陰性對照。
11)無胸腺鼠的腫瘤生長模型(MDA-MB-231細(xì)胞)預(yù)培養(yǎng)直至達(dá)到80％融合的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)取下、洗滌后，然后在PBS中再制成懸浮液(20×106細(xì)胞/毫升)。200微升的細(xì)胞懸浮液注入到如前面描述的預(yù)處理8周裸鼠的背部皮下。根據(jù)數(shù)學(xué)公式[(兩個徑之和除以2)3/0.52]，測量腫瘤的兩個徑就能夠計算出其體積。腫瘤體積達(dá)到18毫米3時，在鼠的飲水中添加200微克/毫升強(qiáng)力霉素(四環(huán)素的穩(wěn)定類似物)(Sigma-Aldrich，Saint Quentin Fallavier，法國)，并且補(bǔ)加5％葡萄糖，以便誘導(dǎo)在鼠的肌肉中表達(dá)AMEP。在誘導(dǎo)后14天期間觀察腫瘤尺寸。
12)腫瘤血管生成的量化(皮下實體瘤的免疫組織化學(xué)和圖像分析)這些腫瘤組織在乙醇中進(jìn)行固定。在石蠟中制備5微米切片。用3％H2O2處理10分鐘消除內(nèi)生的過氧化物酶，以便在免疫組織化學(xué)中能夠使用這些切片。在用蒸餾水洗滌切片，再用1∶10 Optimax血清(bioGenex，San Ramon，CA)飽和10分鐘后，這些切片用大鼠抗-CD31抗體(內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子)按1∶50培養(yǎng)1小時。用Optimax洗滌4分鐘兩次后，這些切片用與生物素偶聯(lián)的山羊抗-大鼠的多克隆抗體(1/50)培養(yǎng)，接著用Optimax洗滌4分鐘，洗滌兩次。這些再用DAB生色底物處理10分鐘，用蒸餾水洗滌，用Mayer的蘇木精著色本底，并裝在Pertex中。所有這些切片進(jìn)行免疫標(biāo)記，并在同一天著色本底，這樣保證標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記的強(qiáng)度。
對于每只動物，使用AxiophotZeiss(德國)顯微鏡，3CCD Sony照相機(jī)(分辨率768×576像素)對用CD31標(biāo)記的切片的代表性組織學(xué)樣品進(jìn)行圖像分析。選擇放大倍數(shù)×100有可能使整個樣品數(shù)字化。這些樣品只是考慮腫瘤組織，壞死和纖維蛋白結(jié)構(gòu)域除外。如果樣品尺寸太大，每個樣品的整個樣品表面或8個鄰近視場進(jìn)行數(shù)字化。采用基于Linux的特定程序分析這些圖像，得到定量指數(shù)0-255?？蓪⑦@些圖像轉(zhuǎn)化成不同灰度水平的數(shù)字化彩色圖像。一種只是由栗-紅色血管組成的理論圖像對應(yīng)于指數(shù)255，而無血管的圖像(全部藍(lán)色標(biāo)記)的指數(shù)定為0。對于圖像的每個像素，其值定為0-255，并且可得到每個圖像的這些數(shù)字平均值。每只動物的最后指數(shù)是由8個鄰近視場平均值計算得到的。
13)同源轉(zhuǎn)移的腫瘤模型(肺部轉(zhuǎn)移，B16F10細(xì)胞)在注入B16F10鼠的黑素瘤細(xì)胞前三天，C57B1/6鼠的飲水中加入200微克/毫升強(qiáng)力霉素(Sigma-Aldrich)，以便誘導(dǎo)C57B1/6鼠肌肉中表達(dá)AMEP。這些細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)直到50％融合，然后洗滌，再按照4×106個細(xì)胞/毫升在PBS中再制懸浮液。一百微升細(xì)胞懸浮液注入鼠的后眼眶竇中的靜脈內(nèi)。在接種這些細(xì)胞后7天處死這些鼠，取出腫瘤，在雙目放大鏡下，計數(shù)黑色肺部轉(zhuǎn)移灶。
II-結(jié)果1)AMEP抑制內(nèi)皮細(xì)胞在纖連蛋白、玻連蛋白和纖維蛋白原上的粘附作用在AMEP或由12個氨基酸(其中有RGDC片段)組成的1.4kDa的AMEP片段(Néosystem，法國)存在下，實施了在方法中描述的兩種粘附技術(shù)。為了確定AMEP的作用方式是否不同于對照RGD肽，使用了這種肽(“1.4kDa-肽”)。
在進(jìn)行粘附實驗之前，用1.4kDa-肽(1微克/毫升)點狀培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)30分鐘時，觀察到在玻連蛋白(49±1.2％的抑制作用)和在纖維蛋白原(50±2.4％的抑制作用)上細(xì)胞粘附作用顯著降低。這個結(jié)果就并不令人驚奇，因為這個片段可阻斷在內(nèi)皮細(xì)胞表面上存在的整聯(lián)蛋白αvβ3與其優(yōu)選底物相互作用。在這些同樣的條件下，在可比較的摩爾濃度(10微克/毫升，未示出)下，沒有檢測到AMEP對內(nèi)皮細(xì)胞粘附在這些底物上有任何顯著的影響。
相反地，用AMEP或用與前面同樣摩爾濃度的1.4kDa-肽預(yù)培養(yǎng)這些細(xì)胞24小時后，得到相反的結(jié)果AMEP抑制內(nèi)皮細(xì)胞在玻連蛋白、纖連蛋白和纖維蛋白原上的粘附作用，其抑制作用達(dá)30％，而1.4kDa-肽沒有任何顯著的作用(圖2)。
2)AMEP抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移圖3顯示了在我們的遷移模型中，與對照(不存在該結(jié)構(gòu)域A、B)相比，在添加5微克/毫升(C、D)和10微克/毫升(E、F)AMEP后內(nèi)皮細(xì)胞的情況。在AMEP存在下，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的變化非常明顯這些內(nèi)皮細(xì)胞形成了長的偽足，細(xì)胞彼此間的粘附作用改變了，許多細(xì)胞也分離了(10微克/毫升)。這種現(xiàn)象在細(xì)胞遷移前沿(D、F)更加可見。AMEP對這些細(xì)胞遷移速度的影響是與劑量相關(guān)的(2-10微克/毫升)，在10微克/毫升時，這些細(xì)胞的遷移完全被抑制(圖4)，1.4kDa-肽(1微克/毫升)則相反，它沒有任何的抑制作用。
3)AMEP對細(xì)胞增殖的影響與該12個氨基酸的片段(1.4kDa-肽)——它對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖沒有任何影響，不管其使用濃度(1-100微克/毫升，未示出)如何)——相反，AMEP從2微克/毫升起就顯著地抑制它們的增殖作用(降低40％)(圖5)。這個作用在5微克/毫升是最大的，并且其增殖作用抑制達(dá)到60％(在10微克/毫升下有相同的百分?jǐn)?shù))。應(yīng)指出，在免疫印跡法中預(yù)先使用的針對AMEP的兔多克隆血清(Néosystem，法國)可比較地抑制所述細(xì)胞的增殖作用(65±0.1％)。
為了分析AMEP作用的特異性，我們曾研究了在下述細(xì)胞表面上有或沒有整聯(lián)蛋白αvβ3時，AMEP對大血管或微血管原始內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響，以及對已知癌細(xì)胞增殖作用的影響，其中一個已知的靶為AMEP。在下面表1中列出的這些結(jié)果表明，AMEP可比較地抑制不同型的內(nèi)皮細(xì)胞，而對各種不同源的癌細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、乳房、結(jié)腸)增殖作用沒有任何影響，它們在其表面上有一點或沒有整聯(lián)蛋白αvβ3(分別是MDA MB 231、C51、3T3)。有利地，根據(jù)表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3的細(xì)胞增殖作用，觀察到AMEP的重要抑制作用。
表1
表1涉及AMEP對內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖的影響。這些實驗重復(fù)五次(平均值±SEM)。列出的數(shù)字表示，與在相同條件下進(jìn)行的對照實驗(沒有AMEP)相比，使用5微克/毫升AMEP對所列細(xì)胞增殖抑制的百分?jǐn)?shù)。
4)證明AMEP對內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡活性使用了兩種能夠測定凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的技術(shù)。其中一種技術(shù)使用Hoechst 33342，它能夠保持活細(xì)胞，因此能夠觀察細(xì)胞周期的不同期。使用膜聯(lián)蛋白-V的技術(shù)能夠測定內(nèi)皮細(xì)胞的早期凋亡(觀察其表面上的磷脂酰絲氨酸)。這些方法得到的結(jié)果是相近的，即在AMEP存在下凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是對照的3倍(下面表2)。相反，與誘導(dǎo)凋亡的大多數(shù)分子不同，在AMEP存在下(未示出)使用Hoechst 33342時，沒有證明細(xì)胞周期有任何改變。
表2
表2涉及凋亡的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。根據(jù)在材料與方法中描述的兩種方法進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS)分析。這些實驗進(jìn)行三次。平均值±SEM。
5)在纖維蛋白凝膠的兩種血管生成模型中AMEP抑制毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成微血管的內(nèi)皮細(xì)胞比較適合于研究血管生成，這就是為什么我們使用HMEC-1的原因(Nehls和Herrmann，1995)。這些細(xì)胞在珠上培養(yǎng)，然后加入纖維蛋白凝膠中(圖6，對照A、B)。在培養(yǎng)三天后觀察到AMEP(5微克/毫升)對毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成的抑制作用(C)，在10天后變得很驚人，管的尺寸降低90％(D)。前面的研究針對確定使用CPAE作為內(nèi)皮細(xì)胞時AMEP對血管生成不同階段的影響，因此，我們想證實這個結(jié)構(gòu)域?qū)α硪环N血管生成模型的影響。這些細(xì)胞僅能在使用珠的模型中使用，因為它們的形態(tài)不發(fā)生適應(yīng)改變；CPAE的聚集是唯一的研究AMEP對體外血管生成的影響的辦法。在纖維蛋白凝膠中加入聚集物后24小時出現(xiàn)了這些毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)。圖7匯集了在培養(yǎng)3天后拍攝的照片。與對照(A、D)相比，添加5微克/毫升(B)或10微克/毫升(C、E)AMEP可誘導(dǎo)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡(未示出)。在對照條件下，一直培養(yǎng)到6天都能觀察到這些結(jié)構(gòu)的長度增加(未示出)。
6)AMEP對裸鼠上腫瘤生長與腫瘤血管生成的抑制作用在鼠肌肉中，在電轉(zhuǎn)AMEP的編碼基因，接著用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)其表達(dá)后，在裸鼠中產(chǎn)生了AMEP。
如圖8所表明的，AMEP組的腫瘤體積明顯地低于對照組，在處理14天后觀察的抑制作用達(dá)到78％。在處理僅7天后觀察到類似的抑制百分?jǐn)?shù)。使用這些同一腫瘤的切片量化了腫瘤內(nèi)的血管生成。下面表3列出的結(jié)果表明，AMEP對腫瘤生長的強(qiáng)抑制作用是與在用AMEP處理的腫瘤內(nèi)血管數(shù)受到顯著抑制(53.4％)相關(guān)的。
這些結(jié)果表明，AMEP在體內(nèi)在未表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3的腫瘤模型中起很強(qiáng)的作用。
下面表3示出腫瘤血管化的統(tǒng)計指數(shù)，其指數(shù)是用表達(dá)或未表達(dá)AMEP的鼠的代表性腫瘤切片樣品，通過數(shù)字化與計算機(jī)圖像分析處理后得到的。
表3
7)AMEP抑制同源鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移形成用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)在C57B1/6鼠的肌肉中產(chǎn)生AMEP。在用AMEP處理的鼠組中觀察到，與對照組相比，處理7天后腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)抑制作用異乎尋常地達(dá)到74.2％(圖9、10)。
III-討論在血管生成的過程中，內(nèi)皮細(xì)胞被激活，它們獲得了血管生成的表型。它們這時在其表面具有整聯(lián)蛋白αvβ3和Metargidin(在來自成熟血管的內(nèi)皮細(xì)胞上未檢測的分子)(Herren等，1997)。
得到的全部結(jié)果表明，AMEP具有的抗血管生成活性遠(yuǎn)大于1.4kDa-肽具有的活性。如果AMEP與1.4kDa-肽都具有在內(nèi)皮細(xì)胞與整聯(lián)蛋白αvβ3結(jié)合中涉及的RGD序列，可以認(rèn)為AMEP的作用不限于阻斷整聯(lián)蛋白αvβ3的功能。AMEP似乎具有在細(xì)胞水平上可能與信號作用改變相關(guān)的獨有活性(通過整聯(lián)蛋白αvβ3和/或通過Metargidin傳送的信息)。
細(xì)胞粘附作用是一種在細(xì)胞遷移中涉及的現(xiàn)象；但是，我們認(rèn)為抑制粘附作用不是構(gòu)成抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移原因的唯一機(jī)制因此，10微克/毫升AMEP足以完全阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而對于這個同樣的濃度，AMEP對粘附的抑制作用只是部分的。
AMEP對血管生成關(guān)鍵階段的這種異乎尋常的抑制活性被其抗增殖作用增強(qiáng)(直到60％抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖)。有意義地，AMEP誘導(dǎo)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖與可檢測的細(xì)胞周期變化無關(guān)聯(lián)。
在血管生成的最后階段時，這些細(xì)胞構(gòu)成管，這些管吻合有可能形成血管腔。我們根據(jù)在材料中描述的兩種技術(shù)，使用微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)和大血管內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)在體外再次產(chǎn)生這種現(xiàn)象。值得注意的是，在AMEP存在下，在使用HMEC-1的模型中，觀察到毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成的總抑制作用。與直到現(xiàn)在我們所觀察到使用其它的血管生成抑制劑相反，AMEP誘導(dǎo)早期預(yù)先形成(12h)的CPAE管的致死性解體。事實上，CPAE的增殖和遷移速度比HMEC-1高得多(未示出)，這樣能夠解釋AMEP對兩種血管生成模型影響的雙重性。
這些研究工作還表明，在體內(nèi)，AMEP抑制腫瘤血管生成導(dǎo)致異乎尋常的抑制腫瘤生長，甚至對還未表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3的已知腫瘤也如此。另外，證明了在肺轉(zhuǎn)移模型中AMEP的顯著的抗遷移作用。
最后，用10微克/毫升AMEP處理內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)能用相差顯微鏡可觀察死亡內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的增加(漂浮在培養(yǎng)培養(yǎng)基中)(圖3)。但是，這種產(chǎn)品對凋亡的作用(對還存活細(xì)胞可計量的現(xiàn)象)是適度的(被因子3增強(qiáng))。因此，AMEP具有的特點是強(qiáng)抗血管生成作用與由新近以Anoikis名稱描述的現(xiàn)象(Frisch，2000年；Zhu等，2001年)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡相關(guān)聯(lián)。
因此，AMEP的獨到之處在于具有抑制血管生成的所有階段的能力，其中包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖，這樣不同于直到現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的其它分子(參見血管抑素，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，O′Reilly等，1994年；Wu等，1997年；Sim等，1997年)，或也抑制它們的增殖以及它們遷移的內(nèi)皮抑素(endostatin)，后者只是當(dāng)用例如VEGF或bFGF之類的血管生成因子誘導(dǎo)其遷移時才如此(O′Reilly等，1997年；Sim等，2000年；Yamaguchi等，1999年)。此外，在體外AMEP分別對遷移與血管生成的影響是驚人的完全停止內(nèi)皮細(xì)胞遷移，也沒有毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成。
出乎意料地，在細(xì)菌中合成的重組蛋白質(zhì)形式的AMEP對所描述的整個體外實驗的強(qiáng)抑制作用，可用在哺乳動物中重新合成的AMEP在體內(nèi)得到的結(jié)果加以證實。有利地，AMEP對無胸腺模型中腫瘤生長的抑制作用是與在體外血管生成的所有階段的腫瘤內(nèi)血管數(shù)降低(即AMEP抑制的直接結(jié)果)相關(guān)的。此外，AMEP對使用黑素瘤細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移形成的抗侵入作用是與AMEP對在體外這些同樣細(xì)胞的特別抗增殖作用相關(guān)的。
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20 25 30Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Ser Asp Gly Pro Cys35 40 45Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly Trp Gln Cys Arg Pro Thr50 55 60Arg Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys Pro Gly Asp Ser Ser Gln65 70 75 80Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly Asp Gly Glu85 90
權(quán)利要求
1.一種活性劑在制備抑制血管生成或侵入和/或轉(zhuǎn)移形成的藥物中的應(yīng)用，所述的活性劑選自一種蛋白物質(zhì)或核酸分子，所述的蛋白物質(zhì)包含Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物、或由Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物組成，所述的核酸分子包含編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列、或由編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的Adamalysin是Metargidin。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的蛋白物質(zhì)包含Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物、或由Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物組成，該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQID NO2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的核酸分子包含編碼Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或衍生物、或由編碼Metargidin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或衍生物組成，編碼該結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的核酸分子是一種載體或是與一種表達(dá)載體結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的核酸分子存在于用所述分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，以便在體內(nèi)表達(dá)所述的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物用于治療和/或預(yù)防癌癥、轉(zhuǎn)移過程、炎癥、牛皮癬、動脈硬化癥或黃斑變性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性劑在制備抑制血管生成或侵入和/或轉(zhuǎn)移形成的藥物中的應(yīng)用，所述的活性劑選自一種蛋白物質(zhì)或核酸分子，所述的蛋白物質(zhì)包含Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物、或由Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物組成，所述的核酸分子包含編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列或由編碼Adamalysin的全部或部分解離素結(jié)構(gòu)域或其衍生物的多核苷酸序列組成。優(yōu)選地，所述的Adamalysin是Metargidin。
文檔編號A61K48/00GK1535156SQ02814760
公開日2004年10月6日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者韋羅妮克·特羅雄, 韋羅妮克 特羅雄, 娜 索里亞, 陸核, 克洛迪娜·索里亞 申請人:國家健康與醫(yī)學(xué)研究院