專(zhuān)利名稱(chēng)：用神經(jīng)細(xì)絲蛋白的抗體防止細(xì)胞死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防止或抑制細(xì)胞死亡的方法，涉及治療需要防止、抑制、和/或改善細(xì)胞死亡和組織壞死疾病的方法。本發(fā)明包括給予由于神經(jīng)細(xì)絲蛋白的存在經(jīng)歷細(xì)胞死亡的哺乳動(dòng)物能結(jié)合神經(jīng)細(xì)絲蛋白的一種或幾種抗體、抗體衍生物或該抗體、抗體衍生物或抗體片段可通過(guò)肌肉內(nèi)、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(軟組織內(nèi))、腦室內(nèi)、腫瘤內(nèi)、病損內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部、透皮、通過(guò)氣霧劑、灌輸、藥因注射、植入裝置、緩釋系統(tǒng)等，或單獨(dú)或結(jié)合于載體給藥。另外可通過(guò)體內(nèi)給予表達(dá)此抗體、抗體衍生物或抗體片段的基因，或誘導(dǎo)此抗體產(chǎn)生的疫苗，或者可通過(guò)遺傳修飾或其它方法誘導(dǎo)體內(nèi)能表達(dá)此抗體、抗體衍生物或抗體片段的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒，來(lái)表達(dá)上述抗體、抗體衍生物或抗體片段。
2.相關(guān)技術(shù)描述阿爾茨海默氏病(AD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退化疾病，其特征是記憶、行為、語(yǔ)言和視覺(jué)-空間能力的漸進(jìn)性損害，最終以死亡為結(jié)束。易受損區(qū)域內(nèi)的特征病理變化包括脆內(nèi)β-淀粉樣沉淀、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、突觸喪失和廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。對(duì)阿爾茨海默氏病病因和治療的研究為研究人員帶來(lái)了多種途徑。相當(dāng)多的證據(jù)表明在疾病病因?qū)W中人淀粉樣前體蛋白(APP)的產(chǎn)生和加工發(fā)生改變。然而研究證明AD是一種有著許多不同也許重疊病因的多因素疾病。
因此本領(lǐng)域人員進(jìn)行了重要的研究和臨床調(diào)查，研究了腦內(nèi)和不同神經(jīng)細(xì)胞群內(nèi)的結(jié)構(gòu)缺陷、化學(xué)變化和功能反常。這種調(diào)查和研究的深度由下列出版物為代表，它們僅代表本領(lǐng)域大量報(bào)導(dǎo)的一小部分阿爾茨海默氏病的神經(jīng)生物學(xué)(Neurobiology of Alzheimer’s Disease，D.Dawbarn和S.J.Allen，編輯，Bios，Oxford 1995)；癡呆(Dementia，J.Whitehouse，編輯，F(xiàn).A.Davis Company，Philadelphia，1993)；阿爾茨海默氏病老年性癡呆和相關(guān)疾病(Alzheimer’sDiseaseSenile Dementia and Related Disorders，Katzman，R，和R.L.Bick，編輯，Raven Press，New York，1994，47-51頁(yè))；阿爾茨海默氏病和相關(guān)疾病，病因、發(fā)病機(jī)理和治療(Alzheimer’s Disease and Related Disorders，Etiology，Pathogenesis and Therapeutics，Iqbol，K.等，編輯，Wiley，Chichester，1999)；阿爾茨海默氏病臨床和基礎(chǔ)研究進(jìn)展(Alzheimer’s DiseaseAdvances inClinical and Basic Research，Corain，B編輯，Wiley，New York，1993)；阿爾茨海默氏病臨床和治療展望(Alzheimer’s DiseaseClinical and TreatmentPerspectivesh，Cutler，N.R.等，編輯，Wiley，Chichester，1995)；阿爾茨海默氏病治療策略(Alzheimer’s DiseaseTherapeutic Strategies，Giacobini，E.，Becker，R.，編輯，Birkhauser，Boston，1994)；Paykel等，Arch.Gen.Psychiat.，51325-332(1994)；Amaducci，等，Neurology 36922-931(1986)McKhann，等，Neurology 34939-944(1984)，Heston等，Arch.Gen.Psychiatry.，381085-1090(1981)；大腦老化(Aging of the Brain，Gispen和Traber，編輯)，ElsevierScience Publisher，Amsterdam，1983，275-282頁(yè))；Heyman等，Ann.Neurol15335-341(1984)；Brayne C.和P.Calloway，Lancet 11265-1267(1988)；Roth等，Br.J.Psychiatry 149698-709(1986)；醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)，NRC阿爾茨海默氏病研討會(huì)的報(bào)告(Report from the NRC Alzheimer’s Disease Workshop，London，England，1987)；Morris等，Neurology 41469-478(1991)；以及各個(gè)這些出版物所引用的參考文獻(xiàn)。
現(xiàn)今阿爾茨海默氏病是美國(guó)第三位最昂貴的疾病，每年使社會(huì)花費(fèi)約一千億美元。它是老人中最普遍的疾病，且隨著社會(huì)的老齡化變得更顯著。AD相關(guān)花費(fèi)包括直接醫(yī)藥費(fèi)用如療養(yǎng)院護(hù)理、直接非醫(yī)藥費(fèi)用如家中日間護(hù)理、和間接費(fèi)用如失去病人和護(hù)理者的生產(chǎn)力。醫(yī)學(xué)治療和行為修正可通過(guò)減慢識(shí)別能力衰退速度、延遲收容入院、減少護(hù)理時(shí)間和提高生活質(zhì)量來(lái)獲得經(jīng)濟(jì)利益。藥物經(jīng)濟(jì)評(píng)估顯示藥物治療和行為修正對(duì)護(hù)理院布置、識(shí)別能力和護(hù)理時(shí)間的效果為正結(jié)果。
神經(jīng)細(xì)絲蛋白(NTP)是最近才特征鑒定的一個(gè)大腦蛋白質(zhì)家族。此家族成員之一AD7C-NTP是的41kD功能與神經(jīng)軸突生長(zhǎng)相關(guān)的膜結(jié)合磷蛋白(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999)；de la Monte SM和Wands JR，Journal of Alzheimer’s Disease，3345-353(2001))。編碼AD7C-NTP的基因和AD7C-NTP的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列已有鑒定和描述(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。除了這種的41kD磷蛋白外，其它種類(lèi)的神經(jīng)細(xì)絲蛋白(約26kD、～21kD、～17kD和～15kD)也已鑒定并與神經(jīng)外胚層腫瘤、星細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及組織缺氧、局部缺血或腦梗塞引起的損傷相關(guān)聯(lián)(Xu等，Cancer Research，533823-3829(1993)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。
對(duì)神經(jīng)細(xì)絲蛋白的種類(lèi)已有描述和權(quán)利要求，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634；5,948,888和5,830,670中所有關(guān)于“阿爾茨海默氏病的神經(jīng)細(xì)絲蛋白基因表達(dá)和檢測(cè)”和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071,705關(guān)于“檢測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)疾病或功能紊亂的方法”。這些專(zhuān)利的方法和說(shuō)明書(shū)全部納入本文參考文獻(xiàn)。如其中所述，NTP在細(xì)胞死亡中受到上調(diào)和產(chǎn)生。因此，描述死亡和垂死的神經(jīng)細(xì)胞為過(guò)度產(chǎn)生NTP，因而它的存在表明神經(jīng)細(xì)胞死亡和阿爾茨海默氏病(AD)發(fā)作。
已將其它種類(lèi)的神經(jīng)細(xì)絲蛋白鑒定為AD7c-NTP基因的其它產(chǎn)物(如描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_032307 PID g15928971的一種112個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))或類(lèi)似于神經(jīng)細(xì)絲蛋白(如描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH14951 PID g15928971的一種106個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599339的另一種106個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)和描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH02534 PID g12803421的一種61個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))。
有令人信服的證據(jù)將AD7C-NTP種類(lèi)和蛋白和AD具體相連系且它在AD的細(xì)胞死亡中受到上調(diào)。與對(duì)照相比AD7C-NTP mRNA在AD大腦中上調(diào)；AD大腦和CSF中的AD7C-NTP蛋白質(zhì)水平高于對(duì)照；AD7C-NTP的免疫反應(yīng)性見(jiàn)于AD和唐氏綜合癥大腦的老年斑中、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)中退化神經(jīng)元、神經(jīng)纖維肉絲(氈)(neuropilthread)和營(yíng)養(yǎng)不良性軸突芽生中(Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86419-423(1989)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，86(3)1004-13(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113(2)152-64(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。免疫細(xì)胞化學(xué)證明AD7C-NTP蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞內(nèi)、神經(jīng)氈內(nèi)的精細(xì)加工中，或AD和唐氏綜合癥大腦的細(xì)胞外。de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)。兩種細(xì)胞神經(jīng)元和星形細(xì)胞含有NTP(Id.)。受影響神經(jīng)元是通常包含在AD大腦熟知的神經(jīng)纖維纏結(jié)中的大錐體型神經(jīng)元。
在AD病人的CSF和尿中都發(fā)現(xiàn)AD7C-NTP蛋白質(zhì)水平升高，顯示它作為此破壞性疾病生化標(biāo)志的準(zhǔn)確性(de la Monte和Wands，F(xiàn)ront Biosci 7989-96(2002)；de la Monte和Wands，Journal of Alzheimer’s Disease，3345-353(2001)；Munzar等，Alzheimer’s Reports 461-65(2001)；Kahle等，Neurology 541498-1504(2000)和Averback Neurology 551068(2000)；Munzar等，Alzheimer’sReports 3155-159(2000)；de la Monte等，Alzheimer’s Reports 2327-332(1999)；Ghaubari等J Clin Lab Aual 122230226(1998)；Ghanbari等，Journalof Contemporary Neurology 1998；4A2-6(1998)；de la Monte等，J Clin Invest1003093-3104(1997)。
過(guò)度表達(dá)AD7C-NTP基因也與阿爾茨海默氏病中的細(xì)胞死亡過(guò)程相連系(de laMonte和Wands，J.Neuropa tho.And Exp.Neuro.，60195-207(2001)；de la Monte和Wands，Cell Mol Life Sci 58844-49(2001)。也在唐氏綜合癥大腦組織中鑒定到AD7C-NTP(Wands等，國(guó)際專(zhuān)利出版號(hào)WO 90/06993；de la Monte等，J NeurolSci 135118-25(1996)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。有一些證據(jù)表明過(guò)度表達(dá)AD7C-NTP基因也可能與青光眼相關(guān)聯(lián)(Golubnitschaja-Labudova等，Curr Eye Res 21867-76(2000))。
本發(fā)明者近來(lái)發(fā)現(xiàn)釋放的AD7C-NTP蛋白質(zhì)有細(xì)胞毒性能引起組織中其他細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡(與垂死細(xì)胞本身產(chǎn)生的AD7C-NTP上調(diào)相比)，見(jiàn)待審批的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)標(biāo)題為“用蛋白治療腫瘤和相關(guān)疾病的方法”，其所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。因此，尤其需要在AD大腦中，防止、抑制、調(diào)節(jié)或改進(jìn)與神經(jīng)細(xì)絲蛋白相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞死亡和組織壞死。
此描述包括前述相關(guān)領(lǐng)域、任何和所有本文所述的公開(kāi)文獻(xiàn)，包括任何和所有相關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利全部納入本文參考文獻(xiàn)。
發(fā)明概述需要發(fā)展一種方法來(lái)防止、抑制、調(diào)節(jié)和/或改善含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和組織壞死。具體是需要發(fā)展一種能防止、抑制和/或改善腦內(nèi)含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。也需要發(fā)展治療因活組織中存在NTP發(fā)生細(xì)胞死亡和/或組織壞死所致疾病的方法。還需要發(fā)展一種通過(guò)防止、抑制和/或改善含NTP的活的哺乳動(dòng)物腦組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死治療腦淀粉樣變性的方法。同樣需要發(fā)展一種控制、抑制、調(diào)節(jié)或改善活組織中由于給予NTP所引起的細(xì)胞死亡和組織壞死的方法來(lái)去除或破壞有害或不需要的組織或細(xì)胞如人良性或惡性腫瘤成分。
因此，本發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)特征是提供防止、抑制和/或改善含NTP的活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。此方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體，其中此抗體存在的量足以防止、抑制、減少、控制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
在發(fā)明實(shí)施方案的另一個(gè)特征，是提供使含NTP的活組織接觸能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體片段來(lái)防止、抑制和/或改善含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。此抗體片段存在的量足以防止、抑制、減少、控制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明實(shí)施方案的又一個(gè)特征，是提供使含NTP的活組織接觸能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體衍生物來(lái)防止、抑制和/或改善含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。此抗體衍生物存在的量足以防止、抑制、減少、控制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明實(shí)施方案的另一特征，是提供使含NTP的活哺乳動(dòng)物腦組織接觸含至少一種能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的成分來(lái)防止和/或抑制含NTP的活哺乳動(dòng)物腦組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。所述成分能穿過(guò)血腦屏障。
本發(fā)明實(shí)施方案的又一特征，是提供治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所所引起疾病的方法，所述方法包括使含NTP的活組織接觸能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段。這些抗體、抗體衍生物或抗體片段存在的量足以防止、抑制、減少和/或改進(jìn)因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。根據(jù)此方法，將能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體或抗體片段給予患有因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所致疾病的哺乳動(dòng)物，給予的量足以防止、抑制、減少和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明實(shí)施方案的另一個(gè)特征，是提供的包含能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的組合物，和能使該抗體或抗體片段穿過(guò)血腦屏障的成分。
本發(fā)明實(shí)施方案的又一個(gè)特征，是提供一種治療腦淀粉樣變性的方法，該方法是使含NTP的活的哺乳動(dòng)物腦組織接觸一種成分，該成分含有至少一種能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段。所述成分能穿過(guò)血腦屏障。
本發(fā)明實(shí)施方案的另一特征，是提供一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的青光眼的方法，該方法是使含NTP的組織接觸至少一種能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段。
本發(fā)明實(shí)施方案的又一特征，是提供治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物一種基因，該基因可表達(dá)能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段，給藥將導(dǎo)致這些抗體、抗體衍生物或抗體片段接觸含NTP的活組織。給予該基因的方式能使抗體、抗體衍生物或抗體片段存在的量足以防止、抑制和/或改進(jìn)因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明實(shí)施方案的又一特征，是提供治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物一種疫苗，該疫苗能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)或產(chǎn)生能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體或抗體片段，給予疫苗將導(dǎo)致這些抗體或抗體片段接觸含NTP的活組織。給予疫苗的方式能使抗體或抗體片段存在的量足以防止、抑制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明實(shí)施方案的另一特征是提供治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，該方法包括將能體內(nèi)表達(dá)可識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒導(dǎo)入或給予或植入需要它的哺乳動(dòng)物，給藥將導(dǎo)致這些抗體、抗體衍生物或抗體片段接觸含NTP的活組織。細(xì)胞、細(xì)菌或病毒的導(dǎo)入、給予或植入的方式能使抗體、抗體衍生物或抗體片段存在的量足以防止、抑制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
本發(fā)明的這些和其它特征對(duì)于閱讀了下詳細(xì)描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員是不難明白的。然而應(yīng)理解盡管詳細(xì)描述和具體實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的較佳實(shí)施方案，它們僅用于闡明，因?yàn)楸景l(fā)明的思路和范圍內(nèi)的各種變化和修飾通過(guò)此敘述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然明白的。除非另有說(shuō)明，本文所引用文獻(xiàn)的各個(gè)內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)中。
附圖簡(jiǎn)述

圖1-4是注射N(xiāo)TP后誘導(dǎo)組織病理學(xué)損傷的顯微照片。
圖5顯示122個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634的序列40；NCBIEntrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25447)的整個(gè)氨基酸序列。
圖6顯示112個(gè)氨基酸蛋白(NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_032307)的整個(gè)氨基酸序列。
圖7顯示在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH14951 PID g15928971中列出的106個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白。
圖8顯示在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599399中列出的106個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白。
圖9顯示98個(gè)氨基酸蛋白(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670的序列30；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE13612)的整個(gè)氨基酸序列。
圖10顯示75個(gè)氨基酸蛋白(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634的序列48；NCBIEntrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25448)的整個(gè)氨基酸序列。
圖11顯示68個(gè)氨基酸蛋白(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634的序列36；NCBIEntrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25446)的整個(gè)氨基酸序列。
圖12顯示61個(gè)氨基酸蛋白樣蛋白質(zhì)(NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH02534)的整個(gè)氨基酸序列。
較佳實(shí)施方案的詳細(xì)描述在此描述中，術(shù)語(yǔ)“NTP”或“神經(jīng)細(xì)絲蛋白質(zhì)”指蛋白質(zhì)和相關(guān)分子(包括胰管細(xì)絲蛋白)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，且包括(但不限于)下列蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸序列(a)AD7C-NTP；(b)～42、～26、～21、～17、～14和～8kD種類(lèi)的神經(jīng)細(xì)絲蛋白質(zhì)，描述見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634；5,948,888；5,830,670和6,071,705和de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de laMonte等，Alz.Rep.，2327-332(1999)；(c)單克隆抗體#2所特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)，保存于American Type CultureCollection，Manassa，Va.，登錄號(hào)HB-12546，單克隆抗體5所特異識(shí)別的蛋白質(zhì)保存于American Type Culture Collection，Manassa，Va.，登錄號(hào)HB-12545；(d)AD7C-NTP基因所編碼的蛋白質(zhì)；(e)122個(gè)氨基酸的神經(jīng)細(xì)絲蛋白，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列40，并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25447，PID g10048540中列出，它的氨基酸序列示于圖5；(f)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_032307，PID g14725132中列出了122個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白，它的氨基酸序列示于圖6；(g)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH14951 PID g15928971中列出了106個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白，它的氨基酸序列示于圖7；(h)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599399中列出了106個(gè)氨基酸神經(jīng)細(xì)絲蛋白，它的氨基酸序列示于圖8；(i)98個(gè)氨基酸蛋白，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,88的序列30并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE13612，PID g10048538中列出，它的氨基酸序列示于圖9；(j)75個(gè)氨基酸蛋白，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列48并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25448，PID g10048541中列出，它的氨基酸序列示于圖10；(k)68個(gè)氨基酸蛋白，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列36并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25446，PID g10048539中列出，它的氨基酸序列示于圖11；(l)在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH02534，PID g12803421中列出了61個(gè)氨基酸蛋白樣蛋白質(zhì)，它的氨基酸序列示于圖12；(m)胰腺線狀蛋白；(n)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071,705中描述了神經(jīng)胰管細(xì)絲蛋白(nPTP)；(o)雜交瘤產(chǎn)生的抗體能特異性識(shí)別所述蛋白質(zhì)，雜交瘤為保存于AmericanType Culture Collection的HB9934、HB9935和HB9936。
術(shù)語(yǔ)“NTP”也包括從哺乳動(dòng)物組織獲得或用重組技術(shù)產(chǎn)生的NTP并包括NTP的片段、變體、衍生物和同源物。
術(shù)語(yǔ)“AD7C-NTP”指～41kD蛋白質(zhì)和編碼它的基因和核酸序列，描述見(jiàn)de laMonte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)，和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634、5,948,888和5,830,670及NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AF010144中的序列120和121。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”指能結(jié)合或識(shí)別NTP的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，單抗是基本上均質(zhì)的群體，多抗是異質(zhì)群體。多克隆抗體獲自用抗原免疫動(dòng)物的血清。抗特異性抗原的單克隆抗體(mAb)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得。例如參見(jiàn)Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,376,110，所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。這種抗體可以是任何免疫球蛋白種類(lèi)，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和它們的亞類(lèi)。
術(shù)語(yǔ)“抗體”具體包括(但不限于)1.如前所述的單克隆抗體Th7、Th9、Th10、N2B10、N2I5、N2J1、N2S6、N2T8、N2U6、N3A13、N3C11、N3D12、N3I4和N2-36(Gross等，J.Clin.Invest.762115-2126(1985)；Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86419-423(1989)；de laMonte等，J.Clin.Invest.，861004-1013(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113152-164(1992)；；de la Monte等，Ann.Neurol.32733-742(1992)；de laMonte，S.M.等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，551038-50(1996)；de la Monte，S.M.等，J.Clin.Invest123093-3104(1997))。
2.選自保存于American Type Culture Collection的HB9934、HB9935和HB9936的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
3.如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888所述的抗神經(jīng)細(xì)絲蛋白的抗體，包括(但不限于)mAbs Th7、Th9、Th10、Th29和Th34和mABs#2和#5。
4.如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071,705所述的抗胰腺神經(jīng)細(xì)絲蛋白神經(jīng)學(xué)形式的抗體，包括(但不限于)本文所述mAbs7、9和10。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”也包含四物活性變體、同源物、模擬肽、反向-D肽和NTP抗體的對(duì)映異構(gòu)體。
結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的抗體(IgG)包括四條多肽鏈，由二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。輕鏈有兩種不同形式，稱(chēng)為κ和λ。每條鏈有一恒定區(qū)(C)和一可變區(qū)(V)。每條鏈由一系列結(jié)構(gòu)域組成。輕鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)對(duì)應(yīng)于C區(qū)另一個(gè)對(duì)應(yīng)于V區(qū)。重鏈有四個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)對(duì)應(yīng)于V區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域(1、2和3)在C區(qū)?？贵w有兩條臂(每條臂是一個(gè)Fab區(qū))，各有相互聯(lián)合的VL和VH區(qū)。此對(duì)V區(qū)(VL和VH)在抗體間不同(由于氨基酸序列變化)且它們一起負(fù)責(zé)對(duì)抗原的識(shí)別和提供抗原結(jié)合位點(diǎn)(ABS)。更詳細(xì)說(shuō)，每個(gè)V區(qū)由四個(gè)框架區(qū)(FR)分開(kāi)的三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)組成。CDR是可變區(qū)的最易變部分，它們行使關(guān)鍵的抗原結(jié)合功能。CDR區(qū)由許多潛在的種系序列通過(guò)包括重組、突變和選擇等復(fù)雜過(guò)程產(chǎn)生。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指抗NTP抗體的生物活性片段，包括(i)Fab片段，由抗體的VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(ii)Fd片段，由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iii)Fv片段，由抗體一條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；(iv)dab片段(Ward，E.S等，Nature 341，544-546(1989)，由VH結(jié)構(gòu)域組成；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，一種包括兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，在鉸鏈區(qū)由二硫橋相連；(vii)單鏈Fv(scFv)，其中由分離基因編碼的Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)一合成接頭連接，通過(guò)重組方法該合成接頭使它們成為一條蛋白鏈(已知如Bird，R.E等，Science 242，423-426(1988)Huston，J.S等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883(1988))。Fab、F(ab’)2、scFv和其它這種片段缺少完整抗體的Fc片段，可更迅速地從循環(huán)中清除，也許非特異組織結(jié)合低于完整抗體(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。此外，F(xiàn)ab、F(ab’)2、scFv和其它這種片段足夠小能穿過(guò)血腦屏障而不需如下所述對(duì)此屏障作外部處理或與屏障-穿透偶聯(lián)物偶聯(lián)。
本發(fā)明所用的Fab、F(ab’)2、scFv和其它抗體片段可以和所用完整抗體相同的方式用于防止、抑制和/或改善含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。這種片段通常通過(guò)蛋白水解產(chǎn)生，采用的酶如木瓜蛋白酶(用于產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用于產(chǎn)生F(ab’)2片段)或通過(guò)重組方法(用于產(chǎn)生scFv片段)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體片段”也包括抗體片段的生物活性變體、同源物、模擬肽、反向-D肽和對(duì)映異構(gòu)體。
術(shù)語(yǔ)“抗體衍生物”指抗NTP抗體和抗體片段的生物活性衍生物，并包括抗體和抗體片段的衍生物，它們可通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或者細(xì)菌或酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)方法來(lái)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“抗體衍生物”也包括人源化抗體和抗體片段并且還包括生物活性抗體衍生物的生物活性變體、同源物、模擬肽、反向-D肽和對(duì)映異構(gòu)體。
術(shù)語(yǔ)“生物活性”指抗體、抗體衍生物或抗體片段，識(shí)別和/或結(jié)合NTP的能力，包括(但不限于)防止、抑制、減少、控制或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的能力。
如果某抗體能特異性地與某分子反應(yīng)從而使該分子結(jié)合于此抗體，就說(shuō)該抗體具有“結(jié)合能力”、“能結(jié)合”、“結(jié)合于”或“識(shí)別”該分子(例如，蛋白質(zhì)NTP)。術(shù)語(yǔ)“抗原表位”指任何分子能被抗體結(jié)合也即能被抗體識(shí)別的部分，?？乖砦粵Q定簇通常由分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性電荷特征。
“抗原”是能與抗體結(jié)合的分子，并能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能結(jié)合該抗原的某抗原表位的抗體。一種抗原可有一個(gè)或一個(gè)以上的表位。上述特異性反應(yīng)表明抗原以高度選擇性方式與其相對(duì)應(yīng)的抗體反應(yīng)但不與其它抗原誘導(dǎo)的其它多種抗體反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“片段”指由NTP蛋白或者抗體、抗體片段或抗體衍生物的氨基酸連續(xù)序列組成的蛋白質(zhì)或多肽，包括天然產(chǎn)生片段如體內(nèi)天然蛋白酶活性產(chǎn)生的剪接變體和片段。這種片段可在氨基末端、羧基末端和/或內(nèi)部(如通過(guò)天然剪接)截短。這種片段可用或不用氨基末端甲硫氨酸制備。術(shù)語(yǔ)“片段”包括不論相同或不相同，來(lái)自同一NTP蛋白或抗體或抗體衍生物的片段，具有共同的或不同的連續(xù)氨基酸序列，或直接或通過(guò)接頭連接在一起。
術(shù)語(yǔ)“變體”指一種蛋白質(zhì)或多肽，其中與NTP蛋白質(zhì)或抗體、抗體衍生物或抗體片段的氨基酸序列相比存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或插入，包括天然產(chǎn)生的NTP蛋白質(zhì)或抗體、抗體衍生物或抗體片段的等位基因變體或者交替剪接變體。術(shù)語(yǔ)“變體”包括在肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸用類(lèi)似或同源性氨基酸或不相似氨基酸置換。氨基酸可在許多等級(jí)上分為類(lèi)似或同源性氨基酸(Gunnarvon Heijne，分子生物學(xué)的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology，123-39頁(yè)Academic Press，New York，NY 1987.)優(yōu)選的變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置的丙氨酸置換。其它優(yōu)選的置換包括對(duì)蛋白質(zhì)整體凈電荷、極性或疏水性影響很小或沒(méi)有影響的保守置換。保守性置換列于下表I中。
表I保守氨基酸置換堿性精氨酸賴(lài)氨酸組氨酸酸性谷氨酸天冬氨酸無(wú)電荷極性 谷氨酰胺天冬酰胺絲氨酸蘇氨酸酪氨酸非極性 苯丙氨酸色氨酸半胱氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸脯氨酸甲硫氨酸亮氨酸異亮氨酸表II列出氨基酸置換的另一種方案表II原始?xì)埢脫Q丙氨酸 甘氨酸；絲氨酸精氨酸 賴(lài)氨酸天冬酰胺谷氨酰胺；組氨酸天冬氨酸谷氨酸半胱氨酸絲氨酸谷氨酰胺天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 丙氨酸；脯氨酸組氨酸 天冬酰胺；谷氨酰胺異亮氨酸亮氨酸；纈氨酸亮氨酸 異亮氨酸；纈氨酸賴(lài)氨酸 精氨酸；谷氨酰胺；谷氨酸甲硫氨酸亮氨酸；酪氨酸；異亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸；亮氨酸；酪氨酸絲氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 絲氨酸色氨酸 酪氨酸酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸；亮氨酸其它變體可由保守性較小的氨基酸置換組成，如選擇的殘基更顯著不同在于它們維持(a)置換區(qū)域中多肽的主鏈結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)型的效果，(b)分子靶位占的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈大小。預(yù)期通常對(duì)功能有更顯著作用的置換是(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一種氨基酸置換或缺失或插入；(b)親水性殘基如絲氨?；蛱K氨酰，置換(或被)疏水性殘基，如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨酰或丙氨酰；(c)半胱氨酸殘基置換(或被)任何其它殘基；(d)有帶正電荷側(cè)鏈的殘基如賴(lài)氨酰、精氨?；蚪M氨酰置換(或被)帶負(fù)電荷的殘基如谷氨?；蛱於滨?；或(e)有大側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸置換(或被)沒(méi)有這種側(cè)鏈的殘基如甘氨酸。其它變體包括設(shè)計(jì)為產(chǎn)生新的糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的，或設(shè)計(jì)為缺失現(xiàn)存糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的殘基。變體包括糖基化位點(diǎn)、蛋白裂解位點(diǎn)和/或半胱氨酸殘基上的至少一個(gè)氨基酸置換。變體還包括在接頭肽上NTP或抗體氨基酸序列之前或之后有其它氨基酸殘基的NTP蛋白質(zhì)或抗體、抗體片段或抗體衍生物。例如，可將半胱氨酸殘基加在抗體片段的氨基或羧基末端以形成二硫鍵來(lái)使抗體片段環(huán)化。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”指化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)或多肽，它們通過(guò)天然過(guò)程如加工和其它翻譯后修飾而被化學(xué)修飾，也可通過(guò)化學(xué)修飾技術(shù)如加入一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子、糖、磷酸和/或其它這種分子，其中這類(lèi)分子不是天然結(jié)合于野生型NTP蛋白或抗體的分子。衍生物包括鹽。這種化學(xué)修飾詳述可見(jiàn)基礎(chǔ)教材和更詳細(xì)的專(zhuān)論以及大量研究文獻(xiàn)中，它們本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。將會(huì)明白相同類(lèi)型的修飾可能以相同或不同程度存在于給定蛋白質(zhì)或多肽的一些位點(diǎn)上。同樣給定蛋白質(zhì)或多肽可包含許多種類(lèi)的修飾。這些修飾可發(fā)生在蛋白質(zhì)或多肽的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。這些修飾包括例如乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)結(jié)合、血紅素部分的共價(jià)結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)結(jié)合、脂類(lèi)或脂類(lèi)衍生物的共價(jià)結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；ⅵ?羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂類(lèi)結(jié)合硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化和ADP-核糖基化、selenoylation、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸加入蛋白質(zhì)，如精氨酰化和泛素化。參見(jiàn)例如蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)(Proteins-Structure And Molecular Properties)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，New York(1993)和Wold，F(xiàn).，“翻譯后蛋白質(zhì)修飾觀點(diǎn)和前景”(Posttranslational Protein ModifcationPerspective and Prospects)，蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾(Posttranslational Convalent Modification ofProteins，1-12頁(yè)，B.C.Johnson編，Academic Press，New York(1983))；Seifter等，Meth.Enzymol.182626-646(1990)和Rattan等，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化”(Posttranslational Modifcation and Aging)，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62(1992)。術(shù)語(yǔ)“衍生物”包括化學(xué)修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽變成分枝狀或者有或沒(méi)有分枝的環(huán)狀。環(huán)狀、分枝狀和分枝環(huán)狀蛋白質(zhì)或多肽可能由于翻譯后的天然加工產(chǎn)生并可完全由合成方法產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“同源物”指蛋白質(zhì)，如NTP蛋白質(zhì)AD7C-NTP，或抗體、抗體衍生物或抗體片段的氨基酸序列，根據(jù)常用于比較兩種多肽的氨基酸位置類(lèi)似性的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定至少有百分之75相同。兩種蛋白質(zhì)之間的相似性或相同性程度可不難用已知方法計(jì)算，包括但不限于以下所描述的那些方法計(jì)算分子生物學(xué)ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.編，Oxford University Press，New York，1988；生物計(jì)算信息和基因組計(jì)劃BiocomputingInformatics and Genome Projiects，Smith，D.W.編，Academic Press，New York，1993；序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析(ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編，HumanaPress，New Jersey，1994)；分子生物學(xué)序列分析(Sequence analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，New York，1987)；序列分析引物(Sequence analysis Primery，Gribskov，M.和Devereux，J.編，M Stockton Press，New York，1991；Carillo H.和Lipman，D.，SIAM，J.Applied Math.，481073(1988)。設(shè)計(jì)了確定相同性的優(yōu)選方法來(lái)測(cè)試序列之間的最大匹配。在公眾可得到的計(jì)算機(jī)程序中編輯有確定相同性和相似性的方法。
用于確定兩種序列之間相同性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法，包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTIN和FASTA，Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLASTX程序公眾可從NCBI和其它來(lái)源獲得(BLAST手冊(cè)，Altschul，S.等，NCBI NLMNIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。例如采用計(jì)算機(jī)算法如GAP(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，排列對(duì)比兩種待測(cè)定的蛋白質(zhì)或多肽的序列相同性百分比用于最佳匹配它們各自的氨基酸(“匹配范圍”通過(guò)算法確定)。空格開(kāi)放罰分(gap opening penalty，計(jì)算為3x倍平均對(duì)角線值；“平均對(duì)角線值”是所用比較矩陣的對(duì)角線平均值；“對(duì)角線值”是通過(guò)具體比較矩陣賦予各優(yōu)選氨基酸的評(píng)分或數(shù)值)和空格延伸罰分(gap extension penalty，通常是空格開(kāi)放罰分的1/10以及比較矩陣?yán)鏟AM250或BLOSUM 62可與此算法結(jié)合使用。標(biāo)準(zhǔn)的比較矩陣(參見(jiàn)Dayhoff等，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)合集(Atlas of Protein Sequence andStructure，第5卷，supp.3；PAM250比較矩陣參見(jiàn)Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919；也可采用該臬法的BLOSUM 62比較矩陣)。然后用該算法計(jì)算相同性百分比。同源物與NTP、AD7c-NTP、抗體、抗體衍生物或抗體片段相比，通常具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或插入。
術(shù)語(yǔ)“模擬肽”指能模擬某肽或某蛋白質(zhì)生物活性但在化學(xué)性質(zhì)上不再是肽的生物活性化合物，即它們不再含肽鍵(即氨基酸間的酰胺鍵)。這里術(shù)語(yǔ)模擬肽用于更廣泛含義，包括性質(zhì)上不再完全是肽的分子如假肽、半肽和擬肽(peptoid)。此廣泛含義上的模擬肽例子(其中肽的一部分被缺乏肽鍵的結(jié)構(gòu)取代)描述于下。無(wú)論完全是或部分是非肽，本發(fā)明的模擬肽提供了反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)的空間排列，(模擬肽所依據(jù)的這些基團(tuán)非常類(lèi)似于抗體、抗體衍生物或抗體片段中活性基團(tuán)的三維排列。由于這種相似的活性位點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)，模擬肽對(duì)生物系統(tǒng)的作用類(lèi)似于肽的生物活性。
本發(fā)明的模擬肽在三維形狀和生物活性上優(yōu)選基本上類(lèi)似于本文所述的抗體、抗體衍生物或抗體片段。結(jié)構(gòu)上修飾本領(lǐng)域已知的肽以產(chǎn)生模擬肽的方法的例子包括倒置主鏈?zhǔn)中灾行漠a(chǎn)生D-氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，具體是在N-末端，使對(duì)蛋白質(zhì)水解降解的穩(wěn)定性提高而沒(méi)有不良活性。在論文“tritriated D-丙氨酸1-肽T結(jié)合”(tritriated D-ala1-Peptide T Binding，Smith C.S.等，Drug DevelopmentRes.，15，371-379頁(yè)(1988)中給出了一個(gè)例子。第二種方法是改變穩(wěn)定性所需的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如N到C鏈間的二酰亞胺和內(nèi)酰胺(Ede等，Smith和Rivier主編“肽化學(xué)和生物”P(pán)eptidesChemistry and Biology，Escom，Leiden，1991 268-270頁(yè))。它的例子見(jiàn)構(gòu)型限制的促胸腺生成素類(lèi)似化合物，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,457,489(1985)，Goldstein，G.等所公開(kāi)的那樣，其內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。第三種方法是用對(duì)蛋白水解有抗性的假肽鍵替換抗體、抗體片段或抗體衍生物中的肽鍵。
所述的一些假肽鍵一般不影響肽的結(jié)構(gòu)和生物活性。此方法的一個(gè)例子是置換逆轉(zhuǎn)化假肽鍵(“促胸腺生成素的生物活性逆轉(zhuǎn)化類(lèi)似物”(Biologicallyactiveretroinverso analogue of thymopentin)，Sisto A等，Rivier，J.E.和Marshall，G.R.主編輯“肽、化學(xué)、結(jié)構(gòu)和生物”(Peptides，Chemistry，Structure and Biology，Escom，Leiden，1990，722-773頁(yè))和Dalpozzo等(1993)，Int.J.Peptide ProteinRes.，41561-566，納入本文參考文獻(xiàn))。根據(jù)此修飾，肽的氨基酸序列可能與上述抗體序列相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被逆轉(zhuǎn)化(retro-inverso)假肽鍵所取代。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被置換，這是由于這種置換是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予了對(duì)蛋白水解的抗性。也可用其它類(lèi)似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)取代氨基酸的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾。另一種已知可提高對(duì)酶裂解穩(wěn)定性而生物活性沒(méi)有或很少損失的合適的假肽鍵是還原型電子等排(isostere)假肽鍵(Couder等(1993)，Int.J.PeptideProtein Res，41181-184，全部納入本文參考文獻(xiàn))。
因此，這些肽的氨基酸序列可能與抗體、抗體片段或抗體衍生物相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被電子等排假肽鍵取代外。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被置換，這是由于這種置換是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予了對(duì)蛋白水解的抗性。合成具有一個(gè)或多個(gè)還原型電子等排假肽鍵的肽是本領(lǐng)域已知的(Couder等，上面所引用)。另一個(gè)例子包括導(dǎo)入酮亞甲基鍵或甲硫化物鍵來(lái)取代肽鍵。
NTP肽的擬肽衍生物代表了另一種類(lèi)模擬肽，擬肽保留了生物活性的重要結(jié)構(gòu)決定簇但去除肽鍵，從而賦予了對(duì)蛋白水解的抗性(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371，全部納入本文參考文獻(xiàn))。擬肽是N-置換甘氨酸的寡聚物。已報(bào)道了一些N-烷基基團(tuán)，各對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的側(cè)鏈(Simon等，1992，上面所引用)?？贵w、抗體片段或抗體衍生物的一些或所有氨基酸用對(duì)應(yīng)于被取代氨基酸的N-置換甘氨酸所取代。
術(shù)語(yǔ)“反-D肽”指與抗體、抗體片段或抗體衍生物的L-氨基酸序列相比由反向順序排列的D-氨基酸組成的生物活性蛋白質(zhì)或肽，。因此，L-氨基酸抗體蛋白質(zhì)、抗體片段或抗體衍生物的羧基末端殘基成為D-氨基酸肽的氨基末端。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)映異構(gòu)體”指一種生物活性蛋白質(zhì)或肽，其中所述抗體、抗體片或抗體衍生物氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基取代。
在此描述中，術(shù)語(yǔ)“淀粉樣變性”和表述“腦淀粉樣變性”指一些病理狀況，其特征為異常纖維(“淀粉樣纖維”)和/或相關(guān)的非纖維狀淀粉樣前體或非前體分子的沉積，以及NTP存在于胞外空間中，這些病理狀況包括例如阿爾茨海默疾病群，即阿爾茨海默氏病(早老性癡呆，老年性癡呆)；與唐氏綜合癥相關(guān)的阿爾茨海默氏??；家族性阿爾茨海默氏病；由于突變?nèi)鏟resenilin 1、Presenilin 2和其它引起的遺傳性阿爾茨海默氏??；與其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的阿爾茨海默氏病，如帕金森氏癥、Lewy Body病和腦血管疾??；congophilic血管病(與或不與阿爾茨海默氏病相關(guān)，家族性或非家族性)和其它疾病，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,331中所示，所公開(kāi)的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。
在本文中，表述“淀粉樣蛋白斑塊”和“淀粉樣纖維”指老年斑、神經(jīng)炎性斑塊、淀粉樣蛋白斑塊、淀粉樣星體、淀粉樣核心、原始斑、典型性斑塊、耗盡斑、擴(kuò)散斑、暗斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、淀粉樣纖維、雙螺旋絲等。在本文中，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指所有的哺乳動(dòng)物，優(yōu)先指羊、母牛、狗、貓、猿、猴、小鼠、大鼠和人，最優(yōu)選指人。
本發(fā)明涉及防止含NTP的活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法。盡管已知道NTP并在文獻(xiàn)中有所描述，但迄今為止不知道NTP可引起除產(chǎn)生NTP細(xì)胞之外的細(xì)胞死亡。盡管不受被任何理的束縛，本發(fā)明人相信活組織中存在NTP，不僅如先前報(bào)道那樣，表明有一些神經(jīng)細(xì)胞死亡，而且也具有毒性因?yàn)樗芤鹌渌罱M織細(xì)胞死亡。本發(fā)明人相信哺乳動(dòng)物腦組織中存在NTP是阿爾茨海默氏病(AD)的標(biāo)志，它通過(guò)在其存在的活組織中引起細(xì)胞死亡和/或組織壞死使AD惡化。因此，相信患AD的哺乳動(dòng)物，神經(jīng)細(xì)胞死亡上調(diào)了產(chǎn)生NTP的細(xì)胞，從而在該部位產(chǎn)生NTP。產(chǎn)生的NTP隨后開(kāi)始破壞它附近的其它活組織(如其它神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等)，因而加劇疾病發(fā)展。因此本發(fā)明人相信用抗體、抗體衍生物或抗體片段中和NTP會(huì)有助于防止、抑制、減少、控制和/或改善含NTP或與NTP接觸活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
NTP在它存在的活組織中引起細(xì)胞死亡和/或組織壞死的能力使它可用于去除或破壞有害的或不需要的組織或細(xì)胞成分如人的良性或惡性腫瘤，見(jiàn)待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)標(biāo)題為“用神經(jīng)細(xì)絲蛋白治療腫瘤和相關(guān)疾病的方法”中所述。本發(fā)明人預(yù)期它可調(diào)節(jié)、控制、防止或抑制為此目的施用NTP所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死，特別是避免或減少周?chē)M織中的細(xì)胞死亡或組織壞死。因此本發(fā)明人相信用抗體、抗體衍生物或抗體片段中和NTP，會(huì)有助于調(diào)節(jié)、控制、防止或抑制施用NTP的活組織中或鄰近組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
進(jìn)行NTP重組的方法見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634、5,948,888、5,830,670和6,071,705，所述(所公開(kāi)的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn))。產(chǎn)生抗NTP抗體使我們可診斷AD和其它相關(guān)疾病，也見(jiàn)以上這些文獻(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可采用NTP片段、同源物、衍生物和變體以及多種來(lái)源的NTP(如天然、胰腺、純化的、合成的或不同體外表達(dá)系統(tǒng)獲得的)來(lái)制備或篩選本發(fā)明所用的抗體、抗體片段或抗體衍生物。
采用NTP片段來(lái)產(chǎn)生或篩選抗體、抗體衍生物或抗體片段也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常根據(jù)目的采用較大活性分子的較小活性片段。采用NTP家族的分子如AD7C-NTP和其它神經(jīng)細(xì)絲蛋白和胰管細(xì)絲蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明所用的單克隆抗體，具體是mAb Th7、Th9、Th10和N314，可如前所述制備(Gross等，J.Clin.Invest.762115-2126(1985)；Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86419-423(1989)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，861004-1013(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113152-164(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32733-742(1992)；de la Monte，S.M.等，Journal of Neuropatholand Experimental Neurology.，551038-1050(1996))。已產(chǎn)生了抗純化形式胰管細(xì)絲蛋白(Id.)的單克隆抗體。也可產(chǎn)生針對(duì)分離自重組宿主的基本純化NTP的NTP-特異性多克隆和單克隆抗體抗(例如參見(jiàn)Carroll等，“產(chǎn)生和純化針對(duì)β-半乳糖苷酶融合蛋白外源區(qū)段的多克隆抗體”(Production and Purification ofPolyclonal Antibodies to the Foreign Segment of β-Galactosidase FusionProteins，“DNA克隆一種實(shí)踐方法”，第III卷，IRL Press，Washington，D.C.，89-111頁(yè)(1987)；Mole等，“抗大腸桿菌產(chǎn)生的融合蛋白的單克隆抗體的生產(chǎn)”，“DNA克隆一種實(shí)踐方法”，第III卷，IRL Press，Washington，D.C.，113-1139頁(yè)(1987))?；蛘撸墒褂檬熘募夹g(shù)來(lái)產(chǎn)生針對(duì)分離自生物物質(zhì)如腦組織和細(xì)胞系的基本純化NTP的NTP-特異性多克隆和單克隆抗體。
例如，可從cDNA(如1-9a)、基因組克隆(G2-2PstI)和AD-NTP3-4 cDNA克隆所表達(dá)的、分離和純化的重組蛋白質(zhì)制備針對(duì)。8、14、17、21、26和42kDa分子量NTP分子的特異性單克隆抗體。這些NTP分子可獲自上述cDNAs和基因組克隆，將其插入并產(chǎn)生在適當(dāng)表達(dá)載體中產(chǎn)生。由于在1-9a NTP cDNA和PTP的5’端有60-70％同源性區(qū)域，可通過(guò)常規(guī)差別性篩選獲得特異性結(jié)合NTP重組蛋白而非胰管形式NTP的單克隆抗體(參見(jiàn)例如de la Monte等，J.Clin.Invest.，861004-1013(1990))。雖然已有結(jié)合NTP和PTP的單克隆抗體，但可產(chǎn)生NTP-特異性單克隆抗體，因?yàn)楦鞣N形式NTP分子(如8、14、17、21、26和42kDa)之間存在著大量的序列多樣性并且抗原表位可能由少至6-8個(gè)氨基酸所確定。在本發(fā)明中，可采用結(jié)合NTP和PTP的單克隆抗體只要它們能抑制、防止和/或改善含NTP的活組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
此抗體也可用嵌合或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備，如采用Abgeuix的異體小鼠(Xenomouse)技術(shù)發(fā)展的小鼠(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598)或HuMAb-小鼠、Kirn TC小鼠或Medarex發(fā)展的KM-Mouse小鼠(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,300,129、5,877,397、5,874,299、5,814,318、5,789,650、5,770,429、5,661,016、5,633,425、5,625,126、5,569,825和5,545,806)。這些專(zhuān)利各自所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。
此抗體片段可由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用熟知的技術(shù)制備?？贵w衍生物可從生物活性抗體、抗體片段或其它抗體衍生物制備，采用噬菌體展示、細(xì)菌細(xì)胞表面展示或酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)以建立組合肽文庫(kù)。NTP可隨后用于篩選這些文庫(kù)以鑒定生物活性抗體、抗體片段或抗體衍生物。
采用稱(chēng)為噬菌粒的絲狀噬菌體展示載體是有效制備具有多樣性和新型免疫特異性的單克隆抗體大文庫(kù)的熟知方法。此技術(shù)采用絲狀噬菌體衣殼蛋白膜定錨結(jié)構(gòu)域作為絲狀噬菌體復(fù)制連物裝配時(shí)接基因產(chǎn)物和基因的工具，已將此技術(shù)用于克隆和表達(dá)組合文庫(kù)的抗體(Kang，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363，1991，Barbas，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887978，1991)。
在噬菌體展示中，感興趣的蛋白質(zhì)(此時(shí)是抗體、抗體片段或抗體衍生物)表達(dá)為融合于噬菌體衣殼蛋白的多肽，然后在稱(chēng)為“淘選”的過(guò)程中通過(guò)與固定的或可溶性生物素?；浠?此時(shí)是NTP)結(jié)合來(lái)篩選。噬菌體攜帶非特異抗體可通過(guò)洗滌去除，然后洗脫結(jié)合的噬菌體并感染大腸桿菌而擴(kuò)增。噬菌體展示已成功地應(yīng)用于產(chǎn)生抗許多抗原的抗體，包括乙肝表面抗原；多糖、胰島素樣生長(zhǎng)因子1，2-苯唑-5-one和4-羥基-5-碘-3-硝基-苯酰-(NIP)-己酸。
酵母和細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)是另外的方法，該方法中可展示蛋白質(zhì)包括抗體和抗體片段的多樣性陣列，并篩選那些表現(xiàn)出良好特征的，如能以所需親和力和特異性結(jié)合抗原的陣列(Bader，ET等，Nat Biotechnol 15553-557(1997)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,300,065，它們所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)；Francisco，JA等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)；Georgiou G，等，Nst Biotech 1529-34(1997))。
可能必須人源化用非人哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的單克隆抗體。。人體內(nèi)使用這種非人抗體可能發(fā)生問(wèn)題。外源性免疫球蛋白可引起干擾治療的抗-球蛋白應(yīng)答(稱(chēng)為人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答)(R.A.Miller等，Blood 62 988-995(1983))或者引起過(guò)敏性或免疫性復(fù)雜超敏反應(yīng)(B.Ratner，Allergy，過(guò)敏性反應(yīng)和免疫治療Williams和Wilkins，Baltimore(1943))。
克服這些問(wèn)題的一種方法是相應(yīng)修飾這種抗體使它們?nèi)嗽椿?。發(fā)展了兩種人源化的通用方法(i)環(huán)-嫁接法，將CDR環(huán)直接鎵接到最密切類(lèi)似于非人動(dòng)物序列的人Fv構(gòu)架上；(ii)重新形成表面，該表面中暴露于表面的大部分Fv構(gòu)架殘基已突變成它們的人的對(duì)應(yīng)部分。Winter和同事(GB2188638B)發(fā)展了一種這樣的方法。小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)包含有抗原結(jié)合位點(diǎn)，將此CDRs插入人構(gòu)架區(qū)而產(chǎn)生的抗體中僅CDR序列衍生自原始小鼠抗體。Herceptin和Rituxan是已批準(zhǔn)用于治療的人源化抗體的兩個(gè)成功例子。采用此技術(shù)如噬菌體展示的組合方法也可用于產(chǎn)生人源化抗體和抗體片段，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,565,332所述，其的所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。
使用靶向重組NTP的抗體片段的克隆偶聯(lián)物或靶向重組NTP的抗體-樣蛋白質(zhì)的克隆偶聯(lián)物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。靶向NTP或相關(guān)分子的克隆偶聯(lián)物的優(yōu)點(diǎn)包括可制造和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)此克隆偶聯(lián)物分子。
產(chǎn)生和檢測(cè)這種抗體、抗體片段或抗體衍生物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的將在下面更詳細(xì)描述。闡明免疫學(xué)一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括Klein的著作(免疫學(xué)，自身-非自身分辨的科學(xué)(ImmunologyThe Science of Self-NonselfDiscrimination，John Wiley&Sons，New York(1982))；Campbell(“單克隆抗體技術(shù)”(Monoclonal Antibody Technology)，生化和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(LaoratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)，第13卷(Burdon，R.等編)，Elsevier，Amsterdam(1984)；Eisen(微生物學(xué))，第三版(Davis，等，Harper&Row，Philadelphia(1980))。
也可將本發(fā)明的用的抗體、抗體衍生物或抗體片段與各種標(biāo)記成分或放射性成分相偶聯(lián)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可給予這種標(biāo)記抗體，結(jié)合活組織中的NTP，并用本領(lǐng)域已知各種技術(shù)檢測(cè)，然后以精確、受控制方式采用各種輻射來(lái)中和或殺死NTP，從而獲得同樣效果。標(biāo)記NTP抗體和片能的各種方法以及它們的檢測(cè)見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634、5,948,888、5,830,670和6,071,705。放射性標(biāo)記抗體、抗體衍生物和抗體片段也可如上所述使用，除了抗體偶聯(lián)物的放射性部分可用于中和或殺死NTP而不需外源輻射外。
抗體、抗體衍生物或抗體片段優(yōu)選與含NTP的活組織接觸。任何含NTP或在某時(shí)間含NTP的活組織包括在本發(fā)明中。優(yōu)選的是組織選自哺乳動(dòng)物組織。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括治療因NTP存在導(dǎo)致活組織壞死所引起的疾病的方法。在本文中，因NTP存在導(dǎo)致活組織壞死和細(xì)胞死亡指細(xì)胞的細(xì)胞死亡和/或組織壞死，除了產(chǎn)生NTP的垂死細(xì)胞。在此方法中，將上述結(jié)合或識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片能給于患這種疾病的哺乳動(dòng)物，給藥的量和時(shí)間足以防止和/或抑制因NTP存在所引起的活組織壞死。
治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其它腦相關(guān)疾病可通過(guò)給予能影響動(dòng)物或病人的神經(jīng)系統(tǒng)功能或功能紊亂的藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常這種藥物通過(guò)外周應(yīng)用，經(jīng)口或全身途徑給予。雖然一些藥物能穿過(guò)血腦屏障(bbb)，但另一些不能有效穿過(guò)bbb或根本不能穿過(guò)，只有直接給入腦內(nèi)時(shí)方才有效。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“血腦屏障”或“bbb”指bbb本身和血-脊髓屏障。血腦屏障由腦血管的內(nèi)皮、基底膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，作用是限制物質(zhì)滲透入腦內(nèi)。有時(shí)可將bbb結(jié)構(gòu)再分成兩種組分內(nèi)皮或毛細(xì)管屏障和室管膜屏障。Banks，W.A.，Kastin，A.J.Barrera，“傳遞肽到中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)退兩難和策略”(Delivering peptides to the central nervous systemDilemmasand strategies)，Pharm.Res.81345-1350(1991)。
能透過(guò)bbb的滲透物質(zhì)的性質(zhì)還沒(méi)有確定但知道許多腦功能的調(diào)節(jié)物如細(xì)胞因子、運(yùn)鐵蛋白、encephalins和內(nèi)啡肽可從血管穿過(guò)bbb進(jìn)入腦內(nèi)。Raeissi，S.，Audus，J.，“δ-睡眠誘導(dǎo)肽血腦屏障滲透性的體外特征”(In vitrocharacterization of blood-brain barrier permeability to delta sleep-inducing peptide)J.Pharm.Phy.41848-852(1989)；Zlokovich，B.，Susie，V.T.，Davson，H.Begley，D.J.，Jankov，R.M.，Mitrivic，B.M.，Lipovac，M.N.，“血管灌注豚鼠腦的血腦屏障的δ-睡眠誘導(dǎo)肽(DSIP)的飽和機(jī)制”(Sturable mechanism fordelta sleep-inducing peptide(DSIP)at the blood-brain barrier of vascularlyperfused guinea pig brain)Peptides 10249-154(1989)；Zlokovich，B.，“研究血腦屏障處肽相互作用的體內(nèi)方法”(In vivo approaches for studying peptideinteraction at the blood-brain barrier)J.Control.Rel 13185-201(1990)。然而許多物質(zhì)可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)如腺苷、β-內(nèi)啡肽、內(nèi)源肽的合成類(lèi)似物Houghten，R.A.Swann，R.W.，Li，C.H.“β-內(nèi)啡肽大鼠和兔靜脈注射氚化肽后的穩(wěn)定性、清除行為和進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)”(β-EndorphinStability，Clearancebehavior and entry into the central nervous system after intravenousinjection of the tritiated peptide in rats and rabbits)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774588-4591(1980)；Levin，E.R.，F(xiàn)rank，H.J.K.，Weber，M.A.，Ismail，M.，Mills M.，“心鈉素滲透通過(guò)血腦屏障的研究”(Studies on penetration of theblood-brain barrier by atrial natriuretic factor)Biochem.Biophys.Res.Commun.1471226-1231(1987)Sakane，T.，Tanaka，C.，Yamamoto，A.，Hashida，M.，Sesaki，H.，Ueda，H.，Takagi，H.，“聚山梨醇酯80對(duì)腦攝入的作用和D-kyoto的止痛效果”(The effect of polysorbate80 on brain uptake and analgesic effectof D-kyoto)Int.J.Pharm.5777-83(1989)以及一些刺激性和抑制氨基酸和營(yíng)養(yǎng)因子滲透通過(guò)bbb較差或根本不滲透?，F(xiàn)在，無(wú)bbb滲透或較差bbb滲透的藥物僅可通過(guò)直接CNS灌輸或植入控釋聚合物來(lái)給予(參見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,883,666，Sabel等)一種克服傳統(tǒng)藥物治療某些局限性的方法是增加透過(guò)bbb的藥物相對(duì)量。相信如果在減少給定藥物或診斷物質(zhì)外周劑量的同時(shí)能增加穿過(guò)bbb的藥物量，藥物的外周副作用嚴(yán)重性也會(huì)更小，同時(shí)維持腦中所需效果。已描述了一些有效提高藥物滲透通過(guò)bbb的方法。
一種方法是改變bbb本身的功能。例如當(dāng)外周給予滲透劑時(shí)(如通過(guò)靜脈注射)，導(dǎo)致bbb打開(kāi)。此外，一些作用于CNS的藥物可改變bbb對(duì)其它物質(zhì)的滲透性；例如報(bào)道類(lèi)膽堿檳榔堿可誘導(dǎo)改變藥物滲透通過(guò)bbb。Saija，A.，Princi，P.，DePasquale，R.，Costa，G.，“檳榔堿而不是氟哌啶醇使大鼠血腦屏障滲透性產(chǎn)生變化”(Arecoline but not haloperidol produces changes in the permeability of theblood-brain barrier in the rat.J.Pharm.Pha.42135-138(1990)。
給予其它可改變bbb滲透性的藥物見(jiàn)授于E.A.Neuwelt的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,059,415和5,124,146所述。緩激肽是有這種作用的一種特殊藥物(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,112,596，授于Malfroy-Camine)。另一種方法包括給予滲透肽如A-7或其構(gòu)象類(lèi)似物(WO 92/18529，J.W.Kozarich等申請(qǐng))。A.Tomasz和E.Tuomanen提出了一種相對(duì)入侵性方法(WO 91/16064)，采用腸胃外注射真細(xì)菌如肺炎鏈球菌的純化細(xì)胞壁或細(xì)胞壁片段來(lái)打開(kāi)bbb。
授于L.L.Rubin等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,260,210公布了一種方法，其中通過(guò)給予能減少或干擾環(huán)腺苷酸濃度或提高環(huán)腺苷酸濃度的制劑增加血腦屏障的通透性。
另一種方法是修飾藥物分子本身。例如大分子如蛋白質(zhì)也許根本不能通過(guò)bbb或通過(guò)有困難或有不利影響蛋白質(zhì)功效的改變。例如可先分離出大分子的活性位點(diǎn)即分子中觸發(fā)生物學(xué)所需活動(dòng)的部分，然后只使用此活性位點(diǎn)。由于分子大小是bbb允許透過(guò)的因素之一，可采用減小的尺寸從而較小分子現(xiàn)在可通過(guò)bbb。因此在本文中采用抗體片段是理想的。對(duì)大分子進(jìn)行其它修飾以嘗試通過(guò)bbb，包括糖化蛋白質(zhì)從而提高它們的bbb滲透性或形成前體藥物。授于J.F.Podusio和G.L.Curran的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,260,308討論了糖化蛋白質(zhì)，而V.E.Shashoua申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,933,324和WO 89/07938公布了一種前體藥物的形成。這些前體藥物由脂肪酸運(yùn)載體和不能自己穿過(guò)bbb的神經(jīng)活性藥物組成。一種類(lèi)似的系統(tǒng)見(jiàn)WO89/07938。
另一種方法是植入控釋聚合物，該聚合物可將基質(zhì)系統(tǒng)的活性成分直接釋放到神經(jīng)組織中。然而，此方法具有侵入性且如果直接植入到腦或脊髓中需要手術(shù)干預(yù)(參見(jiàn)Sabel等美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,883,666；Sabel等美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)07/407,930)。同樣已知如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,800,390所述可將組合物直接給于腦內(nèi)部，該專(zhuān)利所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。這些方法能將緩釋的固體制品和半固體制品直接遞送到腦組織中。
為克服這些局限性，嘗試了另一種方法，其中采用了藥物運(yùn)載體系統(tǒng)如脂質(zhì)體、紅細(xì)胞影、抗體偶聯(lián)物和單克隆抗體偶聯(lián)物。靶向藥物遞送中一個(gè)主要問(wèn)題是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)特別是肝脾巨噬細(xì)胞對(duì)注射的運(yùn)載體的迅速調(diào)理作用和攝取。在脂質(zhì)體中加入所謂的“詭密”脂質(zhì)，如磷脂酰肌醇、單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂或硫酸半乳糖苷神經(jīng)酰胺可部分克服這個(gè)障礙。
授于P.M.Friden的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,182,107和5,154,924教授了偶聯(lián)藥物和抗體的方法，其中所述抗體與運(yùn)鐵蛋白受體反應(yīng)。運(yùn)鐵蛋白受體位于腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞上，因此腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)運(yùn)藥物如神經(jīng)生長(zhǎng)因子穿過(guò)bbb。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,004,697(授于Pardridge)通過(guò)提供有特殊等電點(diǎn)的陽(yáng)離子化抗體改進(jìn)了這種抗體偶聯(lián)方法(也參見(jiàn)Pardridge的WO 89/01343)。
另一種方法是產(chǎn)生活性制劑與之偶聯(lián)的嵌合肽(同樣授于Pardridge的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,801,575)。這種系統(tǒng)也在授于Pardridge和Schimmel的中進(jìn)一步討論，其中嵌合肽如組蛋白能通過(guò)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用穿過(guò)bbb。
授于N.S.Bodor的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,187,158和5,017,566公布了一種腦-特異性藥物傳送方法，其中中樞作用藥物與二氫吡啶反應(yīng)-吡啶鹽氧化還原載體的還原性生物可氧化類(lèi)脂形式一起給予，如多巴胺(也參見(jiàn)Bodor的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,880,816)。
采用一種相當(dāng)入侵性的方法來(lái)傳送遺傳物質(zhì)到腦中。這可通過(guò)例如化學(xué)破壞bbb然隨后用病毒來(lái)傳送基因穿過(guò)bbb而完成(參見(jiàn)E.A.Neuwelt的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,886,042)。這里將一種矯正性遺傳物質(zhì)摻入到病毒中然后將病毒注射入血流。
最后，另一種傳送藥物穿過(guò)bbb的載體系統(tǒng)是使用脂質(zhì)體，如F.D.Collins和R.C.Thompson所述(WO 91/04014)。這里脂質(zhì)體可靶向運(yùn)輸特異配基穿過(guò)bbb的特殊內(nèi)源性腦運(yùn)輸系統(tǒng)。
另外一種方法見(jiàn)Kreuter等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,117,454，。Kreuter專(zhuān)利的主題包括采用表面活性劑包被的納米粒子作為藥物運(yùn)載體(或靶向分子)的方法組合物和藥物靶向系統(tǒng)，用于廣泛范圍的藥物以提高藥物或診斷試劑滲透穿過(guò)bbb。
因此本領(lǐng)域提出一些不同方法來(lái)檢測(cè)AD和腦中NTP的存在，以及提出一些方法允許藥物或其它治療制劑穿過(guò)bbb到達(dá)腦。本領(lǐng)域沒(méi)有認(rèn)識(shí)到防止AD腦中或其它組織中NTP所致細(xì)胞死亡和/或組織壞死的重要性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白除了直接給予抗體外，可通過(guò)基因表達(dá)(如基因治療)或通過(guò)疫苗使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生或表達(dá)抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員運(yùn)用本文提供的指南能創(chuàng)造、分離和純化用于誘導(dǎo)抗體或抗體片段表達(dá)的適當(dāng)基因或疫苗。
例如，基因治療作為治療各種哺乳動(dòng)物疾病和提高特異蛋白質(zhì)產(chǎn)生或其它細(xì)胞產(chǎn)物的方法受到廣泛注意。基因治療一般通過(guò)將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物患病細(xì)胞中而完成。可設(shè)計(jì)導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)來(lái)取代患病哺乳動(dòng)物的異常(缺陷)基因(“基因取代治療”)，或可設(shè)計(jì)用于表達(dá)編碼的蛋白或其它治療產(chǎn)品而不取代任何缺陷基因(“基因增加”)。因?yàn)樵S多天生和獲得性醫(yī)學(xué)疾病是由于多種基因產(chǎn)物的不適當(dāng)產(chǎn)生，基因治療通過(guò)暫時(shí)或穩(wěn)定性表達(dá)編碼治療產(chǎn)物的外源核酸提供了治療這些疾病的方法。
基因治療可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化患病哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞(體內(nèi)基因治療)或體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞然后植入轉(zhuǎn)化的細(xì)胞到哺乳動(dòng)物中(活體內(nèi)基因治療)來(lái)完成。體內(nèi)基因治療特別優(yōu)選用于本發(fā)明。除了修復(fù)體細(xì)胞外，一般知道體內(nèi)基因治療也可用于全身治療，在此領(lǐng)域中基因治療有廣泛用途。全身治療包括用感興趣的DNA轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞、在此細(xì)胞中表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞隨后分泌產(chǎn)生蛋白質(zhì)到血液中的能力。
發(fā)展了各種方法來(lái)完成體內(nèi)轉(zhuǎn)化，包括機(jī)械方法(如直接注射核酸入靶細(xì)胞或粒子轟擊)、重組病毒、脂質(zhì)體和受體-介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(RME)(綜述參見(jiàn)Chang等1994 Gastroenterol.1061076-84；Morsy等1993 JAMA 2702338-45；Ledley 1992J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.14328-37)。
開(kāi)發(fā)和給予適于誘導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體或抗體片段的基因和疫苗的適當(dāng)方法見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,210,919和6,225,290所述。這些專(zhuān)利所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。
因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和活組織壞死所引起疾病可根據(jù)本發(fā)明治療。優(yōu)選的是疾病選自AD、中風(fēng)、腦腫瘤和其它腦疾病，特別是神經(jīng)退化疾病(如AD、Pick病、雷錐小體(Lewy body)病、帕金森氏癥等)。
根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施方案，方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段，結(jié)合量足以防止用NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。給予結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的方法包括肌肉內(nèi)、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、透皮等給予抗體。此外，如上所述，可通過(guò)給予表達(dá)蛋白質(zhì)的基因，或通過(guò)給予能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的疫苗體內(nèi)表達(dá)或產(chǎn)生抗體、抗體衍生物或抗體片段。另外，可通過(guò)給予或?qū)肟贵w內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒體內(nèi)表達(dá)或產(chǎn)生抗體、抗體衍生物或抗體片段。
口服給藥的固體劑型包括膠囊、片劑、藥丸、粉末和顆粒。在這些固體劑型中，活性化合物通常與下列至少一種混合(a)一種或多種惰性賦形劑(或載體)，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣；(b)填充劑或制劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(c)粘合劑，如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠；(d)致濕劑，如甘油；(e)分解劑，如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯粉、褐藻酸、某些復(fù)雜硅酸鹽和碳酸鈉；(f)溶液滯留劑，如石蠟；(g)吸收加速劑，如季銨化合物；(h)潤(rùn)濕劑，如乙酰醇和甘油單硬脂酸；(i)吸附劑，如白陶土和皂土；(j)滑潤(rùn)劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂酰硫酸鈉或它們的混合物。對(duì)于膠囊、片劑和藥丸，劑型也可包括緩沖劑。
口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性抗體化合物，液體劑型可包括本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑。示范性乳化劑是乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯用酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油如棉子油、落花生油、玉米油、橄欖油海貍油和麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑，該組合物也可包括佐劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、增甜、調(diào)味和香味劑。
另一種給予能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體的方法是通過(guò)透皮或經(jīng)皮膚途徑。這種實(shí)施方案的一個(gè)例子是使用小貼片。具體說(shuō)，小貼片可用例如二甲亞砜(DMSO)或DMSO和棉花子油的混合物配的抗體精細(xì)懸浮液制備，使小貼片接觸遠(yuǎn)離含NTP組織部位的哺乳動(dòng)物皮膚?？蓪⒃摻M合物將在皮膚袋(pouch)內(nèi)。其它介質(zhì)和它與其它溶劑和固體支持物的混合物也可同樣起作用。小貼片可含有溶液或懸浮形式的抗體或抗體片段?？蓪⑿∑┘佑诓∪说钠つw，例如通過(guò)將它插入病人的皮膚袋中，皮膚袋是用針、夾子或其它壓緊裝置折疊皮膚和使皮膚保持在一起而形成的。此袋使用的方式應(yīng)確保持續(xù)接觸皮膚而不干擾哺乳動(dòng)物。除了使用皮膚袋外，可使用任何能保證小貼片牢固放置與皮膚接觸的裝置。例如可使用粘合帶使小貼片保持在皮膚位置上。
本發(fā)明組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可不同，以使含抗體的組合物有效獲得具體組合物和給藥方法所需的抑制組織壞死的治療反應(yīng)。因此所選劑量水平取決于所需的治療效果、給藥途徑、治療需要的持續(xù)時(shí)間和其它因素。
對(duì)于哺乳動(dòng)物包括人，有效量可根據(jù)身體表面積的基礎(chǔ)上施用。多種大小、種類(lèi)的動(dòng)物和人的劑量之間的相互關(guān)系(根據(jù)mg/M2身體表面積)見(jiàn)E.J.Freireich等，Cancer Chemother.Rep.，50(4)219(1966)所述。身體表面積可從個(gè)體的身高和體重大致確定(參見(jiàn)科學(xué)表格(Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.537-538頁(yè)(1970))。
給于宿主的結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的每日總劑量可以是單劑或分開(kāi)的劑量。劑量單位組合物可含有這種量，如它的因數(shù)可用于形成每日劑量。然而要理解任何具體病人的具體劑量水平取決于多種因素，包括體重、總體健康、性別、飲食、用藥時(shí)間和途徑、所用藥物的效力、吸收和排泄的速度、與其它藥物的組合和具體治療疾病的嚴(yán)重性。
本發(fā)明含抗體的組合物優(yōu)選含有能使抗體穿過(guò)血腦屏障的成分以治療含NTP的活的腦組織。上述各種成分之一可用于提供抗體穿過(guò)血腦屏障的能力。例如可能只采用抗體的小的結(jié)合部分或片段(如F(ab)或F(ab’)2部分)，這種片段足夠小能穿過(guò)血腦屏障。此時(shí)不需另外的成分。
抗體、抗體衍生物或抗體片段如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,260,308所述可糖化以提高bbb的滲透性，或如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,933,324和WO 89/07938所述形成前體藥物。這些前體藥物優(yōu)選地由脂肪酸運(yùn)載體和能結(jié)合或識(shí)別NTP但本身不能穿過(guò)bbb的抗體組成。
另一種方法是植入控制釋聚合物，該聚合物可將抗體、抗體衍生物或抗體片段從基質(zhì)系統(tǒng)直接釋放到神經(jīng)組織中(參見(jiàn)Sabel等美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,883,666；Sabel等美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)07/407,930)。也可使用藥物載體系統(tǒng)如脂質(zhì)體、紅細(xì)胞影、抗體偶聯(lián)物和單克隆抗體偶聯(lián)物。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，所謂“詭密”脂質(zhì)如磷脂酰肌醇、單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂或硫酸半乳糖苷神經(jīng)酰胺可用于形成含前述抗體和抗體偶聯(lián)物的脂質(zhì)體。
如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,182,107和5,154,924所述，可將結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段與能與運(yùn)鐵蛋白受體反應(yīng)的另一抗體偶聯(lián)。運(yùn)鐵蛋白受體位于腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞上，內(nèi)皮細(xì)胞因此可轉(zhuǎn)運(yùn)藥物如神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其它抗體如產(chǎn)生的抗NTP抗體穿過(guò)bbb。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,004,697和WO 89/01343所述，上述抗體-抗體偶聯(lián)物可進(jìn)一步通過(guò)提供具有特殊等電點(diǎn)的陽(yáng)離子化抗體來(lái)提高。
發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括產(chǎn)生偶聯(lián)于活性抗體、抗體衍生物和/或抗體片段的嵌合肽，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,801,575所述。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,902,505所述，嵌合肽優(yōu)選能通過(guò)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用穿過(guò)bbb的組蛋白。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,880,816、5,187,158和5,017,566所述，本發(fā)明另一實(shí)施方案包括提供與二氫吡啶反應(yīng)-吡啶鹽氧化還原載體的還原性生物可氧化類(lèi)脂形式，如多巴胺給合在一起的抗體或抗體片段。
也可采用另一種傳送抗體、抗體衍生物或抗體片段到腦中。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,886,042所述，這可通過(guò)化學(xué)破壞bbb，然后用病毒來(lái)傳送抗體、抗體衍生物或抗體片段穿過(guò)bbb而完成。這里優(yōu)選將一種矯正性遺傳物質(zhì)摻入到病毒中然后將病毒注射入血流。另一種可用于傳送抗體、抗體衍生物或抗體片段穿過(guò)bbb的載體系統(tǒng)是使用脂質(zhì)體，如F.D.Collins和R.C.Thompson所示(WO 91/04014)。這里脂質(zhì)體優(yōu)選靶向能運(yùn)輸特殊配基穿過(guò)bbb的特殊內(nèi)源性腦運(yùn)輸系統(tǒng)。表面活性劑包被的納米粒子也可作為藥物運(yùn)載體(或靶向分子)用于發(fā)明的抗體、抗體衍生物或抗體片段以提高其滲透穿過(guò)bbb，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,117,454所述，其所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。
另一種方法是使用L-氨基酸氧化酶來(lái)減少抗體、抗體衍生物或抗體片段的血漿水平從而得以運(yùn)輸抗體、衍生物或片段穿過(guò)bbb。這種方法更詳細(xì)地描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,695,751，其所公布的全部納入本文參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的又一種方法是局部給予包含抗體、衍生物或片段的組合物。用于組合物給藥于腦內(nèi)部的裝置見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,800,390所述，其所公布的內(nèi)容全部納入本文參考文獻(xiàn)。緩釋性固體制品和半固體制品可直接給藥到腦組織中。這種給藥可通過(guò)插入一種針樣腦內(nèi)裝置來(lái)完成，將此裝置任選地植入腦部從而導(dǎo)桿(guide)末梢位于用藥位置。
本發(fā)明給藥于患有因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起疾病的哺乳動(dòng)物的優(yōu)選組合物，含有識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物和/或抗體片段以及能使此抗體、衍生物和/或片段穿過(guò)血腦屏障的成分，本發(fā)明的其它優(yōu)選組合物包括表達(dá)抗體、抗體衍生物和/或抗體片段的基因以及能使該基因穿過(guò)血腦屏障的成分。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選組合物包括誘導(dǎo)抗體、抗體衍生物和/或抗體片段表達(dá)的疫苗以及能使疫苗穿過(guò)血腦屏障的成分。
本發(fā)明中優(yōu)選的接觸含NTP的活組織的抗體、抗體衍生物或抗體片段的量足以抑制、防止和/或改善NTP所所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。具體量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用本文所提供的指南確定。優(yōu)選給予足夠的抗體、抗體衍生物或抗體片段使細(xì)胞死亡或組織壞死與對(duì)照相比減少50％以上，此對(duì)照中沒(méi)有抗體存在且NTP引起的細(xì)胞死亡未受抑制。更優(yōu)選與對(duì)照相比，給予抗體、抗體衍生物或抗體片段使細(xì)胞死亡或組織壞死與對(duì)照相比減少60％以上，更優(yōu)選超過(guò)70％，最優(yōu)選超過(guò)75％，此對(duì)照中沒(méi)有抗體存在且NTP引起的細(xì)胞死亡未受抑制。
此用量總是取決于組織的具體類(lèi)型，所用的、抗體、抗體衍生物或抗體片段以及NTP的量。采用上述美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634、5,948,888、5,830,670和6,071,705之一所述方法，可估計(jì)NTP存在的相對(duì)量然后用獲自各種來(lái)源的哺乳動(dòng)物組織進(jìn)行一系列體外實(shí)驗(yàn)，如上述美國(guó)專(zhuān)利所述那樣，確定組織中NTP的量，然后確定獲得所需程度防止細(xì)胞死亡或組織壞死與對(duì)照相比優(yōu)選超過(guò)60％所需的結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段的量。采用本領(lǐng)域已知技術(shù)以及本文所提供的指南，本領(lǐng)域技術(shù)人員能進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)而無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)。
然后待給于其組織含有NTP的哺乳動(dòng)物的抗體、抗體衍生物或抗體片段的量不難根據(jù)哺乳動(dòng)物體重和預(yù)期輸送到該組織的量來(lái)確定。預(yù)期輸送到哺乳動(dòng)物腦組織的抗體、抗體衍生物或抗體片段的量取決于所用的使抗體、衍生物或片段得以穿過(guò)bbb的具體機(jī)制。對(duì)于給予表達(dá)抗體、衍生物和/或片段的基因或給予誘導(dǎo)抗體、衍生物和/或片段表達(dá)的疫苗同樣如此。采用上述(全部?jī)?nèi)容納入本文參考文獻(xiàn))專(zhuān)利中所述技術(shù)和本文所提供的指南，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定給于哺乳動(dòng)物的基因、疫苗、抗體、抗體衍生物或抗體片段的適當(dāng)劑量而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。
提供下列實(shí)施例以闡明本發(fā)明。然而應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些實(shí)施例所述的具體情況或細(xì)節(jié)。
實(shí)施例1此實(shí)施例證明活組織(體內(nèi))中因AD7C-NTP存在所引起的細(xì)胞死亡。
AD7C-NTP根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634、5,948,888、5,830,670和6,071,705中任一所概括的過(guò)程獲得。
給八只正常大鼠皮內(nèi)和皮下注射，鹽水配的濃度為0.1-1.0μg/mL的純化重組AD7C-NTP每只大鼠3處不同部位，，用塑料注射器通過(guò)26號(hào)不銹鋼針頭注入。
觀察動(dòng)物24小時(shí)，在24小時(shí)時(shí)無(wú)痛處死動(dòng)物。切取24個(gè)滲透部位、以10％福爾馬林固定、石蠟包埋、染色和用標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)方法檢查。
類(lèi)似的對(duì)照組大鼠注射(1)鹽水配的牛血清白蛋白、(2)正常人血清、(3)生理鹽水，并如上所述檢查和處死，如上切取注射處理的部位。
在所有實(shí)施例中注射AD7C-NTP后在注射部位產(chǎn)生了急性組織壞死(圖1-4)。圖1-4是顯示注射AD7C-NTP所誘導(dǎo)的組織病理學(xué)損傷的顯微照片。AD7C-NTP注射部位的肌肉組織、皮下結(jié)締組織和真皮中明顯壞死。24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞變得暗淡、縮小和壞死，真炎癥細(xì)胞滲入。壞死與注射區(qū)域相關(guān)且看來(lái)不擴(kuò)散到離注射部位很遠(yuǎn)。
對(duì)照沒(méi)有顯示壞死或細(xì)胞損失的跡象。對(duì)照注射部位具有針頭引起的溫和至輕微的急性炎癥和灶性微出血。
實(shí)施例2此實(shí)施例證明給予含AD7C-NTP組織抗體防止和/或抑制了活組織壞死(體內(nèi))。
抗AD7C-NTP抗體由單克隆抗體N314組成，見(jiàn)de la Monte，S.M.等，Journalof Neuropathol and Experimental Neurology.，551038-1050(1996)所述。
如實(shí)施例1所述獲得AD7C-NTP。
將100ng/mL-10μg/mL重組AD7C-NTP樣品室溫與N314抗體培育5分鐘到1小時(shí)，然后如實(shí)施1所述注射入大鼠。
觀察動(dòng)物24小時(shí)且在24小時(shí)時(shí)無(wú)痛處死動(dòng)物。切取24個(gè)滲透部位、以10％福爾馬林固定、石蠟包埋、染色和用標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)方法檢查。
類(lèi)似的對(duì)照組大鼠注射(1)如實(shí)施1所述單用AD7C-NTP、(2)鹽水配的牛血清白蛋白、(3)正常人血清、(4)生理鹽水，并如上所述檢查和處死，切取注射處理的部位。
單獨(dú)注射AD7C-NTP的對(duì)照產(chǎn)生了組織壞死，見(jiàn)實(shí)施1所述并示于圖1-4。注射牛血清白蛋白(BSA)、正常人血清和生理鹽水的對(duì)照都沒(méi)有顯示壞死或細(xì)胞損失的跡象。上述對(duì)照注射部位具有針頭引起的溫和至輕微的急性炎癥和灶性微出血。
與單獨(dú)注射AD7C-NTP的對(duì)照樣品相比，和N314抗體一起注射的AD7C-NTP樣品顯示組織壞死減少超過(guò)95％。偶然有炎癥細(xì)胞病灶組成的病灶結(jié)節(jié)，炎癥細(xì)胞病灶有微小結(jié)節(jié)形成，這可能是AD7C-NTP和N314凝聚所致。與只注射AD7C-NTP的對(duì)照相比，給予N314抗體的總組織損傷減少95％以上。
雖然本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案和實(shí)施例作了詳細(xì)描述，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白可對(duì)本發(fā)明作出各種修改而不背離本發(fā)明的思路和范圍。
權(quán)利要求
1.一種防止、控制、改善和/或抑制含NTP的活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體，其中所述抗體存在的量足以防止、控制、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
2.一種防止、控制、改善和/或抑制含NTP的活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體片段，其中所述抗體片段存在的量足以防止、控制、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
3.一種防止、控制、改善和/或抑制含NTP的活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體衍生物，其中所述抗體衍生物存在的量足以防止、控制、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
4.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體，其中所述抗體存在的量足以防止、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
5.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體片段，其中所述抗體片段存在的量足以防止、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
6.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體衍生物，其中所述抗體衍生物存在的量足以防止、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
7.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少一種選自能結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物和抗體片段的成分以及能使該抗體或抗體片段穿過(guò)血腦屏障的成分。
8.一種防止和/或抑制含NTP活哺乳動(dòng)物腦組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，其特征在于，所述方法通過(guò)使含NTP活哺乳動(dòng)物腦組織接觸一種組合物，該組合物含有至少一種能識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中該組合物還含有能使該抗體、抗體衍生物或抗體片段穿過(guò)血腦屏障的成分。
9.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所引起的疾病的組合物，其特征在于，所述組合物包含結(jié)合NTP的抗體、抗體衍生物和抗體片段以及能使該抗體或抗體片段穿過(guò)血腦屏障的成分。
10.一種治療腦淀粉樣變性的方法，其特征在于，所述方法通過(guò)使含NTP活哺乳動(dòng)物腦組織接觸一種組合物，該組合物含有至少一種能識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中該組合物還含有能使該抗體、抗體衍生物或抗體片段穿過(guò)血腦屏障的成分。
11.一種治療因NTP存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡和/或組織壞死所所引起的青光眼的方法，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種能識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中該抗體、抗體衍生物或抗體片段存在的量足以防止、控制、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
12.一種防止、調(diào)節(jié)、控制、改善和/或抑制已給予NTP部位或附近活組織中細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，給予NTP目的是去除或破壞不需要的或有害的細(xì)胞或組織，其特征在于，所述方法包括使含NTP的活組織接觸至少一種成分，該成分選自識(shí)別NTP的抗體、抗體衍生物和抗體片段，其中該所述抗體、抗體衍生物或抗體片段存在的量足以防止、調(diào)節(jié)、控制、改善和/或抑制因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了使含有中性細(xì)絲蛋白(NTP)的活組織接觸至少一種能識(shí)別或結(jié)合NTP的抗體、抗體片段或抗體衍生物來(lái)防止、抑制、和/或改善該組織中的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的方法，其中所述抗體、抗體片段或抗體衍生物存在的量能有效防止、抑制、減少、控制和/或改善細(xì)胞死亡和/或組織壞死。此方法能治療需要防止、抑制、減少、控制和/或改善因NTP存在所引起的細(xì)胞死亡和/或組織壞死的疾病。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1635906SQ02813585
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月4日
發(fā)明者P·A·艾弗拜克 申請(qǐng)人:尼莫克斯股份有限公司