專利名稱：新型脂質(zhì)體超聲造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超聲造影劑，具體涉及由一種脂質(zhì)體混合物成份以及包裹生物活性氣體的含該脂質(zhì)混合物的脂質(zhì)體超聲造影劑及其制備方法。
新一代超聲造影劑多以含氟氣體為微泡的核心，因含氟氣體為惰性氣體，分子量大，在血液中的溶解度和彌散性差，穩(wěn)定性好。按包裹活性生物氣體的材料不同而有白蛋白類、表面活性劑類、磷脂類、高分子聚合物類。就其在超聲造影的增強(qiáng)顯像上比較，脂類造影劑有更多的優(yōu)勢，原因在于脂類造影劑具有(1)靶向性。脂質(zhì)體進(jìn)入人體后，易優(yōu)先被富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的組織如肝、脾及骨髓所攝取。(2)穩(wěn)定性好。一方面脂類造影劑化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，常溫下可保存數(shù)月不變化，易于商品化；另一方面在血液循環(huán)中更能耐壓，造影持續(xù)時(shí)間長；(3)安全。構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂膜可生物降解，對人體無害；而白蛋白類造影劑由于以人血白蛋白為載體，尚存有傳播血液性疾病的危險(xiǎn)。
中國發(fā)明專利公開說明書CN1306442A(申請?zhí)枮?9107622.8)公開了一種脂質(zhì)為包裹材料的造影劑，該造影劑是以磷脂為包裹材料，微粒內(nèi)包裹有生物活性的氣體，其組合制劑為兩種組合物，其中之一為含分散氣體和用于穩(wěn)定所述所氣體的物質(zhì)的可注射含水介質(zhì)，另一為可注射的水包油乳液。且其在應(yīng)用中組織增強(qiáng)顯像有效時(shí)間只有5-20分鐘，不能完全滿足臨床檢查的需要；同時(shí)目前國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的各類超聲造影劑有效增強(qiáng)時(shí)間也普遍較短，造影微泡的產(chǎn)出率偏低，如美國發(fā)明專利(專利號6033646)公開說明書報(bào)道其微泡濃度為1×108～1.6×109/ml。且目前造影劑成本高，市售價(jià)格昂貴，如脂質(zhì)體造影劑SonoVue每支售價(jià)為110美金。
本發(fā)明已經(jīng)實(shí)現(xiàn)上述目的，表現(xiàn)在1.微泡產(chǎn)出率高，微泡濃度達(dá)7×109/ml，高于目前文獻(xiàn)報(bào)道，而且微泡均一性好，直徑2～6μm的微球占75～80％(見

圖1)；2.造影劑在組織顯影的有效增強(qiáng)時(shí)間長，大于30分鐘；3.成本低，產(chǎn)品造價(jià)遠(yuǎn)低于國外同類產(chǎn)品。
為實(shí)現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案本發(fā)明的脂質(zhì)體造影劑為由含脂質(zhì)的成膜材料包裹生物活性氣體構(gòu)成，其中成膜材料包括脂質(zhì)體、起泡劑、聚合物成份、高滲糖類或醇類；在所述的成份中，造影劑中脂質(zhì)體占有的比例為0.1～5重量％，起泡劑的比例為0.01～5重量％，高滲糖或醇類比例為1-30重量％，高分子聚合物構(gòu)成比為5-30重量％，生物活性氣體為0.15～0.5ml，其余為溶劑。
上面所說的脂質(zhì)體的構(gòu)成為磷脂類分子，具體地說包括1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPG)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸-鈉鹽(DPPA)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DPPC)。
前面所說的起泡劑為非離子的表面活性劑，具體地講包括吐溫80及司盤80；使用起泡劑的目的是為了增加在制備造影劑微泡時(shí)微泡的產(chǎn)出率，同時(shí)對脂膜起到穩(wěn)定的作用。
所說的聚合物為高分子聚合物，具體應(yīng)用時(shí)為聚乙二醇4000(PEG4000)，高分子聚合物的使用是為脂質(zhì)成份及起泡劑在構(gòu)成造影劑膜時(shí)提供一個(gè)支持結(jié)構(gòu)。
使用的高滲糖為葡萄糖、果糖及其異構(gòu)體、多聚糖；醇類為丙二醇、丙三醇，而應(yīng)用高滲糖或醇類的目的是為了增加微泡在溶液中的粘滯度，減少造影微泡的相互融合傾向，同時(shí)糖上的氫鍵也直接與脂質(zhì)的氫鍵相互作用，兩者共同增強(qiáng)了造影微泡的穩(wěn)定性。
生物活性氣體在造影劑中的作用是與成膜材料共同為超聲波提供一個(gè)聲阻抗差較大的反射界面，所述的生物活性氣體主要為氟化物氣體，具體地講包括有全氟化碳?xì)怏w、氟化硫氣體，在應(yīng)用中主要為全氟丙烷、六氟化硫。
為實(shí)現(xiàn)上述目的之二，本發(fā)明采用了以下的制備工藝即所述脂質(zhì)體造影劑的制備流程是將造影劑成膜材料經(jīng)與水介質(zhì)或非水介質(zhì)接觸分別形成水懸浮物或溶液-冷凍干燥-冷凍干燥所得的脂質(zhì)固態(tài)物與水合液接觸-聲振或振蕩處理同時(shí)將生物活性氣體的導(dǎo)入-半成品的檢測控制及分裝-制成成品。在聲振或振蕩處理前進(jìn)行消毒滅菌，以后的操作均在嚴(yán)格控制的無菌間里進(jìn)行。步驟(a)
(1)將所述所需要的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)與水介質(zhì)接觸，使其成為一個(gè)懸浮狀態(tài)體系。為使該系統(tǒng)內(nèi)成膜材料更好地散布于水介質(zhì)中，使用溫度為45～55℃，時(shí)間為20～40分鐘。
或(2)將所述所需的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)與非水介質(zhì)接觸，使其成為一個(gè)均勻的溶液體系。為使溶解得更為均勻，使用的溫度為45～55℃，時(shí)間為20～40分鐘。
在上述的步驟中所述的水介質(zhì)為去離子水、蒸餾水或生理鹽水。更優(yōu)選的實(shí)施方案中所述的水介質(zhì)為去離子水。上面所述的非水介質(zhì)為叔丁醇、正叔丁醇。更優(yōu)選的實(shí)施方案中所述的非水介質(zhì)為叔丁醇。在上述做成膜材料散布于水介質(zhì)及溶解于非水介質(zhì)時(shí)所要求的溫度為45～55℃，時(shí)間為20～40分鐘。步驟(b)將消毒滅菌后的脂質(zhì)懸浮物或脂質(zhì)溶解物用負(fù)壓冷凍干燥儀進(jìn)行去溶液處理，冷凍干燥操作1～5次，即可進(jìn)行反復(fù)凍融處理，進(jìn)行冷凍干燥的時(shí)間為24～36小時(shí)，冷凍干燥中所述負(fù)壓吸引壓力為50～65×10-3mBar，冷凍干燥溫度控制為-50～-70℃。步驟(c)在嚴(yán)格控制的無菌室內(nèi)將冷凍干燥好的脂質(zhì)固態(tài)物用水合液溶解。
所述的水合液為由高滲糖類和起泡劑配成，其中每毫升水合液中存在高滲糖0.9-0.99ml，存在0.01～0.2ml的起泡劑；或由丙二醇、甘油、生理鹽水三者的體積以8∶1∶1的比例配制的混合液與起泡劑構(gòu)成，由其構(gòu)成的每毫升的水合液中，存在0.01～0.1ml的起泡劑，存在0.9-0.99ml的混合液。此步驟中為使脂質(zhì)固態(tài)物能充分溶解可適當(dāng)進(jìn)行振蕩。在此時(shí)高滲糖或醇類引入到造影劑的成膜材料中。步驟(d)(1)取步驟(c)溶解的脂質(zhì)溶液，在嚴(yán)格控制的無菌室將所得的脂質(zhì)溶液按0.5-1ml/s的速度導(dǎo)入超聲波聲振儀中進(jìn)行聲振處理，同時(shí)從底部導(dǎo)入全氟丙烷氣體，速度為0.25-0.5ml/s；聲振儀探頭置于液面下0.5～2cm處，脂質(zhì)溶液受超聲振動(dòng)產(chǎn)生空化作用，包裹具有生物活性的氣體形成大量粒徑不一的微球，將聲振處理溶液按0.25-0.5ml/s的速度導(dǎo)出引入分液罐中，將分液罐中溶液充分混勻，所述的超聲波聲振儀是指頻率為25KHz，功率為0～650W可調(diào)超聲波振蕩儀，在聲振處理中使用的功率為160W～280W。聲振時(shí)間為30s～90s。聲振儀變幅桿選擇為φ6、φ10或φ15，在更優(yōu)的實(shí)施方案中變幅桿選擇為φ6，聲振時(shí)間為60s。測定溶液中微球的各項(xiàng)指標(biāo)如微球濃度、平均粒徑、粒徑分布等并按現(xiàn)有的方法調(diào)整到要求值，然后將符合要求的溶液再次充分混勻，之后分裝入小包裝瓶中；
或(2)取步驟(c)溶解的脂質(zhì)溶液，按生物活性氣體與脂質(zhì)溶液比為0.5～1.5∶1分裝于經(jīng)高溫高壓滅菌消毒的小安碚瓶或小管中，用機(jī)械振蕩儀處理，然后測定溶液中微球的各項(xiàng)指標(biāo)如微球濃度、平均粒徑、粒徑分布等并按現(xiàn)有的方法調(diào)整到要求值。所述的機(jī)械振蕩儀為轉(zhuǎn)速為4500±100轉(zhuǎn)/秒的機(jī)械振蕩儀，在振蕩處理中溫度控制在18～30℃，振蕩時(shí)間為30～60s，更優(yōu)化的實(shí)施方案中振蕩時(shí)間為45s。步驟(e)將上述小瓶包裝的微球移入冰凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行真空低溫負(fù)壓干燥，制成粉針劑，向瓶內(nèi)注入與脂質(zhì)內(nèi)包裹的相同的生物活性氣體，封蓋即成。
附圖2為造影劑對犬大腦進(jìn)行經(jīng)股靜脈聲學(xué)造影腦實(shí)質(zhì)增強(qiáng)顯像圖像。圖中顯示的是以0.01ml/Kg的劑量分別在推注前、造影劑推注后10秒、30秒、1分鐘腦實(shí)質(zhì)顯影情況。
附圖3為造影劑對兔肝臟進(jìn)行經(jīng)耳緣靜脈聲學(xué)造影肝實(shí)質(zhì)增強(qiáng)顯像圖像；圖中顯示的是以0.01ml/Kg的劑量分別在推注前(A)、造影劑推注后30秒(B)、3分鐘(C)、10分鐘(D)、20分鐘(E)、40分鐘(F)、50分鐘(G)、60分鐘(H)肝實(shí)質(zhì)顯影情況，在60分鐘時(shí)肝實(shí)質(zhì)顯像灰階強(qiáng)度高于未造影前。
附圖4為造影劑對兔腎臟進(jìn)行經(jīng)耳緣靜脈聲學(xué)造影腎臟實(shí)質(zhì)及髓質(zhì)增強(qiáng)顯像圖像，圖中顯示的是以0.01ml/kg的劑量分別在推注前(A)、推注后10秒(B)、20秒(C)、40秒(D)腎臟顯影情況。
具體實(shí)施實(shí)例實(shí)施實(shí)例1脂質(zhì)體造影劑的制備稱取DPPG 2g、DSPC 4g、聚乙二醇4000 300g，在50℃條件下共同散布于1.2L的去離子水中，將其懸浮物冷凍干燥過夜、解凍后再冷凍干燥過夜，制備得到成膜材料的固態(tài)混合物，將制備得到的固態(tài)混合物高溫高壓滅菌處理，在嚴(yán)格控制的無菌間里將上述滅菌處理過的固態(tài)混合物溶于經(jīng)微孔濾膜處理的含有50％葡萄糖90％及吐溫8010％的水合液中，配比濃度為600mg/ml，機(jī)械混勻后，將所得的脂質(zhì)溶液按0.5ml/s的速度導(dǎo)入超聲波聲振儀中進(jìn)行聲振處理，同時(shí)從底部導(dǎo)入全氟丙烷氣體，速度為0.25ml/s，聲振功率為280W，將聲振處理的液體按0.25ml/s導(dǎo)出分裝，即制備得到液態(tài)狀的造影劑，取樣觀察初檢濃度為7.1×109/ml，粒徑分布在2～10μm，調(diào)節(jié)好造影劑的微泡濃度及粒徑分布，將調(diào)節(jié)好濃度及粒徑的造影劑用小瓶分裝，每瓶分裝液態(tài)造影劑量為2ml，用低溫負(fù)壓干燥法制備得到造影劑的粉針劑。
實(shí)施實(shí)例2糖類對微球產(chǎn)出率和粒徑的影響表1列出不同水合液中使用水相溶劑、50％果糖、50％葡萄糖三種情況下微球產(chǎn)率、粒徑及粒徑分布的結(jié)果

從表1中可以看出，糖類作為水合液較水相溶劑好，而果糖比葡萄糖好，可明顯提高2～6μm范圍內(nèi)有效微球的百分比。
實(shí)施實(shí)例3吐溫80對微球產(chǎn)率和粒徑的影響表2列出了制備過程中加入不同濃度的吐溫80對微球產(chǎn)率和粒徑影響的結(jié)果

從表2中可以看出，吐溫80的濃度以在0.02ml/ml脂質(zhì)溶液時(shí)微泡產(chǎn)率最高，粒徑也較好，吐溫80濃度輕微的改變對微泡的產(chǎn)出率影響較大。
應(yīng)用驗(yàn)證對兔、犬體內(nèi)成像使用第二種水合液制備的造影劑對犬大腦進(jìn)行聲學(xué)造影，以0.01ml/kg的劑量進(jìn)行經(jīng)股靜脈聲學(xué)造影，腦實(shí)質(zhì)在約10秒時(shí)即出現(xiàn)明顯增強(qiáng)顯像、30秒達(dá)到高峰(見圖2)，彩色多普勒血流增強(qiáng)時(shí)間達(dá)50分鐘；對兔肝臟、腎臟經(jīng)耳緣靜脈以0.01ml/kg的劑量進(jìn)行聲學(xué)造影，肝臟、腎臟有效增強(qiáng)時(shí)間超過50分鐘，肝實(shí)質(zhì)在60分鐘時(shí)顯像灰階度仍高于未造影前(見圖3、4)。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體超聲造影劑，由含脂質(zhì)的成膜材料包裹生物活性氣體構(gòu)成，其特征在于成膜材料包括脂質(zhì)體、起泡劑、聚合物成份、高滲糖類或醇類；所述造影劑中，脂質(zhì)體占有的比例為0.1～5重量％，起泡劑的比例為0.01～5重量％，高滲糖或醇類的比例為1-30重量％，高分子聚合物構(gòu)成比為5-30重量％，生物活性氣體為0.15～0.5ml，其余為溶劑。
2.一種脂質(zhì)體超聲造影劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟步驟(a)(1)將所述所需要的成膜材料與水介質(zhì)接觸，使其成為一個(gè)懸浮狀態(tài)體系，使用溫度為45～55℃，時(shí)間為20～40分鐘；或(2)將所述所需的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)與非水介質(zhì)接觸，使其成為一個(gè)均勻的溶液體系，使用的溫度為45～55℃，時(shí)間為20～40分鐘；步驟(b)將消毒滅菌后的脂質(zhì)懸浮物或脂質(zhì)溶解物用負(fù)壓冷凍干燥儀進(jìn)行去溶液處理，冷凍干燥操作1～5次，進(jìn)行冷凍干燥的時(shí)間為24～36小時(shí)，冷凍干燥中所述負(fù)壓吸引壓力為50～65×10-3mBar，冷凍干燥溫度控制為-50～-70℃步驟(c)在嚴(yán)格控制的無菌室內(nèi)將冷凍干燥好的脂質(zhì)固態(tài)物用水合液溶解；步驟(d)(1)取步驟(c)溶解的脂質(zhì)溶液，在嚴(yán)格控制的無菌室將所得的脂質(zhì)溶液按0.5-1ml/s的速度導(dǎo)入超聲波聲振儀中進(jìn)行聲振處理，同時(shí)從底部導(dǎo)入生物活性氣體，速度為0.25-0.5ml/s；聲振儀探頭置于液面下0.5～2cm處聲振處理，將聲振處理溶液按0.25-0.5ml/s的速度導(dǎo)出引入分液罐中，將分液罐中溶液充分混勻，測定溶液中微球的各項(xiàng)指標(biāo)如微球濃度、平均粒徑、粒徑分布等并按現(xiàn)有的方法調(diào)整到要求值，然后將符合要求的溶液再次充分混勻，之后分裝入小包裝瓶中；或(2)取步驟(c)溶解的脂質(zhì)溶液，按生物活性氣體與脂質(zhì)溶液比為0.5～1.5∶1分裝于經(jīng)高溫高壓滅菌消毒的小安碚瓶或小管中，用機(jī)械振蕩儀處理，然后測定溶液中微球的各項(xiàng)指標(biāo)如微球濃度、平均粒徑、粒徑分布等并按現(xiàn)有的方法調(diào)整到要求值；在振蕩處理中溫度控制在18～30℃，振蕩時(shí)間為30～60s；步驟(e)將上述小瓶包裝的微球移入冰凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行真空低溫負(fù)壓干燥，制成粉針劑，向瓶內(nèi)注入與脂質(zhì)內(nèi)包裹的相同的生物活性氣體，封蓋即成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于脂質(zhì)體的構(gòu)成為磷脂類分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于磷脂類分子包括1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPG)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸-鈉鹽(DPPA)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DPPC)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于起泡劑為非離子的表面活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于表面活性劑包括吐溫80及司盤80。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于所說的聚合物為高分子聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于使用的高滲糖為葡萄糖、果糖及其異構(gòu)體、多聚糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于水合液為由高滲糖類和起泡劑配成，其中每毫升水合液中存在高滲糖0.9-0.99ml，存在0.01～0.2ml的起泡劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體超聲造影劑，其特征在于水介質(zhì)為去離子水、蒸餾水或生理鹽水。
全文摘要
一種脂質(zhì)體超聲造影劑，包括成膜材料包括脂質(zhì)體、起泡劑、聚合物成份、高滲糖類；每毫升供使用的造影劑中，脂質(zhì)體0.1～5重量％，起泡劑的比例為0.01～1重量％，高滲糖比例為，高分子聚合物構(gòu)成比為70－90重量％，生物活性氣體為0.15～0.5ml。所述脂質(zhì)體造影劑的制備流程是將造影劑成膜材料經(jīng)與水介質(zhì)或非水介質(zhì)接觸分別形成水懸浮物或溶液－冷凍干燥－冷凍干燥所得的脂質(zhì)固態(tài)物與水合液接觸－聲振或振蕩處理同時(shí)將生物活性氣體的導(dǎo)入－半成品的檢測控制及分裝－制成成品。所述的造影劑在小劑量使用時(shí)即可長時(shí)間增強(qiáng)組織顯像，有效增強(qiáng)時(shí)間大于30分鐘。本發(fā)明微球產(chǎn)出率高，微球均一性好，有效微球濃度高。
文檔編號A61K49/18GK1404878SQ02133720
公開日2003年3月26日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者高云華, 譚開彬, 劉平, 劉政, 汪成遠(yuǎn), 左松, 周世文, 夏紅梅 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)