專利名稱：基于使用chromolaena odorata的皮膚處理組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改善皮膚的狀況和外觀的美容方法，以及某些植物提取物在制備用于改善皮膚的狀況和外觀的局部用組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及Chromolaena Odorata(也被稱為例如Siam Weed或Devils Weed)的提取物用于治療皺紋和/或被光損害的皮膚的應(yīng)用。還涉及包含該類提取物的局部用組合物。
在皮膚病、環(huán)境損害(風(fēng)、空調(diào)、集中供暖)中或在正常的老化過程(變老時(shí))中，皮膚會(huì)變壞，其中所說的正常老化過程可以由于皮膚與陽(yáng)光進(jìn)行接觸而被加速(光老化)。在近幾年中，對(duì)于改善有皺紋的、老化和/或光損害皮膚的外觀和狀況的美容方法的需求急劇增長(zhǎng)，特別是對(duì)于逆轉(zhuǎn)、減少或預(yù)防皺紋、老化和/或光損害皮膚的可見跡象的美容方法的需求增長(zhǎng)很大。
消費(fèi)者更多地在尋求一些“抗老化”的化妝品，這些化妝品能逆轉(zhuǎn)、治療或延遲變老時(shí)和光老化皮膚的可視跡象如皺紋、條紋、皮膚松垂、色素沉著過度和老年斑。
膠原，主要的皮膚基質(zhì)蛋白，已知其可使得皮膚具有拉伸強(qiáng)度。在現(xiàn)有技術(shù)中已知皮膚的老化和/或光損害可顯著降低皮膚中的膠原水平。許多研究已經(jīng)表明老化和/或光損害增加可減少皮膚中I型膠原的水平(參見例如Lavker，R.J.Inv.Derm.，(1979)，73，79-66；Griffiths等人.N.Eng.J.med.(1993)329，530-535)。皮膚中膠原水平的下降相應(yīng)地與皮膚的拉伸強(qiáng)度下降有關(guān)，從而造成皺紋和松弛。普遍認(rèn)為通過提高皮膚中膠原的水平而進(jìn)行的皮膚基質(zhì)的強(qiáng)化可提供抗老化和皮膚修復(fù)的有益效果。還已知，例如從WO 99/47110可知道，核心蛋白聚糖可以作為皮膚修復(fù)的一種標(biāo)志。
包含Chromolaena Odorata提取物的Siam weed提取物是一種已知的皮膚治療提取物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其被用于軟組織損傷、燒傷和皮膚感染的處理，例如在越南。證明此應(yīng)用的典型的現(xiàn)有技術(shù)為“TheJournal of Alternative and Complimentary Medicine”，第2卷，第3期，1996，第335-343頁(yè)，Phan等人。其描述了Siam weed葉子的水性提取物用于上述目的的應(yīng)用，以及Siam weed提取物(被Phan等人稱為Eupolin)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)水化膠原晶格收縮的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以前所制備的以礦脂為基礎(chǔ)的Siam weed軟膏包含類黃酮(salvigenin、櫻花亭、異櫻花亭、莰非素、樺木醇、2-5-7-3-四-O-甲基六羥黃酮(quercatagetin)、tamarixetin、查耳酮1和chalcane 2)、精油(geyren、醋酸冰片酯、β-eubeden)、三萜皂甙、鞣酸、有機(jī)酸、以及痕量元素。在所用的典型組合物中Siam weed提取物的體外水平一般為50-200μg/ml。
此外，Phan等人在“Plastic and Reconstructive Surgery”，1998年3月，“用Chromolaena Odorata葉子提取物(Eupolin)進(jìn)行處理來增強(qiáng)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增生，一種治療傷口的草藥治療法”中又一次在燒傷治療的背景中描述了用Siam weed提取物增強(qiáng)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用。特別是發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行皮膚移植的情況中，使用Siam weed提取物可加速肉芽組織的形成。并且能增加膠原合成的速度。在該研究中，Siam weed提取物油膏的局部應(yīng)用濃度為10-230μg/ml。
我們已經(jīng)令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，通過局部使用包含ChromolaenaOdorata提取物的美容組合物可以有效地治療及預(yù)防由于變老時(shí)或光損害而造成的一般皮膚狀況，如皺紋、條紋、皮膚松垂、色素沉著過度和老年斑。我們還發(fā)現(xiàn)在美容組合物中使用Chromolaena Odorata提取物除了抗老化外還可以進(jìn)一步的提供一些有益的作用，如例如緩和敏感和/或受刺激的皮膚。
因此，本發(fā)明第一方面提供了能提供至少一種如下的皮膚護(hù)理益處的美容方法，其中所說的皮膚護(hù)理益處選自治療或預(yù)防起皺紋、皮膚松垂、老化和/或光損害；促進(jìn)皮膚中核心蛋白聚糖的產(chǎn)生、促進(jìn)皮膚中I型和III型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)的活性、增加角質(zhì)層的柔韌性、改善皮膚脫屑和表皮分化、使皮膚顏色變淡、控制皮脂分泌、緩和受刺激、發(fā)紅和/或敏感的皮膚、改善皮膚肌理、光滑度和堅(jiān)實(shí)度、并且逐漸提高皮膚的質(zhì)量；該方法包括給皮膚使用一種優(yōu)選地包含Chromolaena Odorata水性提取物的局部用組合物。
本發(fā)明另一方面還提供了有效量的Chromolaena Odorata水性提取物在制造特別是用于治療光損害皮膚和細(xì)小的條紋和皺紋的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一方面，提供了一種局部用組合物，優(yōu)選用于人皮膚上的以水為基礎(chǔ)的局部用組合物，該組合物包含有效量ChromolaenaOdorata水性提取物。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法中的局部用組合物包含的Chromolaena Odorata提取物的水平為該局部用組合物的0.00005至10％，更優(yōu)選0.0001至1.0％的水平，并且在某些情況下最優(yōu)選地為該局部用組合物的0.001至0.1％重量。
“以水為基礎(chǔ)”指的是該局部用組合物優(yōu)選包含該局部用組合物至少30％，更優(yōu)選60％重量的水。方便地，該局部用組合物可以是水包油乳劑的形式。
關(guān)于光損害皮膚的修復(fù)，一般認(rèn)為與傷口修復(fù)和皮膚的重新塑造有關(guān)的生物化學(xué)和生物學(xué)過程與在光損害修復(fù)中所涉及的這些過程并不相同。例如，已知其它物質(zhì)如能誘導(dǎo)皮膚傷口修復(fù)的物質(zhì)如金盞花和沒藥提取物在光損害修復(fù)中無效。
因此，本發(fā)明的組合物、方法以及應(yīng)用提供了一些抗老化的益處，其可以促使皮膚變得光滑、柔軟，具有改善的彈性，并且能減少或延遲皺紋和老化的皮膚外觀，并且能改善皮膚的色澤。還可以獲得在外觀、肌理和狀況上的一般性改善，特別是還可以獲得容光煥發(fā)的、明晰的、和全面年輕的皮膚外觀。本發(fā)明在提供皮膚護(hù)理益處方面可以具有特別的實(shí)用性。
這里所用的“治療”的定義范圍包括減少、延遲和/或防止上述正常的但是在美容上不希望的由正常老化過程所造成的皮膚狀況。老化的可視跡象如皺紋、條紋和/或松垂可以被延遲或減少。一般而言，通過預(yù)防或減少起皺紋并增加皮膚的柔韌性、堅(jiān)實(shí)度、光滑度、柔軟度和彈性可以提高皮膚的質(zhì)量并改善皮膚的外觀和肌理。
本發(fā)明的組合物、方法和應(yīng)用可用于治療已經(jīng)有皺紋、老化和/或光損害情況的皮膚，或可用于治療年輕的皮膚以預(yù)防或減少上述這些由于正常的老化/光損害過程而出現(xiàn)的不希望的改變。
本發(fā)明所用的組合物還包含皮膚病學(xué)/化妝品上可接受的賦形劑來作為活性成分的稀釋劑、分散劑或載體。該賦形劑還可以包含在皮膚護(hù)理產(chǎn)品中常用的物質(zhì)如水、液態(tài)或固態(tài)的潤(rùn)膚劑、硅油、乳化劑、溶劑、濕潤(rùn)劑、增稠劑、粉末、推進(jìn)劑等等。
賦形劑一般占該組合物重量的5％至99.9％，優(yōu)選25％至80％重量，并且可以在不存在其它的化妝品輔劑的情況下形成該組合物的差額。
除Chromolaena Odorata活性提取物外，還可以包含其它特定的對(duì)皮膚有益的活性物質(zhì)如防曬劑、皮膚增亮劑、和皮膚曬黑劑(skintanning agents)。該賦形劑還可以進(jìn)一步包含輔劑如抗氧劑、香料、遮光劑、防腐劑、著色劑和緩沖劑。
為了制備本發(fā)明的方法中所用的局部用組合物，可以使用制備皮膚護(hù)理產(chǎn)品所用的常規(guī)方法。該活性組分一般以常規(guī)的方法摻入皮膚病學(xué)/化妝品上可接受的載體中。首先可將該活性組分適當(dāng)?shù)厝芙饣蚍稚⒂谝徊糠峙c該組合物相混合的水或其它溶劑或液體中。雖然在某些情況下優(yōu)選油包水組合物，但優(yōu)選的組合物是水包油或油包水或水包油包水乳劑(water-in-oil-in-water emulsions)。
該組合物可以是常規(guī)的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的形式如乳膏、凝膠或洗劑、膠囊等等。該組合物還可以是所謂的“洗去”產(chǎn)品，例如沐浴或淋浴凝膠，其可能包含在沖洗期間促進(jìn)皮膚粘附的活性成分傳遞系統(tǒng)。最優(yōu)選地，該產(chǎn)品是一種“保留”產(chǎn)品，其是一種在應(yīng)用于皮膚后無需故意的沖洗步驟就能被應(yīng)用于皮膚的產(chǎn)品。
該組合物可以通過任意的適合的方式來進(jìn)行包裝，如以傳統(tǒng)的方式如廣口瓶、瓶子、管、滾動(dòng)球(roll-ball)等等。另外的設(shè)計(jì)形式是適于傳遞的制劑如噴霧劑，該噴霧劑得自推進(jìn)劑驅(qū)動(dòng)的氣霧劑或得自泵噴霧。
本發(fā)明的組合物還可以被配制成適于口服攝取的形式如膠囊、片劑或類似制劑。
本發(fā)明的方法可以通過一天一次或多次的對(duì)需要進(jìn)行處理的皮膚進(jìn)行處理來完成。在3至6個(gè)月后或更早的時(shí)間一般就可以看到皮膚外觀的改善，這取決于皮膚的狀況、在本發(fā)明方法中所用的活性組分的濃度、所用組合物的數(shù)量和該組合物的應(yīng)用頻率。一般而言，從適宜的容器或敷料器中將少量的組合物，例如0.1至5ml施用到皮膚上并用手或手指或適宜的裝置將其涂展和/或摩擦到皮膚上。在其后可進(jìn)行沖洗步驟也可不進(jìn)行沖洗步驟，這取決于該組合物是被制備成“保留”還是“洗掉”產(chǎn)品。
為了更容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行理解，用下面的實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，而且僅僅用其來進(jìn)行舉例說明，關(guān)于附圖而言-

圖1表示在人皮膚成纖維細(xì)胞中Eupolin對(duì)PMA刺激的PGE2水平的作用。
實(shí)施例從我們的同樣待審的歐洲專利申請(qǐng)No.99908956.8中可以知道可以通過局部使用視黃酸進(jìn)行治療可造成體內(nèi)原膠原I和核心蛋白聚糖的向上調(diào)節(jié)。為此，該申請(qǐng)中在“在為了進(jìn)行比較的目的而進(jìn)行局部視黃酸治療后對(duì)體內(nèi)在皮膚中原膠原I和核心蛋白聚糖向上調(diào)節(jié)的鑒別”的標(biāo)題下的信息在這里被全部引入作為參考。
實(shí)施例1測(cè)定人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)原膠原-I和核心蛋白聚糖合成的方法皮膚成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備。
以10000細(xì)胞/cm2的密度將人初級(jí)包皮成纖維細(xì)胞第2代(P2)接種于12孔板中并在5％二氧化碳和4％氧氣的氣氛下，將其在另外加入了10％胎牛血清的Dulbeccos改性的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)24小時(shí)。此后，將該細(xì)胞用不含血清的DMEM進(jìn)行洗滌，然后將其在新鮮不含血清的DMEM中再培養(yǎng)60小時(shí)。然后，再將該成纖維細(xì)胞單層用不含血清的DMEM進(jìn)行洗滌。在最終體積為0.4ml/孔新鮮的不含血清的DMEM中，一式三份的把試驗(yàn)試劑和賦形劑對(duì)照加入到該細(xì)胞中，并將其再進(jìn)一步的培養(yǎng)24小時(shí)。立即對(duì)這種成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行分析或?qū)⑵湓谝旱型蝗焕鋬霾⑵鋬?chǔ)存在-70℃下以便于進(jìn)行進(jìn)一步的分析。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨后將由斑點(diǎn)-印跡分析(dot-blot analysis)所得的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞數(shù)目。
在皮膚成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基中原膠原-I和核心蛋白聚糖蛋白的斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)向用賦形劑(作為對(duì)照)或試驗(yàn)試劑處理的皮膚成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的樣品中加入20mM二硫蘇糖醇(200mM儲(chǔ)存液的1∶10稀釋液)和0.1％十二烷基硫酸鈉(10％儲(chǔ)存液的1∶100稀釋液)作為補(bǔ)充，充分進(jìn)行混合，然后將其在75℃下培養(yǎng)2分鐘。該試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是這樣生成的在175cm2燒瓶中以10000細(xì)胞/cm2的密度對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行接種并使其在如上所述的不含血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)，將由其所獲得的純成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋。
隨后，用得自Bio-Rad的96-孔Bio-Dot儀器，按照制造商的說明，一式三份地將試驗(yàn)樣品施用于Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜的預(yù)濕潤(rùn)片中。每孔中使用約200μl的培養(yǎng)基。使該培養(yǎng)基在重力的作用下通過膜進(jìn)行過濾(30分鐘)，之后，將該膜用PBS(200μl)洗滌兩次。使這些PBS洗滌液在重力的作用下通過該膜進(jìn)行過濾(2×15分鐘)。然后，將Bio-Dot儀器連接到真空多支管上，在抽吸下用PBS進(jìn)行第三次(最后的)洗滌。
將該儀器拆開，將該膜取下并根據(jù)需要進(jìn)行快速的切割，然后將其置于封閉緩沖液中并在4℃下放置過夜。將所制備的用于核心蛋白聚糖分析的膜用3％(w/v)BSA/0.1％(v/v)吐溫20(在PBS中)進(jìn)行封閉，而將那些用于原膠原-I分析的膜用5％(w/v)無脂干奶粉/0.5％吐溫20(在PBS中)進(jìn)行封閉。
次日，用人原膠原-I初級(jí)抗體(MAB1912；大鼠單克?。籆hemiconInt.Inc.，Temecula，CA)或人核心蛋白聚糖初級(jí)抗體(兔多克?。籅iogenesis)的1∶10000稀釋物在室溫下對(duì)該膜探測(cè)2小時(shí)。隨后，將該膜用TBS/0.05％吐溫20進(jìn)行洗滌(3×5分鐘)，然后根據(jù)需要，將其用125 I-結(jié)合的抗大鼠或抗兔F(ab′)2片段(Amersham)的1∶1000稀釋液在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。此后，將該Immobilon條再次用TBS/吐溫20進(jìn)行洗滌(3×5分鐘)，然后使其在室溫下，在空氣中進(jìn)行干燥。
將該干燥的膜包于玻璃紙中并將其與分子動(dòng)態(tài)儲(chǔ)存熒光屏(Molecular Dynamics storage phosphor screen)接觸16-18小時(shí)。在這步操作結(jié)束時(shí)，將其所接觸的屏通過phosphorimager(MolecularDynamics Phosphorimager SF)用ImageQuantTM軟件進(jìn)行掃描。用ImageQuantTM中的定量工具，通過計(jì)算機(jī)輔助成像分析來對(duì)點(diǎn)的強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，將其標(biāo)準(zhǔn)化至細(xì)胞數(shù)目并將用賦形劑進(jìn)行處理的對(duì)照值定為100(任意單位)，對(duì)各種試驗(yàn)試劑對(duì)核心糖蛋白聚糖和原膠原-I合成的作用進(jìn)行測(cè)定。
下面的表1表明了Chromdaena Odorata提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞中原膠原-I和核心蛋白聚糖合成的作用和其中所用的該提取物的數(shù)量。為了將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，將用賦形劑處理的對(duì)照值作100任意單位作為基準(zhǔn)來對(duì)比測(cè)定試驗(yàn)物質(zhì)的作用。為了進(jìn)行比較，還用視黃酸進(jìn)行了試驗(yàn)以評(píng)估其對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞中核心糖蛋白合成的作用。在試驗(yàn)中所用試劑的濃度對(duì)細(xì)胞的存活力沒有影響。
通過將Siam weed的葉子在水中煮沸30分鐘來獲得水性提取物，將該提取物進(jìn)行濃縮，制得Chromolaena Odorata的提取物。
如上所述的那樣，在0.1至1μg/ml的水平上，在包含4％氧的體外成纖維細(xì)胞模型中對(duì)該提取物進(jìn)行試驗(yàn)。
用該模型來分析原膠原-I和核心蛋白聚糖。它們的結(jié)果如下所示。
表1
該結(jié)果表明即使相對(duì)低的提取物濃度(例如0.01μg/ml)也能大大增量調(diào)節(jié)該模型中的核心蛋白聚糖合成。與對(duì)照相比，在原膠原I合成方面也觀察到了小的作用，雖然作用較小，但的確呈現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)。還將1.0μg/ml的樣品與視黃酸(1μm)進(jìn)行了比較試驗(yàn)，同樣將用賦形劑進(jìn)行處理的對(duì)照值100任意單位作為基準(zhǔn)來進(jìn)行測(cè)定，表現(xiàn)出核心蛋白聚糖的增量調(diào)節(jié)，138±14.0(p＝0.035，n＝4)。與視黃酸的作用相比，這進(jìn)一步表明了Chromolaena Odorata提取物可使人皮膚成纖維細(xì)胞中核心蛋白聚糖合成大大增加。
實(shí)施例2成纖維細(xì)胞PGE2試驗(yàn)下面的實(shí)施例證明chromolaena odorata提取物可以有效地降低由體外成纖維細(xì)胞所分泌的前列腺素E2(PGE2)的基礎(chǔ)水平。
以10000細(xì)胞/孔的密度將初級(jí)人包皮成纖維細(xì)胞第2代(P2)接種于96孔板中，并且將其在5％二氧化碳?xì)夥障?，在另外加入?0％胎牛血清的Dulbeccos改性的Easgles培養(yǎng)基(DMEM)中維持24小時(shí)。將溶解于乙醇中的Chromolaena Odorata提取物加入到新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基中(終濃度1％乙醇，在另外加入了10％胎牛血清的DMEM中)，然后一式三份地將其加入到孔中的細(xì)胞中，并將其再培養(yǎng)24小時(shí)。向該培養(yǎng)基中加入肉豆蔻酸醋酸佛波醇(Phorbal)酯(PMA)(Sigma)并將該細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。PMA作為可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)的應(yīng)激物。然后，立即按照下面所描述的方法來對(duì)該成纖維細(xì)胞/培養(yǎng)基進(jìn)行分析或?qū)⑵湓谝旱型蝗焕鋬霾⒃?70℃下進(jìn)行儲(chǔ)存以用于進(jìn)一步的分析。
前列腺素E2(PGE2)試驗(yàn)在輕輕振搖培養(yǎng)板后，取50μl的培養(yǎng)基進(jìn)行PGE2分析。用Biotrak PGE2免疫分析試劑盒(Amersham，UK)來測(cè)定培養(yǎng)基中PGE2的水平。該試驗(yàn)的基礎(chǔ)為樣品中未標(biāo)記的PGE2和定量的用辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGE2之間競(jìng)爭(zhēng)有限量的固定的PGE2特異性抗體。用同時(shí)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未標(biāo)記的樣品PGE2的濃度。
與對(duì)照相比，用試驗(yàn)化合物降低所分泌的PGE2基礎(chǔ)水平的能力來對(duì)該試驗(yàn)化合物的抗炎潛力進(jìn)行評(píng)估。所得的結(jié)果被概括的列于下面的表格中，并示于圖1中。
用Chromolaena Odorata提取物處理的和用PMA進(jìn)行刺激的人皮膚成纖維細(xì)胞中PGE2的水平眾所周知，PGE2是皮膚中的炎癥介體，參見Greaves等人“Prostagludus、leukotriemes、磷脂酶、血小板活化因子和細(xì)胞因子一種人皮膚炎癥的綜合治療方法”，Arch.Dermatol.Res.(1988)280[增刊]533-541。該結(jié)果表明用Chromolaena Odorata提取物處理的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生較少的促炎前列腺素PFE2，因此可以降低皮膚炎癥的可能性。
實(shí)施例3器官培養(yǎng)-TGase法材料氯二甲苯酚(Dettol)(Reckitt&Coleman，Hull，UK)，包含glutamax的DMEM(Dulbecco的改性的Eagle培養(yǎng)基)，ABAM，(抗生素/抗真菌的X100)溶液(50,000單位青霉素G，50,00μg硫酸鏈霉素和125μg兩性霉素B/5mL(Gibco BRL，Paisley，UK))，氫化可的松21-半琥珀酸鹽(鈉鹽)(Sigma Co.，Poole，UK)，35×10mm陪替氏培養(yǎng)皿(Nunclon，由Fisher Scientific提供，Loughborough，UK)，微型Marbrook塑料三角架(由C.A.Hendley Ltd提供，UK)，Nybolt尼龍篩(John Staniar Ltd，UK)，無菌的一次性的4mm活體檢查鉆孔器，Steifel Labs Ltd，Bucks，UK)。
生物素化的單丹磺酰尸胺，Alexa Fluor 488鏈霉抗生物素，長(zhǎng)期抗褪色(Prolong antifade)溶液(分子探針，由Cambridge Bioscience提供，UK)，白蛋白。牛的(BSA)，氯化鈣CaCl2，三羥基甲基氨基甲烷(TRIZMA堿)，乙二胺四乙酸(EDTA)，碘化丙錠(propidiumiodide)，(Sigma Co.，Poole，UK)鹽酸(HCl)，Merck，Poole，Dorset，UK))。
器官培養(yǎng)方法通過仔細(xì)的除去皮下脂肪和肌肉來制備豬背部的皮膚，得到3-4mm厚的皮膚樣本。通過修剪除去毛發(fā)，然后將該皮膚用水進(jìn)行洗滌，除去任何殘留的血或污垢。將該皮膚樣本切割成7cm×7cm的方?jīng)Q，然后在室溫下(RT)在5％的氯二甲苯酚(無菌的)中培養(yǎng)1小時(shí)。然后將其在包含ABAM的DMEM(5mL/500mL的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)1小時(shí)。將氫化可的松21-半琥珀酸鹽(100μg/mL，進(jìn)行了無菌過濾)加入到DMEM+ABAM中。在包含3ml培養(yǎng)基(DMEM/ABAM/氫化可的松)的陪替氏培養(yǎng)皿中架起三角架和篩，形成一種負(fù)液面。將鉆孔器的活組織檢查部分從皮膚上取下，并將其放置在篩網(wǎng)上(每皿4個(gè))，然后在進(jìn)行處理前，在37℃下，在5％CO2下將其培養(yǎng)24小時(shí)。每天更換培養(yǎng)基。
原位TGase法將在0.013M HCl中的10mM生物素化的單丹磺酰尸胺儲(chǔ)備液存儲(chǔ)于-20℃下。用該儲(chǔ)備液制備底物緩沖液在100mM Tris HCl中0.1mM生物素化的單丹磺酰尸胺、5mM CaCl2。將5mM CaCl2用200mM EDTA取代，將其作為陽(yáng)性對(duì)照。
將豬皮膚的活組織檢查物立即冷凍于液氮中并將其存儲(chǔ)于-20℃。切下一些部分(5-8微米厚，Brights低溫恒溫器)并在室溫下(RT)風(fēng)干10分鐘。將這些小塊在RT下用pH為8.4的在0.1M Tris/HCl中的1％BSA培養(yǎng)30分鐘，然后在RT下在底物緩沖液中培養(yǎng)2小時(shí)。將載玻片在25mM在PBS中的EDTA洗滌5分鐘以停止該反應(yīng)，然后用PBS洗滌兩次。然后，將該載玻片在RT下在Alexa fluor 488鏈霉抗生物素(1∶250)中培養(yǎng)30分鐘，然后如前所述的那樣用PBS對(duì)其進(jìn)行洗滌。用10μg/ml的碘化丙錠將該載玻片復(fù)染色10秒，然后用水對(duì)其進(jìn)行洗滌，并且用長(zhǎng)期抗褪色溶液進(jìn)行固定。用顯微鏡(Leiea，Leitz DMRB，Leitz ploemopak filter block L3，Milton Keynes，Bucks.UK)對(duì)這些小塊進(jìn)行觀察，并且用Image Grabber PC軟件(NeotechLtd.Eastleigh，Hampshire，UK)來對(duì)其進(jìn)行照相。
按照如上所述的方法，用各種濃度的Chromolaena odorata提取物將豬器官培養(yǎng)物處理48小時(shí)。用如上所述的方法對(duì)豬器官活組織檢查的eyrostat部分中的TGase活性進(jìn)行評(píng)估，由TGase試驗(yàn)所得的結(jié)果被列于下面的表3中。
表3在48h時(shí)Chromolaena odorata提取物對(duì)豬器官培養(yǎng)物中TGase活性的作用
表3中的結(jié)果表明，與對(duì)照相比，用Chromolaena odorata提取物進(jìn)行處理的豬皮膚中的TGase活性顯著增加。倘若豬與人的皮膚類似，則很可能Chromolaena odorata提取物對(duì)于人皮膚中的TGase活性也具有類似的作用。
該數(shù)據(jù)證明Chromolaena odorata提取物可以刺激表皮分化中和屏障形成中的關(guān)鍵酶，因此，這種植物提取物對(duì)于皮膚狀況是有益的。
實(shí)施例5下面描述了一種適用于本發(fā)明的方法和應(yīng)用的水包油膏霜。顯示的百分比是按組合物的重量來計(jì)算的。
*Brij 56是鯨蠟醇POE(10)**Alfol 16RD是鯨蠟醇實(shí)施例6下面描述了一種本發(fā)明的乳膏。
上面實(shí)施例5和6的局部用組合物都可提供有效的美容處理以改善起皺、老化、光損害、和/或刺激性皮膚的外觀，當(dāng)應(yīng)用于在變老中或光老化的劣化的皮膚時(shí)或當(dāng)應(yīng)用于年輕的皮膚上時(shí)，有助于防止或延遲這種損害變化。該組合物可以通過常規(guī)的方式來進(jìn)行制備。
權(quán)利要求
1.能提供至少一種皮膚護(hù)理益處的美容方法，其中所說的皮膚護(hù)理益處選自治療或預(yù)防起皺紋、松垂、老化和/或光損害的皮膚；促進(jìn)皮膚中核心蛋白聚糖的產(chǎn)生、促進(jìn)皮膚中I型和III型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性、增加角質(zhì)層的柔韌性、改善皮膚脫屑和表皮分化、使皮膚顏色變淡、控制皮脂分泌、緩解受刺激的、發(fā)紅的和/或敏感的皮膚、改善皮膚肌理、光滑程度、堅(jiān)固程度并逐漸提高皮膚的品質(zhì)，該方法包括使用有效量的Chromolaena Odorata提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的Chromolaena Odorata提取物是水性提取物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所說的提取物的存在量為組合物重量的0.0001％至1％。
4.Chromolaena Odorata提取物用于制備能提供至少一種皮膚護(hù)理益處的局部用美容組合物的應(yīng)用，其中所說的皮膚護(hù)理益處選自治療或預(yù)防起皺紋、松垂、老化和/或光損害的皮膚；促進(jìn)皮膚中核心蛋白聚糖的產(chǎn)生、促進(jìn)皮膚中I型和III型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性、增加角質(zhì)層的柔韌性、改善皮膚脫屑和表皮分化、使皮膚顏色變淡、控制皮脂分泌、緩解受刺激的、發(fā)紅的和/或敏感的皮膚、改善皮膚肌理、光滑程度、堅(jiān)固程度并逐漸提高皮膚的品質(zhì)。
全文摘要
一種能提供至少一種皮膚護(hù)理益處的美容方法，其中所說的皮膚護(hù)理益處選自治療或預(yù)防起皺紋、松垂、老化和/或光損害的皮膚；促進(jìn)皮膚中核心蛋白聚糖的產(chǎn)生、促進(jìn)皮膚中I型和III型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性、增加角質(zhì)層的柔韌性、改善皮膚脫屑和表皮分化、使皮膚顏色變淡、控制皮脂分泌、緩解受刺激的、發(fā)紅的和/或敏感的皮膚，該方法包括使用有效量的Chromolaena Odorata提取物。
文檔編號(hào)A61K8/00GK1630507SQ01818473
公開日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2001年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月2日
發(fā)明者R·M·多諾文 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司