專利名稱：海狗油作為制備治脂肪肝藥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是海狗油作為制備治脂肪肝藥的應(yīng)用。
通常認(rèn)為，愛斯基摩人和日本沿海漁民患此類疾病的患者數(shù)量比一般人群要明顯的低，研究人員相信這種現(xiàn)象和與他們食用富含不飽和脂肪酸的海狗肉、油有關(guān)。
但是，至今并未有具體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者臨床結(jié)果加以證明。
在本發(fā)明中所述的海狗通常是指生活紐芬蘭、北大西洋地區(qū)、北極的一種哺乳動(dòng)物，它們體內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸含量高達(dá)25％，其分子結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的脂肪酸分子結(jié)構(gòu)相似。
本發(fā)明所述的海狗油(又稱海豹油)是指由海狗的皮下脂肪提煉而成的純天然產(chǎn)品。
研究結(jié)果表明，海狗油中含有大量的人體必需的體內(nèi)不能自行合成的ω-3系長碳鏈多烯不飽和脂肪酸以及少量的角鯊烯(SPUALENE)。
為了進(jìn)一步明確上述海狗油的成份和含量，以下對(duì)本發(fā)明所使用的海狗油的成份進(jìn)行分析和確認(rèn)。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明，從海狗油中提取的ω-3系多烯不飽和脂肪酸的化學(xué)主成份為EPA、DHA和DPA，其中EPA是指二十碳五烯酸；DPA是指二十二碳五烯酸；DHA是指二十二碳六烯酸；本發(fā)明的研究人員對(duì)上述獲得的海狗油進(jìn)行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、氣相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用色譜等項(xiàng)目的測定，對(duì)所述樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，具體如下本發(fā)明采用的海狗油樣品的檢測結(jié)果是(1)紫外吸收光譜用氯仿(分析純)把樣品配成5.9mg/ml溶液后進(jìn)行全波長紫外掃描，所使用的儀器的型號(hào)是U-3210spectrophotometer(Japan制造)；參見附

圖1，其結(jié)果表明樣品在249.8nm處有最大吸收，可以證明樣品中含有大量的不飽和鍵；(2)紅外吸收光譜參見附圖2，其結(jié)果表明，在3010cm-1和1745cm-1處的強(qiáng)吸收分別是不飽和＝C-H和＞C＝O伸縮振動(dòng)的特征吸收；1655cm-1處的弱吸收符合順式雙鍵(R1-C＝C-R2)的伸縮振動(dòng)特征吸收(1665-1635cm-1，反式為1675-1665cm-1)，H/ \H722cm-1處的吸收峰符合順式雙鍵＝C-H彎曲振動(dòng)的特征吸收(730-665cm-1，反式為980-960cm-1)。
綜合紅外和紫外光譜分析，可以認(rèn)為樣品中主要為順式非共軛脂肪酸。
(3)氣相色譜在本項(xiàng)檢測中，采用的標(biāo)準(zhǔn)品由SIGMA公司提供，分別為Cis-5，8，11，14，17-EICOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十碳五烯酸甲酯；Cis-4，7，10，13，16，19-DOCOSAHEXAENOIC ACID ETHYL ESTER，二十二碳六烯酸乙酯；Cis-7，10，13，16，19-DOCOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十二碳五烯酸甲酯；樣品為上述獲得的海狗油，用GC法分析脂肪酸需要將其乙酯化以利氣化，具體是取所述的樣品80μl，加0.5ml/l的NaOH-乙醇液1ml，充N2，加塞，于50攝氏度水浴中振搖至小油滴完全消失，加三氟化硼乙醇液1.5ml。混合均勻，于50度水浴中放5min，取出冷卻，加正庚烷1ml、飽和NaCl為2ml混合均勻，分層。取上層液于另一試管中，加少量無水NA2SO4，充N2，于4度放置待GC分析。
所使用的儀器為HP6890；氣相色譜條件玻璃充填柱2m×3mm，10％DEGS酸洗，101白色擔(dān)體，載氣N2，流速25ml/min，檢測器FID，柱溫180度，氣化室210度，檢測器270度，進(jìn)樣量1ul。
將標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷定容，配置成2.5mg/ml溶液，精密量取1ul進(jìn)行氣相含量測定，同樣的方法對(duì)樣品進(jìn)行測定，結(jié)果是樣品和對(duì)照品的保留時(shí)間一致。
可參見附圖3-7。
(4)氣-質(zhì)聯(lián)用法采用的儀器為美國Trace 2000GC/Trace MS型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，所有試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)條件為氣相色譜條件PEG-20M玻璃毛細(xì)管柱(2m×0.32mm)；柱溫40度保持1min，以10度/min升溫至200度，保持5min，再以30度/min升溫至210度，保持2min；載氣N2，柱前壓3.0kpa，分流比1∶30，進(jìn)樣口溫度250度；離子源溫度250度，電離電壓70Ev，質(zhì)量掃描范圍350AmU.S-1；進(jìn)樣量1ml。
經(jīng)質(zhì)譜圖分析，確定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的分子量相符。
至此，對(duì)本發(fā)明采用的海狗油的分子量、成份、含量和結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到確認(rèn)。
為了確認(rèn)本發(fā)明所述的海狗油在治療DL-乙硫氨酸致大、小鼠脂肪肝方面的療效，進(jìn)行了以下的動(dòng)物試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇私馑龅暮９酚驮谥委熕龅腄L-乙硫氨酸致大、小鼠脂肪肝方面的藥理學(xué)作用和效果，具體的方法與結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)例一本實(shí)驗(yàn)例的目的是了解所述的海狗油在治療所述的DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝方面的藥理學(xué)作用和效果，具體的方法與結(jié)果如下
海狗油為海狗體內(nèi)提取而成的微黃色油狀液體，由大西洋衛(wèi)生食品有限公司生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)室室溫保存。試驗(yàn)時(shí)按20g體重灌胃0.6ml，高，中，低劑量均使用稀釋藥液。
陽性對(duì)照藥為聯(lián)苯雙酯，每丸含量1.5mg，批號(hào)990527，批準(zhǔn)文號(hào)京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第121020號(hào)，由北京協(xié)合制藥廠生產(chǎn)，購于北京協(xié)合制藥廠藥店。實(shí)驗(yàn)前將藥丸在乳缽中壓碎，邊研磨邊加入蒸餾水，制成8mg/ml的混懸藥液，小鼠灌胃體積按0.5ml/20g體重。
模型藥為DL-乙硫氨酸，粉劑，批號(hào)98H5018，由SIGMA公司生產(chǎn)，由本所供銷科代購。實(shí)驗(yàn)前在1/萬天平上稱取DL-乙硫氨酸，制成10mg/ml的混懸藥液，小鼠灌胃體積按0.5ml/20g體重。
空白對(duì)照組小鼠每只灌胃0.5ml蒸餾水。
生化試劑及其它試劑，甘油三酯試劑盒為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，生理鹽水，橄欖油購于北京醫(yī)藥商店。
試驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)昆明種小鼠，小鼠體重19-21g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)京動(dòng)許字(2000)第012號(hào)，由中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前觀察兩天，選健康，活潑的動(dòng)物用于試驗(yàn)。
取小鼠60只，雌雄各半，體重19-21g，隨機(jī)分為6組即空白對(duì)照組，DL-乙硫氨酸模型0.25g/kg組，陽性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯0.2g/kg組，海狗油10ml/kg組、5ml/kg、2.5ml/kg組，每組10只?？瞻捉M及模型對(duì)照組每日灌胃給水，三個(gè)劑量組及陽性對(duì)照藥組每日灌胃給藥共9天，在第7天，除空白對(duì)照組外，均另加DL-乙硫氨酸一次灌胃，于第9天斷頭放血處死動(dòng)物，取肝并用濾紙吸干血跡稱其重量，用生理鹽水按1∶5制成肝勻漿，2500rpm離心5分鐘，取上清按試劑盒要求測定甘油三酯含量，測定波長為550nm。以兩組t檢驗(yàn)測定各組甘油三酯含量差異的顯著性。
所述的結(jié)果詳見表1；給藥期間小鼠的精神好，活動(dòng)自如，未見藥物引起的不良反應(yīng)。
表1海狗油對(duì)甘油三酯的影響(一)

與空白組比較*p＜0.01海狗油對(duì)甘油三酯的影響(二)

與空白組比較*p＜0.01結(jié)果表明，空白對(duì)照組的甘油三酯含量在正常值范圍內(nèi)；模型對(duì)照組的數(shù)值升高則非常明顯；而陽性對(duì)照組的海狗油10ml/kg，5ml/kg組的數(shù)值均有明顯降低，與模型對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有非常顯著性差異及顯著性差異(p＜0.01，p＜0.05)。
結(jié)論海狗油在5ml/kg-10ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃給藥9天，對(duì)小鼠DL-乙硫氨酯所致的脂肪肝，可顯著減少甘油三酯含量的提高，可有效地預(yù)防脂肪肝的發(fā)生，證示了海狗油具有較好的抗脂肪肝的作用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為用DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝的模型，對(duì)海狗油在2.5ml/kg-10ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃9天的藥效學(xué)作用進(jìn)行了觀察，了解海狗油對(duì)DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝模型的藥理學(xué)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥可明顯抑制DL-乙硫氨酸致小鼠甘油三脂含量的增高。
實(shí)驗(yàn)例二本實(shí)驗(yàn)例的目的是了解所述的海狗油在治療所述的DL-乙硫氨酸致大鼠脂肪肝方面的藥理學(xué)作用和效果，具體的方法與結(jié)果如下試驗(yàn)材料海狗油為海狗體內(nèi)提取而成的微黃色油狀液體，由大西洋衛(wèi)生食品有限公司生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)室室溫保存。試驗(yàn)時(shí)按140g體重灌胃1.2ml(高劑量使用原液)或1ml(中，低劑量使用稀釋藥液)。
陽性對(duì)照藥為聯(lián)苯雙酯，每丸含量度1.5mg，批號(hào)990527，批準(zhǔn)文號(hào)京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第121020號(hào)，由北京協(xié)合制藥廠生產(chǎn)，購于北京協(xié)合制藥廠藥店。實(shí)驗(yàn)前將藥丸在乳缽中壓碎，邊研磨邊加入蒸餾水，制成22.5mg/ml的混凝土懸液，大鼠灌胃體積按1ml/140g體重。
模型藥為DL-乙硫氨酸，粉劑，批號(hào)98H5018，由SIGM公司生產(chǎn)，由本所供銷科代購。實(shí)驗(yàn)前在1/萬天平上稱取DL-乙硫氨酸，制成28mg/ml的混懸液，大鼠灌胃體積按1ml/140g體重。
空白對(duì)照組大鼠每只灌胃1ml蒸餾水。
生化試劑及其它試劑，甘油三酯試劑盒為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，生理鹽水，橄欖油購于北京醫(yī)藥商店。
試驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)wister大鼠，大鼠體重130g-150g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)京動(dòng)許字(2000)第012號(hào)，由中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前觀察兩天，選健康，活潑的動(dòng)物用于試驗(yàn)。
方法與結(jié)果取在鼠48只，雌雄各半，體重130-150g，隨機(jī)分為6組即空白組，DL-乙硫氨酸模型0.2g/kg組，陽性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯0.1g/kg組，海狗油8.6ml/kg組、4.3ml/kg、2.2ml/kg組，每組8只?？瞻捉M及模型對(duì)照組每日灌胃給水，三個(gè)劑量組及陽性對(duì)照組每日灌胃給藥共9天，在第7天，除空白對(duì)照組外，均另加DL-乙硫氨酸一次灌胃，于第9天斷頭放血處死動(dòng)物，取肝并用濾紙吸干血跡稱其重量，用生理鹽水按1∶5制成肝勻漿，2500rpm離心5分鐘，取上清按試劑盒要求測定甘油三酯含量，測定波長為550nm。以兩組t檢驗(yàn)測定各組甘油三酯含量差異的顯著性。結(jié)果詳見表2。給藥期間大鼠精神好，活動(dòng)自如，未見藥物引起的不良反應(yīng)。
表2 海狗油對(duì)甘油三酯的影響(一)

與空白組比較*p＜0.01海狗油對(duì)甘油三酯的影響 (二)

與空白組比較*p＜0.01結(jié)果表明，空白對(duì)照組的甘油三酯含量在正常值范圍內(nèi)；模型對(duì)照組的數(shù)值升高則非常明顯；而陽性對(duì)照組和海狗油8.6ml/kg，4.3ml/kg組的數(shù)值均有明顯降低，與模型對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有非常顯著性差異及顯著性差異(p＜0.01，p＜0.05)。
結(jié)論海狗油在4.3ml/kg-8.6ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃給藥9天，對(duì)大鼠DL-乙硫氨酸所致的脂肪肝，可顯著減少甘油三酯含量的提高，可有效地預(yù)防脂肪肝的發(fā)生，證實(shí)了海狗油具有較好的抗脂肪肝的作用。
用DL-乙硫氨酸致大鼠脂肪肝的模型，對(duì)海狗油在2.2ml/kg-8.6ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃9天的藥效學(xué)作用進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥可明顯抑制DL-乙硫氨酸致大鼠甘油三脂含量的增高。
權(quán)利要求
1.一種主要成份為二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)的海狗油作為制備治脂肪肝藥的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用優(yōu)選4.3-10ml/kg的劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用更優(yōu)選5-8.6ml/kg的劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治脂肪肝藥的應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明所述的海狗油在4.3－10ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃給藥，對(duì)DL－乙硫氨酸致大小鼠脂肪肝，可明顯抑制DL－乙硫氨酸致大小鼠甘油三脂含量的增高，從而證實(shí)將所述的海狗油作為藥的情形下，有明顯的治療脂肪肝的作用。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1410073SQ0113551
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者徐康森, 李湛軍, 樂嘉靜, 忻余, 林蘭, 何謂鑒 申請(qǐng)人:中國藥品生物制品檢定所