專利名稱：用于感染的酶療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含酶的組合物以及用所述酶作為抗感染藥在治療消化道感染或降低消化道感染危險方面的方法。
背景技術(shù)：
在聯(lián)合國經(jīng)濟和社會事務(wù)部人口處(the United Nations Departmentof Economic and Social Affairs Population Division)的1998年世界人口估計和計劃修訂本(Revision of the World Population Estimates andProjections)中，預計世界人口將于1999年達到60億。報告還說明，世界人口從50億增加到60億僅用了12年，相比之下，世界人口從10億增加到20億卻用了123年。到21世紀中期，計劃人口會在73億至107億之間。最近十年間顯著的人口增長部分是由于應用技術(shù)和集約化糧食生產(chǎn)措施導致的糧食生產(chǎn)的有效增加所致。對于將來的增長，需要糧食生產(chǎn)更有效的增加跟上增長。
一種使動物性食品生產(chǎn)更為有效的方法涉及在動物飼料中廣泛使用抗微生物化學藥品和抗生素。在大規(guī)模農(nóng)場內(nèi)，感染的傳播在密集型生產(chǎn)條件下非常迅速。因此，通過預防性和治療性應用這些物質(zhì)來控制流行性疾病。例如，通常的做法是在動物飼料中摻入防治球蟲感染的化學藥品(例如，沙利霉素、莫能星、羅沙胂(3-硝基)、哈喹諾、卡巴多司和奧喹多司)以及抗微生物的抗生素(例如，桿菌肽、維吉霉素、泰洛星、四環(huán)素、金霉素、青霉素、竹桃霉素、新生霉素、林可霉素、班貝霉素、安普霉素、螺旋霉素、紅霉素、新霉素等等)。眾所周知這種做法可促進生長并提高飼料轉(zhuǎn)化率。
在諸如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的人類病原體中，多重抗生素抗性的增加已產(chǎn)生這樣的擔心與家畜相關(guān)的微生物中發(fā)生的抗生素抗性可以通過可轉(zhuǎn)移抗藥性因子遷移至人類病原體中。有證據(jù)說明，喂以抗生素的動物是帶有可轉(zhuǎn)移抗藥性因子的細菌源。參見Hooge，F(xiàn)eedstuffs 71(20)59，1999。雖然動物和人類所用的抗生素一般不同，但是在可能產(chǎn)生交叉抗性的機理方面有相似性。在一種情況下，氟喹諾酮(fluroquinolone)被批準用以防治某些動物的大腸桿菌感染(大腸桿菌病)并且也用于人類醫(yī)藥中。Hooge，參見上文。最近，由于發(fā)生氟喹諾酮抗性彎曲桿菌并且轉(zhuǎn)移到人，因此FDA/CVM已經(jīng)建議取消在家禽中使用氟喹諾酮恩氟沙星的批準。參見Murhead，S. Feedstuffs72(45)1-4，2000。
如果在飼料中禁止使用抗生素和抗微生物藥，則肉品生產(chǎn)業(yè)也擔心會造成損失并可能發(fā)生動物病的死灰復燃。例如，在1986年，瑞典禁止使用飼用抗生素后，動物病增加。這伴隨增加使用治療性抗生素，導致抗生素使用總體增加以及肉畜生產(chǎn)成本增加。參見Smith，F(xiàn)eedstuffs 71(13)1，1999。1998年12月，歐洲部長級會議(EU Council ofMinisters)決定暫停使用正式批準為飼料生長促進劑非處方藥中的六種抗微生物藥(Official Journal of the European Communities29.12.98，Council Regulation No.2821/98 concerning Directive70/524)。由于人們擔心肉制品中的殘留物，兩種基于喹喔啉的添加劑也于1999年8月被禁止使用。這些做法的結(jié)果是增加了包括以下正式消除病癥的流行肉用仔雞壞死性腸炎；斷奶仔豬中由于產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的腸炎；豬痢疾和螺旋體性腹瀉；和大腸桿菌相關(guān)腹瀉。參見Miller，United States Animal Health Association，1999Proceedings“食品動物生產(chǎn)中的抗生素使用和抗性—歐洲前景(Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-EuropeanPerspective)”。
每年有30,000人由于在醫(yī)院內(nèi)感染抗性病原體而死亡，但是由于經(jīng)食物傳播的病原體引起的死亡卻少得多。由經(jīng)食物傳播的病原體引起的死亡中沒有一例與抗生素抗性有關(guān)(參見Smith，參見上文)。因而，并不清楚肉品生產(chǎn)業(yè)使用抗生素是否對人類醫(yī)院內(nèi)感染抗藥性病原體的問題產(chǎn)生影響。另一擔心是缺乏治療抗性病原體感染的新型抗生素。參見Henry，C.M.，Chemical and Engineering News，2000年3月6日，第41-58頁。這可能意味著，當發(fā)生重大抗生素抗性病原體時，可能沒有有效治療所述感染的新型抗生素。開發(fā)抗生素的困難、市場大小以及管理問題似乎都使大的制藥公司不將其R&D集中到抗生素研制、尤其是用于動物的抗生素研制。對于注冊動物用藥物的新提出的規(guī)定如此之難，使得會停止研制動物用藥物。參見Smith，參見上文。然而，已有數(shù)個小公司參與新型抗生素的研制(Henry，參見上文)。
在某些動物群體中，傳染病已經(jīng)大流行。例如，禽球蟲病就是一種只能處理，而沒有得到真正控制的疾病。事實上所有禽群都被感染，并且通常在飼料中輪換使用抗球蟲病化學藥品，以控制損失，限制抗性株的發(fā)生。球蟲病使家禽生產(chǎn)者每年因損失和花在抗生素藥物(例如沙利霉素)上的藥品費用達$3.5億。參見Suszkiw，USDA AgriculturalResearch Service News，1997年10月28日。截止1999年，據(jù)估計美國每年花費約$1.1億用在抗球蟲藥上。參見Frost和Sullivan，U.S.Pharmaceutical Products for Food Animals，Report 5245-54，1995。
顯然需要發(fā)現(xiàn)新的更為有效的方法，以防治采用集約農(nóng)業(yè)技術(shù)培育的動物的消化道感染。這種需求基于獲得更高生產(chǎn)效率，以便跟上快速膨脹的世界人口的需要。腸傳染病防治的改進保證較快的生長率并提高飼料轉(zhuǎn)化率。家畜生產(chǎn)中也需要代替抗生素的替代物，以解決人們擔心人類病原體中可能發(fā)生抗生素抗性的問題。
當采用以不同于所有抗生素的方式操作的基于酶的療法時，沒有刺激抗性致病微生物(它們給人類健康帶來問題)進化的危險。由于酶是蛋白質(zhì)，因此不可能在肉制品中摻入危險性化學殘留物，用某些抗生素和抗球蟲病化學藥品會發(fā)生這種情況。參見American Feed ContolOfficials Inc.，Official Publication，1999，“藥物和飼料添加劑(Drugs andFeed Additives)，Section 30.0 Enzymes，”第206-217頁，ISBN 1-878341-10-3。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供降低消化道感染影響的酶療法。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過干擾病原體與消化道細胞的結(jié)合降低消化道感染影響的機制。
就感染引起感染或壞死性腸炎的病原體的動物而論，本發(fā)明的又一個目的是提供提高增重和飼料轉(zhuǎn)化率的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種適合于口服的劑型，所述劑型有效改善被微生物病原體感染或有被微生物病原體感染危險的受治療者的病癥。
在達到這些目的和其它目的的同時，按照本發(fā)明的一個方面，還提供一種包含以下組分的組合物(i)一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶，和(ii)一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染藥。在一個實施方案中，所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物中包括的酶是鞘磷脂酶或磷脂酶、尤其是C型或D型磷脂酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶、腦苷脂酶和糖酶。在另一個實施方案中，由蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌株、優(yōu)選ATCC 7004或ATCC 6464制備所述酶。或者，通過在巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)中表達編碼所述酶的重組DNA獲得所述酶。在另一個實施方案中，所述酶包含在明膠膠囊殼內(nèi)，并且在所述組合物中用量為200IU/Kg-4000IU/Kg飼料。
按照本發(fā)明的另一方面，提供具有上述組分(i)和(ii)的組合物，其中所述生理上可接受的載體是在其中摻入所述酶的飼料。因此，所述組合物可以是不含除所述酶以外的其它抗感染藥的動物飼料。本發(fā)明的動物飼料組合物還包含谷類物料(例如玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥)、蛋白質(zhì)源(例如菜豆或豌豆)和維生素、氨基酸和礦物質(zhì)。
按照本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供如上所述的為固體或液體劑型的組合物。
還提供治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者口服有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶。其中所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶。另外，所述方法不包括給予除所述酶本身以外的抗感染藥。所述感染可以由原生動物(例如艾美耳球蟲屬(Eimeria)和隱孢子蟲屬(Cryptosporidium))、細菌(例如梭菌屬(Clostridium))、真菌或酵母病原體引起。
甚至還提供包含以下組分的組合物(i)一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶和(ii)一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染藥。
還提供治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者口服有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，其中所述方法不包括與所述酶一起給予抗微生物有效量的另外的抗感染藥。
根據(jù)以下詳細描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。雖然指出了優(yōu)選實施方案，但所給出的詳細描述和具體實施例僅用于說明，因為根據(jù)該詳細描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此外，所述實施例證明了本發(fā)明的原理，但不能期望具體描述本發(fā)明對于顯然對本領(lǐng)域技術(shù)人員有用的所有的感染實施例的應用。
附圖簡述

圖1顯示由巨大芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的重組PI-PLC酶的抗隱孢子蟲活性。
發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類特定的酶在口服給藥后顯示出顯著的抗生素活性，所述酶的特征在于切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的能力，所述酶例如在治療消化道感染時有效。所述酶類包括但不限于鞘磷脂酶和C型磷脂酶和D型磷脂酶以及有類似切割特異性的酶。因此，該類酶的示例是切割和釋放通過連接于磷脂酰肌醇的鍵而錨定膜的糖蛋白或糖類的酶。因此，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(E.C.3.1.4.10)(也簡稱為PI-PLC或1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶)是該類中的一個成員。另一個實例是糖基-磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D或GPI-PLD。Low和Prasad，Proc.Natl.Acad.Sci.85980-984，1988。
已經(jīng)描述了來源于真核生物的GPI-PLD和PI-PLC酶。參見Low，“通過特異性磷脂酶降解糖基-磷脂酰肌醇錨著點(Degradation ofglycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases)”，第二章，第35-63頁，載于MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OFMEMBRANE PROTEINSGLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS，A.J.Turner(編輯)，Ellis Horwood，New York，1990；Low和Prasad，Proc.Natl.Acad Sci.85980-984，1988；Essen等，Nature 380595-602，1996和Essen等，Biochemistry 362753-2762，1997。已經(jīng)描述了來源于原核生物的PI-PLC，包括由細菌胞外產(chǎn)生的PI-PLC。在PI-PLC已知的細菌源中有蠟樣芽孢桿菌(Stein和Logan，J.Bacteriol.85369-381，1963；Stein和Logan，J.Bacteriol.9069-81，1965；Ikezawa等，Biochimica et Biophysica Acta 450154-164，1976；Griffith等，Methods in Enzymology 197493-502，1991；Volwerk等，J.Cell.Biochem.39315-325，1989；和Kuppe等，J.Bacteriol.1716077-6083，1989)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Ikezawa和Taguchi，Methods inEnzymology 71731-741，1981；日本專利文件JP 55034039)、金黃色葡萄球菌(Low和Finean，Biochem J.162235-240，1977)和諾氏梭菌(Clostridium novyi)(Taguchi和Ikezawa，Arch.Biochem.Biophys.186196-201，1978)。
已經(jīng)基于熒光底物設(shè)計出PI-PLC酶的改進酶測定技術(shù)。參見Hendrickson等，Biochemistry.3112169-12172，1992；Hendrickson，Anal.Biochem.2191-8，1994；Hendrickson等，Bioorg.Med. Chem.Letters.1619-622，1991。
雖然不明確歸于任何理論，但本發(fā)明強調(diào)PI-PLC酶有切割細胞表面蛋白的磷脂酰肌醇糖脂錨著點和其它糖基磷脂酰肌醇的能力。參見Low，參見上文；Low和Saltiel，Science 239268-275，1988。例如，幾種原生動物寄生蟲的變異型表面糖蛋白和其它表面蛋白以及糖類被糖基-磷脂酰肌醇磷脂(GPI錨著點)錨定，并且對PI-PLC消化和釋放敏感。說明性的物種屬于血吸蟲屬(Schistosoma)、弓形體屬(Toxoplasma)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、錐蟲屬(Trypanosoma)和利什曼原蟲屬(Leishmania)(Low，參見上文)以及艾美耳球蟲屬(Eimeria)、巴貝蟲屬(Babesia)、泰累爾梨蟲屬(Theileria)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)、細滴蟲屬(Leptomonas)和內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)。參見McConville和Ferguson，Biochemical J.294305-324，1993；Pearce和Sher，J.Immunol.142979-984，1989；Sauma等，Mol.Med.Biochem.Parasitol.4673-80，1991；Hawn和Strand，Mol.Med.Biochem.Parasitol.5973-82，1993。
看來細胞表面組分的這種錨定機制對于范圍從酵母到哺乳動物的真核細胞而言是普遍存在的。被認為是非常原始的真核生物—蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)體內(nèi)存在GPI錨著點，表明這種錨著點很早在真核生物中進化。與這一了解相一致的是在古細菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型甘油磷脂GlcNal-6-肌醇-P-二烷基甘油(Nishihara等，J.Biol.Chem.26712432-12435)，它是已進化的更為復雜的真核生物GPI錨著點結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。在原生動物中，使用GPI錨定系統(tǒng)比在高等真核生物中更為大量，有證據(jù)說明GPI-錨定結(jié)構(gòu)對于寄生物在昆蟲和哺乳動物宿主體內(nèi)存活很重要(McConville和Ferguson，參見上文)。例如，變異型表面糖蛋白的頻繁脫落可能是避免免疫系統(tǒng)攻擊的機制。
原生動物柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)含有與布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的糖蛋白/糖脂類似的磷脂酰肌醇錨定結(jié)構(gòu)。認為這些結(jié)構(gòu)對于膜附著以及后續(xù)感染很重要。參見Gurnett等，Mol.Med.Biochem.Parasitol.41177-186，1990。艾美耳球蟲屬結(jié)構(gòu)被錐蟲脂酶和蘇云金芽孢桿菌PI-PLC切割(Gurnett，參見上文)。用PI-PLC體內(nèi)治療寄生蟲，如果證明切實可行的話，可能有助于宿主免疫系統(tǒng)并且干擾進入消化道的病原體的附著和感染。艾美耳球蟲分布廣，并且是養(yǎng)禽業(yè)費用大的問題。另一種原生動物寄生蟲微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)分布廣，并且在人類和許多動物中引起急性腹瀉性疾病?；贒NA序列，預測子孢子蛋白GP15/45/60為GPI聯(lián)蛋白，并且與該子孢子蛋白反應的單克隆抗體抑制感染(Strong，W.B.等，Infection and Immunity 684117-4134，2000；Cevallos，A.M.等，Infection and Immunity 684108-4116，2000)。因此，微小隱孢子蟲是另一種可用PI-PLC潛在治療的病原體。
原核細菌不含被磷脂酰肌醇錨定的表面糖蛋白和糖類(McConville和Ferguson，參見上文)，但是PI-PLC仍可能通過干擾附著過程來降低細菌感染。致病大腸桿菌和許多其它熟知的致病腸桿菌科(Enterobacteriaceae)表達細菌粘附素FimH，一種存在于菌毛遠端的29kD甘露糖結(jié)合凝集素。Abraham等，Nature 336682-684，1988。已經(jīng)顯示這種粘附素與肥大細胞的CD48，即GPI錨著分子結(jié)合。參見Malaviya等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 968110-8115，1999。用PI-PLC體外消化，降低了突變型GPI錨著白喉毒素(來自白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria))受體與鼠類NIH3T3細胞的結(jié)合。參見Lanzrein等，EMBO J.15725-734，1996。另外，敗毒梭菌(Clostridiumsepticum)α毒素和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)氣單胞菌溶素均借助于C末端GPI錨著點附著于細胞表面，并且可以通過用PI-PLC處理而從細胞表面去除。參見Gordon等，J.Biol.Chem.27427274-27280，1999。
PI-PLC降低細菌感染影響的機制涉及從宿主肥大細胞釋放CD48結(jié)合部位。此外，F(xiàn)imH與肥大細胞結(jié)合觸發(fā)炎癥反應。因而按照本發(fā)明，由于炎癥反應涉及腫瘤壞死因子α的釋放，因此減少結(jié)合部位也應該減少可能極度損害腸健康本身的炎癥(Malaviya，參見上文)。因此，通過這種減少炎癥和構(gòu)成腫瘤壞死因子分泌的基礎(chǔ)的機制，按照本發(fā)明進行磷脂酶處理，應該緩解特征性病癥(例如過敏性腸綜合征、結(jié)腸炎和局限性回腸炎)的癥狀。參見van Deventer，S.J.，Ann.Rheum.Dis.58(1)I114-I120(1999年11月)。
針對病毒性感染，本發(fā)明也應該有效，由于它破壞病毒粒子和該病毒將體內(nèi)感染的細胞之間的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本文中描述的口服給藥是有效的，有趣的是，用磷脂酶C預處理流感病毒，引起約50％病毒磷脂的釋放，導致顯著減少雞胚內(nèi)的感染性。參見Mizutani等，Nature 204781-782，1964。相反，用從產(chǎn)氣莢膜梭菌中分離的磷脂酶C預處理培養(yǎng)的雞胚成纖維細胞，顯著抑制西門利啟森林甲病毒(Semliki Forest Virus)對細胞的后續(xù)感染。參見Friedman和Pastan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 591371-1378，1968。雖然當時本領(lǐng)域并沒有認識到這些現(xiàn)象中的治療意義，但事后認識到，它們與認為構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的一種機制相一致，即病原體-表面配體和/或其相關(guān)的細胞膜受體的切割，中斷了感染所必需的相互作用。
本發(fā)明在預防病毒性感染方面可能有效的另一種方式是消除了病毒GPI錨定蛋白與易感細胞的結(jié)合。對PI-PLC消化敏感的病毒GPI錨定蛋白的一個實例是登革病毒(Dengue Virus)NS1(非結(jié)構(gòu)蛋白1)。參見Jacobs等，F(xiàn)ASEB J141603-1610，2000。有多個作為病毒結(jié)合部位的宿主細胞GPI錨定蛋白的實例。這些實例包括結(jié)合GPI錨定CD55(衰變加速因子，DAF)的人艾可病毒(Echovirus)6、7、12和21以及腸道病毒(Enterovirus)70。參見Clarkson等，J.Virology 695497-5501，1995；Bergelson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916245-6248，1994；和Kamauchow等，J.Virology 705143-5152，1996。犬細小病毒(CanineParvovirus)(CPV)感染可以通過用PI-PLC預處理貓細胞來體外阻斷。參見Barbis和Parrish，Brazilian J.Med.Biol.Res.27401-407，1994。
推定對起始感染重要的某些細胞表面受體通過非GPI錨著點的機制附著于膜上。這些包括以下結(jié)構(gòu)例如膽固醇酯(Rostand和Esko，J.Biol.Chem.26824053-24059，1993)、非磷酸化鞘糖脂(Karlsson，Ann Rev.Biochem 58309-350，1989)和諸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸的其它磷脂。參見Sylvester，Infect.Immun.644060-4066，1996。
因此，由于上述原因，在按照本發(fā)明口服給藥后，用對從細胞表面釋放這些結(jié)構(gòu)有活性的合適酯酶、腦苷脂酶、糖酶和磷脂酶靶向這樣的結(jié)構(gòu)，應該對治療消化道感染具有有益的效應。
鑒于真核生物中的磷脂酰肌醇連接的表面蛋白的普遍性，需要給予酶來急性或預防性切下這種細胞表面蛋白和/或糖類的錨定鍵的本發(fā)明的治療方法，，將發(fā)現(xiàn)可廣泛應用于控制消化道的原生動物、細菌、真菌和病毒感染。為此，本發(fā)明的一個關(guān)鍵方面是證實可以口服給予作為抗感染藥的一種酶，所述酶不僅在切除細胞表面組分中有活性，而且在體內(nèi)也有效。值得注意的是，自1960年起一直就可以利用合適的代表性酶PI-PLC，但是迄今為止本方法還沒有被提出過。
本發(fā)明的另一方面是應用如上所述的酶作為動物飼料制劑中的有效抗感染藥，所述酶治療消耗所述飼料的動物的消化道感染或降低所述消化道感染的危險。含有內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶的飼料制劑是已知的，并且有些報道已經(jīng)提出甘露聚糖酶的抗真菌活性。參見WO00/21381(PCT/EP99/07835)和Kudo等，Experentia 48227-281，1992。雖然已經(jīng)廣泛地討論了在不含抗生素的飼料中酶應用的前景，但是在這些情況下，都是將甘露聚糖酶與已知的抗生素混合。Adams，F(xiàn)eed Mix(2000年特刊)，第16-18頁。
因此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及含有特征為上述切割活性的酶的組合物，包括飼料組合物，所述酶不是甘露聚糖酶，或更準確地說不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶，與例如針對甘露聚糖的酶的區(qū)別在于具有不同的切割特異性，如在ENZYME NOMENCLATURE 1992(Academic Press)(參見條目3.2.1.77、3.2.1.78、3.2.1.101、3.2.1.106、3.2.1.130和3.2.1.137)中所述。此外，本發(fā)明考慮了含有這種酶(包括甘露聚糖酶)、但不含其它抗感染藥的組合物。
因此，按照本發(fā)明，可以用得自蠟樣芽孢桿菌并將PI-PLC含量標準化的胞外酶制劑，在感染存在時在增重和飼料轉(zhuǎn)化率方面產(chǎn)生非常顯著的改善。這種結(jié)果是出乎人們所料的，因為蠟樣芽孢桿菌是通常引起食物傳染性胃腸炎和蠟樣芽孢桿菌眼內(nèi)炎的機會致病菌。
早期研究報道將炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)胞外酶或蠟樣芽孢桿菌胞外酶注射到兔子體內(nèi)，引起磷酸酶血癥，甚至死亡。例如，參見Stein和Logan，J.Bacteriol.85369-381，1963。因此，令人驚奇的是，按照本發(fā)明，對于由細菌性感染引起的疾病來說，得自引起胃腸炎的病原體的胞外酶會具有治療效應。
蠟樣芽孢桿菌合成各種各樣的由磷脂酶C和鞘磷脂酶組成的胞外膜活性酶和溶細胞毒素，包括PI-PLC和蠟溶素(Cereolysin)AB。參見Gilmore，J.Bacteriol.171744-753，1989。在上述酶制劑中，由蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C[E.C.3.1.4.10]被認為是一種有效成分。本發(fā)明的酶療法有效地作為抑球蟲劑和抗生素起作用。因此，本發(fā)明的療法特別是在禁止目前使用的物質(zhì)時是一種治療消化道感染的有效的商業(yè)上有前途的方法。
如果不包衣，酶能夠由于胃內(nèi)的胃液而不可逆失活。美國專利第4,079,125號描述了改進的可供缺乏酶的哺乳動物攝入的包腸衣的含酶組合物。令人驚奇的是，將沒有包衣的PI-PLC加入到動物飼料中導致有效治療病原體性感染。
按照本發(fā)明的酶組合物最好配制為干燥的固體或液體口服組合物。這種組合物一般會包括穩(wěn)定劑，例如緩沖劑、糖類和/或甘醇。按照本發(fā)明，適合于在片劑或膠囊中摻入的干燥的貯存穩(wěn)定的酶制劑如下制備例如可以通過凍干法，在含有惰性或糖載體的流化床干燥器中進行噴霧干燥，或利用結(jié)合成玻璃穩(wěn)定劑的蒸發(fā)技術(shù)。參見Franks等，Biopharm.438-55，1991。另一種方法包括鹽沉淀(例如硫酸銨沉淀)或溶劑沉淀(如用丙酮)，形成粉末，隨后干燥并與載體混合。
某些糖類、特別是單糖、二糖和低聚寡糖是重要的成玻璃糖類。用作載體的示例性糖其中有木糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和麥芽三糖，如Franks所述，參見上文?；谂c所述酶的相容性、低吸濕傾向和有利的玻璃化轉(zhuǎn)變曲線，選擇糖載體。穩(wěn)定劑海藻糖特別適用于生產(chǎn)環(huán)境溫度穩(wěn)定的生物制品。參見美國專利第4,891,319號；Roser，Biopharm.4(8)47-53，1991；Colaco等，Bio/Technology 101007-1011，1992；Aldridge，Genetic Engineering News，1995年3月15日，第10-11頁。
本發(fā)明的酶可以配制為液體，例如作為含有降低水活度并且穩(wěn)定所述蛋白的山梨糖醇或甘油的糖漿。這種溶液通常在制藥應用之前進行過濾除菌。
如上所述，一方面，本發(fā)明涉及作為飼料或食料組分的酶的傳遞。飼料主要由谷類物料、蛋白質(zhì)源、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)構(gòu)成。所述谷類物料通常包括玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。所述蛋白質(zhì)源可以是例如菜豆或豌豆。示例性礦物質(zhì)、氨基酸和維生素包括B12、A、泛酸、煙酸、核黃素、K、DL-甲硫氨酸、L-賴氨酸、氯化膽堿、葉酸、磷酸二鈣、磺酸鎂、硫酸鉀、碳酸鈣、氯化鈉、亞硒酸鈉、一氧化錳、碘酸鈣、一氧化銅、氧化鋅和D-活化的動物甾醇。
供飼料中使用，可以用鹽水(例如，NaCl，15-18％ w/w)或降低濃縮產(chǎn)品中水活度并防止微生物生長的糖漿制備液體酶制劑。諸如苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯、山梨酸鈉或山梨酸鉀、以及棕櫚酸抗壞血酸酯的其它飼料用防腐劑都是經(jīng)批準的化學防腐劑的實例，所述防腐劑也可以用來防止制品中由于微生物生長引起的潛在變質(zhì)。參見Association of American Feed Control Officials，Inc.，Official Publication2000，第18部分，“化學防腐劑”，第215-217頁，ISBN 1-878341-11-1。這些防腐劑可以用自動噴霧技術(shù)通過制粒后大量稀釋而應用于飼料。參見Fodge等，F(xiàn)eedstuffs，1997年9月29日。如果相容的話，這種液體制劑可以含有穩(wěn)定性糖類，例如山梨糖醇或甘油。為提高轉(zhuǎn)化率，可以包括作為飼料所需組分的材料，例如其它酶或熱不穩(wěn)定的維生素。
在飼料以非顆粒的粉料形式(即不經(jīng)熱處理)使用的情況下，本發(fā)明的酶可以作為干濃縮物提供，以供在飼料混合器中添加。這種干酶濃縮物如下制備首先采用10Kd NMWC或其它合適的超濾器濃縮液體酶制劑，以達到高百分率的酶含量，然后與非常干的載體例如粗玉米粉、粗大豆粉或甚至批準用于飼料的惰性物質(zhì)或不溶性鹽摻混。參見Official Publication，American Feed Control Officials，參見上文，第582部分，“動物飼料中一般認為安全的物質(zhì)”。
有多種技術(shù)可用來產(chǎn)生足以耐受某些飼料碾磨機制粒過程、同時在較低溫度下保持足夠的活性以在消化道內(nèi)起作用的穩(wěn)定的酶。眾所周知修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，主要通過改變編碼DNA序列，或者其次，通過化學修飾，可以使酶更穩(wěn)定，以抵抗失活。在該方面的一個說明是應用酶晶體的化學交聯(lián)。參見Collins等，Organic Process Research andDevelopment2(6)400-406，1998。增加本發(fā)明酶穩(wěn)定性的另一種方法需要通過誘變編碼目的酶的基因來改變氨基酸，或獲得可供改組的基因或基因的一部分。參見Crameri等，Nature 391288-291，1998；Arnold，Nature Biotechnol.16617-618，1998b；Zhao等，Nature Biotechnol.16258-235，1998；Zhao和Arnold，Protein Eng.1247-53，1999。突變和選擇以使具有所需特性的酶“定向進化”也是切實可行的。例如，參見Giver等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 9512809-12813，1998；Liao等，Proc.Nat’l. Acad. Sci.USA 83576-580，1986；Cherry等，NatureBiotechnol.17379-384，1999。
某些蛋白質(zhì)的修飾(包括糖基化、PEG化(PEGylation)和琥珀?；?也可以增強穩(wěn)定性并改變最適pH，這些是可以使本發(fā)明中所用酶最優(yōu)化的特征。因此，已知的方法可以在這方面用來制備經(jīng)修飾的酶，以供按照實施例進行測試，以估計本發(fā)明療法的適應性。
用于生產(chǎn)PI-PLC的一種有效方法是將蠟樣芽孢桿菌基因克隆到巨大芽孢桿菌中。表達系統(tǒng)(Rygus和Hillen，Appl.Microbiol.Bacteriol.35594-599，1991)利用得自巨大芽孢桿菌木糖調(diào)節(jié)子的元件(Rygus等，Arch.Microbiol.155535-542，1991)，并可在市場上從BIO101 Corp.(Vista，California)獲得。在用四環(huán)素抗性穩(wěn)定化質(zhì)粒中，在PI-PLC基因前導編碼序列和巨大芽孢桿菌xylA基因的前三個氨基酸之間產(chǎn)生融合體，所述融合體受木糖效應阻抑蛋白調(diào)節(jié)。具有增強表達的該類型的菌株為生產(chǎn)按照本發(fā)明摻入到動物飼料中的商業(yè)上有用量的PI-PLC提供了一種切實可行的方法。
某些蠟樣芽孢桿菌分離株產(chǎn)生諸如衣霉素的抗生素。參見Kamogashira等，Agric.Biol.Chem.52859-861，1988。蠟樣芽孢桿菌的另一分離株(ATCC 53522)在美國專利第4,877,738號和第5,049,379號中被描述為預防植物猝倒病和根腐病的生物防治藥。認為這種作用是由于以下兩種抗生素的作用引起的名為“Zwittermicin”，一種396道爾頓線性氨基多元醇；和“抗生素B”，一種氨基糖苷。在下文詳述的實施例中，通過排除酶制劑中可能的低分子量抗生素，消除涉及這兩種抗生素的可能性。
具體地說，借助于一種10Kd分子量截止膜，濃縮無細胞發(fā)酵肉湯。含有大于10Kd的蛋白質(zhì)的濃縮物用于進一步加工。諸如Handelsman描述的小分子量抗生素(參見上文)會通過該濾膜。而且，利用硫酸銨沉淀法沉淀溶液中的高分子量蛋白質(zhì)，留下低分子量物質(zhì)。將硫酸銨沉淀物重新溶解后，所得酶溶液對緩沖液透析，再一次處理以去除低分子量抗生素。最后，將所述蛋白質(zhì)再用硫酸銨第二次沉淀，以去除溶液中任何余下的低分子量化合物。
這四種處理法的聯(lián)合應用非常不利于下述的可能性所觀察到的抗生素效應是由于ATCC 6464或ATCC 7004產(chǎn)生的低分子量抗生素引起的。也用大腸桿菌試驗菌株，測試發(fā)酵肉湯中存在的抗生素，但未檢測到抗生素的活性。
參照以下說明性實施例，下文進一步描述了本發(fā)明。實施例1蠟樣芽孢桿菌ATCC 6464和ATCC 7004冷凍儲備培養(yǎng)物的制備打開得自ATCC的裝有凍干細胞的管形瓶，將凍干細胞接種到由10g/L Amberferm 4015(Red Star)、5g/L Amberex 695(Red Star)和5g/L氯化鈉、pH 7.0構(gòu)成的種子培養(yǎng)基中，于30℃生長。將原始培養(yǎng)物在LB肉湯瓊脂板上劃線接種，然后將所得單菌落接種到裝有20mL種子培養(yǎng)基的250mL帶擋板的搖瓶(Bellco)中，于30℃振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)物密度達到OD600讀數(shù)為1.5時，加入無菌甘油至約10％ v/v，將裝有1.8mL培養(yǎng)物的管形瓶于-80℃冷凍。實施例2培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌ATCC 6464和ATCC 7004分離株用以生產(chǎn)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C兩個Biostat C發(fā)酵罐(每個30升)，分批裝入自來水中的以下物質(zhì)組成的培養(yǎng)基25g/L2號營養(yǎng)肉湯(Oxoid)，10g/L胰蛋白胨(Difco)，10g/L酵母提取物(Difco)和0.1mL/L Mazu DP10P Mod11消泡劑(BASF)。原始批料體積為9.5L，肉湯于121℃滅菌40分鐘。滅菌后，將初始pH用氨氣調(diào)至7.0。
在含500mL相同培養(yǎng)基的4升帶擋板的搖瓶中，制備種子培養(yǎng)物用于接種，所述搖瓶帶有抽氣器連接件(Bellco)以及與連接件連接的硅氧烷管。將搖瓶在高壓滅菌器中于121℃滅菌50分鐘，然后用由ATTC寄出的樣品(shipment)制備的1.8mL冷凍儲用培養(yǎng)物(實施例1)接種前。將種子搖瓶培養(yǎng)物在可控環(huán)境震蕩培養(yǎng)器(NBS G-25型)中以200RPM于30℃振搖培養(yǎng)5.5小時。接種前，ATCC 7004培養(yǎng)物的OD600為1.53，pH為6.58。ATCC 6464培養(yǎng)物的OD600為1.28，pH為6.79。
將500mL種子培養(yǎng)物接種到30-L發(fā)酵罐中并在以下條件下進行操作溫度30℃，混合RPM 600，氣流10升/分鐘，壓力0.5巴。原始培養(yǎng)物的OD600為0.81。在6小時時，終止發(fā)酵，ATCC 7004的終OD600為22.1，ATCC 6464的終OD600為24.2。在不控制pH下進行發(fā)酵，ATCC 7004的終pH為8.17，ATCC 6464的終pH為8.13。進一步加工之前，從發(fā)酵罐中取出肉湯，將其冷卻至8℃。
實際上用與所述兩種ATCC蠟樣芽孢桿菌分離株相同的方法，所述發(fā)酵罐再進行第二次發(fā)酵。在這種情況下，使用第6小時的種子培養(yǎng)物，OD600為2.86(ATCC7004)，OD600為1.98(ATCC 6464)，pH為6.69(ATCC 7004)，pH為6.65(ATCC 6464)。主發(fā)酵進行6.5小時，終OD600為35.9(ATCC 7004)，終OD600為33.6(ATCC 6464)。冷藏時的終pH為8.38(ATCC 7004)，終pH為8.47(ATCC 6464)。實施例3通過過濾去除細胞以及PI-PLC酶的濃縮采用兩個首尾相連的A/G Technology(UFP-500-K-6A)3mm中空纖維500,000分子量截止(500Kd NMWC)濾器，從4個發(fā)酵罐批料中每個批料取出并洗滌細胞。用蠕動泵以約2升/分鐘，通過濾膜泵出冷卻的肉湯，再循環(huán)回貯存器。將含所述酶的透過液收集到冰上冷卻的貯存器中。將含細胞的肉湯原始體積約9升濃縮至約2升，此時用10mM Tris-HCl，pH8.5開始滲濾。在收集總體積約14升透過液后，終止細胞洗滌。
用兩個首尾相連的A/G Technology(UFP-10-C-4XTCA)0.5mm中空纖維10,000分子量截止濾器(10Kd)，濃縮500Kd透過液(每個發(fā)酵罐約14升)。使用濃縮物再循環(huán)的相同泵送方法，只是棄去透過液。將得自每個發(fā)酵罐體積約500mL的終濃縮物用于下一個加工步驟。實施例4PI-PLC酶的進一步純化和濃縮將得自每種蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵的10Kd超濾濃縮物(實施例3)用硫酸銨調(diào)至80％飽和度，在冰上混合60分鐘。將溶液在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子中以6000RPM離心15分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于最小體積的10mM Tris-HCl、0.2mM EDTA(pH 7.5)中，然后對同樣緩沖液冷透析。
采用染料結(jié)合測定(BioRad)測量每種濃縮物中的蛋白質(zhì)，采用基于HPLC的檢測方法和熒光底物(Molecular Probes，Inc.，P-3764，1-芘丁基肌醇-1-磷酸，鋰鹽)，測定PI-PLC的水平(Hendrickson等，Bioorg.Med.Chem.Letters 1619-622，1991)。下表1總結(jié)了測定數(shù)據(jù)，并根據(jù)對4種制劑中的每種制劑所得的純度，預測了大致純度和總酶量。酶制劑于-20℃凍藏待進一步加工。
表1.PI-PLC粗酶制劑的分析匯總
1U＝單位＝1微摩爾/分種。
2基于假定100％純蛋白質(zhì)的比活為60U/mg(Hendrickson，參見上文)。實施例5酶制劑應用于動物飼料之前的合并和濃縮合并所述酶制劑1、2、3和4，總體積為675mL。緩慢加入硫酸銨(492g)，然后將溶液在冰上混合幾分鐘。將溶液離心，收集沉淀。將沉淀部分溶于最小量的20mM磷酸緩沖液(pH7.0)中。
所得溶液為70.9mL，密度1.057克/cc。測定的蛋白質(zhì)濃度約為25.5mg/mL。測定的PI-PLC活性約為1.13U/mg，PI-PLC的估計純度為1.88％。將全部溶液于-20℃凍藏，解凍后用于均勻處理200磅雞飼料。實施例6蠟樣芽孢桿菌PI-PLC基因的克隆和在巨大芽孢桿菌中表達已經(jīng)對編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的基因進行了測序。參見Kuppe等，J.Bacteriol.1716077-6083，1989。采用PCR技術(shù)，從蠟樣芽孢桿菌(ATCC 6464)染色體DNA中克隆PI-PLC基因。使用巨大芽孢桿菌表達載體pMEGA(BIO 101，Vista，CA)。設(shè)計兩種引物，即5’-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3’(引物1)和5’-CGGGATCCATATTGTTGGTTATTGG-3’(引物2)，其中引物-1中有一個SpeI位點，引物-2中有一個BamHI位點。
將經(jīng)PCR擴增的PI-PLC基因連接到pMEGA的SpeI-BamHI位點中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCG682。在所述表達載體中的SpeI位點上，將PI-PLC蛋白與xylA基因產(chǎn)物的前三個氨基酸融合。PI-PLC基因的表達在xylA啟動子的調(diào)節(jié)下進行。用搖瓶發(fā)酵評價巨大芽孢桿菌中磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的產(chǎn)量。用0.2mL種子培養(yǎng)物接種含有10μg/ml四環(huán)素的LB肉湯(20mL)，于37℃在250rpm的搖床上培養(yǎng)。在OD600約為0.5時，加入5g/L D-(+)-木糖，以誘導xylA啟動子。3小時后，通過離心收獲上清液。根據(jù)熒光底物方法(Hendrickson等，Biochemistry 3112169-12172，1992；Hendrickson，Anal.Biochem.2191-8，1994)，使用1-芘丁基肌醇-1-磷酸底物(Molecular Probes，Eugene，OR)，并通過HPLC檢測，測定磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的活性。
表2.PI-PLC表達的測量
這些數(shù)據(jù)說明，大多數(shù)PI-PLC位于胞外，并且僅在加入D(+)木糖后才表達(表2)。估計該重組菌株的生產(chǎn)率是(mg/L/OD)普通野生型菌株(如實施例2中培養(yǎng)的菌株)的生產(chǎn)力的至少15倍。實施例7用于PI-PLC生產(chǎn)的巨大芽孢桿菌的發(fā)酵用實施例6中描述的巨大芽孢桿菌/pCG682通過發(fā)酵生產(chǎn)PI-PLC。用于種子和發(fā)酵階段的培養(yǎng)基(PM)含有20g/L Amberferm 4015(Universal Flavors Bionutrients，Indianapolis，IN)、10g/L Amberex 695酵母提取物(Universal Flavors Bionutrients，Indianapolis，IN)、10g/L NZCase Plus(Quest International，Hoffman Estates，IL)、2.0g/L K2HPO4、0.1g/L MgSO4·7H2O和2.0g/L葡萄糖(最初(initially))以及12.5mg/L四環(huán)素。將pH調(diào)至7.5。
通過用冷凍種子管形瓶接種，以250RPM于30℃振搖，起始種子階段(含500mL的2.8-L帶擋板的搖瓶)。通過將在LB瓊脂平板上生長的單菌落加到含20mL PM的250mL搖瓶中，制備種子管形瓶。于30℃生長至約1.0 OD600后，加入5mL 50％無菌甘油，混合，將溶液分裝到2mL無菌塑料管形瓶中，于-60℃冷凍。
震蕩培養(yǎng)9小時后，在生長至約1.2-1.8 OD600后，使用500mL種子瓶。用兩個種子瓶接種裝有50-L經(jīng)蒸汽滅菌的相同培養(yǎng)基的60-L發(fā)酵罐。將四環(huán)素作為在40％乙醇中的1％溶液過濾除菌(0.2微米濾膜)，并且在除菌并冷卻至30℃后加入。在發(fā)酵罐中，也在原始批料中添加0.1mL/L Mazu DF10PMOD11消泡劑(BASF，Gurnee，IL)，并且在發(fā)酵期間按需添加所述消泡劑以控制泡沫。第一發(fā)酵罐種子階段的操作條件如下壓力0.5-2.5psig；溫度30℃±0.5℃；攪拌200-450RPM；空氣噴射25-50SLPM；溶解氧≥25％。用21.25％ H3PO4或5N NaOH將pH控制在6.9-8.1。當O.D600達到8-10時，用所述內(nèi)容物接種裝有425L相同培養(yǎng)基的600-L發(fā)酵罐。
600-L生產(chǎn)發(fā)酵罐的操作條件如下壓力0.5-2.5psig；溫度30℃±0.5℃；攪拌100-300RPM；空氣噴射250-500SLPM；溶解氧≥25％。用21.25％ H3PO4或5N NaOH將pH控制在6.9-8.1。當在5小時以及O.D600約為17耗盡原始葡萄糖時，開始送入木糖(經(jīng)高壓滅菌器于121℃預滅菌20分鐘，由10 kgD-(+)-木糖和10升水組成)。D-木糖得自Varsal Instruments，New Jersey。所述送料最初以25mL/分鐘開始，保持1.5小時，然后增加至43mL/分鐘。第二速率保持到已經(jīng)消耗所有加入的22.5升木糖。通過將噴射空氣以50SLPM增加到高達500SLPM，以保持所述溶解氧。一旦氣流為500SLPM時，則增加RPM。在20小時終止發(fā)酵。到17小時，累積7440U/L(按照實施例4定義的單位)。
采用Pall Filtron C10 Skid和4個CellFlo Microgon組件(0.2μm膜孔，直徑1mm纖維，3.3m2)收獲發(fā)酵肉湯。采用帶有AG/TechnologiesSize 85 10K超濾膜的LT100 Pall Filtron Skid，濃縮0.2μm膜透過液。終濃縮物為10升體積，于-20℃冷凍。實施例8蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵肉湯不含抗生素活性按照實施例2中所述方法進行蠟樣芽孢桿菌(ATCC 7004)的發(fā)酵，只是初始體積增加至20升。用按照實施例3-5中所述方法制備的終發(fā)酵肉湯或部分純化的PI-PLC，用大腸桿菌MG1655作為測試菌株進行抗生素存在的試驗。根據(jù)杯蝶測定進行所述試驗。參見Brantner，Pharmazie 52(1)34-40，1997。在含有所述酶樣品的杯周圍沒有觀察到指示抗生素活性的透明帶。實施例9用微量滴定板熒光測定分析PI-PLC根據(jù)實施例4中所用的Hendrickson等(參見上文)的方法，開發(fā)PI-PLC的改進生化試驗。底物4-甲基傘形基肌醇-1-磷酸N-甲基-嗎啉鹽得自Biosynth(Naperville，Illinois)。用Flouroscan II熒光微量滴定板讀數(shù)器(得自MTX Lab Systems(Vienna，Virginia))監(jiān)測反應。對于發(fā)酵肉湯或酶濃縮物的測定，在由10mM Tris-Cl、0.16％脫氧膽酸鹽、0.8mM4-甲基傘形基肌醇-1-磷酸N-甲基-嗎啉鹽和經(jīng)稀釋的酶、pH8.0構(gòu)成的黑色塑料微量滴定板上，進行200μL反應。如有需要將酶稀釋液制成0.1％ BSA水溶液。于37℃跟蹤反應達30分鐘，以2分鐘間隔讀數(shù)，以觀察從所述底物中釋放的甲基傘形酮，激發(fā)在350nm，發(fā)射在450nm。
用熒光單位與甲基傘形酮的微摩爾關(guān)系計算每次所添加的酶溶液的量所生成的單位(微摩爾/分鐘)。在pH8.0下反應是兼顧酶的最適pH和甲基傘形酮最大熒光的pH(pH10)。另外，在pH9.0和pH9.0以上，非酶促釋放甲基傘形酮的速率變得顯著。在該測定條件下，比活(單位/mg)比采用Hendrickson等(參見上文)的方法高約39.3倍。為了在動物飼養(yǎng)實驗中測試功效，將采用該測定測量的單位換算成等同的Hendrickson單位，以利于與在運用該測定之前的最初試驗進行比較。實施例10測定動物飼料中以有效量加入的PI-PLC為了測定加入到動物飼料后的酶，包括用于所述測定的一個pH和測量熒光的另一個pH，設(shè)想了基于4-甲基傘形基肌醇-1-磷酸N-甲基-嗎啉鹽的PI-PLC測定(實施例9)的一個更為靈敏的變量。通過稱量4g飼料，將其加到20mL含有0.1％脫氧膽酸的10mM Tris-Cl(pH7.5)中，制得20g/L飼料，從飼料試驗材料中提取所述酶。漿料在NBS G-25搖床(New Brunswich Scientific)中在室溫下以250RPM振搖1小時。將料漿在IEC Micromax微量離心機中用1.5mL微量離心管以13,000RPM離心。用0.1％ BSA(牛血清白蛋白)制備提取物的適當稀釋液。從以10U/磅應用的飼料的提取的樣品不進行稀釋。
第一反應步驟--各管如下建立。也應該包括以1∶100或1∶200稀釋的0.12U/mL PI-PLC(按照實施例4定義的單位)的標準品和空白。樣品反應物應包箔避光，以保護所述底物。
20μL Tris-HCl，0.10M，pH6.040μL脫氧膽酸鹽(0.8％)40μLPI-PLC底物(4mM)100μL酶200μL/管的總反應物，25℃在兩個時間點(30分鐘和60分鐘)，每個反應取出0.1mL反應物。等份樣品于65℃加熱15分鐘，以終止酶反應，然后在冰上冷卻。最后，將樣品在微量離心機中以12,000RPM離心5分鐘。
熒光計讀數(shù)--將120μL 0.10M Tris緩沖液(pH8.0)的Tris緩沖液加到黑色塑料板內(nèi)的微量滴定孔中，然后按照實施例7中所述方法讀數(shù)之前，加入80μL反應樣品。減去本底對照水平。計算每分種熒光單位產(chǎn)生的速率。將熒光單位換算成反應產(chǎn)物的微摩爾數(shù)，計算每磅原始飼料提取的酶單位。實施例11用病原體攻擊的雞飼養(yǎng)試驗I.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗I用1日齡雄性肉用仔雞開始進行第一組飼養(yǎng)試驗。制備“幼雛飼料”的典型統(tǒng)一雞飼料日糧，設(shè)計用以達到或超過the National ResearchCouncil’s NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY(第9版，1994)，并以粉料飼喂。把雞按4個處理組分別裝進雞籠(每只雞占雞舍面積12英寸×24英寸)中，每個處理組重復4次，每個雞籠重復有6只雞(表3)。全部21天試驗期不限量供應水和飼料。用隨機化區(qū)組設(shè)計將雞指定到雞籠以及將雞籠指定到處理組。在試驗開始之前，對所有的雞籠、飼槽和飲水器進行消毒。用白熾燈連續(xù)光照(每天24小時)。然后在第1天和第21天測定體重。在第21天測量飼料消耗量。
第5天，通過經(jīng)口管飼法，所有的雞用200,000個堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)卵囊/只雞感染。第7天，通過飲用水，所有的雞還用500,000個產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。在陰性對照(T1)中，沒有進行感染治療。在陽性對照(T2)中，在飼料中添加一種抗球蟲藥和一種抗生素。這是抗球蟲病治療藥物Sacox(沙利霉素，60g/噸)和抗生素BMD-50(50g/噸)。對于治療組T3和T4，從第5天開始，在經(jīng)口管飼堆型艾美耳球蟲的時候，使用野生型PI-PLC酶處理的飼料(按純量計算約0.34克PI-PLC)。所有飼料都制成統(tǒng)一批料，然后分別用于添加抗生素(試驗組T2)或酶(試驗組T3和T4)。雞體重分析結(jié)果示于表4中，飼料/增重計算示于表5中。
表3.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗I的實驗療法
表4.第21天的平均體重(g)
表5.活雞體重校正的平均飼料轉(zhuǎn)化率(0-21天)
在前面的兩個表中，在一行中字母不同的平均值根據(jù)Duncan顯著性檢驗有顯著性差異(p＜0.05)。
II.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗II用1日齡雄性肉用仔雞開始進行第二組飼養(yǎng)試驗。設(shè)計的基礎(chǔ)日糧超過the National Research Council’s Nutrient Requirements for Poultry(第9版，1994)，并以粉料制備以確保均一性。為了測試從天然來源蠟樣芽孢桿菌制備的PI-PLC(野生型PI-PLC)或重組巨大芽孢桿菌制備的PI-PLC，對飼養(yǎng)至21日齡的雄性肉用仔雞生產(chǎn)性能的影響，在盲法基礎(chǔ)上，對隨機化多層雞籠進行研究。所述天然來源也含有其它胞外酶，但高度純化由巨大芽孢桿菌制備的PI-PLC，然后用30KdNMWC膜通過超濾將其進一步純化。雞在8日齡時用禽球蟲(200,000個堆型艾美耳球蟲卵囊/只雞，通過飲用水)攻擊，在10日齡時用產(chǎn)氣莢膜梭菌(100,000個/只雞，通過飲用水)攻擊。9個治療組中的每個組(表6)具有10個重復或雞籠。每個雞籠裝有6只疫苗接種的(新城疫-支氣管炎混合疫苗(Newcastle-Bronchitis)，Mareks)Cobb×Cobb雄性肉用仔雞，面積為0.40平方英尺/只雞。死雞(如果存在的話)在第8天后不用補充。在全部試驗的試驗期(第0天至第21天)，不限量飼喂粉狀飼料。
所有的雞從第0天至第7天飼喂不含抗生素的普通未經(jīng)處理的基礎(chǔ)粉狀日糧。此后，從8-21日齡飼喂9種經(jīng)處理的粉狀日糧?；A(chǔ)飼料是含22％粗蛋白質(zhì)和1400kcal/lb ME(代謝能含量)的典型肉用仔雞幼雛飼料。
表6.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗II的實驗療法
1每只雞在7日齡時通過飲用水齡給予200,000個堆型艾美耳球蟲卵囊，然后每只雞在10日齡時通過飲用水給予100,000個產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌。
表7.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗II
1用巨大芽孢桿菌生產(chǎn)的重組PI-PLC。2得自蠟樣芽孢桿菌的野生型PI-PLC。3PI-PLC的添加水平太低使得不能有效地提取并在該實驗中測量到，似乎可作為自然本底值在第一組試驗中，當通過飲用水給予細菌感染(實施例11-I)時，根據(jù)所有標準，用蠟樣芽孢桿菌生產(chǎn)的野生型PI-PLC也起作用，或優(yōu)于沙利霉素+BMD療法(表4-5)。在以上顯示的使用重組PI-PLC的后一試驗(實施例11-II，表7)中，以不同濃度加入的PI-PLC在降低腸損害分值和飼料轉(zhuǎn)化率(T3-T6)和提高增重方面顯示依賴于劑量的效應。另外，用90U/lb重組PI-PLC治療，不用沙利霉素+BMD治療，降低腸損害分值，并對飼料轉(zhuǎn)化率和增重有正效應。得自蠟樣芽孢桿菌的野生型PI-PLC在本試驗中不能象相同濃度(10U/lb)的其重組對應物一樣有效地起作用。
III.用酶PI-PLC和內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶的肉用仔雞飼養(yǎng)試驗III為了測試PI-PLC和內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶(美國專利5,429,828)對飼養(yǎng)至21日齡的雄性肉用仔雞生產(chǎn)性能的影響，用隨機化Petersime多層雞籠進行研究。雞在8日齡時用禽球蟲(75,000個堆型艾美耳球蟲卵囊/只雞和1,250個巨型艾美耳球蟲(E.maxima)卵囊/只雞，通過經(jīng)口管飼法)攻擊，并且在11、12和13日齡時用產(chǎn)氣莢膜梭菌(每天經(jīng)口管飼1mL含有108cfu/mL的新鮮培養(yǎng)肉湯)攻擊。每個處理(表8)由8個重復或雞籠構(gòu)成，每個雞籠關(guān)養(yǎng)14只馬立克氏(Mareks)疫苗接種的Cobb×Cobb雄性肉用仔雞(在第14天減至10只，由于從每個雞籠取出了4只雞用于損害評分所致)，面積為0.36平方英尺/只雞。當死雞被檢測后，將其從雞籠中取出，而不用補充。在全部試驗的試驗期(第0天至第21天)，不限量飼喂粉狀飼料。
從0-21日齡飼喂粉狀日糧?；A(chǔ)飼料是含22％粗蛋白質(zhì)和1400kcal/lb ME的典型肉用仔雞幼雛飼料。
表8.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗III的實驗療法
1所述日糧含有雙水楊酸亞甲酯桿菌肽(BMD，50g/噸)和沙利霉素(Sacox，60g/噸)。2100MU/T相當于每噸飼料的活性為100×106單位。3雞在8日齡時用75,000個堆型艾美耳球蟲卵囊/只雞和1,250個巨型艾美耳球蟲卵囊/只雞通過經(jīng)口管飼法攻擊，并且在11、12和13日齡時用產(chǎn)氣莢膜梭菌通過每天經(jīng)口管飼含有108cfu/mL的新鮮肉湯培養(yǎng)物攻擊。
為了比較所述療法，根據(jù)平均雞體重的差異調(diào)節(jié)飼料轉(zhuǎn)化率。感染使AF/G(重量調(diào)節(jié)的飼料轉(zhuǎn)化率)惡化約23％(0.147AF/G單位)。使用沙利霉素和BMD使AF/G完全恢復到正常水平，但在降低由感染引起的腸損害方面，這兩種化學藥品不比-甘露聚糖酶和PI-PLC的組合好。每噸100×106(100MU)單位-甘露聚糖酶或者單獨使用或者與PI-PLC聯(lián)合使用，部分克服了感染的有害結(jié)果，正如受感染對照所給出的AF/G降低方面65％-70％改善所證明的(參見T3對T1)?？磥?甘露聚糖酶對由堆型艾美耳球蟲引起的腸損害分值的降低大于對由巨型艾美耳球蟲引起的腸損害分值的降低。用所述飼料中的PI-PLC治療的受感染雞達到AF/G的部分恢復，但僅33-41％的所述惡化得以克服。然而，兩種PI-PLC均降低由任一艾美耳球蟲引起的腸損害分值。在巨型艾美耳球蟲的情況下，損害降低有統(tǒng)計學顯著性。結(jié)果示于表9中。表9.用PI-PLC和內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶飼喂用堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的雞的肉用仔雞飼養(yǎng)試驗III
IV.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗IV為了測試PI-PLC、甘露聚糖酶(美國專利5,429,828)和真菌甘露聚糖酶對飼養(yǎng)至21日齡的雄性肉用仔雞生產(chǎn)性能的影響，在隨機化Petersime多層雞籠中進行研究。雞在8日齡時用球蟲(75,000個堆型艾美耳球蟲卵囊/只雞和1,250個巨型艾美耳球蟲卵囊/只雞，通過經(jīng)口管飼法)攻擊，并且在11、12和13日齡時用產(chǎn)氣莢膜梭菌(每天經(jīng)口管飼含有108cfu/mL的新鮮肉湯培養(yǎng)物)攻擊。每個處理有8個重復或雞籠。每個雞籠最初關(guān)養(yǎng)14只馬立克氏疫苗接種的Cobb×Cobb雄性肉用仔雞(在第14天減至10只，由于取出4只雞用以損害評分所致)，面積為0.36平方英尺/只雞。不用補充雞。在全部試驗的試驗期(第0天至第21天)，不限量飼喂飼料和水。從0-21日齡飼喂粉狀日糧。治療組1-16的基礎(chǔ)飼料是含22％粗蛋白質(zhì)和1400kcal/lb ME的典型玉米/大豆肉用仔雞幼雛飼料。
下表10中概述的結(jié)果證明了將或者PI-PLC或者甘露聚糖酶加入到用兩種禽球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的肉用仔雞的飼料中的可再生產(chǎn)性收益，導致既提高增重又提高飼料轉(zhuǎn)化率。重要的是，本研究說明，或者PI-PLC或者甘露聚糖酶，當與沙利霉素聯(lián)合使用，但不與抗生素BMD聯(lián)合使用(試驗5和6)時，將生產(chǎn)性能基本上恢復至未感染試驗(編號1和2)的水平。這提供了抗細菌作用的證據(jù)。在這種情況下，PI-PLC/沙利霉素的作用稍微優(yōu)于甘露聚糖酶，甚至優(yōu)于美國目前實施的聯(lián)合加入BMD和沙利霉素用于受感染禽群的作用(試驗4)。
表10.肉用仔雞飼養(yǎng)試驗IV
1I＝感染在8日齡時通過經(jīng)口管飼法用75,000個堆型艾美耳球蟲卵囊/只雞和1,250個巨型艾美耳球蟲卵囊/只雞攻擊，并且在11、12和13日齡時用產(chǎn)氣莢膜梭菌通過經(jīng)口管飼1mL含有108cfu/mL的新鮮肉湯培養(yǎng)物攻擊。2E＝酶PI-PLC＝用巨大芽孢桿菌生產(chǎn)的重組PI-PLC，以30U/lb(如實施例4中所定義的單位)加入；Man.＝遲緩芽孢桿菌(B.lentus)內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶(美國專利5,429,828)，以121MU/噸(百萬個ChemGen單位/噸)或5x的506MU/噸加入。3M＝給藥(B＝BMD(50g/噸)；S＝沙利霉素(60g/噸))。實施例12測定在體外外酶對活力和被堆型艾美耳球蟲子孢子和柔嫩艾美耳球蟲子孢子細胞侵襲的影響通過公開的方法，制備堆型艾美耳球蟲子孢子或柔嫩艾美耳球蟲子孢子和培養(yǎng)的幼倉鼠腎(BHK)細胞。參見Augustine，Avian andPoultry Biology Reviews 11113-122，2000。對于細胞的預處理，細胞培養(yǎng)物用按照表11中所述酶的稀釋液覆蓋，并于覆蓋后5-45分鐘檢查形態(tài)變異。45分鐘后，將單層培養(yǎng)物洗滌兩次，然后用未處理的堆型艾美耳球蟲子孢子或柔嫩艾美耳球蟲子孢子接種。對于感染期間的施用，將子孢子懸浮于所述酶的適當稀釋液中，立即接種到細胞培養(yǎng)物中。孵育45分鐘后，將培養(yǎng)物固定，染色，然后對侵襲進行定量。
進行觀察，以尋找子孢子或細胞由于酶處理引起的大體形態(tài)學方面的變異。在這些實驗中所用的酶水平上，沒有觀察到形態(tài)變異。在兩種酶處理方法后以及不進行酶處理，通過組織染色法和顯微鏡檢術(shù)方法，測量培養(yǎng)細胞的子孢子侵襲。參見Augustine，參見上文。
表11中的數(shù)據(jù)顯示，顯著降低堆型艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲子孢子侵襲的子孢子侵襲。得自蠟樣芽孢桿菌胞外肉湯的相對不純的PI-PLC酶制劑和在重組巨大芽孢桿菌肉湯中產(chǎn)生的非常純的重組PI-PLC都在大多數(shù)實驗中導致在統(tǒng)計學上顯著降低侵襲。甚至在劑量約為蠟樣芽孢桿菌野生型PI-PLC制劑的一半時，重組PI-PLC制劑仍有活性。因此，用所述酶預處理細胞，然后洗去所述酶，與在感染期間同時加入所述酶一樣有效。然而，根據(jù)從飼料中提取的酶的經(jīng)驗，所述兩個洗滌步驟可能沒有去除所有的所述酶。
在感染前用酶預處理所述細胞的兩個實驗中，含有內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶的酶制劑也引起在統(tǒng)計學上顯著地降低侵襲。這些陽性結(jié)果包括用各種類型的病原體進行的一組實驗。因此，甘露聚糖酶也如蠟樣芽孢桿菌PI-PLC制劑一樣好地降低子孢子的體外侵襲。
表11.用和不用酶處理的堆型艾美耳球蟲子孢子或柔嫩艾美耳球蟲子孢子對BHK細胞的體外侵襲
侵襲計數(shù)以從1-3蓋玻片/畸變測量的均數(shù)的均數(shù)±標準誤報道(BHK細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)插入的蓋玻片上生長)。具有不同上標的試組內(nèi)的均數(shù)差異顯著(P＜0.5或P＝0.5)1得自蠟樣芽孢桿菌的胞外酶在磷酸緩沖鹽水中透析，將單位按實施例4的方法標準化。2得自重組巨大芽孢桿菌的胞外酶在磷酸緩沖鹽水中透析，將單位按實施例4的方法標準化。3得自遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)的甘露聚糖酶(美國專利5,429,828中所述)并且在磷酸緩沖鹽水中透析，單位按照the ChemGen Corp.還原糖測定進行定義。4ND＝未測定的實施例13體外評價用于隱孢子蟲屬感染的PI-PLC評價酶PI-PLC在濃度范圍.001-30U/ml下的抗隱孢子蟲活性和毒性，采用4日齡Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞來進行。酶單位按照實施例4的方法定義，但按照實施例9的所述方法測定。所用的酶制劑來自重組巨大芽孢桿菌。感染后3小時開始處理，然后繼續(xù)處理至48小時。
化學發(fā)光免疫測定。感染前，洗滌卵囊，然后將其懸浮于含有0.75％?；悄懰徕c的DMEM基質(zhì)中，于37℃孵育10分鐘(You等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters 136251-256，1996；You等，J.Antimicrobial.Chemother.41293-296，1998)。脫囊混合物用Ultraculture培養(yǎng)基稀釋，迅速在含有100％鋪滿的MDCK細胞的平板內(nèi)分散，在Ultraculture培養(yǎng)基中保持4天。在用PBS洗滌之前，將所述接種物與所述細胞一起孵育3小時，然后更換含有或不含試驗酶的新鮮Ultraculture培養(yǎng)基。將平板在5％ CO2空氣氛圍下于37℃孵育48小時。培養(yǎng)物用PBS洗滌，然后用布安氏液固定。
固定平板用TBST緩沖液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.05％ Tween-20)洗滌，然后用1％ BSA-TBST(含有1％牛血清白蛋白的TBST緩沖液)于25℃溫和振搖下封閉30分鐘。將兔抗微小隱孢子蟲血清(1∶200稀釋度)加樣到所述平板內(nèi)，然后孵育1小時。用TBST洗滌后，將樣品依次與生物素標記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白(工作稀釋度，1∶1000，KPL Inc.，Gaithersburg，MD)一起孵育。增強魯米諾(4-碘苯酚和過氧化氫，Aldrich Chemical Co.Inc.，Milwaukee，WI)用作底物。用ML3000發(fā)光計(Dynatech Lab.，Chantilly，VA)對平板讀數(shù)，并且測定相對光單位(RLU)。用4個重復孔計算出RLU的均數(shù)，所有實驗至少兩個重復。
毒性分析。采用市售四氮唑染料還原測定(CellTiter 96；PromegaCorp.，Madison，WI，USA)對所述酶進行試驗。簡而言之，將下述各種酶濃度加到含有鋪滿MDCK細胞單層的96孔板內(nèi)。每種稀釋度用三個復份來評估。將酶在單層上于37℃和5％ CO2下孵育。在48小時時，將平板顯色1小時，用ELISA板讀出器于490nm讀數(shù)。記錄并分析結(jié)果。毒性百分率如下計算將含有所述酶的平均OD減去不含所述酶的培養(yǎng)基對照的平均OD，然后除以所述培養(yǎng)基的OD，再乘以100。細胞毒性分值如下表所示進行指定。
毒性％分值0-5％ 06-25％ 126-50％ 251-75％ 376-100％4用3U/ml或更高濃度的所述酶觀察到顯著性毒性。所述酶在0.1-1U/ml范圍內(nèi)沒有觀察到顯著性毒性(表12)。因此，在該濃度范圍(1.0U/ml或更低)內(nèi)進行一組實驗，以測定所述酶的活性和所述酶的特異性。在第一組實驗中，用脫囊子孢子感染MDCK細胞。孵育3小時后，洗滌細胞單層，以各種濃度添加所述酶，孵育48小時。如表13所示，所述酶在0.01-1U/ml范圍內(nèi)證明有抗隱孢子蟲活性。在濃度1U/ml時達到約50％抑制(圖1)。
表12.用巨大芽孢桿菌制備的重組PI-PLC對MDCK單層細胞培養(yǎng)物的毒性
表13.重組PI-PLC酶對微小隱孢子蟲感染的MDCK細胞培養(yǎng)物的活性
進行第二組實驗以評價酶的特異性。子孢子用各種濃度的所述酶處理45分鐘，然后簡單地洗滌。然后讓經(jīng)處理的子孢子感染未處理的宿主細胞，讓其發(fā)育和繁殖48小時。在一個獨立的實驗中，將宿主細胞與各種濃度的所述酶一起孵育，洗滌，然后用未處理的子孢子感染。如下所示(表14)，用所述酶處理子孢子或宿主細胞導致部分抑制。在該濃度范圍內(nèi)沒有觀察到依賴于劑量的抑制。這可能是由于所述酶與宿主細胞或寄生蟲細胞的孵育時間較短(45分鐘)或者部分或不完全切割宿主/寄生蟲受體所致。另外，其它宿主/寄生蟲受體可能參與感染并且引起在所述宿主細胞內(nèi)觀察到的生長。
表14.子孢子或MDCK細胞的感染前處理和對微小隱孢子蟲感染性的影響
實施例14體內(nèi)評價用于隱孢子蟲屬感染的PI-PLC采用免疫缺陷型SCID小鼠模型，評價所述酶的抗隱孢子蟲功效。簡而言之，通過用0.1％ BSA、PBS(pH 7.2)洗滌純化卵囊(貯存＜6個月)，以去除重鉻酸鉀，制備卵囊接種物。SCID小鼠(4-5周齡)用106卵囊(IOWA品系)感染，然后如下所述進行處理。從所述小鼠收集糞便樣品，通過不連續(xù)蔗糖純化，如先前所述通過流式細胞術(shù)評價寄生蟲荷載。參見Arrowwood等，J.Parasitol.81404-409，1995。
表15.治療性實驗的治療方案
小鼠顆粒飼料用或者含30U/lb或者含90U/lb PI-PLC的PBS或者PBS涂覆。所有小鼠不限量供食。感染后，小鼠立即接受飼料。每周收集兩次糞便樣品并稱重。每天測量飼料的消耗量。通過注射各0.2cc的100mg/ml氯胺酮、100mg/ml賽拉嗪和0.9％ NaCl，讓小鼠安樂死。
每只小鼠每天消耗的平均飼料和平均小鼠體重示于表16中。在3周內(nèi)沒有觀察到飼料消耗量或體重的統(tǒng)計學顯著性差異。
表16.小鼠的飼料消耗量和增重
在感染后3周的功效。如表17所示，感染后3周、4周和4.5周收集來自處理組和對照組SCID小鼠的糞便樣品，并且測定100微升樣品內(nèi)的隱孢子蟲計數(shù)。如所示，用所述酶處理的小鼠證明寄生蟲荷載降低。在處理組觀察到寄生蟲荷載(34-54％)。當采用ANOVA統(tǒng)計學分析評價時，這些降低中的某些有統(tǒng)計學顯著性(以下所示并且符號標注)。所述酶表現(xiàn)出作為抗隱孢子蟲治療藥物的潛力。較高劑量的所述酶或?qū)⑺雒父玫貍鬟f到感染部位可能增加其功效，并且可能在未來的實驗得以論述。
表17.PI-PLC在體內(nèi)降低糞便內(nèi)隱孢子蟲的功效
*P值為顯著性，0.05或更低。+P值為0.08或更低。實施例15證實生長試驗所用的酶如實施例10所述，分析從用于上述動物試驗的飼料中提取的PI-PLC。結(jié)果概述于表18-19中。
表18.隱孢子蟲研究，小鼠飼料
從飼料中提取的效率隨飼料類型顯著變化。從小鼠飼料的提取顯示出73.4％-76％效率(表18)?？傇谌齻€不同地點制備的雞飼料的三種不同的制劑中小心加入45U/lb或180U/lb重組PI-PLC，由于所述負荷水平在實施例9的連續(xù)分析方法的范圍內(nèi)，因此采用實施例9的分析方法立即對其進行提取和測定(表19)。
表19從不同來源的雞飼料和玉米粉提取的效率試驗
可以看出，從玉米粉提取的效率與從小鼠飼料提取的效率相似。然而，在本實驗以及其它實驗中，某些雞飼料樣品的提取較差。
在如表20所示的試驗中，可提取的酶約為理論PI-PLC的30-45％，而β-甘露聚糖酶較容易提取，得率約為100％。用上述所示的提取試驗，約45％提取是用上述飼料觀察到的提取的最佳水平。因而，表20試驗的飼料提取的U/lb的分析結(jié)果在所用負荷的預期范圍內(nèi)。
表20.對肉用仔雞飼養(yǎng)試驗III的酶負荷的驗證
為了說明本發(fā)明，已經(jīng)描述了某些代表性實施方案和細節(jié)，但顯而易見的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不偏離本發(fā)明范圍的情況下在其中進行各種變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含(i)一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶，和(ii)一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物不含除所述酶以外的抗感染藥。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是一種飼料。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述飼料組合物不含除所述酶以外的抗感染藥。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶選自鞘磷脂酶和磷脂酶。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述酶是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶、腦苷脂酶和糖酶。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，其中所述載體是一種在其中摻入所述酶的食料。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述食料是一種由谷類物料、蛋白質(zhì)源、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)組成的動物飼料。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述谷類物料是玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。
13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述蛋白質(zhì)源是菜豆或豌豆。
14.權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，其中所述組合物為固體制劑或液體制劑。
15.權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，其中所述酶包含在明膠膠囊殼內(nèi)。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶從蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株制備。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述蠟樣芽孢桿菌菌株是ATCC7004或ATCC6464。
18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶通過重組DNA在宿主生物中表達來獲得。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述宿主生物來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株。
20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶用量為200IU/Kg-4000IU/Kg飼料。
21.一種治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括口服給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，其中所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述方法不包括給予除所述酶以外的抗感染藥。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述感染由原生動物、細菌、酵母或真菌病原體引起。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述感染由艾美耳球蟲屬(Eimeria)的原生動物病原體引起。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述感染由隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)的原生動物病原體引起。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述感染由梭菌屬(Clostridium)的細菌病原體引起。
28.權(quán)利要求21的方法，所述方法包括口服給予所述受治療者來自蠟樣芽孢桿菌菌株的一種胞外酶制劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述蠟樣芽孢桿菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述酶通過重組DNA在宿主生物中表達來獲得。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主生物來自巨大芽孢桿菌菌株。
32.一種組合物，所述組合物包含(i)一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶和(ii)一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式，并且所述組合物不含除所述酶以外的抗感染藥。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述載體是一種在其中摻入所述酶的食料。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述食料是一種由谷類物料、蛋白質(zhì)源、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)組成的動物飼料。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述谷類物料是玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中所述蛋白質(zhì)源是菜豆或豌豆。
37.權(quán)利要求32的組合物，其中所述組合物為固體制劑或液體制劑。
38.權(quán)利要求32的組合物，其中所述酶包含在明膠膠囊殼內(nèi)。
39.權(quán)利要求32的組合物，其中所述酶是一種半纖維素酶。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述半纖維素酶是甘露聚糖酶。
41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述甘露聚糖酶是名為ATCC55045的遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)產(chǎn)生的內(nèi)-1，4-β-D-甘露聚糖酶。
42.權(quán)利要求32的組合物，其中所述酶選自鞘磷脂酶和磷脂酶。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述酶是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C。
45.權(quán)利要求32的組合物，其中所述酶選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶、腦苷脂酶和糖酶。
46.一種治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括口服給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，其中所述方法不包括與所述酶一起給予抗微生物有效量的另一抗感染藥。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述感染由原生動物、細菌、酵母或真菌病原體引起。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述感染由艾美耳球蟲屬的原生動物病原體引起。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述感染由隱孢子蟲屬的原生動物病原體引起。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述感染由梭菌屬的細菌病原體引起。
51.權(quán)利要求46的方法，所述方法包括口服給予所述受治療者來自蠟樣芽孢桿菌菌株的一種胞外酶制劑。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述蠟樣芽孢桿菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
53.權(quán)利要求46的方法，其中所述酶通過重組DNA在宿主生物中表達來獲得。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述宿主生物來自巨大芽孢桿菌菌株。
55.權(quán)利要求46的方法，其中所述酶是一種半纖維素酶。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述半纖維素酶是甘露聚糖酶。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述甘露聚糖酶是名為ATCC55045的遲緩芽孢桿菌產(chǎn)生的內(nèi)-1，4-β-D-甘露聚糖酶。
58.一種口服劑型的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶的應用，用來治療消化道感染或降低消化道感染危險，其中所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶。
59.一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶的應用，用來生產(chǎn)治療消化道感染或降低消化道感染危險的口服劑型的藥物，其中所述酶不是內(nèi)-1，4--D-甘露聚糖酶。
60.一種口服劑型的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶的應用，用來治療消化道感染或降低消化道感染危險，其中所述酶不與抗微生物有效量的另一抗感染藥一起給予。
61.一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶的應用，用來生產(chǎn)治療消化道感染或降低消化道感染危險的口服劑型的藥物，其中所述酶不與抗微生物有效量的另一抗感染藥一起給予。
全文摘要
一類特殊的酶，所述酶的特征在于切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的能力，不含抗感染藥的所述酶顯示出顯著的抗感染活性?？诜?，這些酶例如有效治療人和動物的消化道感染。在后一情況下，有顯著提高生長率、飼料轉(zhuǎn)化率并且改善總體健康狀況的益處。
文檔編號A61P31/04GK1433319SQ00818851
公開日2003年7月30日 申請日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日
發(fā)明者D·M·安德森, L·劉, H-Y邵, D·W·福德格 申請人:坎姆根公司