專利名稱：吸入治療二氧化碳增強(qiáng)的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及藥物學(xué)和藥物傳遞領(lǐng)域。更特別的是，本發(fā)明涉及一種在吸入治療過(guò)程中用二氧化碳?xì)怏w提高氣溶膠藥物肺部沉積的方法。
相關(guān)領(lǐng)域的描述小顆粒脂質(zhì)體氣溶膠治療包含摻入脂質(zhì)體的脂溶性或水溶性抗癌藥物，它通過(guò)噴射噴霧器中的水相分散體施用(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,049,388)。在噴霧后產(chǎn)生的1-3微米質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑的氣溶膠能靶向傳遞到呼吸道表面。沉積的脂質(zhì)體然后在肺內(nèi)局部釋放藥物或釋放入血循環(huán)，并傳遞到肺外組織。
如果藥物是脂溶性的，它將以對(duì)使用的脂質(zhì)、使用的抗癌藥物特異性的方式與脂類分子結(jié)合，可能被包含在起懸浮作用的水相介質(zhì)中的各種可溶性成分進(jìn)一步修飾。這些可溶性成分可包括緩沖鹽，還可能包括環(huán)己六醇，來(lái)增強(qiáng)肺組織中具表面活性的磷脂的合成和分泌，并最大程度降低已存在或可由于氣溶膠治療導(dǎo)致的呼吸窘迫。
如果藥物是水溶性的，可通過(guò)合適的方法將其摻入水相小泡，它存在于多層脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層(薄片)之間的同心空間內(nèi)?？芍苽鋯螌又|(zhì)體，但是它們捕捉脂溶性或水溶性藥物的能力降低，因?yàn)椴东@僅限于一個(gè)中央小泡。氣溶膠水滴可含有一個(gè)或多個(gè)藥物-脂質(zhì)體。另外，還可能在氣溶膠脂質(zhì)體治療中，通過(guò)混合不同的含藥物的脂質(zhì)體，或用其中藥物已混合或一起摻入的脂質(zhì)體，將一種以上藥物摻入一種氣溶膠脂質(zhì)體療法。
噴霧將脂質(zhì)體剪切成能從噴霧器噴嘴中輕易釋放的大小。直徑達(dá)幾微米的脂質(zhì)體通常被剪切成直徑小于500納米，比由噴霧器的操作特性和其它變量決定的直徑可能小得多。脂質(zhì)體中所含的水溶性藥物的剪切將釋放可觀量的水溶性化合物，大約50％。這與其用途不矛盾，但意味著施用了兩種形式的藥物制劑，效果包括如果單獨(dú)使用任一種形式，兩種形式將產(chǎn)生的療效。脂質(zhì)體氣溶膠治療的許多其它細(xì)節(jié)在美國(guó)專利號(hào)5,049,388中描述。
一般吸入治療的根本目的是將藥物的氣溶膠顆粒局部傳遞到中央氣道和呼吸道的周?chē)鷧^(qū)域。然而，即使是最佳大小范圍1-2微米的質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑的吸入顆粒沉積部分也僅是20％左右。吸入氣溶膠的肺部沉積顯著受到顆粒大小、吸濕性和氣道幾何形態(tài)的影響(1，2)。呼吸情況也是確定吸入顆粒沉積情況的重要變量(1，2)。
特別是，屏氣顯著增加肺部沉積，因?yàn)樘岣吡朔蝺?nèi)顆粒存留的時(shí)間。這使得尤其在周?chē)獾乐写嬖诟L(zhǎng)時(shí)間的重力沉降，并確保水相顆粒能在接近100％的濕度下平衡，并接近其最大尺寸，進(jìn)一步增強(qiáng)其沉積(1，2)。計(jì)算機(jī)模擬顯示人屏氣30秒的做法可增加沉積部分2.2倍。該作用的生理學(xué)原理是由于在深吸氣后顆粒攝入提高，其中吸入體積可以比基礎(chǔ)潮式呼吸吸入的量高8倍。該更大的潮式呼吸體積導(dǎo)致顆粒能穿透到肺最深處，此處的氣道直徑是最小的，因此能最有效的發(fā)生由于重力和最大粒徑引起的沉積。
通過(guò)延伸該生理性質(zhì)，直接利用能增加吸氣(含有氣溶膠顆粒)體積的因素隨后將顯著增加中央氣道中沉積的部分，和在周?chē)沃羞_(dá)到更大的程度。二氧化碳(CO2)是呼吸最重要的天然調(diào)節(jié)劑。二氧化碳從組織中循著現(xiàn)存的壓力梯度自由彌散到血液中。血液中二氧化碳的遞增水平輕易的彌散到腦脊液中，在其中轉(zhuǎn)化成HCO3-和H-。髓質(zhì)腹面的中樞化學(xué)感受器響應(yīng)CSF中H+的增加，并導(dǎo)致通氣補(bǔ)償性的增加(速度和潮氣量)。
調(diào)查者利用二氧化碳吸入操縱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的通氣。吸入5％二氧化碳導(dǎo)致潮氣量增加192％(3)。該增加是迅速的，在整個(gè)接觸期間達(dá)到持續(xù)的坪值(4)。一旦二氧化碳接觸停止，通氣的改變?cè)趲追昼妰?nèi)回到基線水平(4)。類似的，人吸入5％二氧化碳導(dǎo)致分鐘量增加到3倍(5)。正常人吸入5％或7.5％的二氧化碳兩分鐘導(dǎo)致呼吸頻率分別增加了6.7&和19％，并分別提高了潮氣量31％和52％，因此分鐘量分別提高了34％和75％(6)。更長(zhǎng)時(shí)間的接觸這些濃度將產(chǎn)生更大的效應(yīng)(5)。
喜樹(shù)堿類似物和紫杉烷類是目前開(kāi)發(fā)用作化療劑的化學(xué)物質(zhì)(21，26)。抗癌藥紫杉醇(PTX)和不同的喜樹(shù)堿(CPT)衍生物在治療各種人腫瘤，包括肺癌中具有臨床活性。當(dāng)用作單一的藥物或聯(lián)合其它藥物時(shí)，這些藥物在臨床試驗(yàn)中顯示有益結(jié)果(21)。這些藥物通過(guò)口腔或靜脈途徑全身給藥紫杉醇最有效的途徑是連續(xù)靜脈內(nèi)輸注(22，24)，而口服給藥的喜樹(shù)堿親脂同類物證明最有效。
毒副作用的產(chǎn)生常常是這些治療方案中主要的限制。裸鼠(23)和實(shí)驗(yàn)性小鼠肺轉(zhuǎn)移(6)中幾種皮下人癌異種移植物已將通過(guò)氣溶膠給藥途徑作為治療的另一種方法，已用喜樹(shù)堿和9-硝基喜樹(shù)堿(9NC)的脂質(zhì)體制劑成功治療。在小鼠中用喜樹(shù)堿進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究，顯示吸入脂質(zhì)體喜樹(shù)堿在肺和其它器官中產(chǎn)生較大的藥物水平，在停止氣溶膠傳遞后迅速清除(17)。盡管這些水平，氣溶膠傳遞系統(tǒng)在藥物沉積中通常僅15-20％的效力(29，30)；因此提高肺部沉積可能是有利的。
用這些藥物傳遞的全身途徑，一定量的藥物會(huì)從血流中溢出，定位于呼吸道組織內(nèi)，但肺不是藥物沉積的主要器官。利用常規(guī)脂質(zhì)體作為這些藥物的載體不能改善常用全身途徑施用的藥物的肺部沉積(11，27)。噴霧是對(duì)呼吸道靶向藥物傳遞非常有效的途徑(17)；例如喜樹(shù)堿。當(dāng)通過(guò)氣溶膠化傳遞阿霉素和PTX的新制劑時(shí)，成功治療了患有自發(fā)產(chǎn)生的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺部腫瘤的犬(16)。然而在這些情況下，用正?？諝猱a(chǎn)生氣溶膠。
用病毒和非病毒載體實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種組織的基因傳遞。雖然用非病毒載體避免了與病毒載體有關(guān)的免疫應(yīng)答，陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚陽(yáng)離子聚合物等非病毒載體一般與病毒載體高水平的基因表達(dá)特征無(wú)關(guān)。然而聚乙烯亞胺(PEI)，一種陽(yáng)離子聚合物在組織培養(yǎng)物和體內(nèi)都有效(36)。每第三個(gè)氮上的質(zhì)子化氮具有巨大的緩沖能力。聚乙烯亞胺可將DNA有效引向核(37)，并保護(hù)DNA免受DNAse的降解(36)。聚乙烯亞胺的線性和分枝形式都顯示在各種組織，例如肺、腦和腎中產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(39-41)。聚乙烯亞胺也用于在體內(nèi)將DNA有效傳遞給腫瘤(42)。
氣溶膠傳遞是將感興趣的基因傳遞給肺的非侵襲性途徑，可能用于治療肺癌和囊性纖維變性等疾病。然而轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平不是很高，因?yàn)樵谝恍┣闆r下，在噴霧時(shí)DNA活力會(huì)喪失(43)。PEI能在噴霧過(guò)程中保護(hù)DNA(44)，并能導(dǎo)致肺中比其它測(cè)試的陽(yáng)離子脂類更高水平的轉(zhuǎn)染(44，45)。PEI-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對(duì)于肺部表面活性劑的抑制作用也具有抗性(46)。
用幾種方法實(shí)現(xiàn)了通過(guò)吸入途徑提高呼吸道中的藥物沉積效率1)改變用于氣溶膠化的制劑中藥物的濃度(31)；2)用更有效類型的噴霧器(32)；3)提高治療持續(xù)時(shí)間；或4)改變呼吸模式(4)。如上所述，二氧化碳是呼吸的天然調(diào)節(jié)劑。吸入含有低濃度(約3-7％)二氧化碳的空氣導(dǎo)致呼吸模式類似改變，并且能很好的耐受(13，6)。未觀察到吸入含5％CO2的空氣和人中度體育鍛煉之間呼吸模式的差異(32)。含5％CO2的空氣的類似作用可在使用氣溶膠治療的人中獲得。因此利用富含CO2的空氣作為吸入治療的調(diào)節(jié)劑來(lái)噴霧可導(dǎo)致化療劑的更有效的肺部傳遞。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于缺乏一種在吸入治療過(guò)程中增強(qiáng)氣溶膠化藥物的肺部沉積的手段。本發(fā)明填補(bǔ)了本領(lǐng)域該長(zhǎng)期的需要和需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了一種提高氣溶膠化藥物在個(gè)體或動(dòng)物呼吸道中沉積的方法，包括步驟以含有約達(dá)10％二氧化碳?xì)怏w的空氣混合物施用所述氣溶膠化藥物。本文使用了2.5％、5％和7.5％的二氧化碳濃度。氣溶膠可以施用1-30分鐘或更長(zhǎng)。施用的藥物可以是可溶性藥物，或不可溶性藥物或可溶于溶液并直接用噴射噴霧器氣溶膠化，或在氣溶膠化前摻入脂質(zhì)體、緩釋聚合物或聚陽(yáng)離子聚合物等載體的治療組合物，例如寡核苷酸、基因、肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的其它和另外的方面、特征和優(yōu)點(diǎn)從對(duì)于本發(fā)明目前優(yōu)選例的下列描述將變得明顯。提供這些優(yōu)選例是為了公開(kāi)。
附圖簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的上述以及其它特征、優(yōu)點(diǎn)和目的將變得清楚，并被詳細(xì)理解，上文簡(jiǎn)單總結(jié)的本發(fā)明的更具體描述可參考用


的一些實(shí)施例。這些圖構(gòu)成了說(shuō)明書(shū)的一部分。應(yīng)注意，盡管

了本發(fā)明的優(yōu)選例，不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍。
圖1顯示了接觸用正?？諝?實(shí)線)或富含5％CO2空氣(影線)的脂質(zhì)體氣溶膠30分鐘后喜樹(shù)堿的組織分布。在治療結(jié)束時(shí)(30分鐘)合并每組三只小鼠的器官，用HPLC測(cè)定藥物含量。計(jì)算平均值和SD。5％CO2-空氣與正常空氣相比的P值分別對(duì)于肺、肝、脾、腎、血液和腦是0.02、0.13、0.04、0.04、0.03，和0.01(Student’st檢驗(yàn)，雙側(cè))。
圖2顯示CPT-脂質(zhì)體通過(guò)正?？諝?O)或含有5％CO2-的空氣(·)產(chǎn)生的氣溶膠給藥30分鐘的肺部濃度-時(shí)間曲線。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，切下三只小鼠的肺，并用HPLC測(cè)定藥物含量。計(jì)算平均值和SD。
圖3顯示了PTX-脂質(zhì)體通過(guò)正常空氣(O)或含有5％CO2的空氣(·)產(chǎn)生的氣溶膠給藥30分鐘的肺部濃度-時(shí)間曲線。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，合并三只小鼠的肺，并用HPLC測(cè)定藥物含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值和SD。
圖4顯示了接觸含有不同脂質(zhì)體制劑的氣溶膠的小鼠肺中組織紫杉醇水平的比較。以空間穩(wěn)定的紫杉醇脂質(zhì)體含5％CO2的空氣的氣溶膠實(shí)現(xiàn)與紫杉醇等價(jià)水平的接觸，當(dāng)利用DLPC時(shí)，該脂質(zhì)體是用二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚乙二醇2000制備的。
圖5顯示在肺中通過(guò)用空氣或含5％CO2的空氣產(chǎn)生的PEI-DNA氣溶膠CAT表達(dá)的比較。將1毫克CAT質(zhì)粒與PEI以N∶P比10∶1的比例復(fù)合，得到的復(fù)合物氣溶膠化施給小鼠30分鐘。24小時(shí)后收集肺，如所述進(jìn)行CAT測(cè)定。數(shù)值是平均值±SD(n＝6小鼠/組，P＝0.001)。
圖6顯示CO2百分?jǐn)?shù)對(duì)PEI-DNA通過(guò)氣溶膠轉(zhuǎn)移到肺的效率的影響。用空氣中不同的CO2百分?jǐn)?shù)和固定量的CAT質(zhì)粒。復(fù)合物用0％、2.5％、5％和10％二氧化碳和對(duì)照氣溶膠化。殺死小鼠，收集肺。進(jìn)行CAT測(cè)定。數(shù)值是平均值±SD。
圖7顯示肺中通過(guò)PEI-DNA氣溶膠的基因表達(dá)是劑量依賴性的。用含5％CO2的空氣，以固定的N∶P比10∶1氣溶膠化提高的CAT質(zhì)粒劑量。傳遞的DNA總量和傳遞的PEI-DNA濃度都有提高。24小時(shí)后殺死小鼠，收集肺，并測(cè)定CAT蛋白。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組5只小鼠)。
圖8顯示N∶P比對(duì)PEI-DNA通過(guò)氣溶膠轉(zhuǎn)移到肺的效率的影響。用不同的PEI∶DNA(N∶P)比和固定量的CAT質(zhì)粒(2毫克)。用含5％CO2的空氣氣溶膠化復(fù)合物。24小時(shí)后殺死小鼠，收集肺，進(jìn)行CAT測(cè)定。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組5只小鼠)。
圖9顯示了N∶P比對(duì)肺中熒光素酶基因表達(dá)的影響。以不同N∶P比傳遞固定量的熒光素酶質(zhì)粒(2mg)。復(fù)合物用含5％CO2的空氣氣溶膠化。氣溶膠傳遞24小時(shí)后殺死小鼠。收集肺，測(cè)定熒光素酶活性。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組5只小鼠)。
圖10顯示接觸PEI-DNA氣溶膠一次后轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。在圖10A中，用含5％CO2的空氣以N∶P比15∶1給小鼠傳遞含有2mg CAT質(zhì)粒的氣溶膠。在不同的時(shí)間點(diǎn)殺死小鼠，收集肺，立即冷凍。在最后的時(shí)間點(diǎn)后進(jìn)行CAT測(cè)定。數(shù)值是平均值±SD(n＝每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠)。圖10B顯示用兩種不同的N∶P比持續(xù)表達(dá)CAT。用含5％CO2的空氣以15∶1或10∶1的N∶P比對(duì)兩組小鼠(各組各時(shí)間點(diǎn)n＝5小鼠)傳遞2mg CAT質(zhì)粒。10∶1比例的時(shí)間點(diǎn)是氣溶膠接觸后1、2、3和6日，對(duì)于15∶1是氣溶膠接觸后1、3、7和10日。
圖11顯示一次PEI-DNA氣溶膠接觸后轉(zhuǎn)基因的組織分布。如圖9中使用相同組的小鼠(來(lái)自10∶1組)。收集不同組織并立即冷凍。在最后的時(shí)間點(diǎn)后測(cè)定CAT蛋白。數(shù)值是平均值±SD(n＝每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠)。氣溶膠接觸組中非肺組織中CAT水平與對(duì)照組織中沒(méi)有差異(P＞0.1)。
圖12顯示經(jīng)PEI-DNA氣溶膠治療的肺的組織學(xué)分析。將2mgCAT質(zhì)粒與PEI以N∶P比15∶1混合，該復(fù)合物氣溶膠用含5％CO2的空氣對(duì)5只小鼠噴霧30分鐘。24小時(shí)后殺死小鼠，收集肺，用甲醛固定。用蘇木精和曙紅(H&E)將切片染色。圖12A細(xì)支氣管(對(duì)照)；圖12B細(xì)支氣管(治療的)。放大100x。
圖13顯示了PEI-p53氣溶膠傳遞抑制B16-F10肺轉(zhuǎn)移。圖13A用下式計(jì)算腫瘤指數(shù)腫瘤指數(shù)＝肺重量x該組的平均級(jí)數(shù)。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組10只小鼠)。圖13B來(lái)自對(duì)照的代表性肺，顯示PEI-Lucand PEI-p53處理的小鼠(n＝每組10只小鼠)。用PEI-處理的組的肺(未顯示)的腫瘤病灶形狀、大小和數(shù)量與對(duì)照和PEI-Luc-治療組所示相似。數(shù)據(jù)代表2個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖13C來(lái)自不同組的小鼠肺重量。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組10只小鼠)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種提高個(gè)體或動(dòng)物呼吸道中氣溶膠化藥物的沉積的方法，包括步驟以含有達(dá)約10％CO2氣體的空氣混合物施用所述氣溶膠化藥物。優(yōu)選濃度包括2.5％、5％和7.5％二氧化碳?xì)怏w?？墒┯脷馊苣z1-30分鐘或更長(zhǎng)。
本發(fā)明針對(duì)水溶性藥物的氣溶膠傳遞。該藥物可直接制備成水溶液或緩沖溶液，并直接氣溶膠化。代表性水溶性藥物包括妥布拉霉素和噴他脒等抗生素；乙酰半胱氨酸等粘液溶解劑；舒喘寧等支氣管擴(kuò)張藥；異丙托溴銨等副交感神經(jīng)藥物；DNase等酶和利巴韋林等抗病毒藥。
另外，本發(fā)明可用于傳遞在氣溶膠傳遞前與載體結(jié)合的不溶性藥物。可能的載體包括脂質(zhì)體、緩釋聚合物和聚陽(yáng)離子聚合物。脂質(zhì)體是親脂藥物特別有用的載體，這些藥物包括兩性霉素B；制霉菌素；糖皮質(zhì)激素；CsA、FK506、雷帕霉素或霉酚酸酯等免疫抑制劑；和喜樹(shù)堿、喜樹(shù)堿衍生物和紫杉醇等抗癌藥。可用磷脂二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)等脂類形成脂質(zhì)體，或可以是用修飾的磷脂，例如二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000配制的空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體?？衫镁忈尵酆衔铮缇?乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚陽(yáng)離子聚合物，例如聚乙二亞胺(PEI)。
本發(fā)明還可用于傳遞治療蛋白、治療肽、DNA基因、有義寡核苷酸、反義寡核苷酸和病毒載體。DNA基因的代表性實(shí)施例是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)或p53基因。優(yōu)選這些基因通過(guò)聚陽(yáng)離子聚合物載體，例如聚乙二亞胺傳遞。陽(yáng)離子脂質(zhì)體也可用作載體。聚乙二亞胺可具有約10∶1-20∶1的氮∶磷比。在一個(gè)優(yōu)選例中，PEI氮∶磷比是約10∶1。
提供了下列定義。不特別限定的術(shù)語(yǔ)意味著具有本領(lǐng)域習(xí)慣的意義。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“氣溶膠”指固態(tài)或液態(tài)顆粒在空氣中的分散體，其粒徑足夠細(xì)和因此沉降速度低，具有相對(duì)的空氣攜帶穩(wěn)定性(8)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體氣溶膠”指水相液滴，其中分散有一種或多種脂質(zhì)體顆?；蚝幸环N或多種要傳遞給人或動(dòng)物呼吸道的藥物的脂質(zhì)體(9)。
本文所用的對(duì)于本申請(qǐng)所定義的氣溶膠液滴大小是美國(guó)專利號(hào)5,049,338所述的那些，即1-3微米的質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑(MMAD)，幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差約1.8-2.2。然而使用低濃度的9-NC和可能的其它喜樹(shù)堿衍生物，質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑可小于1微米，例如0.8微米。基于本發(fā)明公開(kāi)的研究，當(dāng)與環(huán)境相對(duì)濕度平衡時(shí)，脂質(zhì)體可占幾乎全部液滴體積。
本文所用的“Weibel肺模型”指人肺結(jié)構(gòu)的類型，它認(rèn)為人氣道有23條順序的分枝。氣管標(biāo)為0，支氣管和細(xì)支氣管持續(xù)到分枝16。氣道的這些部分含有纖毛上皮和粘液腺。它們一起構(gòu)成粘膜纖毛屏障。分枝17-23含有肺的肺泡部分，沒(méi)有粘膜纖毛屏障。因此，在此處沉積的顆粒不會(huì)沿氣道運(yùn)送，而被吞咽。
本文考慮了在高碳酸血癥的受控實(shí)驗(yàn)條件下，吸入的藥物顆粒沉積將大大提高到超出基礎(chǔ)潮氣呼吸條件下觀察到的水平。用二氧化碳?xì)怏w/空氣混合物驅(qū)動(dòng)連續(xù)流噴射噴霧器能大大提高傳遞到周?chē)?Weibel的17-23代)的藥物劑量的效率。照此類推，可能有效利用該系統(tǒng)來(lái)提高吸入藥物的生物效率。該概念可在理論上使用任何藥物、基因、寡核苷酸或蛋白質(zhì)/肽制劑(可溶的、脂質(zhì)體的、晶狀的或基于聚合物載體，例如聚乙二亞胺)和任何氣體或空氣驅(qū)動(dòng)的噴射噴霧器。
本發(fā)明主要針對(duì)用二氧化碳?xì)怏w提高用氣溶膠化藥物吸入治療過(guò)程中呼吸的深度和頻率，使得分鐘量增加。提高的肺潮氣量導(dǎo)致吸入藥物顆粒的肺沉積提高，尤其在低水平呼吸中不能完全通氣的肺周?chē)练e提高。提高呼吸頻率和深度都導(dǎo)致分鐘量提高。
以含有達(dá)約10％二氧化碳?xì)怏w的空氣混合物中施用氣溶膠化藥物，導(dǎo)致藥物在呼吸系統(tǒng)中沉積提高，可測(cè)量的提高氣溶膠藥物傳遞的效率和療效。優(yōu)選濃度包括2.5％、5％和7.5％二氧化碳?xì)怏w?？墒┯脷馊苣z1-30分鐘或更長(zhǎng)。二氧化碳的增強(qiáng)作用在30秒內(nèi)是明顯的。二氧化碳的呼吸作用是瞬時(shí)的，可重復(fù)使用。
給出了下列實(shí)施例，為了說(shuō)明本發(fā)明的各種實(shí)施方式，而不是為了以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1材料從Xechem(New Brunswick，NJ)獲得了PTX。從Sigma(St.Louis，MO)獲得了CPT，從ChemWerth(Woodbridge，CN)獲得了9NC。從Avanti PolarLipids(Alabaster，AL)購(gòu)得二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)。從Sigma(St.Louis，MO)購(gòu)得DMSO，HPLC級(jí)的其它有機(jī)溶劑購(gòu)自Fisher Scientific。用于沖洗的無(wú)菌水來(lái)自Baxter Healthcare Corporation(Deerfield，IL)。
從Harlan-Sprague Dawley(Indianapolis，IN)獲得了ICR小鼠(7-8周齡)，關(guān)在標(biāo)準(zhǔn)籠中，提供食物和水，讓其自由進(jìn)食。雌性C57BL/6小鼠(8-9周齡)和雌性Balb/C小鼠(5-7周齡)從Harlan-Sprague Dawley(Houston，TX)獲得。所有動(dòng)物的護(hù)理根據(jù)Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and UseCommittee。
主要用細(xì)菌的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT，p4119，ref.15)作為測(cè)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)道基因。CAT基因在人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件的控制下。插入CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件和人生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列修飾的熒光素酶質(zhì)粒(pGL3，Promega，Madison，WI)由Dr.Michael Barry(Center for Cell and GeneTherapy，Baylor)贈(zèng)送。所有質(zhì)粒在Qiagen柱(Qiagen，Valencia，CA)上純化，并且是無(wú)內(nèi)毒素的。用260納米的紫外吸收定量質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒是主要的超螺旋質(zhì)粒和少量帶切口的質(zhì)粒的混合物。
含有p53基因的質(zhì)粒是從Dr.Y.K.Fung(Children’s Hospital，LosAngeles，Ca)獲得的。p53基因在人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件的控制下。作為對(duì)照的質(zhì)粒含有螢火蟲(chóng)熒光素酶(Luc)基因，從Dr.Michael Barry(BaylorCollege of Medicine)獲得。由Bayou Biolabs(Harahan，LA)商業(yè)純化的質(zhì)粒沒(méi)有內(nèi)毒素，用紫外吸光度定量。瓊脂糖凝膠分析揭示質(zhì)粒主要是超螺旋形式，有少量帶切口的質(zhì)粒。
B16-F10黑素瘤細(xì)胞系獲自Division of Cancer Treatment and DiagnosisCenter(DCTDC，NCE，F(xiàn)rederick，MD)，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。已證明細(xì)胞系在肺中形成腫瘤(15)。每只C57BL/6小鼠通過(guò)尾靜脈注射含25,000個(gè)B16-F10細(xì)胞的200微升培養(yǎng)液。目測(cè)接種細(xì)胞后2周內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。用3-12代的細(xì)胞。
實(shí)施例2統(tǒng)計(jì)法在進(jìn)行變量單向分析(ANOVA)比較平均值時(shí)，進(jìn)行了雙側(cè)不成對(duì)Student檢驗(yàn)。如果P≤0.05，視為差異顯著。
實(shí)施例3脂質(zhì)體的制備在叔丁醇中分別以100、10和1mg/ml用先前描述的方法(17)制備DLPC、PTX和喜樹(shù)堿儲(chǔ)液。以1∶10的重量比混合紫杉醇和DLPC等份。喜樹(shù)堿與DLPC的重量比是1∶50。然后在液氮中冷凍藥物-磷脂混合物，過(guò)夜凍干成干粉。-20℃密封儲(chǔ)藏制劑。在使用前用無(wú)菌水用于沖洗重建混合物，并渦動(dòng)直到獲得均勻的多層脂質(zhì)體懸液。噴霧前懸液中喜樹(shù)堿和紫杉醇的最初濃度分別是0.5mg/ml和10mg/ml。噴霧前后脂質(zhì)體的大小用Nicomp亞微米顆粒分級(jí)器370型9NICOMP，SantaBarbara，CA測(cè)定。
實(shí)施例4氣溶膠顆粒大小特征用Andersen/AFCM非生命的環(huán)境顆粒定徑取樣機(jī)(Andersen Instruments，Atlanta，GA)估計(jì)了含脂質(zhì)體包裹的藥物的氣溶膠顆粒的特征(31)。在以10L/分鐘流過(guò)AERO-MIST噴霧器的空氣或氣體混合物產(chǎn)生的氣溶膠中藥物濃度也通過(guò)采集在最初氣溶膠化后1分鐘開(kāi)始的3分鐘內(nèi)的樣品測(cè)量。質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑(MMAD)和幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)如所述(30，31)用KaleidaGraph 2.0軟件(SynergySoftware，Reading，PA)計(jì)算。
實(shí)施例5紫杉醇和喜樹(shù)堿的氣溶膠傳遞如上所述(16-18)用氣溶膠進(jìn)行小鼠的治療。簡(jiǎn)單說(shuō)，用AERO-MIST噴射噴霧器(CIS-USA，Bedford.MA)以空氣流速10L/min產(chǎn)生氣溶膠顆粒。將小鼠置于密封的塑料籠(23×18×13厘米)，并接觸氣溶膠30分鐘。用混合器(Bird 3m，PalmSprings，CA)混合正?？諝夂虲O2，用獲得的正?；蚝?％CO2的空氣產(chǎn)生氣溶膠，用Fluid Fyrite(Bacharach Inc.，Pittsbuegh，PA)校準(zhǔn)CO2濃度。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從籠中取出3只小鼠，通過(guò)接觸異氟烷(USP)(Abbott Laboratories，Chicago，IL)放血?dú)⑺馈Ｇ邢缕鞴?，稱重并冷凍在-70℃直到提取。
實(shí)施例6從組織中提取藥物在提取前，融化樣品并立即用剪刀剪成小塊。為了從組織抽提紫杉醇，在各樣品中加入3毫升乙酸乙酯并在微型珠粒打漿機(jī)(Wig-L-Bug，3110B型，CrescentDental MFR Co.，Lyons，IL)中勻漿2分鐘。將勻漿轉(zhuǎn)移到10毫升錐形玻璃離心管中，1,000xg離心10分鐘。分離上清液部分，用空氣蒸發(fā)有機(jī)溶劑。在0.2毫升甲醇∶乙腈(2∶1，v/v)重建剩余物，在水浴超聲器中超聲，1,000xg離心10分鐘。將上清液部分溫?zé)嶂?7℃30分鐘，用HPLC分析。
喜樹(shù)堿和9NC的提取過(guò)程如前所述(17)。簡(jiǎn)單說(shuō)，在融化組織后，在器官中加入20微升體積(含20微克的9NC)，作為內(nèi)標(biāo)來(lái)確定提取效率。樣品切成小塊，在各樣品中加入1毫升0.1％的乙酸水溶液，pH3.2。在微型珠粒打漿機(jī)中勻漿后，以1,000xg離心勻漿5分鐘。重新用8毫升二氯甲烷提取上清液部分。分離有機(jī)部分并在室溫下風(fēng)干。干燥的樣品在0.2毫升乙腈中重建。
實(shí)施例7HPLC分析用反相HPLC以Waters 486紫外吸光度檢測(cè)器(Waters，Milford，MA)于227nm處監(jiān)測(cè)定量紫杉醇。在室溫下，Waters Nova-Pak C18柱(3.9×150cm)進(jìn)行所有測(cè)量。流動(dòng)相由49％乙腈和51％水組成。流速是1.5ml/min。注射各樣品25微升一份，用Waters millennium軟件分析數(shù)據(jù)。PTX提取效率的測(cè)定，當(dāng)在各組織中加入已知量的紫杉醇時(shí)，采用相同的程序，并與紫杉醇的提取量比較。提取效率(％)的計(jì)算為((提取后的紫杉醇量)/(加入的紫杉醇量))×100。對(duì)于所有測(cè)試的組織，平均提取效率是89±4％(數(shù)據(jù)未顯示)，該指數(shù)用于計(jì)算組織中藥物的最終濃度。
用Waters NovaPak C18柱(3.9×150厘米)進(jìn)行喜樹(shù)堿的HPLC分析(17)。以Waters 470掃描熒光檢測(cè)器(λex＝360nm，λem＝455nm)監(jiān)測(cè)喜樹(shù)堿的色譜，而用Waters 440UV吸收檢測(cè)器在254納米檢測(cè)9NC。流動(dòng)相由30％乙腈和70％0.1％的乙酸水溶液，pH3.5構(gòu)成，流速為1.2ml/min(16，17)。
實(shí)施例8脂質(zhì)體制劑的氣溶膠特征表1總結(jié)了CPT-DLPC和PTX-DLPC脂質(zhì)體的性質(zhì)及其氣溶膠特征。用5％CO2-空氣不改變氣溶膠中任一藥物的濃度或其MMAD和GSD(P＞0.1；Student t-檢驗(yàn)，雙側(cè))。噴霧過(guò)程將兩種藥物制劑的溶液中脂質(zhì)體顆粒的大小從微米減小到納米顆粒。用5％CO2-空氣混合物，CPT-DLPC的脂質(zhì)體大小從噴霧前的2.54±0.91微米降低到噴霧后的0.49±0.07微米。對(duì)于PTX-DLPC制劑，這些值分別是13.14±12.15微米和0.23±0.17微米。噴霧前后氣溶膠的粒徑使用正?；?％CO2-空氣施用的PTX-DLPC或CPT-DLPC無(wú)差異(P＞0.5，Student t-檢驗(yàn)，雙側(cè))。
表1用5％CO2-空氣與正?？諝獗容^，PTX-DLPC和CPT-DLPC制劑的氣溶膠和脂質(zhì)體特征
數(shù)值是平均值±SD(每個(gè)值n＝3)。MMAD質(zhì)量中位空氣動(dòng)力直徑，GSD幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例9用正?；蚝?％CO2的空氣產(chǎn)生的氣溶膠傳遞后CPT-DLPC的組織分布和藥物動(dòng)力學(xué)ICR小鼠分成兩組第一組(n＝4)接受通過(guò)用正常空氣產(chǎn)生的氣溶膠傳遞的CPT-DLPC制劑30分鐘，因此它們的呼吸參數(shù)在治療中不變；第二組(n＝6)吸入相同的制劑，但用含5％CO2的空氣。
吸入含5％CO2的空氣產(chǎn)生的氣溶膠導(dǎo)致肺中喜樹(shù)堿的沉積顯著增加(2.1-3.5倍)(圖1)。分別從第一和第二組的小鼠肺組織中檢測(cè)出CPT在134±123和476±216ng/g。用含5％CO2的空氣不改變組織分布情況。吸入用5％CO2-空氣產(chǎn)生的CPT-DLPC氣溶膠后也提高了肝臟、脾臟、腎臟、血液和大腦中的藥物濃度。
測(cè)定了在與用正?；蚝?％CO2的空氣的CPT-DLPC氣溶膠接觸30分鐘過(guò)程中或以后喜樹(shù)堿在肺中的藥物動(dòng)力學(xué)沉積(圖2)。治療中喜樹(shù)堿肺部濃度提高，在氣溶膠治療(30分鐘)終點(diǎn)濃度最大(Cmax)，隨后肺濃度開(kāi)始下降。峰呼吸水平對(duì)于正常和含5％CO2的空氣分別是232±158和486±78ng/g組織。在氣溶膠停用后15分鐘時(shí)間內(nèi)，藥物濃度指數(shù)下降。兩種治療的清除半衰期(T1/2)是12-15分鐘。藥物動(dòng)力學(xué)曲線的形狀對(duì)于兩種治療類型都非常相似。在用任何空氣來(lái)源氣溶膠化結(jié)束后90分鐘肺內(nèi)(120分鐘的時(shí)間點(diǎn))僅檢測(cè)到痕量的藥物。
實(shí)施例10通過(guò)用正常或含5％CO2的空氣產(chǎn)生的PTX-DLPC氣溶膠傳遞后PTX的組織分布和藥物動(dòng)力學(xué)由于檢測(cè)方法的限制，使用10mgPTX/ml懸液的脂質(zhì)體配方。在接觸(15分鐘)的中途，治療終點(diǎn)(30分鐘)和在治療結(jié)束后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)殺死小鼠。小鼠接觸用正常空氣或含5％CO2的空氣產(chǎn)生的PTX-DLPC氣溶膠。
在用任何空氣來(lái)源治療(30分鐘)的終點(diǎn)，得到肺紫杉醇Cmax濃度(圖3)。在用含5％CO2的空氣組中Cmax比環(huán)境空氣組增加到4.2倍(分別是23.1±4.3和5.5±0.2微克/克)。該二氧化碳誘導(dǎo)的增強(qiáng)與脂質(zhì)體配方無(wú)關(guān)(圖4)。當(dāng)用含5％CO2的空氣時(shí)，用二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000和二月桂酰磷脂酰膽堿制備的空間穩(wěn)定的紫杉醇脂質(zhì)體在肺中以相當(dāng)?shù)乃匠练e。
用5％CO2的治療產(chǎn)生了肺濃度-時(shí)間曲線下面積為正?？諝獾?.7倍的沉積(分別是33.7和5.9微克-小時(shí)/克)。在兩種情況下，在治療結(jié)束后PTX濃度開(kāi)始從肺組織中下降。當(dāng)用正?？諝猱a(chǎn)生氣溶膠時(shí)，肺中紫杉醇的T1/2α和T1/2β值分別是0.3和1.6小時(shí)。用含5％CO2的空氣產(chǎn)生的脂質(zhì)體氣溶膠施用紫杉醇，T1/2α是0.7小時(shí)，T1/2β是5.1小時(shí)。進(jìn)行了其它器官，例如肝、脾、腎和血液的比較性分析然而用正常空氣氣溶膠化的紫杉醇在這些組織中的水平在可檢測(cè)水平以下。
表2列出了用含5％CO2的空氣脂質(zhì)體氣溶膠傳遞后紫杉醇的組織分布。在肺中檢測(cè)出藥物的最高濃度。在其它器官中發(fā)現(xiàn)更低的濃度。用梯形規(guī)則分析3小時(shí)內(nèi)不同組織的濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUC)分別顯示下列對(duì)于肺、肝、腎、血液和腦的AUC值34±2、9.8±1.9、2.4±1.4、2.8±1.5、0.13±0.10、0.23±0.2微克PTS-小時(shí)/克組織。
表230分鐘接觸用含5％CO2的空氣產(chǎn)生的氣溶膠PTX-DLPC*的過(guò)程中和過(guò)程后組織中的PTX沉積
數(shù)值是三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD(在每次實(shí)驗(yàn)中合并來(lái)自3只小鼠的器官并處理)。
實(shí)施例11二氧化碳誘導(dǎo)的呼吸模式對(duì)于藥物沉積的影響在吸入含5％CO2的空氣后肺中發(fā)現(xiàn)的肺部藥物濃度提高可以用呼吸模式的改變來(lái)解釋。小鼠在含5％CO2的空氣中呼吸模式可見(jiàn)變得深而且慢，在處理終點(diǎn)幾乎馬上回到正常。組織學(xué)分析并未揭示肺組織中的任何改變。其它研究者進(jìn)行的體積描記法研究顯示吸入含5％CO2的空氣提高哺乳動(dòng)物中的通氣，主要是因?yàn)樘岣吡顺睔饬?約170-180％)(18，19)。喜樹(shù)堿和紫杉醇的平均肺沉積提高到約2-4倍。這與潮氣量的增加不成比例，可能因?yàn)楹粑鼌?shù)有一些其它的生理變化，例如呼吸頻率、吸氣和呼氣循環(huán)的呼吸持續(xù)時(shí)間，和分鐘通氣(13)。通過(guò)深呼氣和完全呼出以及屏息，氣溶膠的滯留與正常呼吸相比增加到幾乎兩倍(15)。
實(shí)施例12PEI-DNA復(fù)合物的制備PEI(25kDa，分枝)購(gòu)自Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)。制備濃度為4.3mg/ml(0.1M氮)的PBS溶液，pH7-7.5的PEI儲(chǔ)液。分別將PEI和DNA與5毫升水以所需濃度混合。緩慢旋轉(zhuǎn)PEI溶液，在其中加入DNA溶液，得到最終濃度為10毫升。混合混合物，在室溫下放置15-20分鐘，然后噴霧。得到的負(fù)荷比表示成PEI氮∶DNA磷(N∶P)，可通過(guò)將DNA看做每微克具有3納摩爾磷，1微升0.1MPEI溶液具有100納摩爾胺氮計(jì)算。10∶1 N∶P比對(duì)應(yīng)于1∶29.1 PEI∶DNA重量比。
實(shí)施例13PEI∶DNA復(fù)合物的氣溶膠傳遞將小鼠置于塑料籠中，氣溶膠傳遞前用膠帶密封(48)。這是非約束的全身氣溶膠接觸系統(tǒng)。用Aero-Mist噴霧器(CIS-US，Inc.Bedford，MA)以10升/分鐘流速，用空氣或含5％CO2的空氣氣溶膠化PEI-DNA復(fù)合物。Aero-Mist是高通量、有效的噴霧器，已證明用Andersen級(jí)聯(lián)沖擊取樣器(Andersen Instruments，Atlanta，GA)通過(guò)先前描述的方法(50)能產(chǎn)生最佳范圍在1-2微米MMAD，幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)2.9的氣溶膠。干燥空氣源(Aridyne 3500，Timeter，Lancaster，PA)傳遞給Bird 3M氣體混合器(Palm Springs，CA)，它與空氣壓縮機(jī)和CO2罐相連。得到的空氣和CO2的混合物傳遞給噴霧器。用Fyrite溶液(Bacharach，Pittsburgh，PA)測(cè)定在空氣中的最終濃度為5％CO2。噴霧10毫升溶液花約30分鐘。
實(shí)施例14CAT測(cè)定在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后麻醉并殺死小鼠，收集肺和其它組織，稱重并立即冷凍。用CAT ELISA試劑盒(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)測(cè)量體內(nèi)表達(dá)。組織在700微升CAT測(cè)定裂解緩沖液中用Wig-L-Bug珠粒勻漿器(CrescentDental Mfg.Lyon，II)勻漿組織。勻漿離心后，200衛(wèi)生提取液用于以96孔板形式進(jìn)行的CAT ELISA用微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)讀出吸光度。用未經(jīng)處理的小鼠作為對(duì)照。用純化的CAT酶制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將CAT活性表達(dá)成ng CAT/克組織。測(cè)定的靈敏度可根據(jù)廠商的建議進(jìn)一步提高，因此可檢測(cè)低至0.1-0.3pg/孔的CAT蛋白水平。
實(shí)施例15熒光素酶測(cè)定麻醉并殺死小鼠，收集肺。用熒光素酶測(cè)定試劑盒(Promega)測(cè)量熒光素酶表達(dá)。肺在1毫升熒光素酶測(cè)定裂解緩沖液中用Wig-L-Bug珠粒勻漿器勻漿。離心勻漿后，將10微升提取物加到50微升熒光素酶底物中，在96孔板中用光度計(jì)(Microlumat LB 96 P，EG&G Berthold，Germany)讀出熒光10秒鐘。用未經(jīng)處理的小鼠作為對(duì)照。熒光素酶活性表達(dá)成RLU/10s/g組織。在該系統(tǒng)中，用純化的Promega的熒光素酶，107RLU對(duì)應(yīng)于1納克熒光素酶。
實(shí)施例16組織切片的組織學(xué)分析用異氟烷麻醉小鼠并通過(guò)腹主動(dòng)脈放血?dú)⑺?。分離肺，插管，并通過(guò)用10％中性緩沖的甲醛膨脹固定，包埋在石蠟中，加工后用于組織學(xué)分析。該切片切成4微米，用蘇木精和曙紅染色在顯微鏡下觀察任何炎癥或毒性的跡象。
實(shí)施例17髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)定接觸氣溶膠后24小時(shí)，用異氟烷麻醉小鼠，并通過(guò)腹主動(dòng)脈放血?dú)⑺?。?jīng)心臟后灌注鹽水后收集肺。如前所述在溴化十六烷基三甲基銨(0.5％HTAB在50mM磷酸緩沖液中(pH6.0)的溶液；5ml HTAB/g組織)中勻漿組織(51)。在離心后，用二鹽酸鄰聯(lián)茴香胺(o-diasinidine dihydrochloride)(0.167mg/ml)加上0.0005％過(guò)氧化氫確定上清液中的MPO活性。在460納米用微量滴定板讀數(shù)器(MolecularDevices)測(cè)量吸光度。記錄15分鐘后的絕對(duì)值。用未經(jīng)處理的小鼠作為對(duì)照。
實(shí)施例18用5％CO2噴霧PEI-DNA復(fù)合物與正?？諝庀啾忍岣叻沃械霓D(zhuǎn)基因表達(dá)呼吸含5％CO2的空氣與小鼠與人的潮氣量和呼吸頻率的增加有關(guān)(52-54)。當(dāng)用含5％CO2的空氣傳遞PEI-DNA氣溶膠時(shí)，小鼠可見(jiàn)呼吸更深更快。吸入含5％CO2的氣溶膠與用空氣傳遞的氣溶膠所實(shí)現(xiàn)的相比可導(dǎo)致氣溶膠顆粒吸入更多，并相應(yīng)更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因?yàn)槌睔饬亢秃粑l率增加。
用正?？諝饣蚝?％CO2的空氣的氣溶膠將PEI-DNA復(fù)合物傳遞給Balb/c小鼠。如上所述噴霧30分鐘固定量的CAT質(zhì)粒(1mg/10ml溶液)，N∶P比為10∶1。24小時(shí)后收集肺，進(jìn)行CAT測(cè)定來(lái)確定轉(zhuǎn)染程度。含5％CO2的空氣導(dǎo)致與單獨(dú)用空氣噴霧的氣溶膠相比檢測(cè)到的CAT水平增加到3倍(P＝0.001)(圖5)。另外，5％CO2并不改變得到的藥物-脂質(zhì)體氣溶膠顆粒的粒徑。
還檢測(cè)了用不同百分比的含CO2的空氣使固定量的CAT質(zhì)粒氣溶膠化增強(qiáng)PEI-DNA轉(zhuǎn)移至肺。用0％、2.5％、5％、10％和對(duì)照量的空氣中的二氧化碳?xì)馊苣z化該復(fù)合物。測(cè)定的CAT活性表明用2.5％或10％提供了與用含5％CO2的空氣相同的轉(zhuǎn)染水平(圖6)。
可能是增加的CO2通過(guò)改變其它生理參數(shù)影響PEI-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。然而CO2與空氣相比，不顯著改變PEI-DNA溶液的pH，也不改變得到的氣溶膠液滴的粒徑。肺中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增加最有可能與氣溶膠顆粒的沉積增加有關(guān)。含5％CO2的空氣能幫助優(yōu)化其它聚合物-DNA或陽(yáng)離子脂質(zhì)-DNA復(fù)合物的氣溶膠傳遞(45)。人完全能忍受該CO2百分?jǐn)?shù)，并且顯示分鐘量增加(54，55)，因此如果考慮到人肺部系統(tǒng)的大小、幾何學(xué)和生理學(xué)，該策略能有效針對(duì)人的肺部疾病。
實(shí)施例19PEI傳遞DNA是劑量依賴性的為了進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)基因表達(dá)，N∶P比維持在10∶1，DNA量從每10毫升氣溶膠化的溶液250微克變到4毫克。這導(dǎo)致儲(chǔ)器濃度和氣溶膠輸出中噴霧的總DNA量增加。
計(jì)算的Aerotech II噴霧器的噴霧輸出大約是80％。約72％儲(chǔ)器的DNA傳遞到吸入室，如用全玻璃沖擊器(AGI)所估計(jì)的(50)。剩余的留在T形接頭和管道中?；谛∈蟊粍?dòng)鼻式呼吸，肺生理學(xué)(分鐘量和沉積比例)(50)和氣溶膠的輸出濃度(4.8微克/升)，沉積在小鼠肺中的DNA量估計(jì)在30分鐘氣溶膠接觸中是約4-5微克(對(duì)于起始儲(chǔ)器濃度是2毫克DNA/10毫升的溶液)。這些計(jì)算基于正?？諝夂粑?；沉積在5％CO2存在時(shí)會(huì)更高，因?yàn)槌睔饬亢秃粑l率增加(53)。
用含5％CO2的空氣氣溶膠化復(fù)合物，2毫克DNA得到肺中最高的CAT表達(dá)水平(圖7)。用250微克DNA測(cè)得的CAT水平與對(duì)照肺中統(tǒng)計(jì)上沒(méi)有差異(P＝0.34)。另外，當(dāng)將4毫克DNA以N∶P比為10∶1溶于10毫升時(shí)，導(dǎo)致DNA肉眼可見(jiàn)沉淀，這可能是在肺中與2毫克相比未檢測(cè)到CAT水平進(jìn)一步提高的原因(P＝0.51)。
應(yīng)注意DNA傳遞的濃度和量都有增加。然而可能進(jìn)一步通過(guò)延長(zhǎng)最佳濃度的氣溶膠接觸時(shí)間提高肺中的表達(dá)。肺中的這些表達(dá)水平與用其它傳遞系統(tǒng)相當(dāng)(34)。
實(shí)施例20PEI-DNA比的優(yōu)化雖然PEI可在噴霧過(guò)程中保護(hù)DNA，并導(dǎo)致當(dāng)與大多數(shù)其它陽(yáng)離子脂類相比，氣溶膠傳遞后在肺中更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，確定基因傳遞的最佳參數(shù)是有益的。任何陽(yáng)離子載體和帶負(fù)電的DNA之間的電荷相互作用是確定復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的重要因素。先前的研究確定了用于肺中的轉(zhuǎn)染的最佳PEI-DNA(N∶P)比(38，56)。然而，這些研究與PEI-DNA傳遞的靜脈內(nèi)模式有關(guān)。氣溶膠基因傳遞可能需要不同的條件。
為了確定體內(nèi)氣溶膠傳遞理想的投料配比，評(píng)估了不同PEI-DNA(N∶P)比轉(zhuǎn)染肺的能力。DNA量維持在2毫克不變，改變PEI濃度以獲得5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1和20∶1的比率?；谙惹绑w外和體內(nèi)(通過(guò)滴注)研究選擇這些比例(43)。用含5％CO2的空氣氣溶膠化復(fù)合物。15∶1的N∶P比在肺中獲得最高水平的CAT表達(dá)，而5∶1得到的CAT表達(dá)水平非常低(圖8)。在10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1和20∶1的比例之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P＞0.1)，但是在15∶1和20∶1之間(P＝0.05)，10∶1和15∶1(P＝0.014)之間存在顯著差異。
為了確定除了CAT以外的質(zhì)粒的最佳比例，試驗(yàn)了肺中熒光素酶基因表達(dá)的不同N∶P比例。評(píng)估的比例是5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1和40∶1。與CAT比較，熒光素酶的最佳曲線向右漂移，最高表達(dá)在20∶1(與其它比例比較P＜0.05)(圖8)。這提示不同質(zhì)?？尚枰煌腘∶P比；熒光素酶質(zhì)粒的不同大小導(dǎo)致其與PEI的復(fù)合與CAT質(zhì)粒結(jié)構(gòu)上不同。也可能是由于質(zhì)粒純度的不同以及超螺旋結(jié)構(gòu)比率的不同。但在這兩種質(zhì)粒的最佳N∶P比例之間還有可觀的重疊。不同質(zhì)粒的最佳比例也許是不同的?？紤]實(shí)驗(yàn)變異性，10∶1和20∶1之間的比例將起到合適的作用。低于10∶1的比例在肺中不產(chǎn)生非常高的轉(zhuǎn)染。這些結(jié)果與用分枝的25K PEI獲得的那些結(jié)果一致，雖然傳遞模式是靜脈內(nèi)(56)。
實(shí)施例21一次氣溶膠傳遞后肺中CAT表達(dá)的時(shí)間過(guò)程還用CAT表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。單劑氣溶膠傳遞后CAT表達(dá)持續(xù)性的分析提供了策劃治療研究的治療方案的重要信息。用含5％CO2的空氣對(duì)小鼠以兩種不同的N∶P比15∶1和10∶1噴霧2毫克CAT質(zhì)粒。對(duì)于10∶1組檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)是氣溶膠接觸后1、2、3和6天。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集肺和其它組織，立即冷凍。在最后的時(shí)間點(diǎn)后同時(shí)測(cè)定所有組織(第6天)。對(duì)于15∶1組在氣溶膠治療后1、3、7和10天殺死小鼠。在各時(shí)間點(diǎn)后收集肺，稱重，冷凍，在最后的時(shí)間點(diǎn)后測(cè)定CAT蛋白質(zhì)(第10天)。
對(duì)于檢測(cè)的兩種N∶P比，CAT表達(dá)在24小時(shí)時(shí)最高，并維持三天不變(在第1天和第3天之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)于15∶1的比例P＝0.4，對(duì)于10∶1的比例P＝0.12)(圖10A和10B)。CAT水平在一周后下降到峰水平的約50％，在10天后仍檢測(cè)到顯著的水平(與對(duì)照相比P＝0.001)。這提示傳遞足夠比各種臨床應(yīng)用的量多得多?；虮磉_(dá)持續(xù)達(dá)10天與其它用于滴注或氣溶膠傳遞基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)相似或更高(34，58)。
實(shí)施例22轉(zhuǎn)基因的組織分布靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)傳遞DNA載體通常導(dǎo)致在各種組織中的表達(dá)。為了確定氣溶膠傳遞PEI-DNA是否也導(dǎo)致全身性基因傳遞，從上述實(shí)驗(yàn)(從10∶1組)的同一組小鼠收集不同組織，在最后時(shí)間點(diǎn)后進(jìn)行CAT測(cè)定。測(cè)定的組織是肺、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、腦和血液。在非肺組織中檢測(cè)到的CAT水平非常低，與對(duì)照組織相比沒(méi)有顯著差異(對(duì)于所有組織p＞0.1)(圖11)。
組織分布數(shù)據(jù)顯示該系統(tǒng)中氣溶膠傳遞后基因表達(dá)限于肺，表明僅有極小的全身性傳遞。與肺相反，當(dāng)用PEI-DNA氣溶膠傳遞時(shí)，肝、脾和腎等組織顯示不顯著或不能檢測(cè)的CAT表達(dá)，而當(dāng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥時(shí)，它們通常顯示可檢測(cè)的表達(dá)水平。如果感興趣的基因表達(dá)要限于肺時(shí)，這是重要的。在其它研究中，基因傳遞的氣管內(nèi)傳遞模式用于將基因局限于肺(58)。然而，這與氣溶膠相比是一種侵入性的技術(shù)，并導(dǎo)致在肺周?chē)鷧^(qū)域較不均勻沉積。氣溶膠傳遞幫助將顆粒非侵入性和均勻的分布在整個(gè)肺中。
實(shí)施例23組織學(xué)分析不顯示炎癥跡象為了確定用該系統(tǒng)氣溶膠傳遞PEI-DNA復(fù)合物是否在該系統(tǒng)中導(dǎo)致任何毒性或急性炎癥，將2毫克CAT質(zhì)粒與PEI以15∶1的N∶P比復(fù)合，使小鼠與氣溶膠用含5％CO2的空氣接觸30分鐘。24小時(shí)后殺死小鼠，將肺固定在福爾馬林中，用蘇木精和伊紅染色。如圖12所示，在檢查薄的切片時(shí)肺不顯示任何組織學(xué)異常的證據(jù)，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或肺損傷。用含5％CO2的空氣通過(guò)PEI-DNA氣溶膠優(yōu)化肺部基因傳遞看來(lái)對(duì)于肺是安全而高度特異性的。
雖然在該系統(tǒng)中單劑氣溶膠接觸甚至一周后都檢測(cè)到高水平的表達(dá)，一些治療仍然需要重復(fù)并頻繁的傳遞基因。需要確定延長(zhǎng)的PEI-DNA氣溶膠接觸對(duì)肺和其它組織的作用。
實(shí)施例24髓過(guò)氧化物酶測(cè)定不顯示任何炎癥急性肺部炎癥部分是由多形核白細(xì)胞(PMN)匯集到周?chē)M織介導(dǎo)的。多形核白細(xì)胞的一個(gè)生物化學(xué)標(biāo)記是髓過(guò)氧化物酶(MPO)，它是在嗜苯胺藍(lán)粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的含血紅素的酶，常常用作肺中的炎癥標(biāo)記(18)。為了評(píng)估中性粒細(xì)胞對(duì)肺的浸潤(rùn)，將2毫克CAT質(zhì)粒與PEI以15∶1的N∶P比復(fù)合，用含5％CO2的空氣使小鼠與氣溶膠接觸30分鐘。24小時(shí)后殺死小鼠，收集肺，并進(jìn)行髓過(guò)氧化物酶測(cè)定(表3)。
對(duì)照和接觸氣溶膠的肺中的髓過(guò)氧化物酶含量無(wú)顯著差異(P＝0.92)。髓過(guò)氧化物酶測(cè)定不揭示對(duì)照和接觸氣溶膠的肺之間的任何差異，即在對(duì)照和接觸氣溶膠的肺的絕對(duì)吸光度值(OD)之間，甚至在反應(yīng)保溫15分鐘后也無(wú)差異(對(duì)照OD是0.078±0.009，氣溶膠接觸的肺是0.084±0.004，P＞0.5)。
表3評(píng)估中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)肺的髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)定
注∶將2毫克CAT質(zhì)粒與PEI以N∶P比為15∶1復(fù)合，用含5％CO2的空氣將復(fù)合物向5只小鼠噴霧30分鐘。24小時(shí)后殺死小鼠，收集肺進(jìn)行MPO測(cè)定。數(shù)值是平均值±SD(n＝每組5只小鼠)。
實(shí)施例25P53試驗(yàn)用ELISA試劑盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)測(cè)定P53表達(dá)。對(duì)于體外表達(dá)，用PEI∶DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染在組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的B16-F10細(xì)胞(20,000細(xì)胞/孔，48孔培養(yǎng)板)24小時(shí)。然后洗滌培養(yǎng)物，用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞。離心后，用100微升裂解液進(jìn)行p53 ELISA。將p53水平標(biāo)定到用BCA蛋白測(cè)定(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定的總蛋白質(zhì)含量。對(duì)于體內(nèi)表達(dá)，使小鼠與PEI∶p53氣溶膠接觸，24小時(shí)后殺死，收集肺并稱重。在1毫升冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液(20mMTris，0.5mM EDTA，1％Nonidet P40，0.05％SDS，1mM PMSE，1微克/毫升胃酶抑素，2微克/毫升亮抑酶肽)中用Wig-L-Bug珠粒勻漿器(Crescent，Lyons，IL)勻漿肺。4℃離心后，用100微升上清液在96孔板中進(jìn)行p53 ELISA。用MolecularDevices(Sunnyvale，CA)微量滴定板讀數(shù)器讀出吸光度(450納米)一式三份。用純化p53制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定p53量。該測(cè)定可檢測(cè)低至10pg/ml的p53水平，該測(cè)定法的線性測(cè)量范圍是50-1000pg/ml。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定了肺中總蛋白含量。
實(shí)施例26PEI-p53復(fù)合物以氣溶膠傳遞后小鼠肺中的P53表達(dá)如上對(duì)于PEI∶DNA復(fù)合物所述制備PEI-p53復(fù)合物。將2毫克p53質(zhì)粒與聚乙二亞胺以PEI∶DNA(N∶P)10∶1復(fù)合，用含5％CO2的空氣噴霧給C57BL/6小鼠。將小鼠置于塑料籠內(nèi)，用膠帶在氣溶膠傳遞前密封。這是無(wú)約束的，全身氣溶膠接觸系統(tǒng)。用Aero-Mist噴霧器在如本文先前對(duì)于氣溶膠化聚乙二亞胺∶CAT復(fù)合物所述的5％CO2存在下氣溶膠化PEI-p53復(fù)合物。
用ELISA在PEI-p53復(fù)合物氣溶膠傳遞給小鼠后24小時(shí)分析肺中的P53表達(dá)。氣溶膠傳遞復(fù)合物導(dǎo)致肺組織中檢測(cè)到的p53水平與未經(jīng)處理的小鼠肺中檢測(cè)到的比較約增加了4倍。對(duì)照小鼠中p53的水平是0.0398±0.01pg/mg蛋白，而給予氣溶膠的小鼠是0.0404±0.008pg/mg蛋白(數(shù)值是平均值±SD)(59)。與PEI-Luc接觸不導(dǎo)致p53水平的任何增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例27氣溶膠傳遞PEI-p53抑制B16-F10肺轉(zhuǎn)移在第0天C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射25,000 B16-F10細(xì)胞。用含5％CO2的空氣產(chǎn)生的聚乙二亞胺-p53氣溶膠復(fù)合物一周治療小鼠兩次，從癌細(xì)胞接種入小鼠后一天開(kāi)始(第1、4、8、11、15、18和22天)，最后一次治療在注射后22天(共接觸7次氣溶膠)。對(duì)照組包括未治療的小鼠，用聚乙二亞胺或聚乙二亞胺-Luc氣溶膠復(fù)合物治療的小鼠。大約腫瘤細(xì)胞接種后24天對(duì)照動(dòng)物開(kāi)始死亡，這是停止治療，實(shí)驗(yàn)終止的時(shí)間。治療劑量是2毫克質(zhì)粒/10毫升氣溶膠化的溶液，聚乙二亞胺∶DNA(N∶P)比是10∶1。這是給這些小鼠的氣溶膠化DNA的總量。估計(jì)傳遞給每只小鼠的DNA量在正?？諝獯嬖谙率羌s4-5微克，在5％CO2存在下由于潮氣量和分鐘量增加而增加。
在腫瘤接種后24天，殺死小鼠，固定肺并計(jì)算腫瘤指數(shù)。用PEI-p53治療的小鼠具有非常低的腫瘤指數(shù)(與所有其它組比較P＜0.001)，而所有對(duì)照組都有大量的腫瘤結(jié)節(jié)(圖13A、13B)。大部分未治療的小鼠和單獨(dú)用聚乙二亞胺或聚乙二亞胺-Luc治療的小鼠具有許多不可計(jì)數(shù)的腫瘤結(jié)節(jié)，并侵入胸壁，而在肺外組織，例如頸部和腹部淋巴結(jié)中有轉(zhuǎn)移。然而，所有用聚乙二亞胺-p53復(fù)合物治療的小鼠具有非常小而明顯的腫瘤病灶，不侵入胸壁，沒(méi)有肺外轉(zhuǎn)移腫瘤。5％CO2單獨(dú)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)與未治療小鼠相比沒(méi)有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。肺重量也顯示PEI-p53治療組和所有對(duì)照組之間的顯著差異(p＜0.01)(圖13C)。
引用了下列文獻(xiàn)。
1.Persons等，吸濕性非均一氣溶膠的氣道沉積計(jì)算機(jī)模型的結(jié)果。J Appl.Physiol.631195-1204(1987)。
2.Persons等，肺吸濕性氣溶膠沉積的最大化。J.Appl.Physiol.631205-1209(1987)。
3.Schlenker，E.H.，djungarian倉(cāng)鼠(Phodopus sungorus)和白化病小鼠的通氣和代謝。Comp.Biochem.Physiol.82A293-295(1985)。
4.Nielsen等，通氣，CO2產(chǎn)生和接觸CO2對(duì)受約束的清醒CF-1小鼠的影響。Pharmacol.Toxicol.72163-168(1993)。
5.Goldring等，人慢性堿中毒的呼吸調(diào)節(jié)。J.Clin.Inv.47188-202。
6.Stegen等，Biological Psychology 49109-122(1998)7.Hallman，M.等，患呼吸窘迫綜合征的早產(chǎn)兒的環(huán)己六醇補(bǔ)充。N.Eng.J.Med.3261233-1239(1992)。
8.Knight，V.呼吸道的病毒和支原體感染1973，Lea和Febiger，Phila，Pa.pp.2。
9.Kay，B.，過(guò)敏和過(guò)敏性疾病，Blackwell Publications，Oxford，England，卷1，pp.730-741(1997)。
10.Burke等，喜樹(shù)堿內(nèi)酯環(huán)的脂質(zhì)體穩(wěn)定化J.Am.Chem.Soc.1148318(1992)。
11.Cabanes等，用紫杉醇和脂質(zhì)體包裹的紫杉醇的體內(nèi)比較研究。Int J.Oncol.121035(1998)。
12.Daoud等，摻入脂質(zhì)體的喜樹(shù)堿對(duì)人惡性異植體的抗腫瘤作用。AnticancerDrugs 683(1995)。
13.Davis，J.N.和Staag，D.人休息時(shí)單次呼吸的體積和時(shí)間因素之間的關(guān)系。J.Physiol.245481(1975)。
14.Gottschalk等，放射性溶液的氣溶膠在上氣道和下氣道中沉積的基礎(chǔ)研究。Z.Erkr Atmungsorgane 153355(1979)。
15.Hershey等，肉眼可見(jiàn)的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的吸入化療用患有自發(fā)生成的腫瘤的犬作為模型證明原理。Clin.Cancer Res.52653(1999)。
16.Knight等，9-硝基喜樹(shù)堿脂質(zhì)體氣溶膠對(duì)裸鼠中人癌異植體的抗癌作用。Cancer Chemother.Pharmacol.44177(1999)。
17.Koshikina等，作為脂質(zhì)體氣溶膠傳遞后或在肌肉內(nèi)注射后小鼠中的喜樹(shù)堿分布。Cancer.Chemother.Pharmacol.44187(1999)。
18.Koshikina等，小鼠中黑素瘤和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移以9-硝基喜樹(shù)堿脂質(zhì)體氣溶膠治療(出版中)。
19.Mortola，J.P.和Lanthier，C.新生哺乳動(dòng)物中高碳酸血癥引起的換氣和代謝反應(yīng)。Respiration Physiol.103263。
20.Nielsen等，通氣，CO2產(chǎn)生和接觸CO2對(duì)受約束的清醒CF-1小鼠的影響。Pharmacol.Toxicol.72163(1993)。
21.Rajkumar，S.V.和Adjei，A.A.肺癌新化療藥物藥理和臨床活性綜述。Cancer Treat Rev.2435-3(1998)。
22.Rowinsky，E.K.和Donehower，R.C.藥物治療紫杉醇(Taxol)。N.Engl.J.Med.3321004(1995)。
23.Sharma等，紫杉醇脂質(zhì)體制劑對(duì)于人卵巢腫瘤異植體的活性。Int.J.Cancer 71103(1997)。
24.Socinski，M.A.晚期非小細(xì)胞肺癌異植體治療中單用紫杉醇。Oncologist4408(1999)。
25.Stehlin等，口服20-(S)-喜樹(shù)堿的I期臨床試驗(yàn)和藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果。于Potmesil M.，Pinedo，H.編，喜樹(shù)堿，新抗癌藥CRC Press.Boca Raton，F(xiàn)L59(1995)。
26.Steward，W.P.和Dunlop，D.J.治療非小細(xì)胞癌的新藥物。Ann.Oncol.6S49(1995)。
27.Sugarman等，脂質(zhì)復(fù)合的喜樹(shù)堿制劑和初步生物分布以及抗腫瘤活性研究。Cancer Chemother.Pharmacol.37531(1996)。
28.Verschraegen等，口服新穎水不溶性拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑9-硝基喜樹(shù)堿的I期臨床和藥理研究，Anti-Cancer Drugs 936(1998)。
29.Vidgren等，正常志愿者中99m锝標(biāo)記倍氯米松二丙酸的二月桂酰磷脂酰膽堿脂質(zhì)體氣溶膠的研究。Int.J.Pharm.115209(1995)。
30.Waldrep等，用倍氯米松二丙酸酯脂質(zhì)體氣溶膠研究18種不同的連續(xù)流動(dòng)噴射噴霧器的操作特征。Chest 105106(1994)。
31.Waldrep等，高劑量環(huán)孢菌素A和布地奈德-脂質(zhì)體氣溶膠。Int.J.Pharm.1227(1997)。
32.Yamashiro等，CO2吸入和運(yùn)動(dòng)中呼吸優(yōu)化的總作功速率。J.Appl.Physiol.38702(1975)。
33.Tempieton等，增加的全身傳遞和基因表達(dá)的改良的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物。Nat.Biotechnol.15647-652(1997)。
34.Eastman，S.J.等，陽(yáng)離子脂質(zhì)DNA復(fù)合物的濃縮和穩(wěn)定的氣溶膠制劑在小鼠肺中獲得高水平的基因表達(dá)。Hum.Gene.Ther.8165-773(1997)。
35.Li，S.和Huang，L.通過(guò)靜脈內(nèi)施用陽(yáng)離子脂質(zhì)-乳清胺(orotamine)-DNA(LPD)復(fù)合物體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因Gen.Ther.4891-900(1997)。
36.Boussif，O.等，基因和寡核苷酸轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)和活體內(nèi)的細(xì)胞中的通用載體聚乙二亞胺Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927297-7301(1995)。
37.Godbey等，跟蹤基因治療的聚(乙二亞胺)/DNA復(fù)合物的胞內(nèi)途徑。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905177-5181(1999)。
38.Ferrari等，聚乙二亞胺顯示囊性纖維變性基因治療中感興趣的性能。Biochem.Biophys.Acta.1447219-225(1999)。
39.Goula等，基于聚乙二亞胺的靜脈內(nèi)傳遞轉(zhuǎn)基因到小鼠肺。Gene Ther.51291-1295(1998)。
40.Abdallah等，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到成年哺乳動(dòng)物腦的強(qiáng)大非病毒載體聚乙二亞胺。Hum.Gene.Ther.71947-1954(1996)。
41.Boleta等，用聚乙二亞胺對(duì)大鼠腎進(jìn)行非病毒基因傳遞。Hum.Gene.Ther.81243-1251(1997)。
42.Coll等，體內(nèi)傳遞與線性聚乙二亞胺復(fù)合的腫瘤f DNA。Hum.Gene.Ther.101659-1666(1999)。
43.Schwartz等，用小顆粒氣溶膠傳遞DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。Hum.Gene.Ther.7731-741(1996)。
44.Densmore，C.L.等，用于基因治療和基因免疫接種的穩(wěn)健聚乙二亞胺-DNA復(fù)合物的氣溶膠傳遞。Mol.Ther.1180-188(2000)。
45.Densmore等，用氣溶膠中的鈲-膽固醇二油酰磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的基因傳遞。J.Gene.Med.1251-264(1999)。
46.Ernst，N.等，脂質(zhì)體和聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染復(fù)合物與肺部表面活性劑的相互作用。J.Gene Med.1331-340(1999)。
47.Liu等，陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的靜脈內(nèi)基因傳遞。J.Biol.Chem.27024864-24870(1995)。
48.Koshkina等，作為脂質(zhì)體氣溶膠傳遞后，或肌肉內(nèi)注射后小鼠中喜樹(shù)堿的分布。Cancer Chemother.Pharmacol.44187-192(1999)。
49.Vidgren，M.等，正常志愿者中99m锝標(biāo)記倍氯米松二丙酸的二月桂酰磷脂酰膽堿脂質(zhì)體氣溶膠的研究。Int.J.Pharm.115209-216(1995)。
50.Knight等，9-硝基喜樹(shù)堿脂質(zhì)體氣溶膠對(duì)裸鼠中人癌異植體的抗癌作用。Cancer Chemother.Pharmacol.44177-186(1999)。
51.Goldblum等，家兔中作為肺白細(xì)胞停滯量度的肺髓過(guò)氧化物酶。J.Appl/Physiol.591978-1985(1985)。
52.Schlenker，E.H.，djungarian倉(cāng)鼠(Phodopus sungorus)和白化病小鼠的通氣和代謝。Comp.Biochem.Physiol.82A293-295(1985)。
53.Nielsen等，通氣，CO2產(chǎn)生和接觸CO2對(duì)受約束的清醒CF-1小鼠的影響。Pharmacol.Toxicol.72163-168(1993)。
54.Goldring等，人慢性代謝性堿中毒的呼吸調(diào)節(jié)。J.Clin.Invest.47188-202(1968)。
55.Goldring等，呼吸衰竭時(shí)肺泡通氣的調(diào)節(jié)。Am.J.Med.Sci.269160-170(1975)。
56.Bagonzi，A.等，陽(yáng)離子聚合物和脂類介導(dǎo)全身性基因傳遞到肺中的比較。Gene Ther.61995-2004(1999)。
57.Lee，E.R.等，用于有效的基因轉(zhuǎn)移到肺的陽(yáng)離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和制劑的詳細(xì)分析。Hum.Gene.Ther.71701-1717(1996)。
58.Meyer等，氣管內(nèi)基因傳遞到小鼠氣道質(zhì)粒DNA表達(dá)和藥物動(dòng)力學(xué)特征確定。Gene Ther.2450-460(1995)。
59.Fidler，I.J.和Nicolson，G.L.影響血液攜帶的B16黑素瘤轉(zhuǎn)移變體的植入和存活的腫瘤細(xì)胞和宿主性質(zhì)。Isr.J.Med.Sci.1438-50(1978)。
本說(shuō)明書(shū)中提到的任何專利或出版物表明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。另外，這些專利和出版物在此引入以供參考，其程度如同指出各獨(dú)立出版物特別并分別被引入以供參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將不難理解本發(fā)明適合實(shí)施目的并獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及那些本文中提到的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文的實(shí)施例以及方法、程序、療法、分子和本文所述的具體化合物是優(yōu)選例的代表，是示范性的，不意味著限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行改變和其他用途，這些在權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提高個(gè)體或動(dòng)物呼吸道內(nèi)氣溶膠化藥物沉積的方法，其特征在于，該方法包括步驟以含有達(dá)約10％二氧化碳?xì)怏w的空氣混合物施用所述氣溶膠化藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述空氣混合物含有2.5％二氧化碳。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述空氣混合物含有5％二氧化碳。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述空氣混合物含有7.5％二氧化碳。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣溶膠是在從約1分鐘到約30分鐘的一段時(shí)間內(nèi)施用的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藥物通過(guò)噴射噴霧器氣溶膠化。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藥物是水溶性的或溶于緩沖液的藥物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述水溶性或可溶于緩沖液的藥物選自抗生素、粘液溶解劑、支氣管擴(kuò)張藥、副交感神經(jīng)藥、酶和抗病毒劑。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藥物是通過(guò)載體傳遞的不溶性藥物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述載體選自脂質(zhì)體、緩釋聚合物和聚陽(yáng)離子聚合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體是傳統(tǒng)脂質(zhì)體，或空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述常規(guī)脂質(zhì)體可從含有磷脂酰膽堿或聚(乙二醇)修飾的磷脂形成。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述磷脂酰膽堿是二月桂酰磷脂酰膽堿。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體從修飾的磷脂形成。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述修飾的磷脂是二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體在脂質(zhì)體制劑中攜帶親脂藥物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述親脂藥物選自兩性霉素B、制霉菌素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗癌藥。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥物選自喜樹(shù)堿、喜樹(shù)堿衍生物和紫杉醇。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藥物選自治療性蛋白、治療性肽、DNA基因、有義寡核苷酸、反義寡核苷酸和病毒載體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述DNA基因是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或p53。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述DNA基因通過(guò)聚陽(yáng)離子聚合物載體或陽(yáng)離子脂質(zhì)體傳遞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述聚陽(yáng)離子聚合物是聚乙二亞胺。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述聚乙二亞胺具有約10∶1到約20∶1的氮∶磷比。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述聚乙二亞胺具有約10∶1的氮∶磷比。
全文摘要
本發(fā)明提供了提高氣溶膠藥物在呼吸道內(nèi)沉積的方法。
文檔編號(hào)A61K47/24GK1424914SQ00818567
公開(kāi)日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月4日
發(fā)明者J·C·沃爾德萊普, J·V·奈特, N·克什基那 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)