專利名稱：預(yù)防與豬環(huán)狀病毒－2相關(guān)的心肌炎、流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療PCV-2引起的心肌炎、和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及病理學(xué)后遺癥(包括但不限于斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征)的方法和/或組合物；并且尤其涉及制備這些組合物的方法和制備這些組合物或?qū)嵤┻@些方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
豬環(huán)狀病毒-2(PCV-2)是最近確認(rèn)的一貫與世界幾個地方的豬群斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征(post-weaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)有關(guān)的病因(Allan等，1998；Ellis等，1998)。從幾個國家的受染豬身上獲得的PCV-2分離株實際上在遺傳上是一致的，但與20世紀(jì)70年代最初作為豬腎細胞系(PK/15)的非致細胞病變污染物而鑒定的PCV(CCL33，PCV-1)明顯不同(Meehan等，1998；Tischer等，1974)?；加刑烊猾@得的或?qū)嶒炚T導(dǎo)的PCV-2感染的豬表現(xiàn)出進行性的體重降低、呼吸急促、呼吸困難和黃疸(Allan等，1998；Allan等，1999；Elllis等，1998；Ellis等，1999)。直接與PCV-2抗原有關(guān)的宏觀病理學(xué)研究結(jié)果包括淋巴結(jié)病、間質(zhì)性肺炎、肝炎和腎炎(Allan等，1998；Allan等，1999；Elllis等，1998；Ellis等，1999)。也參見WO-A-9918214、WO-A-00 01409、WO-A-99 29717和WO-A-99 29871。在此之前，并沒有將PCV-2直接地與流產(chǎn)或胎豬的損傷聯(lián)系起來。因此，迄今還沒有人想解決有關(guān)PCV-2引起的心肌炎、和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染的問題。
發(fā)明目的和概述令人驚奇的是我們發(fā)現(xiàn)PCV-2是導(dǎo)致心肌炎、流產(chǎn)和宮內(nèi)感染、以及斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征的原因。
關(guān)于定義，正如本文或本文引用或參考的文獻中所公開的，PCV-2免疫原旨在包括減毒活PCV-2或滅活PCV-2、或通過體外表達或通過提取獲得的PCV-2亞單位、或能夠通過化學(xué)合成或體外重組表達獲得的含有至少一個目的表位的片段、以及包含并體內(nèi)表達PCV-2基因組的序列或片段或表位的重組載體。
類似的定義也適用于本文公開的其它豬病原體的免疫原。
關(guān)于定義，免疫原性組合物引起-局部的或系統(tǒng)的-免疫原性應(yīng)答(immunogenic response)。疫苗組合物引起局部的或系統(tǒng)的保護性應(yīng)答。術(shù)語“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”(因為前一術(shù)語可以是保護性組合物)。
因此，本發(fā)明的一個目的可以是提供預(yù)防和/或治療PCV-2引起的心肌炎、和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和/或病理學(xué)后遺癥(包括但不限于斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征)的方法和/或組合物；并提供配制這些組合物(該組合物還可以包括豬細小病毒(PPV)免疫原)的方法和PCV-2免疫原在這些組合物的配制中的用途。
另一目的是PCV-2免疫原在制備用于預(yù)防和/或治療PCV-2引起的心肌炎、和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染的組合物中的用途。
本發(fā)明的另一目的是分離和表征標(biāo)識為1103(1103/1 P.2)和1121(1121/1 P.1)的新PCV-2毒株，以及它們在制備免疫原、以及用于診斷的抗原和抗體中的用途，該用途與PCV-2引起的心肌炎、和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和/或相關(guān)的病理學(xué)后遺癥有關(guān)。
本發(fā)明還提供了在繁殖前；和/或配種前、和/或妊娠(或懷孕)期間；和/或圍生期或產(chǎn)仔前；和/或在一生中反復(fù)地，采用含有(至少一種)PCV-2免疫原的組合物(該組合物還可以包括豬細小病毒的免疫原)接種雌豬(例如母豬(sow)、小母豬(gilt))的方法，以便預(yù)防與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥；或，以便引起抵抗PCV-2的免疫原性或保護性應(yīng)答并籍此預(yù)防與豬環(huán)狀病毒-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和/或心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或其它與PCV-2相關(guān)的病理學(xué)后遺癥。
有利地，在配種前至少接種一次。而且有利地，隨后在妊娠期間，例如大約妊娠中期(妊娠約6-8周時)和/或妊娠末期(妊娠約11-13周時)進行一次接種。因此，有利的方案是在配種前接種一次然后在妊娠期間作一次加強接種。其后，可以在每次配種前和/或妊娠期間約妊娠中期(妊娠約6-8周時)和/或妊娠末期(妊娠約11-13周時)，再次接種。優(yōu)選地，可以僅在妊娠期間再次接種。
在另一優(yōu)選實施方案中，小豬，例如來自接種過(例如按此處所討論的方式接種)的雌豬的小豬，在出生后的第頭幾周中接受接種，例如在出生后第一和/或二和/或三和/或四和/或五周時接種。更優(yōu)選地，小豬在出生后的第一周內(nèi)或出生后的第三周內(nèi)(例如在斷奶期)接受第一次接種。甚至更有利的是，然后(第一次接種后)二(2)至四(4)周后給予這些小豬加強接種。因此，仔豬和雌豬(例如母豬、小母豬)均可以施用本發(fā)明組合物和/或可以是本發(fā)明方法的實施對象。
因此，本發(fā)明包括含有PCV-2毒株1103和/或1121來源的免疫原、用于預(yù)防或治療與豬環(huán)狀病毒-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥的免疫原性或疫苗組合物。
本發(fā)明還包括PCV-2免疫原在配制用于預(yù)防或治療豬環(huán)狀病毒-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥的免疫原性或疫苗組合物中的用途。
再有，本發(fā)明還包括用于預(yù)防和/或治療PCV-2引起的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征、含有藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體和/或賦形藥(vehicle)和/或賦形劑(excipient)和/或佐劑、及PCV-2免疫原的免疫原性或疫苗組合物。
此外，組合物還可以包括來自至少一種其它豬病原體的至少一種免疫原，例如豬繁殖和呼吸綜合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome，PRRS)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)、大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、大腸桿菌(E.coli)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、假狂犬病病毒(Pseudorabies)、豬霍亂病毒(Hog cholera)、豬流感病毒(Swine Influenza)、和豬細小病毒(Porcine Parvovirus)(PPV)。因此，基于載體的組合物可以包括來自至少一種其它豬病原體的至少一種免疫原，例如表達來自該病原體的序列的載體，其中載體也可以是表達PCV-2免疫原的載體。表達PCV-2序列的載體可以包含PCV-2的序列或片段；并且本發(fā)明包括這些核酸分子、含有它們的載體、含有這些核酸分子或載體的組合物、來自這些核酸分子的表達產(chǎn)物、含有這些表達產(chǎn)物的組合物、針對這些核酸分子的探針或引物、和制備和使用前述任一個或所有的方法。
載體可以包含DNA載體質(zhì)粒、細菌如大腸桿菌、病毒如桿狀病毒、皰疹病毒(包括豬皰疹病毒，包含奧耶斯基病病毒(Aujeszky’s diseasevirus))、腺病毒(包括豬腺病毒)、痘病毒(包括痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、浣熊痘病毒和豬痘病毒)等?；谳d體的組合物可以包含如下載體，所述載體含有并表達選自PCV-2的ORF1-13的ORF、例如選自O(shè)RF 4、7、10和13的ORF、優(yōu)選ORF 4和/或13，有利地所述PCV-2是本文確定的PCV-2毒株之任一種、尤其是毒株1103和/或1121。而且，組合物中的免疫原(PCV-2和/或來自其它豬病原體的免疫原)可以通過重組方式產(chǎn)生。
質(zhì)粒這個詞旨在包括以含有待表達的PCV序列的多核苷酸序列形式存在的任何DNA轉(zhuǎn)錄單位。有利地，質(zhì)粒包括對于其表達(例如體內(nèi)表達)必需的元件。超螺旋的或其它形式的環(huán)狀質(zhì)粒形式是有利的；線性形式也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。質(zhì)粒免疫原性或疫苗組合物可以通過基因槍、借助無針頭注射器(needleless injector)通過皮內(nèi)途徑、通過皮下或肌內(nèi)途徑、或通過粘膜途徑、或通過允許實現(xiàn)體內(nèi)表達以及有利地實現(xiàn)免疫原性或保護性應(yīng)答的任何其它手段，進行給藥。
應(yīng)注意，還可以任選地從感染或轉(zhuǎn)染的細胞中分離和/或純化本發(fā)明載體或重組體產(chǎn)生的表達產(chǎn)物；以便，例如，制備給豬施用的組合物；然而，在某些情況下，不從細胞中分離和/或純化表達產(chǎn)物可能是有利的；例如當(dāng)細胞或其部分可以增強該多肽的免疫原性作用時。而且，蛋白質(zhì)分離和/或純化的技術(shù)是已知的，而且無需過多實驗即能夠在本發(fā)明的實施中用于純化和/或分離重組體或載體的表達產(chǎn)物、和/或PCV-2的亞單位和/或其它豬病原體；一般地，這些技術(shù)可以包括利用目的蛋白質(zhì)在變化的鹽濃度下的溶解度進行的沉淀、采用有機溶劑、聚合物和其它物質(zhì)進行的沉淀、親和沉淀和選擇性變性；柱層析，包括高效液相層析(HPLC)、離子交換層析、親和層析、免疫親和層析或染料-配體層析；免疫沉淀、凝膠過濾、電泳方法、超過濾和等電聚焦，尤其是它們的組合。
本發(fā)明還設(shè)想了預(yù)防和/治療豬環(huán)狀病毒-2(PCV-2)引起的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和/或其它病理學(xué)后遺癥的方法，該方法包括通過給豬施用前述或本文公開的組合物在豬身上誘導(dǎo)對抗PCV-2的免疫原性或保護性應(yīng)答。
因此，本發(fā)明包括預(yù)防和/或治療豬環(huán)狀病毒-2(PCV-2)引起的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2有關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和/或其它病理學(xué)后遺癥的方法，該方法包括通過給豬施用如下組合物在豬身上誘導(dǎo)對抗PCV-2的免疫原性或保護性應(yīng)答，所述組合物包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體或賦形劑或賦形藥(優(yōu)選地還包含佐劑)和含有PCV-2免疫原的活性劑。該方法可以用于預(yù)防PCV-2引起的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染，包括施用包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體和PCV-2免疫原的組合物。PCV-2免疫原可以是活的減毒全PCV-2或滅活PCV-2。該方法可以涉及是亞單位免疫原性或疫苗組合物的組合物。該方法可以涉及此外還包括來自至少一種其它豬病原體的至少一種免疫原(包括表達該免疫原或表位的載體)的組合物；例如，該至少一種其它豬病原體可以選自PRRS、豬肺炎支原體、大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌、假狂犬病病毒、豬霍亂病毒、支氣管炎博德特氏菌、多殺巴斯德氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、豬流感病毒、和PPV、以及它們的組合。該方法可以涉及載體，該載體是DNA載體質(zhì)粒、細菌如大腸桿菌、病毒如桿狀病毒、皰疹病毒(包括奧耶斯基病病毒)、腺病毒(包括豬腺病毒)、痘病毒(包括痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒)等。該方法可以涉及基于載體的組合物，該組合物此外還包括來自至少一種其它豬病原體的至少一個序列、片段或表位，或表達該序列、片段或表位的載體，其中該載體也可以是表達PCV-2序列、片段或表位的載體。該方法可以涉及如下載體，該載體含有并表達選自O(shè)RF1-13的ORF，例如選自O(shè)RF 4、7、10和13的ORF；優(yōu)選ORF4和/或13。該方法還可以涉及基于免疫原的組合物，其中一或多個免疫原是通過重組方式產(chǎn)生的。在此方法中，優(yōu)選地按上述方式接種雌豬和/或小豬。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及制備上述或本文所公開任一種組合物的方法，包括將藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體和可能的佐劑，與PCV-2免疫原混合。該方法還可以包括采用含有編碼PCV-2免疫原的DNA并表達該免疫原的重組載體轉(zhuǎn)染或感染細胞或宿主；以及任選地包括從該細胞純化和/或分離該免疫原。類似地，該方法可以包括從PCV-2分離和/或純化PCV-2免疫原、或從樣品中分離PCV-2。
本發(fā)明還提供用于制備上述或本文所公開任一種組合物、或?qū)嵤┥鲜龌虮疚乃_任一種方法的試劑盒，其包含置于第一容器中的藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體或賦形藥或賦形劑和置于第二容器中的含有PCV-2免疫原的活性劑，其中任選地可以將該第一和第二容器包裝在一起，并且任選地該試劑盒可以包括有關(guān)該組合物成分的混合和/或該組合物的施用方式的說明書。
在再一實施方案中，本發(fā)明涉及給雄性和/或雌性豬施用上述或本文所公開任一種組合物；以便預(yù)防PCV-2的傳播、和預(yù)防或治療或控制與豬環(huán)狀病毒-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥。施用優(yōu)選按上述方式進行。
術(shù)語“包含”在本公開中可以指“包括”或可以具有美國專利法中術(shù)語“包含”所通常被賦予的意義。
通過以下公開，本發(fā)明的其它方面得到了描述或是明顯的(并且屬于本發(fā)明范圍內(nèi))。發(fā)明詳述豬環(huán)狀病毒-2(PCV-2)是與豬群中斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征(PMWS)有關(guān)的病因。正如實施例1和2中所顯示的，PCV-2相關(guān)疾病的可能范圍由于垂直傳播得以擴大并與繁殖失敗相關(guān)。
具體地，實施例1顯示，從來自經(jīng)歷后期流產(chǎn)和死產(chǎn)的農(nóng)場的一窩流產(chǎn)小豬中分離出PCV-2。在一頭出現(xiàn)PCV-2抗原的廣泛免疫組織化學(xué)染色的小豬中，有嚴(yán)重的彌散性心肌炎。并且在多頭胎豬的肝、肺和腎中也有不同數(shù)量的PCV-2抗原。與胎豬損傷和豬的流產(chǎn)有關(guān)的其它因素，包括豬細小病毒、豬繁殖呼吸綜合征病毒、腦心肌炎病毒和腸道病毒，的存在沒能得到證實。
更具體地，實施例2顯示，四年內(nèi)從30個高度健康豬群獲得的、并在流產(chǎn)或繁殖失敗的常規(guī)病案中測試過的組織，在兩個涉及幾頭出現(xiàn)彌散性心肌炎、心臟肥大和慢性被動充血跡象的死產(chǎn)小豬和不能存活新生豬的提交物中為PCV-2陽性。這兩個陽性提交物來自同一農(nóng)場，但發(fā)生在兩個不同的時間。通過免疫組織化學(xué)和病毒的分離證實了染病小豬的心臟和其它組織中存在PCV-2。1999年之前在出現(xiàn)地方性感染的區(qū)域的繁殖失敗病案中沒有檢測到豬環(huán)狀病毒，這支持了繁殖性疾病是PCV-2感染的新臨床表現(xiàn)，而且還提示性交和垂直模式的傳遞負(fù)責(zé)病毒在豬群中的傳播。
因此，給豬，例如雌豬(如母豬或小母豬)接種包括至少一種PCV-2免疫原(例如來自至少一個選自病毒株Imp1008、Imp1010、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1003和1121的病毒株)的組合物(尤其是，該組合物還可以包括來自至少一種其它豬病原體(例如至少一種豬細小病毒)的至少一種免疫原，其中當(dāng)采用載體時，載體可以共同表達PCV-2免疫原和至少一種其它豬病毒體的至少一種免疫原(例如PPV的免疫原)，尤其是當(dāng)按上述的免疫進度進行接種時，可以預(yù)防與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥。
因此，本發(fā)明涉及采用PCV-2免疫原預(yù)防與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥的方法和組合物。尤其是，對于采用PCV-2免疫原預(yù)防與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥的方法和組合物，來自1103株和/或1121株的免疫原是有用的。
本發(fā)明還涉及任何已知PCV-2株或來自它們的免疫原在配制如下免疫原性或疫苗組合物中的用途，所述組合物被用于預(yù)防或治療與PCV-2有關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染、以及與PCV-2有關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥(這些病毒株包括病毒株Imp1008、Imp1010、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1103和1121)，尤其是當(dāng)該組合物旨在被施用給小豬例如來自經(jīng)過接種的雌豬的小豬，更具體地施用給雌豬，尤其是懷孕雌豬或?qū)⒁邮芘浞N的雌豬時；更特別地是根據(jù)以上定義的接種方案進行施用時。
更具體地，該用途是配制如下組合物，該組合物旨在預(yù)防或治療與PCV-2有關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染，尤其是當(dāng)該組合物旨在施用給小豬例如來自經(jīng)過接種的雌豬的小豬，更特別地施用給雌豬，尤其是懷孕雌豬或?qū)⒁邮芘浞N的雌豬時；更特別地是根據(jù)以上定義的接種方案進行施用時。
所述來自至少一種其它豬病原體的至少一種免疫原可以是在已知豬疫苗或免疫原性組合物中使用的、或在WO98/03658中描述的那些。
在本發(fā)明中使用的組合物可以根據(jù)獸醫(yī)或制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。這些組合物可由獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員在考慮了如豬的年齡、性別、體重、身體狀況和具體治療方案以及給藥途徑這些因素之后，按其熟知的劑量和技術(shù)給藥。這些組合物可單獨給藥，或可以與本發(fā)明的其它組合物(例如含有PCV-2免疫原的其它組合物)或與其它預(yù)防或治療性組合物(例如其它豬免疫原性或疫苗組合物)共同給藥或順序給藥。由此，本發(fā)明還提供多價或“雞尾酒式”或聯(lián)合的組合物和使用它們的方法。在這一方面，請參考涉及狂犬病毒組合物和聯(lián)合組合物及其使用的美國專利5,843,456。
本發(fā)明的組合物可以用于腸胃外或粘膜給藥，優(yōu)選通過皮內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥。具體地，對于皮內(nèi)途徑，可以采用無針頭注射器進行注射。當(dāng)采用粘膜給藥時，可以使用口、鼻或眼途徑。
在這些組合物中，可以將免疫原與適合的載體、稀釋劑、或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等，和/或優(yōu)選地與佐劑混合。這些組合物也可被凍干或冷凍。這些組合物根據(jù)給藥途徑和預(yù)期的制品可以含有輔助物質(zhì)如pH緩沖劑、佐劑、防腐劑、用于粘膜途徑的聚合物賦形劑等。
可參考標(biāo)準(zhǔn)文獻如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCICNCE”第17版，1985，來制備適當(dāng)?shù)闹破罚鵁o需過多實驗。合適的劑量也可以以本文和本文引用的文獻作為基礎(chǔ)。
佐劑是增強針對免疫原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑可以包括氫氧化鋁和磷酸鋁、皂角苷如QuilA、油包水型乳劑、水包油型乳劑、水包油包水型(water-in-oil-in-water)乳劑。乳劑可以基于尤其是輕液體石蠟油(歐洲藥典類型)；類異戊二烯油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；鏈烯，尤其是異丁烯或癸烯，低聚化產(chǎn)生的油；含有直鏈烷基的酸或醇的酯，更具體地是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸脂；分枝脂肪酸或醇的酯，尤其是異硬脂酸酯。油與乳化劑聯(lián)合使用以形成乳劑。優(yōu)選地，乳化劑是非離子表面活性劑，尤其是山梨聚糖、二縮甘露醇(例如脫水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯(任選地該酯可以乙氧基化)，和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其是Pluronic產(chǎn)品、特別是L121。見Hunter等，有關(guān)佐劑的理論和實際應(yīng)用(The Theory andPractical Application of Adjuvants)(Stewart-Tull，D.E.S.編)，John Wiley and Sons，NY，第51-94頁(1995)和Todd等，疫苗(Vaccine)15564-570(1997)。
例如，可以使用“疫苗設(shè)計，亞單位和佐劑方法”(Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach)，M.Powell和M.Newman編，Plenum Press，1995，第147頁上描述的SPT乳劑，和同一本書第183頁上描述的MF59乳劑。
例如，含有佐劑的疫苗可以按以下方式制備借助乳化渦輪混合器，將67％v/v含有免疫原的水相在2，3％ w/v脫水甘露醇油酸酯、2，6％ w/v11 EO(環(huán)氧乙烷)乙氧基化的油酸和28，1％ v/v輕液體石蠟油(歐洲藥典類型)中乳化。
制備乳劑的另一種方法是將5％ w/v角鯊?fù)椤?.5％ w/v PluronicL121、0.2％ w/v 20 EO乙氧基化的油酸和脫水山梨糖醇的酯、92.3％ v/v含有免疫原的水相混合，然后使之通過一個高壓勻漿器來乳化。
尤其是，還可以與合成聚合物(例如乳酸和乙醇酸的同聚物和共聚物，它們已經(jīng)被用于制備包被免疫原的微球，見Eldridge等，Mol.Immunol. 28287-294(1993)，例如生物可降解微球)、與細胞因子如IL-2和IL-12(見例如美國專利5,334,379)和GMCSF，有利的是豬的GMCSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；一般參見美國專利4,999,291和5,461,663，也參見Clark等，科學(xué)(Science)1987，2301229；Grant等，藥物(Drugs)，1992，53516)，一起配制。某些佐劑可以和免疫原和/或表位一起在體內(nèi)表達；例如細胞因子、GMCSF(見例如，有關(guān)編碼和表達豬GM-CSF的質(zhì)粒的文獻Inumaru和Takamatsu，Immunol.Cell.Biol.，1995，73474-76)。
佐劑的再一實例是選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和順丁烯二酸酐與鏈烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐劑化合物是交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其與糖或多元醇的多聚鏈烯基醚交聯(lián)。這些化合物稱為術(shù)語carbomer(Phameuropa第8卷第二期，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國專利號2909462，該專利描述了與多羥基化合物交聯(lián)的這類丙烯酸聚合物，該多羥基化合物含有至少3個羥基，優(yōu)選不超過8個羥基、其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團所取代。優(yōu)選基團是那些含有2-4個碳原子的基團，如乙烯基、烯丙基和其它烯鍵式不飽和基團。這些不飽和基團本身可以含有其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(BF Goodrich，俄亥俄州，美國)出售的產(chǎn)品特別適合。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中可以提及的有Carbopol974P、934P和971P。在順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物中，優(yōu)選順丁烯二酸酐和乙烯的線性或交聯(lián)的共聚物EMA(Monsanto)，例如與二乙烯基醚交聯(lián)的共聚物。可參考文獻J.Fields等，自然(Nature)，186778-780，1960.6.4。
從其結(jié)構(gòu)來看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物EMA優(yōu)選由下式的基本單位形成 其中R1和R2相同或不同，代表H或CH3；x＝0或1，優(yōu)選x＝1；且y＝1或2，且x+y＝2。
對于共聚體EMA，x＝0，y＝2。對于carbomer，x＝y(tǒng)＝1。
這些聚合物溶解于水產(chǎn)生酸性溶液，將其中和，優(yōu)選中和至生理pH，以便制備將要摻入免疫原性、免疫學(xué)或疫苗組合物的佐劑溶液。此聚合物的羧基部分地為COO-形式。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的佐劑溶液，尤其是carbomer溶液，用蒸餾水制備，優(yōu)選有NaCl的蒸餾水，獲得的溶液為酸性pH。將該儲備液加入到預(yù)定量(用來獲得預(yù)定終濃度)，或其相當(dāng)大部分，的含有NaCl的水、優(yōu)選生理鹽水(NaCl 9g/l)中來稀釋，在幾個步驟中都立刻同時或隨后進行中和(pH7.3-7.4)，優(yōu)選用NaOH中和。使用生理pH的該溶液與疫苗混合，該溶液特別可以以凍干、液體或冰凍的形式貯藏。
在最后的疫苗組合物中聚合物濃度可以為0.01％-2％w/v，例如0.06-1％w/v，如0.1-0.6％w/v。
從本公開和本領(lǐng)域的知識，如果需要的話，技術(shù)人員可以選擇適合的佐劑和其量用于根據(jù)本發(fā)明的免疫的、免疫原性的或疫苗組合物中，而無需過多實驗。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物可以與至少一種其它豬病原體的至少一種減毒活疫苗、滅活疫苗、或亞單位疫苗、或表達至少一種免疫原或目的表位的重組疫苗(如作為載體的痘病毒或DNA質(zhì)粒)關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明設(shè)想了用于各種施用途徑的組合物形式。此外，有效劑量和施用途徑可以由已知因素如年齡、性別、體重和其它已知篩選程序來確定，而無需過度實驗。每一種活性劑的劑量都可以與本文所引用文獻中的相同，和/或可以在一或幾個至幾百或幾千個微克的范圍內(nèi)變動，例如對于亞單位免疫原性或疫苗組合物在1μg至1mg；對于滅活免疫原性或疫苗組合物為104-1010TCID50，有利地106-108TCID50(滅活前的滴度)。對于減毒活免疫原性或疫苗組合物，劑量可以為101-108TCID50，有利地103-106TCID50。
可以按適合的量施用重組體或載體，以便體內(nèi)獲得相應(yīng)于此處所述和/或本文引用文獻中所述劑量的表達。例如，對于病毒懸浮液，可以經(jīng)驗地確定適合的范圍。在本發(fā)明中可以按每劑(例如約2ml)約至少103pfu；更優(yōu)選約104pfu-約1010pfu，例如約105pfu-約109pfu，如約106pfu-108pfu的量，給豬施用病毒載體或重組體，或用病毒載體或重組體感染或轉(zhuǎn)染細胞。而且，如果有一個以上的重組體表達一個以上的基因產(chǎn)物時，每個重組體均可以按這些量進行施用；或者，可以這樣施用各重組體，以便組合起來產(chǎn)生包含這些量的重組體總量。
在本發(fā)明所用質(zhì)粒組合物中，劑量可以與本文引用文獻中所述的或本文所述的相同。例如，質(zhì)粒組合物中每種質(zhì)粒DNA的適合量可以為1μg-2mg，優(yōu)選地50μg-1mg。技術(shù)人員可以參考本文引用的有關(guān)DNA質(zhì)粒載體的文獻確定本發(fā)明DNA質(zhì)粒載體組合物的其它適合劑量，而無需過多實驗。
然而，引起適合免疫應(yīng)答的組合物劑量、其中成分的濃度和施用組合物的時間選擇可以通過以下方法確定，例如血清的抗體滴定，如ELISA和/或血清中和測定分析，和/或在豬身上作接種攻擊評價。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識、本公開和本文引用的文獻，這些確定并不需要過多的試驗。而且，順序給藥的時間安排同樣可以采用從本公開和本領(lǐng)域知識可確定的方法來確定，而無需過多實驗。
PCV-2免疫原可以從PCV-2獲得，或可以從PCV-2基因或其部分或表位的體外重組表達獲得。制備載體(或重組體)和/或使用它們進行表達的方法可以參照或類似于以下文獻中公開的方法，尤其是有關(guān)DNA表達載體的方法美國專利4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、5,756,103、5,766,599、6,004,777、5,990,091、6,033,904、5,869,312、5,382,425；PCT公開文本W(wǎng)O94/16716、WO96/39491、WO95/30018；Paoletti，“痘病毒載體在接種中的應(yīng)用新信息”，PNAS USA 9311349-11353，1996年10月；Moss，“用于重組基因表達的遺傳工程化痘病毒、接種和安全性”，PNAS USA 9311341-11348，1996年10月；Smith等，美國專利4,745,051(重組桿狀病毒)；Richardson，C.D.(編)，分子生物學(xué)方法(Methods inMolecular Biology)39，“桿狀病毒表達的實驗操作”(1995Humana Press公司)；Smith等，“在感染了桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞中制備人β干擾素”，分子和細胞生物學(xué)(Molecular and Cellular Biology)，1983年12月，第3卷第12期第2156-2165頁；Pennock等，“用桿狀病毒載體在感染細胞中有調(diào)節(jié)地強表達大腸桿菌β半乳糖苷酶”，分子和細胞生物學(xué)，1984年3月，第4卷第3期第399-406頁；EPA 0 370 573；1986年10月16提交的美國申請920，197；EP專利公開文本265785；美國專利4,769,331(重組皰疹病毒)；Roizman，“單純皰疹病毒基因的功能遺傳改造新載體的一個引子”，PNAS USA9311307-11312，1996年10月；Andreansky等，“遺傳工程化單純皰疹病毒在治療實驗性腦腫瘤中的應(yīng)用”，PNAS USA9311313-11318，1996年10月；Robertson等，“用于向B淋巴細胞遞送基因的埃-巴病毒載體”，PNAS USA9311334-11340，1996年10月；Frolov等，“基于α病毒的表達載體策略和應(yīng)用”，PNAS USA9311371-11377，1996年10月；Kitson等，J.Virol.65，3068-3075，1991；美國專利5,591,439、5,552,143；WO98/00166；1996年7月3日同時提交的獲得承認(rèn)的美國申請08/675,556、和08/675,566(重組腺病毒)；Grunhaus等，1992，“作為克隆載體的腺病毒”，專題討論，病毒學(xué)(Virology)(第3卷)，第237-52頁，1993；Ballay等，EMBO Journal，第4卷，第3861-65頁；Graham，Tibtech8，85-87，1990年4月；Prevec等，J.Gen Virol.70，429-434；PCT WO91/11525；Felgner等(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561；科學(xué)2591745-49，1993；和McClements等，“采用編碼糖蛋白D或糖蛋白B的DNA疫苗單獨或組合免疫，在患有2型單純皰疹病毒疾病的動物模型中誘導(dǎo)保護性免疫”，PNAS USA9311414-11420，1996年10月；和美國專利5,591,639、5,589,446和5,580,859；以及WO-A-90 11092、WO-A-93 19183、WO-A-94 21797、WO-A-95 11307、WO-A-95 20660；Tang等，自然(Nature)356，152-154，1992；和Furth等，AnalyticalBiochemistry 205，365-368，1992。也參見WO98/33510；Ju等，Diabetologia，41736-739，1998(慢病毒表達系統(tǒng))；Sanford等，美國專利4,945,050；Fishbach等(Intracel)，WO90/01543；Robinson等，專題討論，IMMUNOLOGY，第9卷，第271-283頁(1997)(DNA載體系統(tǒng))；Szoka等，美國專利4,394,448(在活細胞中插入DNA的方法)；McCormick等，美國專利5,677,178(致細胞病變病毒的用途)；和美國專利5,928,913(基因遞送載體)；以及這里引用的其它文獻。例如，在本發(fā)明的實施中，采用選自豬皰疹病毒如奧耶斯基病病毒、豬腺病毒、痘病毒(尤其是痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒)的病毒載體、以及DNA載體(DNA質(zhì)粒)是有利的。
來自PCV-2基因或其部分的表達產(chǎn)物可以用于制備在診斷目的中有用的抗體如單克隆或多克隆抗體。類似地，來自PCV-2基因或其部分的表達產(chǎn)物可以在診斷應(yīng)用中使用。
而且，根據(jù)此處的公開和本領(lǐng)域的知識，無需過多試驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定PCV-2免疫原中的或其它豬病原體免疫原中的目的表位；見，例如WO98/40500，尤其是有關(guān)測定目的表位或蛋白質(zhì)表位區(qū)域的一般信息。
根據(jù)本發(fā)明，有利的免疫原性或疫苗組合物是從感染了PCV-2純化制品的體外細胞培養(yǎng)物中收集的免疫原性或疫苗組合物，其中所述PCV-2純化制品的例子有選自保藏在ECACC(歐洲動物細胞保藏中心，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，UK)、具有如下參考信息的制品的豬環(huán)狀病毒純化制品1997年10月2日保藏的具有保藏號V97100219(Imp.1008株)、V97100218(Imp.1010株)和V97100217(Imp.999株)的制品，1998年1月16日保藏的具有保藏號V98011608(Imp.1011-48285株)和V98011609(Imp.1011-48121株)的制品，2000年2月2日保藏的具有保藏號00012710(1103株)和00012709(1121株)的制品；或包含自體外細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生并分離的豬環(huán)狀病毒的免疫原性或疫苗組合物，其中這些細胞已感染了能夠從患有PMWS綜合征的豬的生理樣品或組織樣品，尤其是損傷處，分離出來的豬環(huán)狀病毒，例如其中的豬環(huán)狀病毒產(chǎn)生并分離自豬腎細胞系，如產(chǎn)生并分離自沒有PCV-1污染的PK/15細胞的那些組合物；或含有從感染了該環(huán)狀病毒的體外細胞培養(yǎng)物收集的培養(yǎng)物提取物或上清液，或從這些培養(yǎng)物提取物或上清液制備的那些組合物。因此，豬環(huán)狀病毒可以是免疫原。例如，有利地，疫苗或免疫原性組合物可以在獸醫(yī)學(xué)上或藥學(xué)上可接受賦形藥或稀釋劑和任選的獸醫(yī)學(xué)上或藥學(xué)上可接受佐劑、以及任選的凍干穩(wěn)定劑中包含減毒的活的全免疫原(例如病毒)。免疫原(例如病毒)可以是滅活的，并且疫苗或免疫原性組合物可以還和/或任選地含有獸醫(yī)學(xué)上或藥學(xué)上可接受賦形藥或稀釋劑和任選地含有獸醫(yī)學(xué)上或藥學(xué)上可接受佐劑。疫苗或免疫原性組合物可以含有PCV-2免疫原和/或幾種豬環(huán)狀病毒(包括PCV-2或PCV-2的幾個株，并包括PCV-1)的免疫原，以及任選地含有來自其它豬病原體的其它免疫原；例如PRRS、豬肺炎支原體、大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌、假狂犬病病毒、豬霍亂病毒、支氣管炎博德特氏菌、多殺巴斯德氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、豬流感病毒、PPV(也參見WO-A-0001409)的免疫原。
為了制備環(huán)狀病毒抗原制品，環(huán)狀病毒可以在細胞，尤其是細胞系如PK/15細胞上傳代后獲得。可以采用培養(yǎng)物上清液或提取物，它們可以任選地通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。
對于減毒PCV，可以根據(jù)通常的方法，例如在細胞上傳代、優(yōu)選在豬細胞(尤其是細胞系如PK/15細胞)上傳代(例如20-150代，尤其是大約40-100代)，進行減毒。
對于滅活疫苗，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)滅活PCV-2，以及可能存在的部分。優(yōu)選地，通過化學(xué)途徑，例如將抗原暴露于化學(xué)試劑如甲醛(福爾馬林)、多聚甲醛、β-丙醇酸內(nèi)酯或乙烯亞胺或其衍生物，和/或通過物理處理，進行滅活。滅活的優(yōu)選方法在本文中是暴露于化學(xué)試劑，尤其是乙烯亞胺或β-丙醇酸內(nèi)酯。
疫苗或免疫原性組合物中的免疫原可以從如下DNA片段表達，該DNA片段含有PCV-2核苷酸序列或其(有利地編碼至少一個表位的)片段，例如選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、以及SEQ ID NO6和SEQ ID NO7(

圖1-4和6-7)中所示序列的那些。疫苗或免疫原性組合物中的免疫原可以從含有選自PCV-2株的ORF1-13，例如ORF4、7、10和13的ORF，優(yōu)選ORF4和/或13的DNA片段表達，其中的PCV-2株尤其是指以上定義的病毒株之一(與WO-A-99 18214中的命名相同，也參見下文表1)。因此，免疫原或其部分，例如目的表位，可以通過從重組體或載體體外進行表達來獲得。免疫原還可以通過常規(guī)方法進行純化和/或濃縮。
疫苗或免疫原性組合物中的免疫原可以通過含有如下DNA片段的表達載體進行體內(nèi)表達，所述DNA片段含有PCV-2核苷酸序列或其片段(有利地編碼至少一個表位)，例如選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、以及SEQ ID NO6和SEQ ID NO7(圖1-4和6-7)中所示序列的那些。類似地，疫苗或免疫原性或免疫組合物中的免疫原可以通過含有如下DNA片段的表達載體進行體內(nèi)表達，所述DNA片段含有選自PCV-2株，尤其是以上定義的毒株之一，的ORF1-13，例如ORF4、7、10和13的ORF，優(yōu)選ORF4和/或13。也就是說，疫苗或免疫原性組合物可以含有可體內(nèi)表達免疫原或其部分(例如目的表位)的表達載體。
表達載體可以是任何適合的載體，例如尤其是選自DNA質(zhì)粒、細菌如大腸桿菌、病毒例如桿狀病毒、皰疹病毒(如奧耶斯基病病毒)、腺病毒(包括豬腺病毒)、痘病毒(尤其是痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒)的載體(本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參考Audonnet等和Bublot等分別于1999年6月10日同時提交的美國申請60/138,352和60/138,478，尤其是參考詳述、更尤其是參考實施例(分別是作為附錄的“DNA疫苗-PCV”和“豬環(huán)狀病毒重組痘病毒疫苗”))。
因此，本發(fā)明還包括核酸分子和含有它們的載體、以及由此而來的表達產(chǎn)物、含有這些核酸分子和/或載體和/或表達產(chǎn)物的組合物，以及制備和使用任一個或所有這些實施方案的方法。本發(fā)明尤其包括本文中編碼免疫原或表位的ORF和/或片段；以及1103和/或1121株的核酸分子，尤其是它們的ORF1-13，例如ORF4、7、10和13，優(yōu)選ORF4和/或13，和其片段；以及含有這些核酸分子的載體，含有這些核酸分子或載體的組合物，來自它們的表達產(chǎn)物，含有這些表達產(chǎn)物的組合物，針對這些核酸分子的引物或探針，和涉及這些實施方案的用途或方法，例如用于檢測、診斷、測定PCV-2、用于誘導(dǎo)免疫原性或保護性應(yīng)答、等。
正如之前提出的，本發(fā)明實施方案可以包括抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體；例如，從上述環(huán)狀病毒、或從具有例如選自SEQ IDNOS1、2、3、4、6和7(圖1-4和6-7)的PCV-2序列的DNA片段編碼的多肽、或從含有例如選自SEQ ID NOS1、2、3、4、6和7的PCV-2序列的載體所表達的多肽、或從含有包括了選自O(shè)RF1-13的ORF在內(nèi)的DNA的載體所表達的多肽，制備的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)誘發(fā)抗體和制備單克隆或多克隆抗體。抗體和抗原可以用于診斷中。
本發(fā)明還包括來自PCV-2的1103和/或1121株的探針或引物，它們可以用于例如檢測PCV-2DNA，尤其是與心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染有關(guān)的PCV-2DNA，以及擴增PCV-2DNA以便例如制備表達載體。探針或引物可以是PCV-2基因組或PCV-2基因中的任何一段至少8個、優(yōu)選至少10個、更優(yōu)選至少12、13、14或15，例如至少20個如至少23個或25個，例如至少27或30個核苷酸的序列，而且這些序列對于PCV-2，可能地對于這些病毒株，是獨特的，或是PCV-2中至少對于PCV或環(huán)狀病毒家族而言保守的序列。對于PCR或雜交的引物或探針以及它們的最適長度，也可以參考Kajimura等，GATA7(4)71-79(1990)。雜交有利地在高嚴(yán)緊性條件下進行，術(shù)語“高嚴(yán)緊性”將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解(見例如Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；和Hames和Higgins(編)，1985，核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，IRL Press，Oxford，UK)。應(yīng)理解，雜交可以采用成熟技術(shù)進行，這些技術(shù)包括但不限于Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交和，有利地，針對PCR擴增的DNA片段進行的Southern雜交。
與探針或引物一樣，非全長PCV-2蛋白質(zhì)的肽也是本發(fā)明的部分，其可以是PCV-2中的任何一段至少8個、優(yōu)選至少10個、更優(yōu)選至少12、13、14或15個、例如至少20個如至少23或25個、例如至少27或30個氨基酸的序列，而且該序列是PCV-2、可能地這些毒株所獨特的，或是PCV-2中至少對于PCV和/或環(huán)狀病毒家族而言保守的序列。作為替代或此外，非全長PCV-2蛋白質(zhì)的本發(fā)明氨基酸可以是PCV-2蛋白質(zhì)的表位區(qū)。
Meehan等，1998公開了PCV-2序列(Imp.1010株；ORF1為第398-1342位核苷酸；ORF2為第1381-314位核苷酸；分別相應(yīng)于本發(fā)明術(shù)語(見表1)和1998年9月25日提交的美國申請09/161,092中的ORF4和ORF13，以及相應(yīng)于WO-A-9918214中的COL4和COL13)。本文公開了幾個PCV-2株和它們的序列，并將它們稱作Imp1008、Imp999、Imp1011-48285、Imp1011-48121、1103和1121。其它病毒株公開于A.L.Hamel等，J.Virol.，1998年6月，第72卷，65262-5267(GenBankAF027217)和I.Morozov等，J.Clinical Microb.，1998年9月，第36卷，92535-2541，以及GenBank AF086834、AF086835和AF086836。這些序列、或來自它們的ORF、或它們的編碼抗原或免疫原或目的表位的區(qū)域也可以用于實施本發(fā)明。
本發(fā)明還包括本文和本文引用文獻中所用或提及的那些核苷酸序列的等同序列；例如，能夠在高嚴(yán)緊性條件下與該核苷酸序列雜交的序列(見例如Sambrook等，(1989))。在這些等同序列中，還可以提及的有保留了完整序列的免疫原性的基因片段，例如目的表位。
PCV1型和2型的全基因組之間同源性大約為75％。但在2型中，同源性通常高于95％。因此，在本發(fā)明的實施中，等同地包括了任何PCV-2株的使用。一個標(biāo)準(zhǔn)可以是該病毒株是2型的，例如在全基因組的核苷酸水平上與本文公開的病毒株如Imp1010株的同源性等于或大于85％、有利地90％或更高，更有利地95％或更高、優(yōu)選97、98、或99％或更高。
下表1中給出了Imp1010株的ORF的界限
這些ORF是相對Imp1010株定義的。本發(fā)明還包括任何其它PCV-2株和本文或本文引用文獻中定義的任何PCV-2株的相應(yīng)ORF的使用。因此，從該基因組核苷酸序列，采用標(biāo)準(zhǔn)軟件例如Mac Vector確定這些ORF是常規(guī)技術(shù)。而且，基因組與1010株基因組的比對以及與1010株ORF的比較使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定另一毒株(例如公開于WO-A-99 18214中的那些，如Imp1008、Imp1010-48121、Imp1011-48285、Imp999、以及新毒株1103和1121)的基因組上的ORF。采用軟件或進行比對，無需過多實驗就可直接地找到這些ORF。
例如，參照圖6和7，下表2中給出了毒株1103和1121的相應(yīng)ORF
而且，不改變所討論基因或該基因編碼的多肽的功能性和毒株特異性(如2型毒株的特異性)的核苷酸序列，是等同的并且在本發(fā)明的實施中是有用的。由于密碼子簡并性而不同的序列當(dāng)然包括在本發(fā)明的實施中。
對于ORF4，PCV-1和PCV-2間的同源性為約86％；對于ORF13，PCV-1和PCV-2間的同源性為約66％。因此，對于ORF4，在本發(fā)明實施中也有用的等同序列是與Imp1010株的ORF4有等于或大于88％、有利地90％或更高、優(yōu)選地92％或95％或更高同源性的那些序列；而對于ORF13，是與Imp1010株的ORF13有等于或大于80％、有利地85％或更高、優(yōu)選地90％或95％或更高同源性的那些序列(采用表1的術(shù)語)。
對于其它ORF的同源性，可以從具有ORF4和/或ORF13的PCV毒株確定與1010株的相應(yīng)ORF有上述定義的同源性的那些序列。對于ORF7，在本發(fā)明實施中有用的序列包括與Imp1010株的ORF7有同源性的那些序列，其中所述同源性有利地等于或大于80％、更有利地85％或更高、優(yōu)選90％或95％或更高。對于ORF10，在本發(fā)明實施中有用的序列包括與Imp1010株的ORF10有同源性的那些序列，其中所述同源性有利地等于或大于86％、更有利地90％或更高、優(yōu)選95％或更高(采用表1的術(shù)語)。
同樣，對于ORF4，在本發(fā)明實施中有用的等同序列是與Imp1010株的ORF4有等于或高于88％、有利地90％或更高、優(yōu)選地90％或95％或更高同源性的那些序列，而對于ORF13是與Imp1010株的ORF13有等于或高于80％、有利地85％或更高、優(yōu)選地90％或95％或更高同源性的那些序列。
ORF4和ORF13可能分別編碼預(yù)期分子量為37.7kD和27.8kD的蛋白質(zhì)。ORF7和ORF10(相應(yīng)于Meehan等，1998中的ORF3和ORF4)可能分別編碼預(yù)期分子量為11.9kD和6.5kD的蛋白質(zhì)。這些ORF的序列也可以在Genbank AF055392中獲得。也可以將它們摻入質(zhì)粒中并根據(jù)本發(fā)明單獨地或聯(lián)合如ORF4和/或ORF13一起使用。
上表中公開的其它ORF1-3和5、6、8-9、11-12(WO-A-9918214中的COL 1-3和5、6、8-9、11-12)、或它們的編碼抗原或目的表位的區(qū)域，也可以用于本發(fā)明實施中，例如單獨地或彼此聯(lián)合地或聯(lián)合ORF4和/或13或它們的編碼抗原或表位的區(qū)域一起使用。類似地，對于同源性，可以從具有ORF13和/或ORF4的PCV病毒株中確定與本文或Meehan等(1998)中定義的1010株的相應(yīng)ORF有以上定義的同源性的等同序列。對于ORF7，等同序列與Imp1010株ORF7有同源性，該同源性有利地是例如等于或高于80％、例如85％或更高、優(yōu)選地90％或95％或更高。而對于ORF10，有利地等同序列與Imp1010株ORF10有等于或高于86％、有利地90％或更高、優(yōu)選地高于95％或更高的同源性。
核苷酸序列同源性可利用Myers和Miller(“線性空間的最佳比對”，CABIO4，11-17，1988)和NCBI提供的“比對(Align)”程序來測定。作為替代或此外，術(shù)語“同源性”或“一致性”，例如關(guān)于核苷酸序列或氨基酸序列的“同源性”或“一致性”，可指兩個序列間同源性的定量測量值。序列同源性百分率可用(Nref-Ndif)*100/Nref來計算，其中Ndif是比對的兩序列中非相同殘基的總數(shù)，Nref是其中一個序列的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC的序列相似性為75％(Nref＝8；Ndif＝2)。
作為替代或此外，關(guān)于序列的“同源性”或“一致性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的數(shù)目除以兩序列中較短序列的核苷酸或氨基酸數(shù)，其中兩序列的比對可按照Wilbur和Lipman的算法(Wilbur和Lipman，1983PNAS美國80726)來確定，例如使用20個核苷酸的窗口大小、4個核苷酸的字長、缺口罰分為4來確定，并且包括比對在內(nèi)的計算機輔助分析及序列數(shù)據(jù)解釋可以方便地使用商業(yè)化程序進行(如IntelligeneticsTMSuite，Intelligenetics Inc.CA)。當(dāng)認(rèn)為RNA序列與DNA序列相似、或有一定程度的序列一致性或同源性時，那么DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
通過將DNA序列中的胸腺嘧啶(T)認(rèn)同為RNA序列中的尿嘧啶(U)，本發(fā)明范圍內(nèi)的RNA序列可由DNA序列衍生而來。
此外或作為替代，氨基酸序列相似性或一致性或同源性可使用BlastP程序(Altschul等，Nucl.Acids Res.25，3389-3402)和NCBI提供的程序來測定。后面的參考文獻提供了算法用于比較兩個蛋白氨基酸殘基的相對一致性或同源性，此外或作為替代，關(guān)于前述問題，這些文獻中的指導(dǎo)可用來測定同源性或一致性百分率Needleman SB和Wunsch CD“適用于搜索兩個蛋白氨基酸序列相似性的普通方法”J.Mol.Biol.48444-453(1970)；Smith TF和Waterman MS，“生物序列比較，”應(yīng)用數(shù)學(xué)進展(Advances in Applied Mathematics)2482-489(1981)；Smith TF，Waterman MS和Sadler JR，“核酸序列功能域的統(tǒng)計學(xué)表征，”Nucleic Acids Res.，112205-2220(1983)；Feng DF和Dolittle RF，“作為修正進化系統(tǒng)樹前提條件的漸進序列比對，”J.of Molec.Evol.，25251-360(1987)；Higgins DG和Sharp PM，“在微型計算機上快速靈敏的多重序列比對，”CABIOS，5151-153(1989)；Tompson JD，HigginsDG和Gibson TJ，“Cluster W通過序列加權(quán)、位置特異性缺口罰分和權(quán)重矩陣選擇提高漸近多重序列比對的靈敏度，Nucleic Acids Res.，224673-480(1994)；和Devereux J、Haeberlie P和Smithies0，“用于VAX的一套綜合性序列分析程序，”Nucleic Acids Res.，12387-395(1984)。
本發(fā)明還包括PCV-2免疫原單獨地或進一步聯(lián)合其它豬病原體的免疫原在制備根據(jù)本發(fā)明的組合物中的用途，例如將這些成分混合；因此，本發(fā)明還包括試劑盒，該試劑盒中各成分單獨容納并任選地為了混合和/或施用將這些容器包裝在一起，其中該試劑盒還可以任選地包括混合和/或施用的說明書。
盡管本發(fā)明已在給雌豬施用含有PCV-2免疫原的免疫原性或疫苗組合物方面進行了討論，但本發(fā)明還可以包括按本文所述的方法給母豬或小母豬和/或給公豬施用這些組合物；因此，母豬和仔豬(例如母豬、小母豬)以及公豬均可以被給予本發(fā)明組合物和/或均可以是本發(fā)明方法的實施對象。
根據(jù)本發(fā)明，免疫原性組合物和疫苗組合物可以含有來自一種以上PCV-2株的免疫原。例如，可以將來自1121和1103株，來自這兩個毒株之一或兩者的免疫原，與本文公開的至少一種其它毒株的免疫原組合起來，或任何其它組合。
本發(fā)明為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠評價PCV-2疫苗的有效性提高了方法。一個方法是ELISA法或采用血清中和。再一方法是疫苗接種后采用強毒性PCV-2株，例如本文公開的其中一個毒株進行攻擊。換言之，本發(fā)明使得可以檢測能夠引起針對PCV-2的免疫原性或保護性應(yīng)答的PCV免疫原，包括PCV-1的免疫原。這些PCV免疫原然后可以用于預(yù)防或治療豬，以抵抗尤其是與PCV-2有關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染，以及抵抗與PCV-2有關(guān)的PMWS和/或其它病理學(xué)后遺癥。
因此，本發(fā)明一方面提供能夠引起針對PCV-2的免疫原性或保護性應(yīng)答的、含有PCV免疫原的免疫原性或疫苗組合物。本發(fā)明還涉及采用這些免疫原進行免疫或接種的方法，并涉及該免疫原在制備該免疫原性或疫苗組合物中的用途。
本發(fā)明將通過以下“實施例和結(jié)果”作進一步描述，提供它們是為了說明而不應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的限制。
圖1描述了SEQ ID NO.1，Imp.1011-48121株的PCV基因組DNA序列。
圖2描述了SEQ ID NO.2，Imp.1011-48285株的基因組DNA序列。
圖3描述了SEQ ID NO.3，Imp.999株的基因組DNA序列。
圖4描述了SEQ ID NO.4，Imp.1010株的基因組DNA序列。
圖5描述了SEQ ID NO.5，PK/15株的基因組DNA序列。
圖6描述了SEQ ID NO.6，在加拿大Alberta分離的1103株的基因組DNA序列。k是指g(G)或t(T)，y是指c(C)或t(T)。在該病毒群體中觀察到這些序列變異。
圖7描述了SEQ ID NO.7，在加拿大Saskatoon分離的1121株的基因組DNA序列。
實施例和結(jié)果實施例/結(jié)果1與PCV-2有關(guān)的心肌炎、流產(chǎn)和宮內(nèi)感染當(dāng)開始投入生產(chǎn)時一個具有450頭雌豬的新豬圈中發(fā)生了后期流產(chǎn)和死產(chǎn)及干化小豬的分娩。在幾頭小母豬中還觀察到假孕。在繁殖前小母豬接種了兩劑含有細小病毒和鉤端螺旋體免疫原的滅活疫苗。
接受尸體檢查的一窩豬仔由9頭表現(xiàn)出死于妊娠不同階段的胎豬組成。其中2頭是干化的、2頭是浸軟的、3頭發(fā)生自體溶解、2頭是新鮮的死產(chǎn)小豬。在僅一個部分自體溶解的胎豬的大體病理學(xué)檢查中觀察到損傷。在此胎豬中心臟的兩個心室均被擴大，肝臟出現(xiàn)增大并且堅硬，有胸膜積水和腹水。組織病理學(xué)檢查，有大面積的心肌退化或壞死，伴有水腫和輕度纖維化，以及彌散性中度淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。有明顯的普遍化肝充血和肝細胞損失。脾和腎也出現(xiàn)充血。在其它胎豬中沒有檢查到顯著的病理學(xué)損傷。
PCV-2的免疫組織化學(xué)染色按先前所述采用針對PCV-2產(chǎn)生的兔多克隆抗血清和單克隆抗體，在福爾馬林固定常規(guī)處理和包埋的組織切片上進行(Ellis等，1998；Ellis等，1999)。在患有擴大的心肌病的胎豬中，整個患病心肌有大范圍對PCV-2抗原的染色。在壞死區(qū)域染色更為顯著，并表現(xiàn)出涉及主要是心肌細胞。細胞質(zhì)和細胞核染色均存在。在多個胎豬中肝內(nèi)有廣泛染色。在一些切片中，似乎涉及主要是竇狀隙內(nèi)皮和Kupfer細胞，而在其它胎豬中(包括患有心肌炎的一頭胎豬)還有肝細胞的細胞核和細胞質(zhì)染色。陽性染色細胞分散在整個肺中，而在腎中出現(xiàn)多個病灶的陽性染色。針對PCV-2的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)按前人所述采用冰凍組織進行(Ellis等，1999)。從胎豬中擴增出針對PCV-2的具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。從患有心肌炎的胎豬和來自此窩的其它胎豬的組織庫中，通過將組織勻漿物接種在無PCV的PK-15細胞上，分離PCV-2。
此外，針對其它與胎豬損傷和豬的流產(chǎn)相關(guān)的病毒病原體，例如豬細小病毒(PPV)、豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、和腸道病毒，檢測了胎豬組織。通過熒光抗體檢測(FAT)在干化或死產(chǎn)胎豬的肺、肝、和脾的冰凍切片上沒有檢測到PPV抗原。我們還將流產(chǎn)胎豬的肝、肺和脾的勻漿物接種在無PCV的PK-15細胞、原代豬輸卵管細胞和Vero細胞的培養(yǎng)物中。三代后沒有檢測到致細胞病變病毒。采用PCR檢測組織的PPV為陰性。通過免疫組織化學(xué)染色沒有檢測到PRRSV抗原。
因此，胎豬的損傷和流產(chǎn)與PCV-2有直接關(guān)系。這些結(jié)果還顯示了該病毒的垂直傳播。
在以前的研究中，從160頭受檢胎豬的2頭中分離出PCV-1，提示該組病毒能夠進行垂直傳播；然而，PCV-1抗原不可能與組織中的任何損傷有關(guān)(Allan等，1995)。其它與胎豬的損傷和豬流產(chǎn)有關(guān)的病因，包括PPV(Bolt等，1997；Molitor等，1991)、PRRSV(Lager等，1996)、EMCV(Kim等，1989)、和腸道病毒(Molitor等，1991)，的排除表明，PCV-2能夠引起顯著的胎豬病變和隨后的流產(chǎn)。
然而，PCV-1免疫原(仍根據(jù)開頭給出的一般定義)可以引起抵抗心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染以及斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征的免疫原性或保護性應(yīng)答，因此也可以采用PCV-1免疫原實施本發(fā)明(例如實施本發(fā)明的方法、組合物、應(yīng)用等)-它們可以單獨地或與PCV-2免疫原聯(lián)合(該載體可以含有并表達編碼PCV-1免疫原和/或表位及PCV-2免疫原和/或表位的DNA)和/或單獨地或與其它豬病原體的免疫原和/或表位聯(lián)合(如果采用載體，則該載體可以含有并表達編碼PCV-1免疫原和/或表位及其它豬病原體的免疫原和/或表位的DNA，或編碼PCV-1免疫原和/或表位及PCV-2免疫原和/或表位及其它豬病原體的免疫原和/或表位的DNA)。因此，作為替代或此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需任何過多實驗可以在本發(fā)明實施中采用PCV-1免疫原、和/或表位、和/或編碼該免疫原和/或表位的載體；例如，為此，僅需要閱讀本實施例之前的本文文本，和在本實施例(后面)結(jié)論處的文本，可以基于此處的講授進行任何小的改動以實現(xiàn)PCV-1對PCV-2的替代。
與PCV-2感染有關(guān)的萎縮綜合征最通常發(fā)生在5-12周齡的小豬身上(Allan等，1998；Ellis等，1998)。對新生豬的實驗感染說明在感染和PCV-2有關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)之間有一個相對長的前驅(qū)期(Allan等，1999；Ellis等，1999)。此處的這些發(fā)現(xiàn)顯示了，該病毒為垂直傳播或在圍生期中傳播。PCV-2的子宮內(nèi)垂直傳播不僅導(dǎo)致流產(chǎn)，而且可能宮內(nèi)感染的亞致死小豬會成為隨后發(fā)生PMWS的動物。
而且，這些結(jié)果顯示，采用含有PCV-2免疫原的組合物(該組合物還可以包括其它豬病原體的免疫原，例如豬細小病毒)在繁殖或配種前、或在圍生期前和/或妊娠期間接種雌豬，通過引起針對PCV-2的免疫應(yīng)答或抗體，可以預(yù)防與豬環(huán)狀病毒-2有關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染，以及與PCV-2有關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥。
當(dāng)然，本發(fā)明的組合物、方法和其它方面可以在非豬的其它動物，例如綿羊、野牛、牛、野豬中使用或?qū)嵤焕?，如果PCV-2感染這些其它動物。實施例/結(jié)果2與PCV-2有關(guān)的心肌炎、流產(chǎn)和宮內(nèi)感染新生小豬中PCV-2的存在提示垂直傳播可能是病毒傳播的一個重要手段。這種傳播模式可能不僅與繁殖失敗有關(guān)，還與生命后期出現(xiàn)的多系統(tǒng)疾病有關(guān)。在PMWS和延伸的PCV-2感染成為地方性疾病至少幾年的豬肉生產(chǎn)區(qū)域中確定以前未檢測到的PCV-2(和PCV-1)是否是垂直傳播的，是有意義的。
Saskatchewan大學(xué)西獸醫(yī)學(xué)院(WCVM)診斷實驗室(Saskatoon，加拿大)在4年期間從加拿大的總共30個高度健康豬群接受了涉及繁殖失敗的38例提交物，并對它們進行了評價。獲取這些樣品的農(nóng)場中5個診斷出了PMWS病案。38例提及物中27例(71％)被定性為流產(chǎn)；其中5例(13％)還涉及至少一個干化胎豬。剩余10例中5例涉及死產(chǎn)小豬和不可存活小豬(5％)；2例涉及死產(chǎn)和一或多個干化胎豬(5％)；2例僅涉及死產(chǎn)小豬(5％)；1例僅涉及干化胎豬(2.5％)。對非環(huán)狀病毒的病原體的常規(guī)診斷揭示，有4例(11％)的病因被確定為豬細小病毒，有2例(5％)的病因被確定為細菌來源的。我們進行了大體尸體解剖，并收集了組織，將其固定在緩沖福爾馬林中(固定時間24-72個小時)，在大多數(shù)情況下，還提交了新鮮組織用于常規(guī)微生物學(xué)評價。這些病案沒有一個先前檢測過PCV-2。
按前人所述實施用于檢測PCV-1和PCV-2的PCR技術(shù)(Tischer等，1974)。在4年期間收集的包含繁殖失敗的所有提交物中均沒有檢測到PCV-1。在兩個不同提交物中，通過PCR檢測到PCV-2，其中所述兩個提交物來源于同一個多點豬肉生產(chǎn)單位，它們是在4年期的最后一年春天于兩個不同時候采取的。這兩個提交物中第一個包括一窩有明顯心肌炎、心臟肥大、和慢性被動充血跡象的小豬。
按前人所述(Tischer等，1974)在組織中進行PCV-2的免疫組織化學(xué)鑒定。在提交的所有6頭小豬中心臟的PCV-2免疫組織化學(xué)染色(IHC)為陽性，而通過PCV-2PCR檢測6頭中有4頭為陽性(見下表)。
表在福爾馬林固定的患有心肌炎的豬心臟中通過PCR、IHC和從細胞培養(yǎng)物中作病毒分離檢測PCV-2。
來自同一個農(nóng)場的第二個提交物由一窩4頭小豬組成，其中2頭死產(chǎn)、另2頭在出生后很快死亡。所有4頭小豬也出現(xiàn)嚴(yán)重彌散性心肌炎、心臟肥大和慢性被動充血的明顯跡象。僅提交了新鮮冰凍心臟和混合的肺/脾組織進行分析。4頭小豬中2頭的心臟和4頭小豬中4頭的混合肺和脾組織，PCV-2PCR為陽性。在PCR檢測為PCV-2陽性的4例中2例，從患病的心臟和/或混合的肺和脾組織分離的PCV-2為陽性?；谘鍖W(xué)和/或PCR，與豬繁殖失敗相關(guān)的其它病因，包括豬繁殖和呼吸綜合征病毒和豬細小病毒，似乎在該繁殖豬群中傳播。然而，這些沒能表現(xiàn)出與患病小豬中的嚴(yán)重心臟(或其它)損傷有關(guān)；但它們可能促進了PMWS。
通過PCR和IHC，4年期間的頭3年中提交的任何繁殖失敗代表性病案中均未檢測到PCV-2(在此4年期間的最后一年提交的繁殖失敗病案中檢測到了PCV-2)。為了排除由于福爾馬林固定引起的DNA損傷，該損傷是限制PCR檢測PCV-2的能力的一個可能不利因素，對收集自患有PMWS的4頭斷奶小豬的組織進行PCR，在從來自所有4個個體的所有測試的固定組織，包括肺、肝、腎和支氣管淋巴結(jié)中，擴增出PCV-2DNA。而且，PCV-2PCR的靈敏度與每種組織在福爾馬林中的固定時間長度無關(guān)。
這些結(jié)果證實并擴充了以前的觀察(West等，1999)PCV-2能夠垂直傳播并能夠大量存在于子宮內(nèi)受感染小豬的損傷處。PCV-2的垂直傳播和導(dǎo)致的胎兒損傷如心肌炎是PCV-2的另一疾病表現(xiàn)。而且，4年期間的最后一年之前在來自PCV-2感染的地方性區(qū)域的繁殖失敗病案中沒有檢測到PCV-2，可能說明垂直傳播不是負(fù)責(zé)病毒感染最初傳播的主要機制。性交和垂直模式的傳播都能夠引起PCV-2感染在豬中的擴散。實施例/結(jié)果3豬環(huán)狀病毒株的培養(yǎng)和分離根據(jù)J.Ellis等(Can.J.Vet.1998，第39卷，44-51)所述方法，在加拿大的Alberta和Saskatoon分別從流產(chǎn)的病案中分離了1103和1021病毒。
在已知沒有被豬環(huán)狀病毒(PCV)、瘟病毒(pestivirus)、豬腺病毒和豬細小病毒感染的PK/15細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)病毒(Allan G.等，剝奪了初乳的小豬的豬環(huán)狀病毒感染的發(fā)病機制和豬胚物質(zhì)的檢測，Vet.Mirobiol.1995，44，49-64)。
通過胰蛋白酶消化(采用胰蛋白酶-versene混合物)從匯合的培養(yǎng)物分散單層PK/15細胞，并吸取放入含有15％胎牛血清、未被瘟病毒污染的MEM-SA培養(yǎng)基(＝MEM-G培養(yǎng)基)中，終濃度為每ml約400,000個細胞。然后將此細胞懸浮液的10ml等分試樣組分與上述接種物的2ml等分試樣組分混合，最后的混合物按6ml的體積等分在兩個25cm2的Falcon瓶中。然后于+37℃在含有10％ CO2的空氣中孵育這些培養(yǎng)物18小時。
孵育后，用300mM D-葡糖胺(Cat# G48175，Sigma-Aldrich CompanyLimited，Poole，UK)處理半?yún)R合單層細胞的培養(yǎng)基，然后于+37℃再繼續(xù)孵育48-72小時。該最后孵育后，對每個接種物的兩個Falcon瓶中的一個實施3個連續(xù)凍/融循環(huán)。剩余Falcon瓶中的PK/15細胞用胰蛋白酶-versene溶液處理，重懸在20ml MEM-G培養(yǎng)基中，然后按400,000個細胞/ml的濃度接種在75cm2Falcon瓶中。然后通過加入5ml從該凍/融循環(huán)獲得的相應(yīng)裂解物，“超感染”這些新鮮接種的瓶。實施例/結(jié)果4通過免疫熒光檢測PCV的技術(shù)采用1/100稀釋的成年豬血清庫，通過間接免疫熒光技術(shù)(IIF)，對丙酮固定的所有細胞培養(yǎng)物制品作初篩。該血清庫包含來自北愛爾蘭的25頭成年母豬的血清，并已知含有抵抗多種豬病毒，包括PCV、豬細小病毒、豬腺病毒、和PRRS病毒的抗體。IFF技術(shù)的實施過程是于+37℃用該血清(稀釋在PBS中)接觸這些細胞培養(yǎng)物1小時，隨后在PBS中洗滌兩次。然后用1/80稀釋在PBS中的偶聯(lián)了異硫氰酸熒光素的兔抗豬免疫球蛋白對這些細胞培養(yǎng)物進行1小時染色，然后用PBS洗滌，并放入甘油緩沖液中，之后在紫外光下作顯微鏡觀察。實施例/結(jié)果5通過體外培養(yǎng)制備PCV抗原根據(jù)實施例1所述相同方法進行未被污染的PK/15細胞的培養(yǎng)和病毒的增殖。37℃孵育4天后胰蛋白酶消化以收集感染的細胞并計數(shù)。按每ml 400,00個感染細胞接種下一代。
本文公開的各種PCV-2毒株，例如1103和1121株，也如此進行培養(yǎng)。實施例/結(jié)果6PCV-2的滴定在96孔微量培養(yǎng)板中進行滴定。首先引入PK/15細胞懸浮液(每ml150 000個細胞)(每孔100μl)。然后稀釋病毒培養(yǎng)物，將其100μl加入這些孔中。于37℃存在CO2時進行孵育。24小時后，用葡糖胺37℃處理半小時(條件見實施例3)。然后去除此培養(yǎng)基，并加入新鮮培養(yǎng)基。37℃孵育72小時。采用抗PCV-2單克隆抗體和FITC標(biāo)記的小鼠偶聯(lián)物顯示病灶。
該方法可以用于滴定以制備滅活和減毒活PCV-2。實施例/結(jié)果7病毒抗原的滅活在病毒培養(yǎng)結(jié)束時，收獲感染細胞，并超聲(Branson超聲儀)破碎或借助轉(zhuǎn)子-定子型膠體磨(UltraTurrax，IKA)裂解。然后3700g離心此上清液30分鐘。采用0.1％乙烯亞胺37℃ 18小時、或采用0.5％ β-丙醇酸內(nèi)酯28℃ 24小時，滅活病毒懸浮液。如果滅活前病毒滴度不足，則采用具有300 kDa截斷值的膜(Millipore PTMK300)通過超過濾濃縮病毒懸浮液。將滅活的病毒懸浮液儲存在+5℃。實施例/結(jié)果8將疫苗制備成基于礦物油的乳劑形式根據(jù)以下配方制備疫苗-滅活豬環(huán)狀病毒的懸浮液250ml-MontanideISA 70(SEPPIC)750ml此水相和油相分別通過過濾除菌。借助于Silverson渦輪乳化器將這些成分混合并勻漿，以制成乳劑。
一劑疫苗含有約107.5TCID50。一劑疫苗的體積對于皮內(nèi)途徑給藥為0.5ml，對于肌內(nèi)途徑給藥為2ml。
該疫苗與Parvovax疫苗聯(lián)合用于抵抗多系統(tǒng)萎縮綜合征的疫苗接種計劃。實施例/結(jié)果9將疫苗制成基于油的可代謝乳劑形式根據(jù)以下配方制備疫苗-滅活豬環(huán)狀病毒的懸浮液200ml-Dehymuls HRE7(Henkel) 60ml-Radia 7204(Oleofina)740ml將此水相和油相分別通過過濾除菌。借助于Silverson渦輪乳化器將這些成分混合并勻漿，以制成乳劑。
一劑疫苗含有約107.5TCID50。一劑疫苗的體積對于肌內(nèi)途徑給藥為2ml。
該疫苗與Parvovax疫苗聯(lián)合用于抵抗多系統(tǒng)萎縮綜合征的疫苗接種計劃。實施例/結(jié)果10用DNA(質(zhì)粒)載體接種小豬將第0天剖腹產(chǎn)獲得的幾個具有3或4頭小豬的組置于隔離室中。在第2天給小豬接種(A)含有ORF13的質(zhì)?；?B)該質(zhì)粒與含有ORF4的另一質(zhì)粒的混合物，并以接種生理鹽水的小豬作為對照組。所有質(zhì)粒均稀釋在無菌生理鹽水(0.9％NaCl)中，終濃度為250μg/μl。通過肌內(nèi)途徑注射2ml體積，兩針各1ml(頸兩側(cè)每一邊各1針)。第14天再次注射疫苗或安慰劑。小豬對DNA接種有很好的耐受性，沒有注意到對接種有不良反應(yīng)的跡象。第21天通過口鼻施用PCV-2病毒懸液(每個鼻孔給予1ml)，攻擊小豬。攻擊后，一周一次稱重小豬。在第17、21、22、24、27、29、31、34、37、41、44天記錄直腸溫度。第44天從每頭小豬收集糞便拭子以檢測PCV-2的泄出。通過定量PCR檢測并定量該病毒。第45天進行尸體剖檢，并收集組織樣品用于病毒分離?！づR床癥狀各組間平均體重增加或平均身體溫度沒有顯著差異?！なw剖檢損傷結(jié)束時在豬身上注意到的僅有的大體發(fā)現(xiàn)是支氣管淋巴結(jié)病。該損傷根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)計分。
0＝?jīng)]有可見的淋巴結(jié)增大1＝輕微淋巴結(jié)增大，局限于支氣管淋巴結(jié)2＝中度淋巴結(jié)增大，局限于支氣管淋巴結(jié)3＝嚴(yán)重淋巴結(jié)增大，擴展至支氣管、下頜下prescapsular和腹股溝的淋巴結(jié)。
std是標(biāo)準(zhǔn)差的縮寫組別 淋巴結(jié)病分?jǐn)?shù)平均值 Std N(A) 1.2 1.3 4(B) 2.0 1.7 3對照 3.0 0.0 3N＝每組的小豬數(shù)量我們觀察到用(A)免疫的4頭小豬中3頭小豬和用(B)免疫的3頭小豬中1頭小豬出現(xiàn)淋巴結(jié)損傷減輕。由于高數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差(std)，該差異沒有顯著性(p＞0.05)。·淋巴結(jié)組織中的病毒負(fù)載量在制備自支氣管和腸系膜淋巴結(jié)的組織勻漿物上進行定量病毒再分離。
給出的數(shù)據(jù)相應(yīng)于組織勻漿物中的病毒滴度，表示為log10。
PCV-2的滴度組別支氣管淋巴結(jié) 腸系膜淋巴結(jié)平均值std 平均值Std N(A)0.9 0.8 0.9 0.8 4(B)0.7 0.6 0.2 0.2 3對照 2.0 1.1 1.8 1.1 4支氣管淋巴結(jié)似乎含有感染性最強的病毒。在(A)或(B)免疫的小豬的支氣管和腸系膜淋巴結(jié)中觀察到病毒負(fù)載量的下降。對于質(zhì)粒混合物這種下降是顯著的(p≤0.05)?！げ《镜呐懦龉艉笸ㄟ^基于PCV-2ORF13的PCR擴增在糞便拭子上評價PCV-2的排出。所有測定均在2ml的樣品上重復(fù)3次。未接種的對照在攻擊前PCV-2為陰性，在攻擊后為陽性，這證實了該PCR測定的有效性。
數(shù)值表示為log10(2μl樣品中PCV-2 DNA分子的數(shù)量)。
組間差異不顯著(p＞0.05)。實施例/結(jié)果11用金絲雀痘病毒活載體接種小豬和結(jié)果將具有第0天剖腹產(chǎn)獲得的3或4頭小豬的幾個組置于隔離室中。在第2天給小豬接種1ml PBS中的108pfu(C)含有ORF13的金絲雀痘病毒或(D)含有ORF13和ORF4的金絲雀痘病毒、或親本金絲雀痘病毒，通過肌內(nèi)途徑在頸側(cè)進行接種。第14天再次注射疫苗或安慰劑。小豬對金絲雀痘病毒接種有很好的耐受性，沒有注意到對接種有不良反應(yīng)的跡象。第21天通過口鼻施用PCV-2病毒懸液(每個鼻孔給予1ml)，攻擊小豬。第45天進行尸體剖檢，并收集組織樣品用于病毒分離。尸體剖檢結(jié)果·PMWS的一般特征是淋巴結(jié)病，較為罕見的是肝炎或腎炎。因此按以下方式對在淋巴結(jié)中的大體觀察結(jié)果為每頭小豬評分0＝無可見淋巴結(jié)增大；1＝輕微淋巴結(jié)增加，局限于支氣管淋巴結(jié)；2＝中度淋巴結(jié)增大，局限于支氣管淋巴結(jié)；3＝嚴(yán)重淋巴結(jié)增大，擴展至支氣管、下頜下prescapsular和腹股溝的淋巴結(jié)。
組別評分(C) 0.50.00.01.0平均值 0.38標(biāo)準(zhǔn)差 0.48(D) 0.00.50.51.0平均值 0.5標(biāo)準(zhǔn)差 0.41對照2.02.52.52.5平均值 2.38標(biāo)準(zhǔn)差 0.25PCV-2的支氣管淋巴結(jié)病的大體觀察結(jié)果是顯著的。采用(C)和(D)免疫后觀察到相對于對照組，淋巴結(jié)損傷有顯著下降(p≤0.05)。
***因此根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述，應(yīng)當(dāng)理解由所附權(quán)利要求書規(guī)定的本發(fā)明不應(yīng)受到以上描述中給出的具體細節(jié)的限制，因為其可以有許多明顯的變化而不偏離本發(fā)明的精神或范圍。參考文獻1.Allan GM，McNeilly F，Cassady JP等1995，豬環(huán)狀病毒的發(fā)病機制；對被剝奪了初乳的小豬的實驗感染和豬胎物質(zhì)的檢查。Vet Microbiol4449-641。
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附件1DNA疫苗-PCV相關(guān)申請參考1998年5月21日提交的美國申請系列號09/082,558和作為09/082,558的部分延續(xù)的1998年9月25日提交的美國申請系列號09/161,092，這些申請以參考文獻方式并入本文，而且在本申請中引用的每篇文獻也以參考文獻方式并入本文。(參考作為1998年5月21日提交的美國申請系列號09/082,558的CIP于1998年9月25日提交的美國申請系列號09/161,092，該申請要求法國申請97/12382、98/00873和98/03707(提交日期為1997日10月3日、1998年1月22日和1998年3月20日)的優(yōu)先權(quán)；所有這些申請，以及其中所引用的每篇文獻均并入本文作為參考)。
本發(fā)明涉及編碼和表達豬環(huán)狀病毒免疫原(豬環(huán)狀病毒，PCV)的質(zhì)粒構(gòu)建體，豬環(huán)狀病毒免疫原與PMWS綜合癥(豬多系統(tǒng)萎縮綜合征或斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征)有關(guān)，也涉及免疫接種的方法和DNA疫苗，還涉及生產(chǎn)和制備這些疫苗的方法。本文引用的所有文獻，以及本文引用的文獻中引用的所有文獻特此并入本文作為參考。
PCV最初作為豬腎細胞系PK/15中非細胞病原性污染物被檢測到。這種病毒與雞貧血癥病毒(雞貧血癥病毒CAV)和PBFDV病毒(鸚鵡喙和羽毛疾病(Pscittacine Beak and Feather Disease)病毒)一起分在Circoviridae中。這些是小的無包膜病毒(15至24nm)，其共同特征是含有一種1.76至2.31千堿基對(kb)的環(huán)形單鏈DNA形式的基因組。開始認(rèn)為這一基因組編碼大約30kDa多肽(Todd等，Arch.Virol.，1991，117129-135)。然而最近的工作顯示存在更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1997，78221-227)。此外，在三種已知的環(huán)狀病毒種間，已知在核苷酸序列或共同抗原決定簇中沒有明顯的同源性。
來源于PK/15細胞的PCV被認(rèn)為不是致病性的。從B.M.Meehan等J.Gen.Virol.1997(78)221-227已知其序列。僅在最近一些作者認(rèn)為PCV毒株可能是病原性的，并且與PMWS綜合癥有關(guān)(G.P.S.Nayar等，Can.Vet.J.，1997，38385-387和Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501)。Nayar等利用PCR技術(shù)在患有PMWS綜合癥的豬中已檢測到PCV DNA。
針對具有PMWS綜合癥癥狀的豬中所發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀病毒e的單克隆和多克隆抗體能夠說明這些環(huán)狀病毒和從PK-15細胞培養(yǎng)物分離的豬環(huán)狀病毒之間的區(qū)別(Allan G.M.等Vet Microbiol.，1999，66115-123)。
在加拿大，美國和法國所發(fā)現(xiàn)的PMWS綜合癥以重量逐漸喪失和以例如呼吸急促、呼吸困難和黃疸表現(xiàn)為臨床特征。根據(jù)病理觀點，它由淋巴細胞或肉芽腫滲入，淋巴結(jié)病，少數(shù)情況下由肝炎和淋巴細胞或肉芽腫腎炎證明(Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501；La Semaine Veterinaire No.26，La Semaine Veterinaire 1996(834)增刊；La Semaine Veterinaire 1997(857)54；G.P.S.Nayer等，Can.Vet.J.，1997，38385-387)。
從北美和歐洲獲得的這些環(huán)狀病毒非常近緣相關(guān)，它們的核苷酸序列具有96％的等同程度，而當(dāng)這些環(huán)狀病毒的核苷酸序列與從PK-15細胞分離的豬環(huán)狀病毒比較時，等同性程度不到80％。因此，有人提出了兩個病毒子群，PCV-2是與PMWS綜合癥相關(guān)的環(huán)狀病毒，PCV-1用于從PK-15細胞分離的環(huán)狀病毒(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1998，792171_2179；WO-A9918214)。
申請人已發(fā)現(xiàn)編碼和表達PCV-2免疫原的質(zhì)粒構(gòu)建體可以用來針對PMWS綜合癥免疫豬。
PCV-2免疫原可以與PCV-1免疫原結(jié)合使用，也針對PCV-2免疫這些動物。
根據(jù)不太優(yōu)選的方式，PCV-1免疫原可以單獨地使用。
本發(fā)明的主題是編碼和表達PCV-1或PCV-2免疫原，特別是PCV-1的開放讀框(ORFs)1和2，PVC-2的ORFs 1和2的質(zhì)粒構(gòu)建體。
不言而喻，本發(fā)明自動覆蓋編碼和表達等同核苷酸序列的質(zhì)粒，所說的等同核苷酸序列是這樣的序列既非改變所考慮的基因或這一基因編碼的多肽的功能性，也非改變它們的毒株特異性。當(dāng)然會包括因密碼子簡并性產(chǎn)生的不同的序列。
用于實施例的PCV-2序列來源于Meehan等，同上(ORF1核苷酸398-1342；ORF2核苷酸1381-314；分別符合1998年9月25日的US09/161，092中的ORF4和ORF13和WO-A-9918214中的COL4和COL13)。其它PCV-2序列在以下文獻中已出版WO-A-9918214(稱為Imp1008，Imp999，Imp1011-48285和Imp1011-48121)；A.L.Hamel等J.
Virol.June1998，vol72，65262-5267(GenBank AF027217)；I.Norozov等J.ClinicalMicrob.Sept.1998 vol.36，92535-2541；以及GenEank AF086834，AF086835和AF086836，并且給出等同的ORF序列索取號。
本發(fā)明也覆蓋了這種意義上的等價序列，它們在高嚴(yán)格條件下能夠與所考慮的基因的核苷酸序列雜交。在所說的等價序列中，也可以是所提到的基因的保留完整序列免疫原性的片段。
1998年9月25日的US09/161,092中的其它ORFs1-3和5-12(WO-A-9918214中的COLs1-3和5-12)，尤其是ORFs7和10，在這里所描述的條件下，可以組合或相互或與這里定義的ORFs1和2一起使用。
術(shù)語質(zhì)粒在這里意欲包括多核苷酸序列形式的任何DNA轉(zhuǎn)錄單位，包含待表達的PCV序列和其體內(nèi)表達必需的元件。環(huán)形質(zhì)粒形式，超卷曲的或其它方式的，是優(yōu)選的。線性形式也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的主題更具體地說是被稱為pJP109(包含PCV-2的ORF2基因，圖1)，pJP111(包含PCV-2的ORF1基因，圖2)，pJP120(包含PCV-1的ORF2基因，圖3)和pJP121(包含PCV-1的ORF1基因，圖4)的質(zhì)粒。
每一質(zhì)粒包含能夠確保在其控制下的插入基因在宿主細胞中表達的啟動子。一般來說它是一個強大的真核啟動子，特別是巨細胞病毒早期啟動子CMV-IE，人或鼠源的，也可以是其它來源的，如大鼠或天竺鼠。更一般地，啟動子或是病毒來源的或是細胞來源的。作為非CMV-IE的病毒啟動子，可以提及的是SV40病毒早期或晚期啟動子或Rous肉瘤病毒LTR啟動子。它也可以是基因所來源的病毒的啟動子，例如，對基因特異的啟動子。作為細胞啟動子，可以提及的是細胞支架基因啟動子，例如結(jié)蛋白啟動子或肌動蛋白啟動子。當(dāng)幾個基因在相同的質(zhì)粒中存在時，它們可以在相同的轉(zhuǎn)錄單位或兩個不同的轉(zhuǎn)錄單位中提供。
質(zhì)粒也可以包含其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，例如，內(nèi)含子型的穩(wěn)定序列，優(yōu)選的是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(van Ooyen等科學(xué)，1979，206337-344)，由組織纖溶酶原活化基因編碼的蛋白質(zhì)的信號序列(tPA；Montgomery等，Cell.Nol.Biol.1997，43235-292)，以及多聚腺苷酸化信號(polyA)，特別是牛生長激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)的或兔β-珠蛋白基因的。
本發(fā)明的主題也是免疫原性制劑和DNA疫苗，它們包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的編碼和表達PCV-1或PCV-2免疫原中的一個，優(yōu)選地是以上提到的ORFs之一的質(zhì)粒，以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，可以也可以不包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
本發(fā)明的主題更具體地說是包含至少一種編碼和表達PCV-1或PCV-2免疫原的質(zhì)粒的免疫原性制劑和疫苗，與佐劑配制的組合物，所說的佐劑特別是含有季銨鹽的陽離子脂，優(yōu)選的是DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-1-丙銨(WO-A-9634109)，最好與中性脂，例如優(yōu)選的是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)連接，形成DMRIE-DOPE。優(yōu)選的，與這一佐劑的質(zhì)粒混合物就在使用之前制成，最好是在施用于動物之前制成。由此產(chǎn)生的混合物使得可以形成復(fù)合物，例如在10至60分鐘，特別是30分鐘時間內(nèi)。
當(dāng)DOPE存在時，DMRTE∶DOPE摩爾比例優(yōu)選的范圍是95∶5到5∶95，更優(yōu)選的是1∶1。
質(zhì)粒DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑的重量比范圍是50∶1到1∶10，優(yōu)選的是10∶1到1∶5，更優(yōu)選的是1∶1到1∶2。
根據(jù)另一個本發(fā)明的有利的方式，可能的是利用作為佐劑的佐劑化合物，其選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，順丁烯二酸酐的共聚物和鏈烯基衍生物的共聚物。特別是與糖的或多元醇的聚鏈烯基醚連接的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物是優(yōu)選的。這些混合物被稱作carbomer(Pharmeuropa vol. 8，No.2，June1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參考US-A-2,909,462(本文一并參考)，該文獻描述了與聚羥基化的化合物交聯(lián)的這樣的丙烯酸聚合物，所說的化合物具有至少3個羥基，優(yōu)選地不多于8個羥基，至少3個羥基的氫原子由具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團取代。優(yōu)選的基團是那些包含2至4個碳原子的基團，例如乙烯基，丙烯基和其它烯鍵不飽和基團。不飽和基團本身可以包含其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(GF Goodrich，俄亥俄，美國)出售的產(chǎn)品特別適當(dāng)。它們與丙烯基蔗糖或者與丙烯基季戊四醇交聯(lián)，在它們中，可以提到的是Carbopol974P，934P和971P。
在順丁烯二酸酐的共聚物和鏈烯基衍生物的共聚物中，EMAs(Monsanto)是優(yōu)選的，它是順丁烯二酸酐和乙烯的共聚物，線性或交聯(lián)的，例如與二乙烯基醚交聯(lián)的，可以參見J.Fields等，自然，186778-780，4 June 1960(本文一并參考)。從它們的結(jié)構(gòu)的觀點看，丙烯酸或甲基丙烯酸和EMAs的聚合物優(yōu)選地含有下式的基本單位 其中-R1和R2，相同或不同，代表氫或甲基。-X＝0或1，優(yōu)選的X＝1-Y＝1或2，當(dāng)X+Y＝2時對于EMAs，X＝0，Y＝2。對carbomers，X＝Y(jié)＝1。
這些聚合物在水中的分解形成酸性溶液，其會被中和，優(yōu)選的是至生理pH，以給出佐劑溶液，實際的疫苗將摻入其中。聚合物的羧基部分以COO-形式。
對于這種類型的佐劑，較好的是制備佐劑，特別是carbomer在蒸餾水中的溶液，優(yōu)選的是氯化鈉存在下，所獲得的溶液在酸性pH下。通過添加至所需數(shù)量的(由此獲得所需的最終濃度)、或相當(dāng)大部分的有氯化鈉的水，優(yōu)選生理鹽水(NaCl 9g/l)中，稀釋該儲備溶液，以一或多個部分進行伴隨的或后續(xù)的中和(pH7.3至7.4)，優(yōu)選的是用氫氧化鈉中和。當(dāng)其與質(zhì)粒，特別是以冷凍干燥，液體或凍結(jié)形式貯存的質(zhì)粒，混合時，就使用這種在生理pH下的溶液。
在最終疫苗組合物中的聚合物濃度將是0.01％至2％w/v，特別是0.06至1％w/v，優(yōu)選的是0.1至0.6％w/v。
在一特定的實施方案中，免疫原性或疫苗制劑包含一種質(zhì)?；蚓幋a和表達PCV-2ORF1和ORF2的質(zhì)粒的混合物。
本發(fā)明也提供了將針對豬環(huán)狀病毒的免疫接種和針對其它豬病原體的免疫接種聯(lián)合的方法，所說的病原體特別是可能與PMWS綜合癥相關(guān)的那些。
因此，本發(fā)明的主題也是含有至少一種按照本發(fā)明的質(zhì)粒和至少另一種編碼和表達豬免疫原的質(zhì)粒的質(zhì)?；旌衔?，所說的免疫原選自，例如，奧耶斯基氏病病毒(假狂犬病毒或PRY)的糖蛋白gB和gD，豬流感病毒H1N1的血細胞凝集素和核蛋白，豬流感病毒H3N2的血細胞凝集素和核蛋白，Lelystad與美國毒株的PRRS病毒的ORF5和ORF3基因，豬細小病毒的VP2蛋白質(zhì)，豬霍亂病毒(HCV)的E1和E2蛋白質(zhì)，從大葉性肝炎的線桿菌缺失的apxI，apxII以及apxIII基因(參見例如WO-A-9803658的質(zhì)粒)。
這些質(zhì)?；旌衔飱A帶在獸醫(yī)學(xué)上可接受載體或稀釋劑，可有可無的前面描述的獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑中，由此形成免疫原性制劑或多價DNA疫苗。這些免疫原性制劑或多價疫苗用DMRIE，最好是與中性脂DOPE連接形成的DMRIE-DOPE，配制可以特別有利。
所配制的或者用以上描述的佐劑配制的根據(jù)本發(fā)明的制劑或單價或多價DNA疫苗用細胞因子(優(yōu)選的是豬來源的，特別是豬GM-CSF)補充也可以是有利的。這種豬GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；ClarkS.C.等科學(xué)1987，2301229；Grant S.TA.等藥物，1992，53516)的添加可以通過將豬GN-CSF蛋白質(zhì)或是編碼和表達豬GN-CSF基因的質(zhì)粒摻入到制劑中或者摻入到疫苗中實現(xiàn)(Inumaru S.和Takamatsu H.免疫細胞生物學(xué)，1995，73474-476)。尤其是，編碼和表達豬GM-CSF的質(zhì)?？梢允琴|(zhì)粒pJP058(圖5)。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性制劑和單價或多價DNA疫苗也可以與針對至少一種不同的或相同的豬病原體的至少一種常規(guī)疫苗(減毒活疫苗，滅活疫苗或亞單位疫苗)或重組疫苗(病毒載體)組合使用。本發(fā)明特別提供了與含佐劑的常規(guī)疫苗(減毒的活疫苗，滅活的疫苗或亞單位疫苗)組合的方法。對于滅活疫苗或亞單位疫苗，可以提到特別包含單獨的或與作為佐劑的皂角甙混合的氧化鋁凝膠的那些，或者以水包油乳劑形式配制的那些。
本發(fā)明的主題也是免疫方法，其使得可能在豬中針對按照本發(fā)明的環(huán)狀病毒誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。其主題具體地說是在豬中有效的免疫接種的方法。這些免疫和免疫接種的方法包括施用以上描述的制劑的一種或者單價或多價DNA疫苗的一種。這些免疫和免疫接種的方法包括施用一個或多個這些制劑或DNA疫苗的后續(xù)劑量。在這種免疫或免疫接種方法的上下文中，可以通過現(xiàn)有技術(shù)中提出的用于多核苷酸免疫接種的各種施用路線施用所說的制劑和DNA疫苗。特別是肌內(nèi)和真皮內(nèi)路線，并且借助已知的施用技術(shù)，特別是使用有針的注射器進行液體推注式的注射(Furth等，分析生物化學(xué)，1992，205365-368)、或者通過涂布有一層DNA的金微粒投射注射(Tang等，自然，1992，356152-154)。
這種方法不僅使得可以施用到成年豬，而且也可以施用到幼年和懷孕豬；在后一種情況下，其使得可以，尤其是，將被動免疫賦予新生豬(母性的抗體)。
用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗的DNA的數(shù)量在約10μg和約2000μg之間，優(yōu)選的約50μg和大約1000μg之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力精確限定用于每一免疫或免疫接種方案的DNA的有效劑量。
劑量體積可以在0.5和5ml之間，優(yōu)選的在2和3ml之間。
免疫和免疫接種的優(yōu)選方法包括通過肌內(nèi)路線施用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗。
現(xiàn)在將參照附圖，借助非限制性例證性實施方案更為詳細地描述本發(fā)明。在附圖中圖1質(zhì)粒pJP109圖2質(zhì)粒pJP111圖3質(zhì)粒pJP120圖4質(zhì)粒pJP121圖5質(zhì)粒pJP058序列表SEQ IDSEQ ID NO1寡核苷酸JP779SEQ ID NO2寡核苷酸JP780SEQ ID NO3寡核苷酸JP781SEQ ID NO4寡核苷酸JP782SEQ ID NO5寡核苷酸JP783SEQ ID NO6寡核苷酸JP784SEQ ID NO7寡核苷酸JP785SEQ ID NO8寡核苷酸JP786實施例實施例1構(gòu)建質(zhì)粒pJP109用EcoRI消化含有EcoRI片段形式的PCV-2病毒基因組的質(zhì)粒pGEM7Z-Imp1010 Stoon-EcoRI No.14(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79 2171-2179)，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離1768堿基對(bp)的EcoRI-EcoRI片段。這一片段是自連接的。
用由自連接的EcoRI-EcoRI片段組成的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增PCV-2病毒株1010-Stoon的ORF2基因(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998. 79. 2171-2179；GenBank序列登記號AF055392)Jp779(SEQ ID NO1)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3’JP780(SEQ ID NO 2)(36聚體)5’TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3’以產(chǎn)生730bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離715bp SalI-BglII限制片段。然后將該片段與事先用SalI和BglII消化的質(zhì)粒pVR1012(Hartikka J.等，人類基因治療，1996.7.1205-1217)連接，給出質(zhì)粒pJ109(5567pb)(圖1)。實施例2構(gòu)建質(zhì)粒pJP111使用質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon(參見實施例1)(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179)和下列寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(yīng)Jp781(SEQ ID NO3)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3’JP782(SEQ ID NO 4)(36聚體)5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3’以產(chǎn)生含有PCV-2病毒ORF1基因的970bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離955bp SalI-BglII限制片段。然后將該片段與質(zhì)粒pVR1012(實施例1)連接，以便給出質(zhì)粒pJP111(5810bp)(圖2)。實施例3構(gòu)建質(zhì)粒pJP120(PCV-1 ORF2)使用質(zhì)粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol. 1997.78. 221-227)和下列寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(yīng)JP783(SEQ ID NO 5)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3’JP784(SEQ ID NO 6)(40聚體)5’TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3’以產(chǎn)生含有PCV-1病毒(PK-15毒株，GenBank登記號U49186)ORF2基因的730bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離715bp SalI-BglII限制片段。然后將該片段與質(zhì)粒pVR1O12(實施例1)連接，以便給出質(zhì)粒pJP120(5565bp)(圖3)。實施例4構(gòu)建質(zhì)粒pJP121(PCV-1 ORF1)用PstI消化含有PstI片段形式的PCV-1病毒基因組的質(zhì)粒pPCV1(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997，78，221-227)，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離1759堿基對(bp)的PstI-PstI片段。這一片段是自連接的。
用由自連接的PstI-PstI片段組成的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增PCV-1病毒株P(guān)K-15(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997，78，221-227；GenBank序列登記號U49186)的ORF1基因JF785(SEQ ID NO 7)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3’JP786(SEQ ID NO 8)(36聚體)5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3’以產(chǎn)生包含PCV-1病毒(毒株P(guān)K-15)的ORF1基因的965bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離946bpSalI-BglII限制片段。然后將該片段與質(zhì)粒pVR1012(實施例1)連接，給出質(zhì)粒pJP121(5804bp)(圖4)實施例5構(gòu)建質(zhì)粒pJP058(表達豬GM-CSF)通過從頸靜脈采血，用含有EDTA的管子收集豬血液。經(jīng)Ficoll梯度離心收獲單核化的(mononucleated)細胞，然后在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL)上體外培養(yǎng)，通過以5μg/ml終濃度在培養(yǎng)基中添加伴刀豆球蛋白A(Sigma)進行刺激。在刺激72小時之后，收獲成淋巴細胞，用抽提試劑盒″小量總RNA分離試劑盒″(Clontech)，按照制造商推薦的辦法抽提這些細胞的總RNA。借助“第1鏈cDNA合成試劑盒”(PerkinElmer)，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，接著采用下列寡核苷酸，對從這些豬成淋巴細胞抽提的總RNA進行聚合酶鏈反應(yīng)RG972(33聚體)(SEQ ID NO9)5’TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3’RG973(34聚體)(SEQ ID NO10)5’TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3’以產(chǎn)生約450堿基對(bp)的PCR片段。將這一片段以NotI消化以便瓊脂糖凝膠電泳后分離450bp NotI-NotI片段。然后將該片段與質(zhì)粒pVR1012(實施例1)連接，優(yōu)選地是以NotI消化并去磷酸化的質(zhì)粒pVR1012，給出質(zhì)粒pJP058(5405bp)(圖5)。檢查克隆進質(zhì)粒pJP058的pGM-CSF基因的序列，發(fā)現(xiàn)與GenBank數(shù)據(jù)庫中(登記號D21074)獲得序列相同。實施例6產(chǎn)生免疫接種豬的純化的質(zhì)粒用以上實施例1到5的質(zhì)粒pJP109，pJP111，pJP058，pJP120和pJP121轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12細菌(菌株DH10B或SCS1)。然后分開在Luria-Broth(LB)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(37℃)用這五種質(zhì)粒分別獲得的五種轉(zhuǎn)化克隆。在指數(shù)階段的末期收獲細菌培養(yǎng)物。根據(jù)堿性溶胞技術(shù)提取質(zhì)粒。然后根據(jù)由Sambrook等描述的技術(shù)(分子生物學(xué)實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)在氯化銫梯度上純化所提取的質(zhì)粒。在溴化乙錠最終抽提和在無水乙醇存在下沉淀后，將純化的質(zhì)粒重懸于TE緩沖液(1mM Tris/EDTA pH8.0)中，以獲得含每毫升2毫克質(zhì)粒的貯存液。使用前將該貯存液貯存在-20℃下。實施例7控制PCV-2病毒ORFs1和2的表達為了控制分別克隆進質(zhì)粒pJP109和pJP111的PCV-2ORF2與PCV-2ORF1基因表達的產(chǎn)物，按照制造商推薦的使用方法，采用LipofectaminePl us？轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco-BRL，目錄10964-013)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進CHO-Kl(中國倉鼠卵巢)細胞(ATCC號CCL-61)。轉(zhuǎn)染后48小時，洗滌轉(zhuǎn)染的細胞，在室溫以95％的冰丙酮溶液固定3分鐘。將對PCV-2ORF1蛋白質(zhì)(F199 1D3GA和F210 7G5GD)與ORF2蛋白質(zhì)(F190 4C7C，F(xiàn)1902B1BC和F190 3A8BC)特異性的五種單克隆抗體用作第一抗體。以Cy3標(biāo)記的抗小鼠IgG綴合物用來揭示特定標(biāo)記。采用3種PCV-2ORF2單克隆在質(zhì)粒pJP109轉(zhuǎn)染的細胞中觀察到一種PCV-2特定熒光，而用質(zhì)粒pJP111轉(zhuǎn)染的細胞中沒有。相反采用2種PCV-2ORF1單克隆在質(zhì)粒pJP111轉(zhuǎn)染的細胞中觀察到一種PCV-2特定熒光，而用質(zhì)粒pJP109轉(zhuǎn)染的沒有。采用PCV-2單克隆在質(zhì)粒pVR1012單獨轉(zhuǎn)染的CHO細胞或未轉(zhuǎn)染的CHO細胞中檢測不到任何熒光。
采用對PCV-2病毒特異性的多克隆血清觀察到相同的表達結(jié)果。在這種情況下，熒光標(biāo)記的抗-豬IgG綴合物用于檢測特定熒光。采用這種多克隆血清在質(zhì)粒pVR1012單獨轉(zhuǎn)染的CHO細胞或未轉(zhuǎn)染的CHO細胞中檢測不到任何熒光。實施例8用裸DNA免疫接種豬8.1 1天齡小豬通過D0天剖腹產(chǎn)方案獲得的幾組小豬置于分開的單位中，用各種質(zhì)粒疫苗溶液經(jīng)肌內(nèi)路線在2天時接種這些小豬。經(jīng)用無菌生理鹽水(0.9％NaCl)稀釋貯存液制備疫苗溶液。
小豬用單獨的質(zhì)粒pJP109或質(zhì)粒pJP109與pJP111的混合物或質(zhì)粒pJP109與pJP058的混合物或質(zhì)粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物接種。
疫苗溶液含有每一質(zhì)粒500μg。
體積疫苗溶液經(jīng)肌內(nèi)路線以2ml總體積注射。在實施中，給定接種小豬的年齡(1-2天)，在頸兩側(cè)的每一邊給予1毫升的一次注射(＝2×1ml)。
兩次疫苗注射在兩周間隔進行，這就是說在方案的D2天和D14天進行。
在方案的D21天用口鼻施用毒性PCV-2毒株病毒懸液進行激發(fā)。然后監(jiān)測小豬三周，觀察小豬斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征的特定臨床征候的出現(xiàn)。觀測到的癥候是直腸溫度頭14天每日測量，然后，在激發(fā)后的第三周測量兩次。重量就在激發(fā)之前稱量小豬，在激發(fā)后的3周期間每周稱量一次。試驗病毒血癥和抗體之血樣的收集在D2，D14，D21，D28，D35和D42天采集血樣。尸體解剖在D42天，溫和地處死存活的小豬，進行尸體解剖，以研究病理解剖學(xué)損傷，并從肝臟，淋巴結(jié)，脾，腎以及胸腺進行組織學(xué)制備，以研究在這些組織中的損傷。8.2. 5-7周大豬崽不再具有對PCV-2病毒特異性的母性抗體的5-7周大豬崽經(jīng)肌內(nèi)路線接種單獨質(zhì)粒pJP109，或者質(zhì)粒pJP109與pJP111的混合物，或者質(zhì)粒pJP109與pJP058的混合物或者質(zhì)粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物。
接種劑量與實施例8.1中所指出的那些相同(每個質(zhì)粒500μg)。以2ml體積經(jīng)肌內(nèi)路線注射疫苗溶液(一次施用2ml到頸肌肉)。
兩次免疫接種間隔21天(D0和D21)。通過肌內(nèi)施用毒性PCV-2毒株的病毒懸液，在最后一次接種后的14天(D35)進行激發(fā)。
監(jiān)測小豬八周，觀察小豬斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征的特定臨床征候的出現(xiàn)。激發(fā)后小豬的臨床監(jiān)測與實施例8.1中描述的相同，只是總的觀察期這次是8周。實施例9用以DMRIE-DOPE配制的DNA免疫接種小豬替代實施例8中所描述的裸質(zhì)粒DNA溶液，使用以DMRIE-DOPE配制的質(zhì)粒DNA溶液是可能的。用0.9％NaCl制備1mg/ml的DNA溶液(含有根據(jù)實施例6的一種或多種質(zhì)粒)。通過將DMRIE-DOPE的凍干物吸收進合適體積的無菌蒸餾水中制備0.75mM DMRIE-DQPE溶液。
通過用0.9％NaCl中的1mg/ml DNA溶液等份稀釋0.75mM DMRIE-DOPE溶液，形成質(zhì)粒DNA-陽離子脂復(fù)合物。借助裝有26G針的注射器，沿著包含陽離子脂溶液的藥瓶的壁，慢慢引入DNA溶液，避免形成泡沫。兩種溶液混合，迅速輕輕振蕩。最終獲得包含0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml DNA的組合物。
對在以上描述的所有操作，在室溫下使用溶液是合乎需要的。在免疫豬之前30分鐘，在室溫下形成DNA/DMRIE-DOPE復(fù)合物。
然后根據(jù)實施例8.1和8.2中描述的條件接種豬。
應(yīng)當(dāng)清楚地理解，由本所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明不受以上說明書中指出的具體實施方案的限制，但包括不偏離本發(fā)明范圍和精神的變體。
權(quán)利要求書1.一種免疫原性制劑或疫苗，它們一方面包含編碼和表達選自PCV-2的ORF1、PCV-2的ORF2、PCV-1的ORF1以及PCV-1的ORF2的基因的質(zhì)粒，另一方面包含能夠增強針對所說基因表達產(chǎn)物之免疫反應(yīng)的元件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強免疫反應(yīng)的元件包含作為佐劑的DMRIE。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于DMRIE連接到一中性脂上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于DMRIE連接到DOPE上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強免疫反應(yīng)的元件包括作為佐劑的carbomer。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強免疫反應(yīng)的元件包括豬細胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其中所說的豬細胞因子是GM-CSF。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其包含編碼和表達豬細胞因子的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強免疫反應(yīng)的元件包括作為佐劑的豬細胞因子和選自由DMRIE，DMRIE/DOPE和carbomer組成的組的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到10之任一的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其包含編碼和表達另一個豬免疫原的質(zhì)粒。圖1 圖2 圖3 圖4 圖5
附件2發(fā)明名稱豬環(huán)狀病毒重組痘病毒疫苗相關(guān)申請的交叉文獻參考美國系列號09/082,358(申請日1998年5月21日)和作為系列號09/082,558的部分延續(xù)的美國系列號09/161,092(申請日1998年9月25日)，所有這些申請和其中引用的每篇文獻均特此并入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及修飾的痘病毒和制備及使用它們的方法。更具體地，本發(fā)明涉及重組ALVAC，該病毒表達豬環(huán)狀病毒(環(huán)狀病毒)2(PCV2)的基因產(chǎn)物，并涉及誘導(dǎo)針對PCV2基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答并賦予抵抗PCV2感染的保護性免疫的免疫組合物或疫苗。
本申請參考了幾篇出版物。在權(quán)利要求說明書之前具體描述的結(jié)尾處可找到所有這些文獻的引用處。這些文獻屬于本發(fā)明的領(lǐng)域；并且本申請參考的每篇文獻和所有這些文獻中引用的每篇文獻均特此并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征(PMWS)是近來在仔豬中發(fā)現(xiàn)的一種疾病。PMWS的臨床癥狀為逐漸的體重降低和其它癥狀如呼吸急促、呼吸困難和黃疸。病理上可觀察到淋巴細胞和肉芽腫性浸潤液、淋巴結(jié)病，和更罕見的淋巴細胞和肉芽腫性肝炎及腎炎(Clark，1997；Harding，1997)。
在不同的歐洲國家以及北美都描述了該疾病。目前該疾病還不能得到預(yù)防和治療。
有幾條證據(jù)指出豬環(huán)狀病毒是PMWS的病原體(Ellis等，1998)。已從患有PMWS的豬身上獲得了環(huán)狀病毒，而且已經(jīng)證明患有該疾病的豬有豬環(huán)狀病毒的抗體。
環(huán)狀病毒是在某些動物和植物種屬中發(fā)現(xiàn)的單鏈環(huán)狀DNA病毒。豬環(huán)狀病毒最初作為污染因子從豬腎傳代細胞系分離。該細胞培養(yǎng)分離株曾被命名為PK-15(Meehan等，1997)。最近，比較了獲自患有PMSW的豬的豬環(huán)狀病毒與PK-15。這類病毒與PK-15在核苷酸和蛋白序列水平上有實質(zhì)性不同，已被命名為PCV2(Meehan等，1998；Hamel等，1998)。
在PCV2基因組中鑒定了多達13個開放讀碼框(ORF)(法國專利申請9803707中的COL1-COL13)。這些ORF中的四個與PK-15基因組的類似ORF基本同源。含有nt 398-1342(GenBank登錄號AF055392)的ORF1(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國專利申請98 03707中的COL4)，可能編碼預(yù)期分子量為37.7kD的蛋白。含有nt 1381-1768且與1-314連接(GenBank登錄號AF055392)的ORF2(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國專利申請98 03707中的COL13)，可能編碼預(yù)期分子量為27.8kD的蛋白。含有nt 1018-704(GenBank登錄號AF055392)的ORF3(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國專利申請98 03707中的COL7)，可能編碼預(yù)期分子量為11.9kD的蛋白。含有nt912-733(GenBank登錄號AF055392)的ORF4(Meehan等，1998；相應(yīng)于法國專利申請98 03707中的COL10)可能編碼預(yù)期分子量為6.5kD的蛋白。
PCV2的ORF1與PK-15分離株的ORF1(Meehan等，1998)高度同源(86％的一致性)。已部分表征了PK-15的ORF1蛋白((Meehan等，1997；Mankertz等，1998a)。已知它是病毒復(fù)制所必需的，并且可能參與病毒DNA的復(fù)制。
各個ORF2的蛋白序列一致性比ORF1要低，但，每個ORF2共有一個高度保守的堿性N末端區(qū)，與禽環(huán)狀病毒雞白血病病毒(CAV)(Meehan等，1998)的主要結(jié)構(gòu)蛋白的N末端區(qū)相似。近來，Mankertz等(1998b)提出PK-15分離株的ORF2(在Mankertz等，1998b中命名為ORF1)編碼衣殼蛋白。
在PK-15分離株和PCV2各自的ORF3和ORF4中觀察到了更大差別。在每種情況下，與PK-15分離株基因組中存在的相應(yīng)ORF相比，PCV2 ORF4和ORF3的C末端區(qū)有缺失。在ORF3和ORF4的N末端區(qū)都觀察到了最高的蛋白序列一致性(Meehan等，1998)。
還沒有發(fā)表對PCV2基因組的轉(zhuǎn)錄分析。從PK-15分離株獲得的近期數(shù)據(jù)表明ORF2轉(zhuǎn)錄物被剪接(在Mankertz等，1998b)。
痘苗病毒已成功用于免疫預(yù)防天花，在1980年的世界根除天花運動中達到極點。隨著天花的根除，痘病毒作為表達外源基因的遺傳工程化載體(Panicali和Paoletti，1982；Paoletti等，1984)的新作用變得很重要。編碼異源性抗原的基因已在痘苗中表達，常常導(dǎo)致抵抗相應(yīng)病原體攻擊的保護性免疫(綜述Tartaglia等，1990)。命名為MVA的高度減毒疫苗株也已被作為基于痘病毒的疫苗載體。美國專利號5185146中描述了MVA的應(yīng)用。
另外兩個疫苗載體系統(tǒng)涉及天然宿主限制的痘病毒禽痘病毒的應(yīng)用。家禽痘病毒(FPV；Taylor等，1998a，b)和金絲雀痘病毒(CPV；Taylor等，1991&1992)都已被改造用來表達外源基因產(chǎn)物。家禽痘病毒(FPV)是痘病毒家族禽痘病毒屬的原型病毒。該病毒引發(fā)經(jīng)濟上重要的家禽患疾病，該疾病自從1920年以來通過減毒活疫苗的使用得到了很好控制。禽痘病毒的復(fù)制僅限于禽類(Matthews，1982)，文獻中沒有關(guān)于禽痘病毒在任何非禽類(包括人類)中引起繁殖性感染的報道。這種宿主局限性提供了一道固有的安全屏障，防止該病毒傳播到其它物種，并使得在脊椎動物和人類應(yīng)用中使用基于禽痘病毒的疫苗載體的建議很吸引人。
已利用FPV作為載體表達來自禽病原體的抗原。在FPV重組體中表達了強致病性禽流感病毒的血凝素蛋白(Taylor等，1988c)。重組體接種小雞和火雞后，誘導(dǎo)了抵抗同源或異源的強致病性流感病毒攻擊的保護性免疫應(yīng)答(Taylor等，1988c)。也已建立了表達新城疫病毒表面糖蛋白的FPV重組體(Taylor等，1990；等，1990)。
通過基因修飾野生型病毒株制備了其它減毒的痘病毒載體。已經(jīng)證明，通過缺失痘苗病毒哥本哈根株(Tartaglia等，1992)的特異性毒力基因和宿主范圍基因而衍生的NYVAC載體可作為重組載體，引發(fā)針對所表達外源抗原的保護性免疫應(yīng)答。
另一個改造的痘病毒載體為ALVAC，來自金絲雀痘病毒。ALVAC在非禽類宿主中沒有繁殖性復(fù)制，據(jù)信該特征改進了其安全譜(Taylor等，1991&1992)。ALVAC和NYVAC都是BSL-1載體。
發(fā)展亞單位PCV2疫苗的一種方法是使用活病毒載體來表達相關(guān)的PCV2 ORF?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的兩個步驟和美國專利號4769330、4722848、46003112、5110587、5174993、5494807和5505941(這些專利的公開并入本文作為參考)所描述的產(chǎn)生痘病毒(如痘苗病毒和禽痘病毒)的合成重組體的類似方法構(gòu)建重組痘病毒。因此提供PCV2重組痘病毒及其組合物和產(chǎn)物，特別是基于ALVAC的PCV2重組體及其組合物和產(chǎn)物，尤其是含有PCV2的ORF1和/或2的重組體及其組合物和產(chǎn)物，將是本領(lǐng)域技術(shù)現(xiàn)狀的期望進展。
發(fā)明目的和概述因此本發(fā)明一個目的是提供治療和預(yù)防PCV2感染的組合物和方法。另一個目的是提供治療和預(yù)防PMWS的工具。
本發(fā)明一方面涉及用于在接種了該組合物的宿主動物中誘導(dǎo)抗原性或免疫應(yīng)答的抗原性、免疫性組合物或疫苗組合物或治療性組合物，所述疫苗包括載體和修飾的重組病毒，該重組病毒具有滅活的非必需病毒編碼遺傳功能以致其毒性降低而安全性提高。在根據(jù)本發(fā)明的組合物中使用的病毒有利地為痘病毒、特別是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒和金絲雀痘病毒)，更有利地為ALVAC。修飾的重組病毒可在病毒基因組的非必需區(qū)中包括編碼抗原性蛋白(如來自PCV2的ORF如PCV2 ORF1和/或2)的異源DNA序列。
另一方面，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其含有的修飾重組病毒具有滅活的非必需病毒編碼遺傳功能，所以重組病毒毒性降低而安全性提高。修飾的重組病毒包括在病毒基因組非必需區(qū)內(nèi)編碼抗原性蛋白(如來自PCV2的ORF尤其是ORF1和/或2)的異源DNA序列，其中該組合物給予宿主后能夠誘導(dǎo)抗原特異的免疫應(yīng)答。
再一方面，本發(fā)明涉及修飾的重組病毒，該病毒具有滅活的非必需病毒編碼遺傳功能，所以該病毒的毒性降低，并且其中修飾的重組病毒還在該病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)含有異源DNA。該DNA可編碼PCV2基因如任一個或所有的PCV2 ORF1、ORF2、ORF3或ORF4(Meehan等，1998)。具體地，通過缺失編碼毒力因子的開放讀碼框或通過利用天然宿主限制性病毒，滅活這些遺傳功能。根據(jù)本發(fā)明使用的病毒有利地為痘病毒，尤其是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒或金絲雀痘病毒)。有利地，所述開放讀碼框選自J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L(Goebel等報道的術(shù)語學(xué)，1990)及其組合。在這一方面，該開放讀碼框含有一個胸腺嘧啶激酶基因、一個出血性區(qū)域、一個A型包涵體區(qū)、一個血凝素基因、一個宿主范圍基因區(qū)或一個大的亞單位、核糖核苷酸還原酶；或它們的組合。一個適當(dāng)修飾的痘苗病毒哥本哈根株被鑒定為NYVAC(Tartaglia等，1992)，或一種痘苗病毒，其中缺失了J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L或一個胸腺嘧啶激酶基因、一個出血性區(qū)域、一個A型包涵體區(qū)、一個血凝素基因、一個宿主范圍基因區(qū)和一個大的亞單位、核糖核苷酸還原酶(也見美國專利號5364773)。優(yōu)選地，痘病毒載體為ALVAC或金絲雀痘病毒(Rentschler疫苗株)，金絲雀痘病毒為減毒的，例如通過在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳200代以上，它們的主種子經(jīng)過瓊脂糖連續(xù)四次噬斑純化，其中一個克隆通過5次額外傳代來擴增。
本發(fā)明再一方面還涉及發(fā)明的重組痘病毒的表達產(chǎn)物及其用途，例如形成用于治療、預(yù)防、診斷或測試的抗原性、免疫的或疫苗的組合物；并涉及來自重組痘病毒，在構(gòu)建DNA探針和PCR引物時有用的DNA。
一方面，本發(fā)明涉及重組痘病毒，其中在痘病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)含有來自PCV2的一段DNA序列。痘病毒有利地為禽痘病毒，例如家禽痘病毒，尤其是減毒家禽痘病毒，或金絲雀痘病毒，尤其是減毒金絲雀痘病毒如ALVAC。
根據(jù)本發(fā)明，重組痘病毒表達外源PCV2基因的基因產(chǎn)物。PCV2的特定ORF插入到痘病毒載體，產(chǎn)生的重組痘病毒用來感染動物。在動物中PCV2基因產(chǎn)物的表達導(dǎo)致動物對PCV2的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的重組痘病毒可能用于免疫組合物或疫苗，來提供誘導(dǎo)可能(但不需要)是保護性的免疫應(yīng)答的方法。
重組痘病毒PCV2或其表達產(chǎn)物即本發(fā)明的組合物如免疫的、抗原性組合物或疫苗組合物或治療性組合物的給藥方式可以是經(jīng)腸胃外的途徑(皮內(nèi)、肌肉或皮下)。這種免疫方式可引起系統(tǒng)性免疫應(yīng)答、或體液或細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
更通常地，本發(fā)明的痘病毒PCV2重組體、抗原性、免疫性或疫苗痘病毒PCV2組合物或治療性組合物，可按照藥學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。這些組合物可由醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之后，按其熟知的劑量和技術(shù)給藥。這些組合物可單獨給藥，或可以與組合物，例如與“其它”免疫的、抗原性或疫苗或治療性組合物共同施用或順序施用，由此提供本發(fā)明的多價或“雞尾酒”或聯(lián)合組合物和使用它們的方法。同樣，可在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之后來確定給藥的成分、方式(順序或同時給藥)和劑量。在這一方面，請參考并入本文作為參考的關(guān)于狂犬病毒組合物和聯(lián)合組合物及其使用的美國專利號5843456。
本發(fā)明組合物的實例包括用于各入口的液體制品，如口的、鼻的、肛門的、陰道的、經(jīng)口的、胃內(nèi)的等，給藥方式如懸液、糖漿或酏劑；和用于腸胃外的、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或血管內(nèi)(如可注射的給藥)的制品如無菌懸液或乳劑。在這些組合物中，重組痘病毒或抗原可能與合適的載體、稀釋物或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等形成混合物。這些組合物也可被凍干。這些組合物根據(jù)給藥途徑和預(yù)期的制品可含有輔助物質(zhì)如保濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、膠凝劑或粘性促進添加劑、防腐劑、香精、色素等?？蓞⒖紭?biāo)準(zhǔn)原文如 “REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCICNCE”第17版，1985(在此并入本文作為參考)，來制備適當(dāng)?shù)闹破?，以避免不適當(dāng)?shù)膶嶒灐：线m的劑量也可根據(jù)下面的實施例。
這些組合物可含有選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和順丁烯二酸酐與鏈烯衍生物的共聚體的至少一種佐劑化合物。
優(yōu)選的佐劑化合物為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其與糖或多元醇的多聚鏈烯基醚交聯(lián)。這些化合物稱為術(shù)語carbomer(Phameuropa第8卷第二期，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國專利號2909462(在此并入本文作為參考)，該專利描述了與多羥基化合物交聯(lián)的這類丙烯酸聚合物，該多羥基化合物含有至少3個羥基優(yōu)選不超過8個羥基、其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的非飽和脂肪酸基團所取代。優(yōu)選基團是那些含有2-4個碳原子的，如乙烯基、丙烯基和其它乙烯基非飽和基團。這些非飽和基團本身可含有其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(BF Goodrich，俄亥俄州，美國)出售的產(chǎn)品特別好。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基戊赤蘚糖醇交聯(lián)。其中可能提及Carbopol974P、934P和971P。
在順丁烯二酸酐和鏈烯衍生物的共聚體中，優(yōu)選順丁烯二酸酐和乙烯線性或交聯(lián)的共聚體EMA(Monsanto)，例如與二乙烯醚交聯(lián)的共聚體。可參考并入本文的文獻J.Fields等，自然(Nature)，186778-780，1960.6.4。
從其結(jié)構(gòu)來看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚體EMA優(yōu)選由下面公式中的基本單位形成 其中- R1和R2相同或不同，代表H或CH3- x＝0或1，優(yōu)選x＝1- y＝1或2，且x+y＝2對于共聚體EMA，x＝0，y＝2。對于carbomer，x-y＝1。
這些聚合物溶解于水產(chǎn)生酸性溶液，其將被中和，優(yōu)選中和至生理pH，以便制備將要摻入疫苗的佐劑溶液。聚合物的羧基部分為COO-形式。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的佐劑溶液，尤其是carbomer溶液，用蒸餾水制備，優(yōu)選有NaCl的蒸餾水時制備，獲得的溶液為酸性pH。該儲備液加入到預(yù)定量(用來獲得預(yù)定終濃度)或其實際比例的含有NaCl的水中、優(yōu)選生理鹽水(NaCl 9g/l)來稀釋，幾步中都立刻同時或隨后中和(pH7.3-7.4)，優(yōu)選用NaOH中和。將生理pH的該溶液與疫苗混合，特別可以凍干、液體或冰凍的形式貯藏。
在最后的疫苗組合物中聚合物濃度為0.01％-2％w/v，更特別為0.06-1％w/V，優(yōu)選0.1-0.6％w/v。根據(jù)本發(fā)明的免疫組合物可與至少一種減毒活疫苗、滅活疫苗、或亞單位疫苗、或表達至少一種其它豬病原體免疫原的重組疫苗(如痘病毒作為載體或DNA質(zhì)粒)關(guān)聯(lián)。
這些和其它實施方案由下面的詳細描述公開或變得顯而易見并包含于其中。
附圖簡述通過查閱所附圖表將更好地理解本發(fā)明，其中·圖1(SEQ ID NO1)顯示了ALVAC DNA含有C6開放讀碼框的3.7千堿基對片段的核苷酸序列。
·圖2顯示了pJP102供體質(zhì)粒圖。
·圖3(SEQ ID NO8)顯示了pJP102供體質(zhì)粒從KpnI(653位)到SacI(3166位)限制酶位點的2.5千堿基對片段的核苷酸序列。
·圖4顯示了pJP105供體質(zhì)粒圖。
·圖5顯示了pJP107供體質(zhì)粒圖。
·圖6(SEQ ID NO11)顯示了pJP107供體質(zhì)粒從KpnI(653位)到SacI(4255位)限制酶位點的3.6千堿基對片段的核苷酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在痘病毒基因組的非必需區(qū)含有來自PCV2的DNA序列的重組痘病毒。重組痘病毒表達外源PCV2基因的基因產(chǎn)物。特別分離并表征了編碼PCV2蛋白的ORF1和ORF2基因，并將其插入ALVAC重組體(金絲雀痘病毒載體)。使用的分子生物學(xué)技術(shù)是Sambrook等所描述的那些(1989)。
細胞系和病毒株。命名為Imp.1010-Stoon的PCV2毒株先前已有描述(Meehan等，1998)。它從來自加拿大的一頭病豬的腸系膜淋巴結(jié)組織中分離。Meehan等(1998)描述了PCV2基因組的克隆。質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14含有作為EcoRI片段插入質(zhì)粒pGem-7Z(Promega，Madison，WI)EcoRI位點的PCV2基因組。Imp.1010-Stoon PCV2毒株的全核苷酸序列已由Meehan等(1998)測定，并可由GenBank登錄號AF055392獲得。
親本金絲雀痘病毒(Rentschler毒株)是用于金絲雀的疫苗株。疫苗株獲自野生分離株，并通過在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳200代以上而減毒。主毒種用瓊脂經(jīng)連續(xù)四次噬斑純化，并且其中一個克隆再通過五次傳代擴增，然后用該病毒庫作為體外重組試驗的親本病毒。噬斑純化的金絲雀痘病毒分離株被命名為ALVAC。ALVAC于1996年12月14日按照布達佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC登錄號為VR-2547。
重組痘病毒的產(chǎn)生包括幾步(1)構(gòu)建一個插入質(zhì)粒，含有痘病毒基因組中插入位點兩側(cè)的序列(“臂”)，和位于兩側(cè)臂之間的多克隆位點(MCS)(例如見實施例1)；(2)構(gòu)建供體質(zhì)粒，該質(zhì)粒由已將外源基因表達盒插入其MCS的插入質(zhì)粒組成(例如見實施例2-5)；(3)供體質(zhì)粒的兩臂和親本痘病毒的基因組在細胞培養(yǎng)物中的體外重組，使外源基因表達盒插入痘病毒基因組的合適位點，和噬斑純化重組病毒(例如見實施例6)。
PCV2重組免疫原可能與PCV1免疫原聯(lián)合使用，用于免疫動物預(yù)防PMWS。在最末優(yōu)選的方法中，可能單獨使用PCV1免疫原，而不與PCV2免疫原一起使用。
此外本發(fā)明通過下面說明性而非限制性的實施例來描述。實施例1-在C6位點構(gòu)建金絲雀痘病毒插入質(zhì)粒圖1(SEQ ID NO1)為金絲雀痘病毒DNA的3.7kb片段的序列。序列分析表明存在一個從377位起始并在2254位終止的命名為C6L的ORF。下面描述了C6插入質(zhì)粒的構(gòu)建，通過缺失C6 ORF并用兩側(cè)為轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的多克隆位點(MCS)取代。使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ IDNO2)和C6B1(SEQ ID NO3)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴增了380bp的PCR片段。使用寡核苷酸引物C6C1(SEQ ID NO4)和C6D1(SEQ ID NO5)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴增了1155bp的PCR片段。將380bp和1155bp的片段融合在一起，融合方法為將二者一起加入作為模板，使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6D1(SEQ ID NO5)擴增了1613bp的PCR片段。該片段用SacI和KpnI消化，并連接到用SacI/KpnI消化的pBluescript SK+(Stratagen，La，Jolla，CA，美國)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒pC6L通過DNA序列分析證實。它由C6上游370bp的金絲雀痘病毒DNA(“C6左臂”)、痘苗病毒早期終止信號、6個讀碼框中的翻譯終止子、含有SmaI、PstI、XhoI和EcoRI位點的MCS、痘苗病毒早期終止信號、6個讀碼框中的翻譯終止子和1155bp的下游金絲雀痘病毒序列(“C6右臂”)組成。
質(zhì)粒pJP099由pC6L衍生而來，將含有連接了外源基因的痘苗病毒H6啟動子(在Taylor等(1988c)、Guo等(1989)和Perkus等(1989)有描述)連接到pC6L的SmaI/EcoRI位點。質(zhì)粒pJP099在H6啟動子3′端含有一個獨特的EcoRV位點和一個獨特的NruI位點，在外源基因的終止密碼和C6左臂之間有一個獨特的SalI位點。因此來自pJP099的～4.5kbEcoRV/SalI或NruI/SalI片段含有質(zhì)粒序列(pBluescript SK+；Stratagene，La Jolla，CA，USA)、兩個C6臂和H6啟動子5′端到EcoRV和NruI位點的序列。引物序列引物C6A1(SEQ ID NO2)ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT引物C6B1(SEQ ID NO3)GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA引物C6C1(SEQ ID NO4)CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA引物C6D1(SEQ ID NO5)GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG實施例2-構(gòu)建PCV2 ORF2的ALVAC供體質(zhì)粒用EcoRI消化質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14(含有在質(zhì)粒pGem7Z中作為EcoRI片段的PCV2基因組)，分離1768bp的片段并連接。
為了將PCV2 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP760(SEQID NO6)和JP773(SEQ ID NO7)從1768bp連接的EcoRI片段(見上文)擴增PCV2 ORF2，產(chǎn)生PCRJ1304。引物JP760(SEQ ID NO6)含有從EcoRV開始的H6啟動子3′端和PCV2 ORF2的5′端。引物JP773(SEQ ID NO7)含有PCV2 ORF2的3′端，后跟一個SalI位點。然后用EcoRV/SalI消化PCR產(chǎn)物J1304，并作為～750bp的片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見上文實施例1)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過序列分析證實并命名為pJP102(見圖2的pJP102圖和圖3的序列(SEQ ID NO8))。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為AF055392。供體質(zhì)粒pJP102(用NotI線性化)用于體外重組試驗(IVR)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1614(見實施例6)。引物序列JP760(SEQ ID NO6)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-AGG-AGG-CGJP773(SEQ ID NO7)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC實施例3-構(gòu)建PCV2 ORF2和ORF1的ALVAC供體質(zhì)粒用引物JP774(SEQ ID NO9)和JP775(SEQ ID NO10)在質(zhì)粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14上通過PCR擴增PCV2 ORF1，產(chǎn)生PCR J1311。引物JP774(SEQ ID NO9)含有從NruI到H6啟動子的3′端和PCV2 ORF1的5′端。引物JP775(SEQ ID NO10)含有PCV2 ORF1的3′端，后跟一個SalI位點。PCR產(chǎn)物J1311(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過序列分析證實并命名為pJP104。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為AF055392。將從pJP104分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見實施例1)，產(chǎn)生的質(zhì)粒用限制酶切分析并命名為pJP105(見圖4)。供體質(zhì)粒pJP105(用NotI線性化)用于體外重組試驗(實施例6有描述)，產(chǎn)生表達PCV2 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來自pJP102的～838bp的BamHI/SalI片段，并克隆到Klenow削平的pJP105的EcoRI位點。通過限制酶切分析檢查插入片段的方向并選擇頭對頭的方向。該質(zhì)粒用序列分析證實并命名為pJP107(見圖5的pJP107圖和圖6的序列(SEQ ID NO11))。供體質(zhì)粒pJP107(用NotI線性化)用于體外重組5(IVR)試驗，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1615(見實施例6)。引物序列JP774(SEQ ID NO9)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGGJP775(SEQ ID NO10)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG實施例4-構(gòu)建PCV1 ORF2的ALVAC供體質(zhì)粒質(zhì)粒pPCV1(B.Meehan等，J.Gen.Virol.1997.78.221-227)含有在質(zhì)粒pGem7Z中作為PstI片段的PCV1基因組，作為模板用來擴增PCV1ORF2。
為了將PCV1 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP787(SEQID NO12)和JP788(SEQ ID NO13)從質(zhì)粒pCV1擴增PCV1 ORF2(見上文)，產(chǎn)生PCRJ1315。引物JP787(SEQ ID NO12)含有從EcoRV到H6啟動子的3′端和ORF2，后跟一個SalI位點。然后用EcoRV/SalI消化PCR產(chǎn)物J1315并克隆到來自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見上文實施例1)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過序列分析證實并命名為pJP113。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為U49186。供體質(zhì)粒pJP113(用NotI線性化)用于體外重組試驗(IVR)，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1621(見實施例7)。引物序列JP787(SEQ ID NO12)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CGJP788(SEQ ID NO13)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G實施例5-構(gòu)建PCV1 ORF2和ORF1的ALVAC供體質(zhì)粒用PstI消化質(zhì)粒pPCV1(見產(chǎn)施例4)，該質(zhì)粒含有在質(zhì)粒pGem-7Z中作為PstI片段的PCV1基因組。分離1759bp的片段并連接。
使用引物JP789(SEQ ID NO14)和JP790(SEQ ID NO15)從連接的1759bpPstI片段擴增PCV1 ORF1，產(chǎn)生PCR J1316。引物JP789(SEQ IDNO14)含有從NruI到H6啟動子的3’端和PCV1 ORF1的5’端。引物JP790(SEQ ID NO15)含有PCV1 ORF1的3’端，后跟一個SalI位點。PCR產(chǎn)物J1316(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過序列分析證實并命名為pJP114。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為U49186。從pJP114分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見實施例1)，產(chǎn)生的質(zhì)粒用限制酶切分析并命名為pJP115。供體質(zhì)粒pJP105(用NotI線性化)用于體外重組試驗(實施例6有描述)，產(chǎn)生表達PCV1 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來自pJP113的～838bp的BamHI/SalI片段，并克隆到Klenow削平的pJP115的EcoRI位點。通過限制酶切分析檢查插入片段的方向，選擇頭對頭的方向。該質(zhì)粒通過序列分析證實并命名為pJP117。供體質(zhì)粒pJP117(用NotI線性化)用于體外重組(IVR)試驗，產(chǎn)生ALVAC重組體vCP1622(見實施例7)。引物序列JP789(SEQ ID NO14)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-AAG-CAA-GAA-AAG-CGGJP790(SEQ ID NO15)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG實施例6-ALVAC-PCV2重組體的產(chǎn)生質(zhì)粒pJP102(見實施例2和圖2)和pJP107(見實施例3和圖5)用NotI線性化，并使用先前描述的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染ALVAC感染的原代CEF細胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據(jù)與放射性標(biāo)記的特異性PCV2探針雜交選擇陽性噬斑，進行連續(xù)四輪噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然后擴增每個IVR的一個代表性噬斑，產(chǎn)生的ALVAC重組體命名為vCP1614和vCP1615。vCP1614病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP102重組的結(jié)果，它含有插入到ALVAC C6位點的PCF2 ORF2。vCP1615病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP107重組的結(jié)果，它含有以頭對頭方向插入到ALVAC C6位點的PCV2 ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實施例3描述的供體質(zhì)粒pJP105可產(chǎn)生僅表達PCV2 ORF1的ALVAC重組體。
免疫熒光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細胞是否表達PCV2蛋白，進行了免疫熒光分析(IF)。感染的Vero細胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時后用PBS洗滌，并用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。對PCV2ORF1(PCV2 199 1D3GA&PCV2 210 7G5GD)或ORF2(PCV2 190 4C7CF、PCV2190 2B1BC&PCV2 190 3A8BC)特異的五種單克隆抗體(Mab)制品(雜交瘤上清)用作第一抗體。這些特異的單克隆抗體獲自Merial-Lyon。單克隆抗體也可按照此處引用文獻中的指導(dǎo)來獲得，例如并入本文作為參考的美國系列號09/082,358和09/161,092。IF反應(yīng)按照Taylor等描述的進行(1990)。
使用三個ORF2特異性抗體的PCV2特異的免疫熒光可以在感染了vCP1614的細胞和感染了vCP1615的細胞中檢查到。使用兩個ORF1特異性抗體的PCV2特異的免疫熒光只能在感染了vCP1615的細胞中檢查到。這些結(jié)果表明，如預(yù)料的那樣，vCP1614只表達ORF2，而vCP1615表達ORF1和ORF2。在親本ALVAC感染的Vero細胞和未感染的Vero細胞中都沒有檢查到熒光。實施例7-ALVAC-PCV1重組體的產(chǎn)生質(zhì)粒pJP113(見實施例4)和pJP117(見實施例5)用NotI線性化，并使用先前描述的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染ALVAC感染的原代CEF細胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據(jù)與放射性標(biāo)記的特異性PCV1探針雜交選擇陽性噬斑，進行四輪連續(xù)噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然后擴增每個IVR的代表性噬斑，產(chǎn)生的重組體命名為vCP1621和vCP1622。vCP1621病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP113重組的結(jié)果，它含有插入到ALVAC C6位點的PCV1 ORF2。vCP1622病毒是ALVAC和供體質(zhì)粒pJP117重組的結(jié)果，它含有以頭對頭方向插入到ALVAC C6位點的PCV1ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實施例5描述的供體質(zhì)粒pJP115可產(chǎn)生只表達PCV1 ORF1的重組體ALVAC。
免疫熒光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細胞是否表達PCV1蛋白，進行了免疫熒光分析(IF)。感染的Vero細胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時后用PBS洗滌，并用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。特異的抗PCV1的豬多克隆血清(Allan G等.Vet.Microbiol.1999，66115-123)用作第一抗體。IF反應(yīng)按照Taylor等描述的進行(1990)。
PCV1特異的免疫熒光可以在感染了vCP1621的細胞和感染了vCP1622的細胞中檢查到。這些結(jié)果表明，如預(yù)料的那樣，vCP1621和vCP1622表達PCV1特異的產(chǎn)物，用PCV2特異的豬多克隆血清在vCP1621感染的Vero細胞和vCP1622感染的Vero細胞中都沒有檢查到熒光。在親本ALVAC感染的Vero細胞和未感染的Vero細胞中都沒有檢查到熒光。實施例8-用CarbopolTM974P配制重組金絲雀痘病毒為了制備疫苗，重組金絲雀痘病毒vCP1614和vCP1615(實施例6)可與carbomer溶液混合。以同樣的方式，重組金絲雀痘病毒vCP1621和vCP1622(實施例7)可與carbomer溶液混合。用于根據(jù)本發(fā)明來免疫豬的carbomer成分為BF Goodrich公司制造的CarbopolTM974P(分子量為3,000,000)。首先用含有1g/l氯化鈉的蒸餾水制備1.5％CarbopolTM974P儲備液。然后用該儲備液制備4mg/ml CarbopolTM974P的生理鹽水溶液。在一個步驟或幾個連續(xù)步驟中，儲備液與所需體積的生理鹽水混合，每一步用1N(或更濃的)氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值，使最終pH值為7.3-7.4。這種最終的CarbopolTM974P溶液可立即用于復(fù)制凍干重組病毒或用于稀釋濃縮的重組病毒儲備液。例如，為了獲得每2ml劑量含有10e8pfu的最終病毒懸液，可將0.1ml 10e9pfu/ml儲備液加入到立即可用的1.9ml上述4mg/mlCarbopolTM974P溶液中稀釋。以相同的方式，也可制備立即可用的2mg/ml CarbopolTM974P溶液。實施例9-免疫豬及以后的攻擊9.1.免疫1日齡小豬將一組在第0天來自caesarian的小豬放入隔離器。在第2天用各種疫苗溶液通過肌肉途徑接種小豬。用無菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲備液制備疫苗病毒懸液。病毒懸液的合適范圍可根據(jù)經(jīng)驗確定，但通常范圍在106-1010，優(yōu)選大約1010pfu/劑量。疫苗溶液也可通過將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來制備，如實施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實施例2)；重組病毒vCP1615(實施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
每個劑量病毒懸液含有108噬斑形成單位(pfu)。通過肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射頸部肌肉。
在實驗第2天和第14天注射2針病毒懸液。在第21天用PCV-2強毒株培養(yǎng)物制備的病毒懸液經(jīng)口鼻攻擊。攻擊后，監(jiān)視小豬斷奶后多系統(tǒng)綜合征的臨床體征3周。記錄以下體征直腸溫度攻擊后每天監(jiān)視持續(xù)2周，然后在第3周測量2次直腸溫度。體重臨攻擊前稱量小豬體重，然后在攻擊后前3周每周稱一次體重。在實驗的第2、14、21、28、35和42天采集血樣，來監(jiān)測病毒血癥水平和抗-PCV-2特異性抗體滴度。
尸體剖檢在第42天所有存活的小豬被處以人道安樂死并進行尸體剖檢，觀察特異的PWMS肉眼損害。從肝臟、淋巴結(jié)、脾、腎和胸腺制備組織樣品以觀察特異性組織學(xué)損害。9.2-免疫5-7周齡小豬無抗PCV-2特異性母體抗體的5-7周齡小豬通過肌肉途徑接種各種疫苗溶液。用無菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲備液制備疫苗病毒懸液。疫苗溶液也可通過將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來制備，如實施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實施例2)；重組病毒vCP1615(實施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
病毒懸液每劑量含有108噬斑形成單位(pfu)。通過肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射到頸部肌肉。
在實驗第0天和第21天注射2針病毒懸液。在第35天用PCV-2強毒株培養(yǎng)物制備的病毒懸液經(jīng)口鼻攻擊。攻擊后，監(jiān)視小豬斷奶后多系統(tǒng)綜合征的臨床體征8周。監(jiān)測的臨床體征與實施例9.1中描述的相同。只是總監(jiān)視時間為8周而非3周。
在整個實驗過程中對攻擊后死亡的小豬及實驗結(jié)束時(第97天)所有存活的小豬進行尸體剖檢。組織樣品與實施例9.1中描述的相同。
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權(quán)利要求書1.一種含有來自豬環(huán)狀病毒2的DNA的重組病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒，其為痘病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組痘病毒，其為禽痘病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組禽痘病毒，其為ALVAC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環(huán)狀病毒2的DNA編碼并表達為豬環(huán)狀病毒的主要衣殼蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開放讀碼框2(ORF2)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開放讀碼框1(ORF1)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環(huán)狀病毒2的DNA含有豬環(huán)狀病毒2的開放讀碼框1和2(ORF1和2)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的重組ALVAC病毒，其為vCP1614和vCP1615。
10.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有一種載體和根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒。
11.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求5的重組病毒。
12.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求6的重組病毒。
13.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求7的重組病毒。
14.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求8的重組病毒。
15.一種用于在接種了該免疫組合物的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據(jù)權(quán)利要求9的重組病毒。
16.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求11的免疫組合物。
17.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求12的免疫組合物。
18.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求13的免疫組合物。
19.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求14的免疫組合物。
20.一種用于在宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給予宿主根據(jù)權(quán)利要求15的免疫組合物。
圖1AHindIII(1)1 AAGCTTCTATCAAAAGTCTTAATGAGTTAGGTGTAGATAGTATAGATATTACTACAAAGGTATTCATATT71 TCCTATCAATTCTAAAGTAGATGATATTAATAACTCAAAGATGATGATAGTAGATAATAGATACGCTCAT141 ATAATGACTGCAAATTTGGACGGTTCACATTTTAATCATCACGCGTTCATAAGTTTCAACTGCATAGATC211 AAAATCTCACTAAAAAGATAGCCGATGTATTTGAGAGAGATTGGACATCTAACTACGCTAAAGAAATTAC281 AGTTATAAATAATACATAATGGATTTTGTTATCATCAGTTATATTTAACATAAGTACAATAAAAAGTATT351 AAATAAAAATACTTACTTACGAAAAAATGTCATTATTACAAAAACTATATTTTACAGAACAATCTATAGT1MetSerLeuLeuGlnLysLeuTyrPheThrGluGlnSerIleVa421 AGAGTCCTTTAAGAGTTATAATTTAAAAGATAACCATAATGTAATATTTACCACATCAGATGATGATACT15lGluSerPheLysSerTyrAsnLeuLysAspAsnHisAsnValIlePheThrThrSerAspAspAspThr491 GTTGTAGTAATAAATGAAGATAATGTACTGTTATCTACAAGATTATTATCATTTGATAAAATTCTGTTTT39ValValValIleAsnGluAspAsnValLeuLeuSerThrArgLeuLeuSerPheAspLysIleLeuPheP561 TTAACTCCTTTAATAACGGTTTATCAAAATACGAAACTATTAGTGATACAATATTAGATATAGATACTCA62heAsnSerPheAsnAsnGlyLeuSerLysTyrGluThrIleSerAspThrIleLeuAspIleAspThrHi631 TAATTATTATATACCTAGTTCTTCTTCTTTGTTAGATATTCTAAAAAAAAGAGCGTGTGATTTAGAATTA85sAsnTyrTyrIleProSerSerSerSerLeuLeuAspIleLeuLysLysArgAlaCysAspLeuGluLeu701 GAAGATCTAAATTATGCGTTAATAGGAGACAATAGTAACTTATATTATAAAGATATGACTTACATGAATA109GluAspLeuAsnTyrAlaLeuIleGlyAspAsnSerAsnLeuTyrTyrLysAspMetThrTyrMetAsnA771 ATTGGTTATTTACTAAAGGATTATTAGATTACAAGTTTGTATTATTGCGCGATGTAGATAAATGTTACAA132snTrpLeuPheThrLysGlyLeuLeuAspTyrLysPheValLeuLeuArgAspValAspLysCysTyrLyNrul(880)Ndel(901)841 ACAGTATAATAAAAAGAATACTATAATAGATATAATACATCGCGATAACAGACAGTATAACATATGGGTT155sGlnTyrAsnLysLysAsnThrIleIleAspIleIleHisArgAspAsnArgGlnTyrAsnIleTrpVal911 AAAAATGTTATAGAATACTGTTCTCCTGGCTATATATTATGGTTACATGATCTAAAAGCCGCTGCTGAAG179LysAsnValIleGluTyrCysSerProGlyTyrIleLeuTrpLeuHisAspLeuLysAlaAlaAlaGluA981 ATGATTGGTTAAGATACGATAACCGTATAAACGAATTATCTGCGGATAAATTATACACTTTCGAGTTCAT202spAspTrpLeuArgTyrAspAsnArgIleAsnGluLeuSerAlaAspLysLeuTyrThrPheGluPheIl1051 AGTTATATTAGAAAATAATATAAAACATTTACGAGTAGGTACAATAATTGTACATCCAAACAAGATAATA225eValIleLeuGluAsnAsnIleLysHisLeuArgValGlyThrIleIleValHisProAsnLysIleIle1121 GCTAATGGTACATCTAATAATATACTTACTGATTTTCTATCTTACGTAGAAGAACTAATATATCATCATA249AlaAsnGlyThrSerAsnAsnIleLeuThrAspPheLeuSerTyrValGluGluLauIleTyrHisHisAEcoRI(1223)1191 ATTCATCTATAATATTGGCCGGATATTTTTTAGAATTCTTTGAGACCACTATTTTATCAGAATTTATTTC272snSerSerIleIleLeuAlaGlyTyrPneLeuGluPhePheGluThrThrIleLeuSerGluPheIleSe1261 TTCATCTTCTGAATGGGTAATGAATAGTAACTGTTTAGTACACCTGAAAACAGGGTATGAAGCTATACTC295rSerSerSerGluTrpValMetAsnSerAsnCysLeuValHisLeuLysThrGlyTyrGluAlaIleLeu1331 TTTGATGCTAGTTTATTTTTCCAACTCTCTACTAAAAGCAATTATGTAAAATATTGGACAAAGAAAACTT319PheAspAlaSerLeuPhePheGlnLeuSerThrLysSerAsnTyrValLysTyrTrpThrLysLysThrL1401 TGCAGTATAAGAACTTTTTTAAAGACGGTAAACAGTTAGCAAAATATATAATTAAGAAAGATAGTCAGGT342euGlnTyrLysAsnPhePheLysAspGlyLysGlnLeuAlaLysTyrIleIleLysLysAspSerGlnVa
圖1B1471 GATAGATAGAGTATGTTATTTACACGCAGCTGTATATAATCACGTAACTTACTTAATGGATACGTTTAAA365lIleAspArgValCysTyrLeuHisAlaAlaValTyrAsnHisValThrTyrLeuMetAspThrPheLys1541 ATTCCTGGTTTTGATTTTAAATTCTCCGGAATGATAGATATACTACTGTTTGGAATATTGCATAAGGATA389IleProGlyPheAspPheLysPheSerGlyMetIleAspIleLeuLeuPheGlyIleLeuHisLysAspA1611 ATGAGAATATATTTTATCCGAAACGTGTTTCTGTAACTAATATAATATCAGAATCTATCTATGCAGATTT412snGluAsnIlePheTyrProLysArgValSerValThrAsnIleIleSerGluSerIleTyrAlaAspPh1681 TTACTTTATATCAGATGTTAATAAATTCAGTAAAAAGATAGAATATAAAACTATGTTTCCTATACTCGCA435eTyrPheIleSerAspValAsnLysPheSerLysLysIleGluTyrLysThrMelPheProIleLeuAla1751 GAAAACTACTATCCAAAAGGAAGGCCCTATTTTACACATACATCTAACGAAGATCTTCTGTCTATCTGTT459GluAsnTyrTyrProLysGlyArgProTyrPheThrHisThrSerAsnGluAspLeuLeuSerIleCysL1821 TATGCGAAGTAACAGTTTGTAAAGATATAAAAAATCCATTATTATATTCTAAAAAGGATATATCAGCAAA482euCysGluValThrValCysLysAspIleLysAsnProLeuLeuTyrSerLysLysAspIleSerAlaLy1891 ACGATTCATAGGTTTATTTACATCTGTCGATATAAATACGGCTGTTGAGTTAAGAGGATATAAAATAAGA505sArgPheIleGlyLeuPheThrSerValAspIleAsnThrAlaValGluLeuArgGlyTyrLysIleArg1961 GTAATAGGATGTTTAGAATGGCCTGAAAAGATAAAAATATTTAATTCTAATCCTACATACATTAGATTAT529ValIleGlyCysLeuGluTrpProGluLysIleLysIlePheAsnSerAsnProThrTyrIleArgLeuL2031 TACTAACAGAAAGACGTTTAGATATTCTACATTCCTATCTGCTTAAATTTAATATAACAGAGGATATAGC552euLeuThrGluArgArgLeuAspIleLeuHisSerTyrLeuLeuLysPheAsnIleThrGluAspIleAl2101 TACCAGAGATGGAGTCAGAAATAATTTACCTATAATTTCTTTTATCGTCAGTTATTGTAGATCGTATACT575aThrArgAspGlyValArgAsnAsnLeuProIleIleSerPheIleValSerTyrCysArgSerTyrThrNdeI(2189)2171 TATAAATTACTAAATTGCCATATGTACAATTCGTGTAAGATAACAAAGTGTAAATATAATCAGGTAATAT599TyrLysLeuLeuAsnCysHisMetTyrAsnSerCysLysIleThrLysCysLysTyrAsnGlnValIleT2241 ATAATCCTATATAGGAGTATATATAATTGAAAAAGTAAAATATAAATCATATAATAATGAAACGAAATAT622yrAsnProIle···2311 CAGTAATAGACAGGAACTGGCAGATTCTTCTTCTAATGAAGTAAGTACTGCTAAATCTCCAAAATTAGAT2361 AAAAATGATACAGCAAATACAGCTTCATTCAACGAATTACCTTTTAATTTTTTCAGACACACCTTATTAC2451 AAACTAACTAAGTCAGATGATGAGAAAGTAAATATAAATTTAACTTATGGGTATAATATAATAAAGATTC2521 ATGATATTAATAATTTACTTAACGATGTTAATAGACTTATTCCATCAACCCCTTCAAACCTTTCTGGATA2591 TTATAAAATACCAGTTAATGATATTAAAATAGATTGTTTAAGAGATGTAAATAATTATTTGGAGGTAAAG2661 GATATAAAATTAGTCTATCTTTCACATGGAAATGAATTACCTAATATTAATAATTATGATAGGAATTTTT2731 TAGGATTTACAGCTGTTATATGTATCAACAATACAGGCAGATCTATGGTTATGGTAAAACACTGTAACGG2801 GAAGCAGCATTCTATGGTAACTGGCCTATGTTTAATAGCCAGATCATTTTACTCTATAAACATTTTACCABamHI(2880)2871 CAAATAATAGGATCCTCTAGATATTTAATATTATATCTAACAACAACAAAAAAATTTAACGATGTATGGC2941 CAGAAGTATTTTCTACTAATAAAGATAAAGATAGTCTATCTTATCTACAAGATATGAAAGAAGATAATCAHindIII(3058)3011 TTTAGTAGTAGCTACTAATATGGAAAGAAATGTATACAAAAACGTGGAAGCTTTTATATTAAATAGCATA3081 TTACTAGAAGATTTAAAATCTAGACTTAGTATAACAAAACAGTTAAATGCCAATATCGATTCTATATTTC
圖1C3151 ATCATAACAGTAGTACATTAATCAGTGATATACTGAAACGATCTACAGACTCAACTATGCAAGGAATAAG3221 CAATATGCCAATTATGTCTAATATTTTAACTTTAGAACTAAAACGTTCTACCAATACTAAAAATAGGATA3291 CGTGATAGGCTGTTAAAAGCTGCAATAAATAGTAAGGATGTAGAAGAAATACTTTGTTCTATACCTTCGG3361 AGGAAAGAACTTTAGAACAACTTAAGTTTAATCAAACTTGTATTTATGAACACTATAAAAAAATTATGGA3431 AGATACAAGTAAAAGAATGGATGTTGAATGTCGTAGTTTAGAACATAACTATACGGCTAACTTATATAAA3501 GTGTACGGACAAAACGAATATATGATTACTTATATACTAGCTCTCATAAGTAGGATTAATAATATTATAG3571 AAACTTTAAAATATAATCTGGTGGGGCTAGACGAATCTACAATACGTAATATAAATTATATAATTTCACA3641 AAGAACAAAAAAAAATCAAGTTTCTAATACCTTATAGATAAACTATATTTTTTACCACTGA圖2
圖3Kpnl(1)1 GGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTGTTCTAAAGTTCTTTCCTCCGAAGGTATAGAA71 CAAAGTATTTCTTCTACATCCTTACTATTTATTGCAGCTTTTAACAGCCTATCACGTATCCTATTTTTAG141 TATTGGTAGAACGTTTTAGTTCTAAAGTTAAAATATTAGACATAATTGGCATATTGCTTATTCCTTGCAT211 AGTTGAGTCTGTAGATCGTTTCAGTATATCACTGATTAATGTACTACTGTTATGATGAAATATAGAATCG281 ATATTGGCATTTAACTGTTTTGTTATACTAAGTCTAGATTTTAAATCTTCTAGTAATATGCTATTTAATA351 TAAAAGCTTCCACGTTTTTGTATACATTTCTTTCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTTT421 CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCATACATCGTTABamHI(532)491 AATTTTTTTGTTGTTGTTAGATATAATATTAAATATCTAGAGGATCCTATTATTTGTGGTAAAATGTTTA561 TAGAGTAAAATGATCTGGCTATTAAACATAGGCCAGTTACCATAGAATGCTGCTTCCCGTTACAGTGTTT631 TACCATAACCATAGATCTGCCTGTATTGTTGATACATATAACAGCTGTAAATCCTAAAAAATTCCTATCA701 TAATTATTAATATTAGGTAATTCATTTCCATGTGAAAGATAGACTAATTTTATATCCTTTACCTCCAAAT771 AATTATTTACATCTCTTAAACAATCTATTTTAATATCATTAACTGGTATTTTATAATATCCAGAAAGGTT841 TGAAGGGGTTGATGGAATAAGTCTATTAACATCGTTAAGTAAATTATTAATATCATGAATCTTTATTATA911 TTATACCCATAAGTTAAATTTATATTTACTTTCTCATCATCTGACTTAGTTAGTTTGTAATAAGGTGTGT981 CTGAAAAAATTAAAAGGTAATTCGTTGAATGAAGCTGTATTTGCTGTATCATTTTTATCTAATTTTGGAG1051 ATTTAGCAGTACTTAGTTCATTAGAAGAAGAATCTGCCAGTTCCTGTCTATTACTGATATTTCGTTTCATEcoRI(11121 TATTATATGATTTATATTTTACTTTTTCAATTATATATACTCATTTGACTAGTTAATCAATAAAAAGAAT1191 TCCTGCAGCCCTGCAGCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAACTAATTABamHI(1266)1261 ATTAAGGATCCCCCAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTEcoRV(1378)Nrul(1374)1331 GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGT1401 AATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTC1MetThrTyrProArgArgArgTyrArgArgArgArgHisArgProArgSerHisLeuGlyGlnIleLeu1471 CGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACA24ArgArgArgProTrpLeuValHisProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePheAsnT1541 CCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGCGTACCACAGTCACAACGCCCTCCTGGGCGGTGGA47hrArgLeuSerArgThrPheGlyTyrThrValLysArgThrThrValThrThrProSerTrpAlaValAsSmaI(1644)1611 CATGATGAGATTTAAAATTGACGACTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTT70pMetMetArgPheLysIleAspAspPheValProProGlyGlyGlyThrAsnLysIleSerIleProPhe圖4 圖5
圖6AKpnl(1)1 GGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTGTTCTAAAGTTCTTTCCTCCGAAGGTATAGAA71 CAAAGTATTTCTTCTACATCCTTACTATTTATTGCAGCTTTTAACAGCCTATCACGTATCCTATTTTTAG141 TATTGGTAGAACGTTTTAGTTCTAAAGTTAAAATATTAGACATAATTGGCATATTGCTTATTCCTTGCAT211 AGTTGAGTCTGTAGATCGTTTCAGTATATCACTGATTAATGTACTACTGTTATGATGAAATATAGAATCG281 ATATTGGCATTTAACTGTTTTGTTATACTAAGTCTAGATTTTAAATCTTCTAGTAATATGCTATTTAATA351 TAAAAGCTTCCACGTTTTTGTATACATTTCTTTCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTTT421 CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCATACATCGTTABamHI(532)491 AATTTTTTTGTTGTTGTTAGATATAATATTAAATATCTAGAGGATCCTATTATTTGTGGTAAAATGTTTA561 TAGAGTAAAATGATCTGGCTATTAAACATAGGCCAGTTACCATAGAATGCTGCTTCCCGTTACAGTGTTT631 TACCATAACCATAGATCTGCCTGTATTGTTGATACATATAACAGCTGTAAATCCTAAAAAATTCCTATCA701 TAATTATTAATATTAGGTAATTCATTTCCATGTGAAAGATAGACTAATTTTATATCCTTTACCTCCAAAT771 AATTATTTACATCTCTTAAACAATCTATTTTAATATCATTAACTGGTATTTTATAATATCCAGAAAGGTT841 TGAAGGGGTTGATGGAATAAGTCTATTAACATCGTTAAGTAAATTATTAATATCATGAATCTTTATTATA911 TTATACCCATAAGTTAAATTTATATTTACTTTCTCATCATCTGACTTAGTTAGTTTGTAATAAGGTGTGT981 CTGAAAAAATTAAAAGGTAATTCGTTGAATGAAGCTGTATTTGCTGTATCATTTTTATCTAATTTTGGAG1051 ATTTAGCAGTACTTACTTCATTAGAAGAAGAATCTGCCAGTTCCTGTCTATTACTGATATTTCGTTTCAT1121 TATTATATGATTTATATTTTACTTTTTCAATTATATATACTCATTTGACTAGTTAATCAATAAAAAGAAT1191 TTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGG233ProLysLeuProProAspLysLeuAsnPheGluArgPheGlnValTyrMetThrValArgIStul(1306)1261 ATATTGTAGTCCTGGTCGTATTTACTGTTTTCGAACGCAGCGCCGAGGCCTACGTGGTCCACATTTCCAG212l(fā)eAsnTyrAspGlnAspTyrLysSerAsnGluPheAlaAlaGlyLeuGlyValHisAsPValAsnGlySe1331 AGGTTTGTAGTCTCAGCCAAAGCTGATTCCTTTTGTTATTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGGAGTCAAG189rThrGlnLeuArgLeuTrpLeuGlnAsnArgLysAsnAsnProGlnPheTyrAspIleThrSerAspLeu1401 AACAGGTTTGGGTGTGAAGTAACGGGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATTGTATGGCGGGAGGAGTAG166ValProLysProThrPheTyrArgSerHisTyrSerPheProGlnProIleThrHisArgSerSerTyrANdel(1475)1471 TTTACATATGGGTCATAGGTTAGGGGTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGG142snValTyrProAspTyrThrLeuAlaThrAlaLysThrValPheAsnAspAspLeuIleValAlaThrSeEcoRI(1584)1541 AGCCCACTCCCCTATCACCCTGGGTGATGGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTCT119rGlyValGlyArgAspGlyGlnThrIleProSerCysProTrpPheGluValLysValLysArgIleArgSmaI(1651)1611 GTAGTATTCAAAGGGTATAGAGATTTTGTTGGTCCCCCCTCCCGGGGGAACAAAGTCGTCAATTTTAAAT96TyrTyrGluPheProIleSerIleLysAsnThrGlyGlyGlyProProValPheAspAspIleLysPheA
圖6B1681 CTCATCATGTCCACCGCCCAGGAGGGCGTTGTGACTGTGGTACGCTTGACAGTATATCCGAAGGTGCGGG72rgMetMetAspValAlaTrpSerProThrThrValThrThrArgLysValThrTyrGlyPheThrArgSe1751 AGAGGCGGGTGTTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAACGGTAGCGGTGGCGGGGGTGGACGAGCCAGGG49rLeuArgThrAsnPheIleGlyAsnLysArgArgTrpArgTyrArgHisArgProHisValLeuTrpPro1821 GCGGCGGCGGAGGATCTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGGTGTCTTCTTCTGCGGTAACGCCTCCTTGGA26ArgArgArgLeuIleGlnGlyLeuHisSerArgProArgHisArgArgArgArgTyrArgArgArgProTNrul(1921)EcoRV(1917)1891 TACGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCGATAATGAAATAATTTATGATTATTTCTCGCTTTCA2yrThrMet1961 ATTTAACACAACCCTCAAGAACCTTTGTATTTATTTTCACTTTTTAAGTATAGAATAAAGAAGCTGGGGG2031 ATCAATTCCTGCAGCCCTGCAGCTAATTAATTAAGCTACAAATAGTTTCGTTTTCACCTTGTCTAATAACBamHI(2112)2101 TAATTAATTAAGGATCCCCCAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGEcoRV(2224)Nrul(2220)2171 AGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTG2241 TATCGTAATGCCCAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGACCCCAACCACATAAAAGGTGGGTGTTCACGCTG1MetProSerLysLysAsnGlyArgSerGlyProGlnProHisLysArgTrpValPheThrLeuSacI(2347)2311 AATAATCCTTCCGAAGACGAGCGCAAGAAAATACGGGAGCTCCCAATCTCCCTATTTGATTATTTTATTG22AsnAsnProSerGluAspGluArgLysLysIleArgGluLeuProIleSerLeuPheAspTyrPheIleV2381 TTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCTCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCA45alGlyGluGluGlyAsnGluGluGlyArgThrProHisLeuGlnGlyPheAlaAsnPheValLysLysGlBcll(2514)2451 AACTTTTAATAAAGTGAAGTGGTATTTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCCAAAGGAACTGATCAG68nThrPheAsnLysValLysTrpTyrLeuGlyAlaArgCysHisIleGluLysAlaLysGlyThrAspGlnSacI(2570)2521 CAGAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTTATTGAATGTGGAGCTCCTCGATCTCAAGGAC92GlnAsnLysGluTyrCysSerLysGluGlyAsnLeuLeuIleGluCysGlyAlaProArgSerGlnGlyG2591 AACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCA115lnArgSerAspLeuSerThrAlaValSerThrLeuLeuGluSerGlySerLeuValThrValAlaGluGl2661 GCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAG138nHisProValThrPheValArgAsnPheArgGlyLeuAlaGluLeuLeuLysValSerGlyLysMetGln2731 AAGCGTGATTGGAAGACCAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATGGGCTG162LysArgAspTrpLysThrAsnValHisValIleValGlyProProGlyCysGlyLysSerLysTrpAlaANcol(28652801 CTAATTTTGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGG185laAsnPheAlaAspProGluThrThrTyrTrpLysProProArgAsnLysTrpTrpAspGlyTyrHisGl2871 TGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCGTGGGATGATCTACTGAGACTGTGTGAT208yGluGluValValValIleAspAspPheTyrGlyTrpLeuProTrpAspAspLeuLeuArgLeuCysAspEcoRV(2942)2941 CGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAGTATTCTGATTACCA232ArgTyrProLeuThrValGluThrLysGlyGlyThrValProPheLeuAlaArgSerIleLeuIleThrS
圖6C3011 GCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGAT255erAsnGlnThrProLeuGluTrpTyrSerSerThrAlaValProAlaValGluAlaLeuTyrArgArgIl3081 TACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGCTACAGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTT278eThrSerLeuValPheTrpLysAsnAlaThrGluGlnSerThrGluGluGlyGlyGlnPheValThrLeuSmal(3199)Ndel(3173) Sall(3193)3151 TCCCCCCCATGCCCTGAATTTCCATATGAAATAAATTACTGAGTCGACCCCGGGTTTTTATAGCTAATTA302SerProProCysProGluPheProTyrGluIleAsnTyr3221 GTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAATACTTTTTATTGTACTTATGTTAAATATAACTGATGA3291 TAACAAAATCCATTATGTATTATTTATAACTGTAATTTCTTTAGCGTAGTTAGATGTCCAATCTCTCTCA3361 AATACATCGGCTATCTTTTTAGTGAGATTTTGATCTATGCAGTTGAAACTTATGAACGCGTGATGATTAA3431 AATGTGAACCGTCCAAATTTGCAGTCATTATATGAGCGTATCTATTATCTACTATCATCATCTTTGAGTT3501 ATTAATATCATCTACTTTAGAATTGATAGGAAATATGAATACCTTTGTAGTAATATCTATACTATCTACASacI(3604)NotI(3596)3571 CCTAACTCATTAAGACTTTTGATAGGCGGCCGCGAGCTC
序列表(1)一般信息(i)申請人Bublot，MichelPerez，Jennifer MCharreyre，Catherine E(ii)發(fā)明名稱豬環(huán)病毒2重組痘病毒(iii)序列數(shù)目13(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Virogenetics Inc.
(B)街道465Jordan Road(C)城市Troy(D)州NY(E)國家美國(F)郵政編碼12180(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(viii)代理人/代理機構(gòu)數(shù)據(jù)(A)姓名Howe，Timothy R.
(B)登記號39，228(C)文檔號TH0125(ix)通訊信息(A)電話(570)586-1022(B)傳真(570)895-2702(2)SEQ.TD.NO.1的信息(i)序列特征(A)長度3701個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述AAGCTTCTAT CAAAAGTCTT AATGAGTTAG GTGTAGATAG TATAGATATT ACTACAAAGG60TATTCATATT TCCTATCAAT TCTAAAGTAG ATGATATTAA TAACTCAAAG ATGATGATAG120TAGATAATAG ATACGCTCAT ATAATGACTG CAAATTTGGA CGGTTCACAT TTTAATCATC180ACGCGTTCAT AAGTTTCAAC TGCATAGATC AAAATCTCAC TAAAAAGATA GCCGATGTAT240TTGAGAGAGA TTGGACATCT AACTACGCTA AAGAAATTAC AGTTATAAAT AATACATAAT300GGATTTTGTT ATCATCAGTT ATATTTAACA TAAGTACAAT AAAAAGTATT AAATAAAAAT360ACTTACTTAC GAAAAAATGT CATTATTACA AAAACTATAT TTTACAGAAC AATCTATAGT420AGAGTCCTTT AAGAGTTATA ATTTAAAAGA TAACCATAAT GTAATATTTA CCACATCAGA480TGATGATACT GTTGTAGTAA TAAATGAAGA TAATGTACTG TTATCTACAA GATTATTATC540ATTTGATAAA ATTCTGTTTT TTAACTCCTT TAATAACGGT TTATCAAAAT ACGAAACTAT600TAGTGATACA ATATTAGATA TAGATACTCA TAATTATTAT ATACCTAGTT CTTCTTCTTT
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(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述GAATTCCTCG AGCTGCAGCC CGGGTTTTTA TAGCTAATTA GTCATTTTTT CGTAAGTAAG60TATTTTTATT TAA73(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述CCCGGGCTGC AGCTCGAGGA ATTCTTTTTA TTGATTAACT AGTCAAATGA GTATATATAA60TTGAAAAAGT AA72(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述GATGATGGTA CCTTCATAAA TACAAGTTTG ATTAAACTTA AGTTG45(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述CATCATCATG ATATCCGTTA AGTTTGTATC GTAATGACGT ATCCAAGGAG GCG53(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述TACTACTACG TCGACTTAGG GTTTAAGTGG GGGGTC36(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特征(A)長度2520個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述GGTACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTCCGA60AGGTATAGAA CAAAGTATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT120ATCACGTATC CTATTTTTAG TATTGGTAGA ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA180CATAATTGGC ATATTGCTTA TTCCTTGCAT AGTTGAGTCT GTAGATCGTT TCAGTATATC240ACTGATTAAT GTACTACTGT TATGATGAAA TATAGAATCG ATATTGGCAT TTAACTGTTT300TGTTATACTA AGTCTAGATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC360CACGTTTTTG TATACATTTC TTTCCATATT AGTAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT420CATATCTTGT AGATAAGATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTAGAAAATA CTTCTGGCCA480TACATCGTTA AATTTTTTTG TTGTTGTTAG ATATAATATT AAATATCTAG AGGATCCTAT540TATTTGTGGT AAAATGTTTA TAGAGTAAAA TGATCTGGCT ATTAAACATA GGCCAGTTAC600CATAGAATGC TGCTTCCCGT TACAGTGTTT TACCATAACC ATAGATCTGC CTGTATTGTT660GATACATATA ACAGCTGTAA ATCCTAAAAA ATTCCTATCA TAATTATTAA TATTAGGTAA720TTCATTTCCA TGTGAAAGAT AGACTAATTT TATATCCTTT ACCTCCAAAT AATTATTTAC780ATCTCTTAAA CAATCTATTT TAATATCATT AACTGGTATT TTATAATATC 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權(quán)利要求
1.PCV-2免疫原在配制疫苗組合物中的用途，該疫苗組合物含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥，用于預(yù)防或治療豬的與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于該免疫原是減毒活PCV-2、或滅活PCV-2、或PCV-2亞單位或其片段、或含有并體內(nèi)表達PCV-2序列、片段或表位的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于該PCV-2株是Imp999、Imp1010、Imp1011-48121或Imp1011-48285。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于該PCV-2株是1103或1121株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的用途，其特征在于該免疫原與佐劑一起進行配制。
6.保藏在ECACC、編號為V00012710的1103株培養(yǎng)物。
7.保藏在ECACC、編號為V00012709的1121株培養(yǎng)物。
8.含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥及PCV-2免疫原的疫苗組合物，其特征在于該PCV-2免疫原是1103株或1121株的免疫原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗組合物，其特征在于該PCV-2免疫原是減毒活PCV-2、或滅活PCV-2、或PCV-2亞單位或其片段、或含有并體內(nèi)表達PCV-2序列、片段或表位的重組載體。
10.包含SEQ ID NO6的DNA片段。
11.包含SEQ ID NO7的DNA片段。
12.PCV-2免疫原在配制疫苗組合物中的用途，所述疫苗組合物含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥，用于預(yù)防或治療豬的與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥，其中該疫苗組合物旨在給雌豬施用，并在配種前接種至少一次，優(yōu)選地隨后在妊娠期間、優(yōu)選在妊娠約6-8周時接種一次，和/或在妊娠末期、優(yōu)選在妊娠約11-13周時接種一次。
13.為了預(yù)防或治療豬的與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥給豬接種的方法，其中給雌豬施用含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥及PCV-2免疫原的疫苗組合物，并在配種前接種至少一次，優(yōu)選地隨后在妊娠期間、優(yōu)選在妊娠約6-8周時接種一次，和/或在妊娠末期、優(yōu)選在妊娠約11-13周時接種一次。
14.PCV-2免疫原在配制疫苗組合物中的用途，所述疫苗組合物含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥，用于預(yù)防或治療豬的與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥，其中旨在于小豬出生后第一周內(nèi)或出生后第三周內(nèi)給小豬施用該疫苗組合物，優(yōu)選地隨后在2-4周后給予一次加強。
15.為了預(yù)防或治療豬的與PCV-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或?qū)m內(nèi)感染和/或與PCV-2相關(guān)的斷奶后多系統(tǒng)萎縮綜合征和其它病理學(xué)后遺癥給豬接種的方法，其中在小豬出生后第一周內(nèi)或出生后第三周內(nèi)給小豬施用含有藥學(xué)可接受載體、賦形劑或賦形藥及PCV-2免疫原的疫苗組合物，優(yōu)選地隨后在2-4周后給予一次加強。
全文摘要
本發(fā)明描述了含有來自豬環(huán)狀病毒(2)的外源DNA的重組痘病毒，例如禽痘病毒。也描述了含有該重組痘病毒的免疫組合物，該免疫組合物被用于在施用了該免疫組合物的宿主動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。還描述了通過將本發(fā)明的免疫組合物給予需要治療或?qū)ωi環(huán)狀病毒(2)的感染敏感的動物，來治療或預(yù)防豬環(huán)狀病毒(2)引起的疾病的方法。
文檔編號A61P43/00GK1409765SQ00813489
公開日2003年4月9日 申請日期2000年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月31日
發(fā)明者J·A·埃里斯, G·M·艾倫, B·米翰, E·克拉克, D·海尼斯, L·哈薩德, J·哈丁, C·E·查雷勒, G·E·查普伊斯, G·S·克拉考卡, J-C·F·奧東奈特, F·麥克奈利 申請人:梅瑞爾公司, 薩斯喀徹溫大學(xué), 貝爾法斯特皇后大學(xué)