專利名稱：因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與神經(jīng)突生長有關(guān)的因子。
背景技術(shù)：
例如在神經(jīng)損傷例如脊髓損傷的情況下，理想的是引起神經(jīng)突發(fā)育，例如神經(jīng)突向外生長和/或神經(jīng)突再生。
已知神經(jīng)生長因子(NGF)刺激某些事件，例如神經(jīng)突向外生長。然而，NGF是一種相應(yīng)高分子量的相對大的分子。此外，NGF對蛋白酶介導(dǎo)的降解敏感。由于這些考慮和其它考慮，NGF難以給藥。NGF的制備也相對昂貴。這些是現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
發(fā)明概述我們已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用視黃酸受體β2(RARβ2)和/或其激動劑引起神經(jīng)突發(fā)育(例如神經(jīng)突向外生長和/或神經(jīng)突再生)是有可能的。本發(fā)明的概述方面本發(fā)明基于這樣一個意外發(fā)現(xiàn)通過應(yīng)用RARβ2和/或其激動劑引起神經(jīng)突發(fā)育(例如神經(jīng)突向外生長和/或神經(jīng)突再生)是有可能的。
本發(fā)明的多個方面利用這一發(fā)現(xiàn)。例如，有可能有通過應(yīng)用本文所解釋的RARβ2和/或其激動劑引起神經(jīng)突發(fā)育(例如神經(jīng)突向外生長和/或神經(jīng)突再生)調(diào)節(jié)的方法。本發(fā)明的詳述方面一方面，本發(fā)明涉及RARβ2和/或其激動劑在引起神經(jīng)突發(fā)育的藥物制備方面的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，RARβ2和/或激動劑可以被稱作藥學(xué)活性劑。
神經(jīng)突是眾所周知的由各種神經(jīng)元細胞類型發(fā)育的結(jié)構(gòu)。它們以微觀分支或梳樣結(jié)構(gòu)或從它們所發(fā)源的細胞表面上的形態(tài)學(xué)突出。神經(jīng)突向外生長的實例示于附圖中以及例如在(Maden 1998-綜述文章)中引用的出版物中，并且是本領(lǐng)域眾所周知的。
RARβ2編碼序列(即RARβ2基因)如下文所述使用。通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)和/或合成技術(shù)，可以制備RARβ2基因。例如，采用如該文件實施例一節(jié)中所述采用本文詳述的引物等制備的PCR擴增的基因片段，可以制備RARβ2基因，或可以按照本領(lǐng)域已知的任何其它合適的方法制備RARβ2基因。
另一方面，本發(fā)明涉及RARβ2和/或其激動劑在引起神經(jīng)突發(fā)育的藥物制備方面的應(yīng)用，其中所述激動劑是視黃酸(RA)和/或CD2019。
視黃酸是市售的。CD2019是一種多環(huán)雜carbyl分子，它是一種RARβ2激動劑，具有本文所討論的并且如(Elmazar等，(1996)Teratology第53卷第158-167頁)中所示的結(jié)構(gòu)。
另一方面，本發(fā)明涉及RARβ2和/或其激動劑在神經(jīng)性病癥治療藥物制備方面的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明涉及RARβ2和/或其激動劑在神經(jīng)性病癥治療藥物制備方面的應(yīng)用，其中所述神經(jīng)性病癥包括神經(jīng)損傷。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)性病癥的方法，包括給予藥理學(xué)有效量的RARβ2受體和/或其激動劑。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)性病癥的方法，包括給予藥理學(xué)有效量的RARβ2受體和/或其激動劑，其中所述激動劑是RA和/或CD2019。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)性病癥的方法，包括給予藥理學(xué)有效量的RARβ2受體和/或其激動劑，其中通過包括RARβ2表達系統(tǒng)的一個實體給予所述RARβ2受體。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在受治療者中引起神經(jīng)突發(fā)育的方法，所述方法包括提供能夠指導(dǎo)RARβ2受體的至少一部分表達的核酸構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體導(dǎo)入所述受治療者的一種或更多種細胞中，并且任選地給予所述受治療者一種RARβ2激動劑，例如RA和/或CD2019。
再一方面，本發(fā)明涉及一種用于確定一種藥物是否能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號的測定方法，所述方法包括提供神經(jīng)細胞，使所述細胞與所述藥物接觸，并且評價所述RARβ2受體的活性，例如通過檢測神經(jīng)突向外生長來評價。
用于本發(fā)明測定方法的神經(jīng)細胞可以是任何合適的神經(jīng)細胞系，無論其穩(wěn)定保持在培養(yǎng)物中，還是直接得自動物的原代細胞。最好所述細胞是如下文所述制備的小鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細胞。
再一方面，本發(fā)明涉及一種包括以下步驟的方法(i)進行上述對于RARβ2信號調(diào)節(jié)的測定，(ii)鑒定能夠調(diào)節(jié)所述RARβ2信號的一種或更多種藥物，以及(iii)制備一定量的那些一種或更多種鑒定的藥物。
再一方面，本發(fā)明涉及一種包括以下步驟的方法(i)進行上述對于RARβ2信號調(diào)節(jié)的測定，(ii)鑒定能夠調(diào)節(jié)所述RARβ2信號的一種或更多種藥物，(iii)制備一定量的那些一種或更多種鑒定的藥物，以及(iv)制備包含那些一種或更多種所鑒定藥物的藥用組合物。
再一方面，本發(fā)明涉及一種用藥物影響RARβ2體內(nèi)活性的方法，其中所述藥物能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號，例如在如上所述的體外測定方法中能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號。
再一方面，本發(fā)明涉及一種藥物在治療神經(jīng)性病癥或神經(jīng)損傷的藥用組合物制備方面的應(yīng)用，其中所述藥物能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號，例如在如上所述的體外測定方法中能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號。
再一方面，本發(fā)明涉及用一種藥物治療受治療者的方法，其中所述藥物能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號，例如在如上所述的體外測定方法中能夠調(diào)節(jié)RARβ2信號。
再一方面，本發(fā)明涉及一種藥用組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合的RARβ2和/或其激動劑；其中所述藥用組合物用于引起神經(jīng)突發(fā)育。
為了便于查閱，現(xiàn)在在合適的小節(jié)標(biāo)題下討論本發(fā)明的這些方面和其它方面。然而，在每一小節(jié)下的內(nèi)容不一定限于每個特定小節(jié)。優(yōu)選方面在一個優(yōu)選方面，能夠?qū)ARβ2的表達定向的核酸構(gòu)建體的給予將伴隨著RARβ2激動劑例如RA、或最好是CD2019(或其模擬物)的給予。
最好是所述激動劑在一定程度下對于RARβ2受體是選擇性的。所述激動劑最好不顯著影響RARα受體。優(yōu)選所述激動劑將不顯著影響RARr受體。更優(yōu)選所述激動劑將不顯著影響RARα受體或RARγ受體。甚至更優(yōu)選所述激動劑表現(xiàn)出對RARβ2受體的高度選擇性。
在一個優(yōu)選方面，能夠?qū)ARβ2表達定向的核酸構(gòu)建體的給予將采用一種載體、優(yōu)選用一種病毒載體、更優(yōu)選用一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體來完成。在一個高度優(yōu)選的實施方案中，能夠?qū)ARβ2表達定向的核酸構(gòu)建體的給予采用能夠感染非分裂哺乳動物細胞(例如神經(jīng)細胞)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體來完成。優(yōu)勢本發(fā)明具有優(yōu)勢，因為RARβ2和/或其激動劑可以引起對神經(jīng)細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)勢是避免將NGF給予受治療者。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢是能夠在成體神經(jīng)組織中促進神經(jīng)突向外生長。類維生素A(retinoids)類維生素A是一類由維生素A衍生的分子的家族，包括生物活性代謝物視黃酸(RA)。RA的細胞效應(yīng)通過兩類受體的作用來介導(dǎo)，一類是視黃酸受體(RAR)，它們由全反式-RA(tRA)和9-順式-RA(9-cis-RA)兩者激活，另一類是類維生素AX受體(RXR)，它們僅由9-cis-RA激活(Kastner等，1994；Kleiwer等，1994)。所述受體具有3個主要亞型-α、β和γ，其中由于可變剪接和差別啟動子用法而有多種同種型(Leid等)。RAR通過與RXR形成異二聚體而介導(dǎo)基因表達，而RXR可以作為同二聚體或通過與多種孤獨受體形成異二聚體而介導(dǎo)基因表達(Mangelsdorf和Evans，1995)。對多種胚胎神經(jīng)元類型的許多研究已經(jīng)表明，RA既可以刺激神經(jīng)突的數(shù)目，又可以刺激神經(jīng)突的長度(綜述，Maden，1998)，實際上神經(jīng)營養(yǎng)蛋白也是如此(Campenot，1977；Lindsay，1988；Tuttle和Mathew，1995)。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是一個生長因子家族，它們是發(fā)育中的外周神經(jīng)系統(tǒng)中多種初級(primary)感覺神經(jīng)元的神經(jīng)元存活所需要的(Snider，1994)。在PC12細胞中由NGF誘導(dǎo)的最早期基因之一是孤獨受體NGFI-B(NURR1)(Millbrandt，1989)。這提示該生長因子和類維生素A在發(fā)育中的神經(jīng)元中介導(dǎo)的途徑可以相互作用。
這些方面的背景內(nèi)容已經(jīng)由Victor A.McKusick等在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim上提出。已經(jīng)從該資源中提取了以下信息。
三種視黃酸受體-α、β和γ是核受體超家族成員。視黃酸是在脊椎動物中描述的第一種形態(tài)發(fā)生素。RARA和RARB基因與分別位于第17號染色體和第3號染色體上的2種密切相關(guān)的甲狀腺激素受體THRA和THRB基因的同源性比與核受體家族的任何其它成員的同源性大。這些研究結(jié)果提示，甲狀腺激素受體和視黃酸受體通過由一個自身趨異的共同祖先基因在從該家族類固醇受體組的所述共同祖先進化過程中的相當(dāng)早期的基因重復(fù)、可能是染色體重復(fù)進化而來。先前用HAP表示的RARB基因通過體細胞雜交和原位雜交作圖至3p24。
Benbrook等(1988)表明在上皮組織中的主要分布，因此使用命名RAR(ε)。Mattei等(1988)通過原位雜交，將RARB基因分配至3p24。采用缺失作圖法，de The等(1990)鑒定出一種位于轉(zhuǎn)錄起始上游59-bp的27-bp片段，它賦予皰疹病毒胸苷激酶啟動子的視黃酸應(yīng)答性。他們發(fā)現(xiàn)，α受體和β受體均通過同一DNA序列起作用。Mattei等(1991)將所述相應(yīng)的基因分配至小鼠的14號染色體的A帶以及大鼠15號染色體上。
Nadeau等(1992)證實了所述小鼠同系物分配至14號染色體的著絲粒部分。
根據(jù)存在于特定人肝細胞癌(HCC)中的乙型肝炎病毒(HBV)整合位點與同一肝臟的非腫瘤組織中相應(yīng)的非占據(jù)位點的比較，Dejean等(1986)發(fā)現(xiàn)HBV整合將所述病毒序列鄰近帶有與癌基因ERBA和人糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體基因的推定DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域都明顯相似的肝細胞序列放置。
Dejean等(1986)提出，通常是沉默的或在正常肝細胞中以非常低水平轉(zhuǎn)錄的該基因，由于HBV整合而表達不當(dāng)，因此導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化。
Dejean等(1986)借助一組嚙齒動物-人類體細胞雜種DNA，將該基因定位至3號染色體。de The等(1987)的其它研究表明，HAP基因產(chǎn)物可能是一種新型配體效應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，其在肝中的不當(dāng)表達與肝細胞癌發(fā)生有關(guān)。Brand等(1988)指出，稱為HAP(對于HBV激活的蛋白)的新型蛋白是一種視黃酸受體。他們將該受體稱為β型(RARB)，并將其作圖至3p25-p21。
Lotan等(1995)發(fā)現(xiàn)，RARB mRNA的表達在惡化前口腔損傷中選擇性地喪失，并且可以通過用異維A酸治療而得到恢復(fù)。RARBmRNA表達的恢復(fù)與臨床反應(yīng)相關(guān)。
RARB、RARG、RXRB和RXRG在紋狀體中表達。為了研究這些基因?qū)\動的影響，Kreczel等(1998)研制出單剔除(knockout)小鼠和雙剔除小鼠，并通過開放場地和轉(zhuǎn)桿試驗分析其運動技能。RARB-當(dāng)與野生型同窩小鼠(littermate)比較時，RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG雙無效突變體小鼠，表現(xiàn)出向前運動減少，而相應(yīng)的單無效突變體沒有表現(xiàn)出所述減少。40％RARB-RXRB無效突變體表現(xiàn)出向后運動。RARB、RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG小鼠的轉(zhuǎn)桿試驗表現(xiàn)受到損害。相反，即使RARA和RARG也在紋狀體中表達，但RARA、RARG、RARA-RXRG和RARG-RXRG無效小鼠在運動中沒有表現(xiàn)出損害。骨骼肌、外周神經(jīng)和脊髓的形態(tài)學(xué)、發(fā)育和功能在所有單無效突變體和雙無效突變體中均正常，平衡反射也是如此。這些結(jié)果提示Kreczel等(1998)，RARB、RXRB和RXRG特異性地參與運動行為的控制，并且RARB與或者RXRB或者RXRG的異二聚體是功能受體單位，使得RXRB和RXRG在功能上是豐余的。
Kreczel等(1998)研究了D1和D2多巴胺受體(D1R和D2R)在這些突變體小鼠中的表達，這兩種受體是紋狀體中最豐富的多巴胺受體。與野生型對照相比，RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG雙無效突變體表現(xiàn)出全紋狀體D1R和D2R轉(zhuǎn)錄物分別減少40％和30％，而RARB或RXRG單突變體沒有表現(xiàn)出所述減少。
這種減少主要在紋狀體的腹中區(qū)中，包括伏隔核(nucleusaccumbens)的殼和核心以及尾狀核的內(nèi)側(cè)背(mediodorsal)部分。這種減少不是由D2R表達神經(jīng)元的損失引起的，注意到凋亡沒有增加。紋狀體的組織學(xué)正常。
Samad等(1997)對D2R啟動子中視黃酸效應(yīng)元件的鑒定導(dǎo)致Kreczel等(1998)提出D2R和D2R表達的減少發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG雙無效突變體沒有表現(xiàn)出由可卡因誘導(dǎo)的運動的正常增加，模擬D1R無效小鼠的表型。
總而言之，這些結(jié)果為Kreczel等(1998)指出，類維生素A參與多巴胺能mesolimbic通路功能的控制，并且提示視黃酸信號的缺陷可以導(dǎo)致神經(jīng)性病癥。激動劑本發(fā)明的激動劑可以是任何合適的RARβ2激動劑。所述RARβ2激動劑最好能夠在反式激活測定中激活RARβ2。
所述激動劑可以是有機化合物或其它化學(xué)物質(zhì)。所述激動劑可以是一種氨基酸序列或其化學(xué)衍生物或它們的組合。所述藥物甚至可以是核苷酸序列-它可以是有義序列或反義序列。所述藥物甚至可以是一種抗體。
通常，所述激動劑是一種有機化合物。所述有機化合物通常將包含兩個或更多個烴基。這里，術(shù)語“烴基”是指包含至少C和H的基團，并且可以任選地包含一個或更多個其它合適的取代基。這類取代基的實例可以包括鹵代、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)基等。除所述取代基可能是一種環(huán)基外，取代基的組合可以組合一個環(huán)基。如果所述烴基包含一個以上的C，則那些碳不必是相互連接的。例如，所述碳中的至少兩個可以通過合適的元素或基團連接。因此，所述烴基可以含有雜原子。合適的雜原子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，包括例如硫、氮和氧。對于某些應(yīng)用，最好是所述藥物包含至少一個環(huán)基。所述環(huán)基可以是多環(huán)基，例如非稠合多環(huán)基。對于某些應(yīng)用，所述激動劑包含至少一個與另一烴基連接的所述環(huán)基。特異性激動劑按照本發(fā)明的特異性激動劑的一個實例是視黃酸(RA)。視黃酸的兩種常見形式(或者全反式視黃酸(tRA)或者9-順式-RA)是RARβ2的激動劑。
CD2019是一種RARβ2激動劑，其結(jié)構(gòu)如本文所討論的并且如(Elmazar等(1996)Teratology第53卷第158-167頁)中所示。在(Beard和Chandraratna第194頁；Johnson等，1996)中也討論了這種激動劑和其它激動劑。CD2019的結(jié)構(gòu)在附圖中作為式I顯示。
一種替代的RARβ2激動劑在附圖中以式II顯示。
本發(fā)明也包括式I和/或式II的結(jié)構(gòu)式的模擬物或生物等排物。
可按照本發(fā)明使用的激動劑最好對于RARβ2具有選擇性。確定RARβ2激動作用的測定按照本發(fā)明的激動劑的實例可以采用確定RARβ2激動作用的測定來鑒定和/或證實。
因此，本發(fā)明也包括(i)確定一種候選藥物是否能夠作為RARβ2激動劑起作用；(ii)如果所述候選藥物能夠作為RARβ2激動劑起作用，則將所述藥物以引起神經(jīng)突發(fā)育的量傳遞至受治療者。測定任何一種或更多種合適的靶-例如氨基酸序列和/或核苷酸序列，均可以用于在多種藥物篩選技術(shù)的任一種中鑒定能夠調(diào)節(jié)RARβ2的藥物。在這樣一種試驗中使用的靶可以是在溶液中游離的、固定于固相支持體、在細胞表面上帶有的、或位于胞內(nèi)?？梢詼y量靶活性的消除或靶和所述藥物之間結(jié)合復(fù)合體的形成。
本發(fā)明的測定可以是一種篩選，藉此可以測試多種藥物。一方面，本發(fā)明的測定方法是一種高通量篩選法。
用于藥物篩選的技術(shù)可以基于1984年9月13日公開的Geysen的歐洲專利申請84/03564中描述的方法。概括地講，在一種固相基片例如塑料釘或某些其它表面上合成大量不同的小肽試驗化合物。使所述肽試驗化合物與一種合適的靶或其片段反應(yīng)，并進行洗滌。然后例如通過本領(lǐng)域眾所周知的適當(dāng)改變的方法檢測結(jié)合的實體。也可以將一種純化靶直接包被在板上，用于藥物篩選技術(shù)?；蛘?，可以用非中和抗體捕獲所述肽，并將其固定至固相支持體上。
本發(fā)明也設(shè)想了應(yīng)用競爭性藥物篩選測定，其中能夠結(jié)合一種靶的中和抗體特異性地與試驗化合物競爭與靶的結(jié)合。
用于篩選的另一種技術(shù)可供用于高通量篩選(HTS)對所述物質(zhì)具有合適結(jié)合親和性的藥物，并且基于WO-A-84/03564中詳述的方法。
預(yù)計本發(fā)明的測定方法將既適合于試驗化合物的小規(guī)模篩選，又適合于其大規(guī)模篩選，也適用于定量測定。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及選擇性地調(diào)節(jié)RARβ2的藥物的鑒定方法。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的測定利用在表面展示RARβ2的細胞。這些細胞可以從具有這類細胞的受治療者中分離。然而，最好是通過轉(zhuǎn)染細胞使得在轉(zhuǎn)染后那些細胞在其表面上展示RARβ2，來制備所述細胞。
可以使用的測定的另一實例描述于WO-A-9849271中，它涉及一種無限增殖化人畸胎癌CNS神經(jīng)元細胞系，該細胞系據(jù)說具有高水平的神經(jīng)元分化，并且可用于測定與RARβ2結(jié)合的化合物。報道基因在本發(fā)明的測定方法(以及篩選)中可以使用種類繁多的報道基因，優(yōu)選的報道基因提供方便的可檢測信號(例如通過光譜學(xué))。作為實例，一種報道基因可以編碼一種催化改變光吸收特性的反應(yīng)的酶。
其它方案包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)。甚至可以使用一種利用與兩種非干擾表位反應(yīng)的單克隆抗體的兩位點基于單克隆的免疫測定。這些測定和其它測定在其它地方描述于Hampton R等(1990，Serological Methods，ALaboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，JExp Med 1581211)。
報道分子的實例包括但不限于(半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、綠熒光蛋白、熒光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、(葡糖醛酸糖苷酶、外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。或者，可以將放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸摻入新生的轉(zhuǎn)錄物中，然后當(dāng)將轉(zhuǎn)錄物與寡核苷酸探針結(jié)合時鑒定所述轉(zhuǎn)錄物。
作為其它實例，許多公司例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)供應(yīng)市售試劑盒和測定方法的操作步驟。合適的報道分子或標(biāo)記包括那些放射性核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光或生色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子等。指出這類標(biāo)記應(yīng)用的專利包括US-A-3817837、US-A-3850752、US-A-3939350、US-A-3996345、US-A-4277437、US-A-4275149和US-A-4366241。宿主細胞可以將用于本發(fā)明-例如用作靶或用于表達靶或用作藥用活性劑的多核苷酸導(dǎo)入宿主細胞中。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“宿主細胞”包括包含本發(fā)明多核苷酸序列的任何細胞。
這里，可以將多核苷酸導(dǎo)入原核生物細胞或真核生物細胞，例如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。
可以用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化和電穿孔，將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入合適的宿主細胞中。當(dāng)要將本發(fā)明的多核苷酸給予動物時，幾種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如用重組病毒載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)感染以及直接注射核酸和基因槍轉(zhuǎn)化。
因此，本發(fā)明的再一實施方案提供用作為本發(fā)明靶或表達本發(fā)明靶的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。最好是所述多核苷酸載于用于復(fù)制或表達將作為所述靶或表達所述靶的多核苷酸的載體中。將篩選與所述載體匹配的所述細胞，所述細胞例如可以是原核生物(例如細菌)細胞、真菌細胞、酵母細胞或植物細胞。
革蘭氏陰性菌大腸桿菌廣泛用作異源基因表達的宿主。然而，大量的異源蛋白往往在所述細胞中積累。隨后從大量大腸桿菌胞內(nèi)蛋白純化所需蛋白有時可能是困難的。
與大腸桿菌相反，來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的細菌非常適合作為異源宿主，因為它們能夠?qū)⒌鞍追置诘脚囵B(yǎng)基中。適合作為宿主的其它細菌是來自鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌。
根據(jù)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的性質(zhì)和/或?qū)τ谒磉_蛋白的進一步加工的需求，最好使用真核生物宿主，例如酵母或其它真菌。一般而言，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，因為它們更易于操作。然而，某些蛋白或者從酵母細胞分泌差，或者在某些情況下其加工不當(dāng)(例如在酵母中過度糖基化)。在這些情況下，應(yīng)該選擇一種不同的真菌宿主生物。
本發(fā)明范圍內(nèi)合適表達宿主的實例是真菌，例如曲霉屬(Aspergillus)菌種(例如在EP-A-0184438和EP-A-0284603中描述的那些菌種)和木霉屬(Trichoderma)菌種；細菌，例如芽孢桿菌屬菌種(例如在EP-A-0134048和EP-A-0253455中描述的那些菌種)、鏈霉菌屬菌種和假單胞菌屬菌種；和酵母，例如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)菌種(例如在EP-A-0096430和EP-A-0301670中描述的那些菌種)和酵母屬(Saccharomyces)菌種。作為實例，典型的表達宿主可以選自黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉tubigenis變種(Aspergillus niger var.tubigenis)、黑曲霉awamori變種(Aspergillus niger var.awamori)、刺孢曲霉(Aspergillus aculeatis)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
被廣泛修飾的多肽可能需要正確的加工以完成其功能。在那些情況下，需要哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(例如HEK-293、CHO、HeLA)，并且所述多肽或者在胞內(nèi)表達、在細胞膜上表達，或者如果所述多肽前接合適的前導(dǎo)序列，則被分泌到培養(yǎng)基中。
應(yīng)用合適的宿主細菌例如酵母、真菌、植物和哺乳動物宿主細胞，可以提供翻譯后修飾(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂質(zhì)化以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化)，也可能需要應(yīng)用合適的宿主來賦予本發(fā)明重組表達產(chǎn)物最適生物活性。生物與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“生物”包括可以包含按照本發(fā)明的序列和/或從其中獲得的產(chǎn)物的任何有機體。有機體的實例可以包括真菌、酵母或植物。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”包括包含按照本發(fā)明的靶和/或所獲得的產(chǎn)物的任何生物。宿主細胞/宿主生物的轉(zhuǎn)化如早先指出的，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合適的原核生物宿主的實例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。本領(lǐng)域大量記載了關(guān)于原核生物宿主轉(zhuǎn)化的內(nèi)容，例如參見Sambrook等(MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc.。
如果使用原核生物宿主，則所述核苷酸序列可能需要在轉(zhuǎn)化之前進行適當(dāng)修飾，例如通過除去內(nèi)含子進行修飾。
在另一實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。在該方面，酵母也已經(jīng)廣泛用作異源基因表達的載體。菌種釀酒酵母有很長的工業(yè)應(yīng)用史，包括其用于異源基因表達。異源基因在釀酒酵母中的表達已經(jīng)由Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等編著，第401-429頁，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and CellBiology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton編著，第107-133頁，Blackie，Glasgow)進行了綜述。
由于幾種原因，釀酒酵母非常適合于異源基因表達。首先，它對于人類是非致病性的，并且它不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，它在數(shù)個世紀(jì)的用于不同目的的商業(yè)開發(fā)后有長期安全應(yīng)用史。這導(dǎo)致廣泛的公眾可接受性。第三，對于該生物的廣泛商業(yè)應(yīng)用和研究已經(jīng)得到許多關(guān)于釀酒酵母的遺傳學(xué)和生理學(xué)以及大規(guī)模發(fā)酵特性的知識。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“作為異源基因表達載體的酵母”，Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison編著，第2版，Academic Press Ltd.)給出了關(guān)于釀酒酵母中異源基因表達和基因產(chǎn)物分泌的原理的綜述。
可利用幾種類型的酵母載體，包括整合型載體，該類型載體需要與宿主基因組重組以進行其維持，還包括自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。
為了制備轉(zhuǎn)基因酵母屬，通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入設(shè)計用于在酵母中表達的構(gòu)建體中，制備表達構(gòu)建體。已經(jīng)研制了幾種類型的用于異源表達的構(gòu)建體。所述構(gòu)建體含有一個在酵母中有活性的、與本發(fā)明核苷酸序列融合的啟動子，通常使用一種酵母起源的啟動子，例如GAL1啟動子。通常使用酵母起源的信號序列，例如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中有活性的終止子位于該表達系統(tǒng)的末端。
關(guān)于酵母轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開發(fā)幾種轉(zhuǎn)化方案。例如，通過按照Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的所述內(nèi)容，可以制備按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母屬。
可以使用各種選擇標(biāo)記篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細胞。在用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記中有許多營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記(例如LEU2、HIS4和TRP1)和顯性抗生素抗性標(biāo)記(例如氨基糖苷抗生素標(biāo)記，例如G418)。
另一種宿主生物是植物。構(gòu)建遺傳修飾植物的基本原理是在植物基因組中插入遺傳信息，以獲得所插入遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定保持。有幾種用于插入遺傳信息的技術(shù)，兩個主要原理是直接導(dǎo)入遺傳信息和利用載體系統(tǒng)導(dǎo)入遺傳信息。在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)的文章中可以找到關(guān)于一般技術(shù)的綜述。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的其它內(nèi)容可以在EP-A-0449375中找到。
適用于本發(fā)明核苷酸序列的其它宿主包括高等真核生物細胞，例如昆蟲細胞或脊椎動物細胞，特別是哺乳動物細胞，包括人細胞，或來自其它多細胞生物的有核細胞。在最近數(shù)年間，在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中繁殖脊椎動物細胞已經(jīng)成為一種常規(guī)方法。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是上皮或成纖維細胞細胞系，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NIH 3T3細胞、HeLa細胞或293T細胞。
可以將本發(fā)明的核苷酸序列穩(wěn)定地?fù)饺胨拗骷毎校蚩梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法進行瞬時表達。例如，通過用具有一種選擇標(biāo)記基因的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，然后在對于表達所述標(biāo)記基因的細胞選擇性的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，可以制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞。為了制備瞬時轉(zhuǎn)染子，用報道基因轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。
為了產(chǎn)生這類穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染的細胞，所述細胞應(yīng)該用足量的本發(fā)明核苷酸序列轉(zhuǎn)染。本發(fā)明核苷酸序列的精確量可以憑經(jīng)驗確定并且對于特定細胞和測定優(yōu)化。
因此，本發(fā)明也提供一種用待作為靶或待表達所述靶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法。用所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以在適合表達所編碼蛋白的條件下培養(yǎng)。由重組細胞產(chǎn)生的蛋白可以展示在該細胞的表面上。如果需要，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可以設(shè)計具有指導(dǎo)所述編碼序列通過特定原核生物或真核生物細胞膜分泌的信號序列的含編碼序列的表達載體。其它重組構(gòu)建可以將所述編碼序列與編碼有助于純化可溶性蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列連接(Kroll DJ等(1993)DNA Cell Biol 12441-53)。受體此中討論的RARβ2受體包括所述完整基因產(chǎn)物的模擬物、同源物、片段以及部分或全部的所述完整基因產(chǎn)物。此中討論的RARβ2最好基本上是指完整的基因產(chǎn)物。神經(jīng)性病癥此中所用術(shù)語神經(jīng)性病癥可以指任何損傷，無論是機械損傷(例如由于創(chuàng)傷)還是化學(xué)誘導(dǎo)的損傷(例如由于神經(jīng)毒素，或由于或者因設(shè)計或者作為副作用而具有免疫抑制劑效應(yīng)的治療方案)；任何神經(jīng)病理學(xué)，例如由病毒感染或其它引起的神經(jīng)病理學(xué)；任何變性性疾病或其它神經(jīng)組織相關(guān)的疾病。
神經(jīng)性病癥的實例包括例如帕金森病、早老性癡呆、衰老、運動神經(jīng)元疾病、精神分裂癥以及其它神經(jīng)和/或神經(jīng)變性性疾病。其它神經(jīng)相關(guān)病癥可以包括青光眼或視神經(jīng)的其它損害病因、貝爾麻痹或其它形式的局限性麻痹、基于神經(jīng)的陽萎例如在根治性前列腺切除術(shù)后神經(jīng)創(chuàng)傷引起的陽萎、或其它病。本發(fā)明可能有效的其它病癥包括糖尿病的神經(jīng)病理學(xué)效應(yīng)、ADS性神經(jīng)病、麻風(fēng)等。
術(shù)語神經(jīng)性病癥是指任何神經(jīng)系統(tǒng)的病癥，無論是外周神經(jīng)系統(tǒng)還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，無論是交感神經(jīng)系統(tǒng)還是副交感神經(jīng)系統(tǒng)，或無論是影響一個亞組的不同神經(jīng)類型還是影響一個超組(superset)的不同神經(jīng)類型。目的核苷酸(NOI)按照本發(fā)明，所述NOI序列可以編碼一種肽，該肽可以是藥用活性劑，例如一種RA受體(最好是RARβ2)或其激動劑。
這類編碼NOI序列通?？梢杂行У剡B接于一個例如在一種或更多種特定細胞類型中能夠驅(qū)動所述肽表達的合適啟動子。
除所述NOI或其部分以及本文描述的表達調(diào)節(jié)元件外，傳遞系統(tǒng)可以含有另外的遺傳元件，以有效地表達所述一個或更多個基因或調(diào)節(jié)所述基因的表達，所述遺傳元件包括啟動子/增強子、翻譯起始信號、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、剪接信號和聚腺苷酸化信號。
所述一個或更多個NOI可以處于表達調(diào)節(jié)元件的表達控制之下，所述表達調(diào)節(jié)元件通常是啟動子或啟動子和增強子。所述增強子和/或啟動子可以優(yōu)先在神經(jīng)細胞中有活性，使得所述NOI優(yōu)先在特定的目的細胞中表達，例如在神經(jīng)細胞中表達。因此，所述NOI對待治療個體的任何顯著生物學(xué)效應(yīng)或有害效應(yīng)可以被降低或消除。增強子元件或提供受調(diào)節(jié)表達的其它元件可以以多個拷貝存在。同樣或另外，增強子和/或啟動子可以優(yōu)先在一種或更多種特定細胞類型中有活性，所述特定細胞類型諸如神經(jīng)細胞，例如有絲分裂后終末分化的非復(fù)制型細胞，例如神經(jīng)元。
術(shù)語“啟動子”以本領(lǐng)域通常的意義使用，例如是Jacob-Monod基因表達理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點。
術(shù)語“增強子”包括結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的其它蛋白組分并因此促進與其相連的啟動子所指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列。表達載體最好將用于本發(fā)明方法中的NOI(例如編碼RARβ2或其部分的NOI)插入有效連接于一個能夠為宿主細胞提供所述編碼序列表達的控制序列的載體中，即所述載體是一種表達載體。定向載體術(shù)語“定向載體”是指能夠感染/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞或?qū)⒃谒拗骱?或靶細胞中表達的能力限于該宿主生物的某些細胞類型的載體，所述細胞通常是具有共同表型或相似表型的細胞。傳遞用于本發(fā)明的傳遞系統(tǒng)可以是任何合適的傳遞系統(tǒng)，所述傳遞系統(tǒng)用于傳遞所述NOI并且供所述NOI在體內(nèi)表達，以產(chǎn)生所述相關(guān)的肽(例如RARβ2)，這進而提供有效治療效應(yīng)。
傳遞系統(tǒng)可以是病毒傳遞系統(tǒng)。病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。另一方面，傳遞系統(tǒng)可以是非病毒傳遞系統(tǒng)，例如質(zhì)粒、染色體或人工染色體的DNA轉(zhuǎn)染法。這里，轉(zhuǎn)染包括一個采用非病毒載體將基因傳遞至哺乳動物靶細胞的方法。通常，轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、DNA基因槍、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、壓縮(compacted)DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染試劑、陽離子劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子面式兩親物(cationic facial amphiphile)(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556)和它們的組合。
載體的其它實例包括離體傳遞系統(tǒng)，它們包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染法，例如電穿孔、DNA基因槍、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、壓縮DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)。
在一個優(yōu)選方面，所述傳遞系統(tǒng)是一種載體。
在一個更優(yōu)選方面，所述傳遞系統(tǒng)是一種病毒傳遞系統(tǒng)，有時稱為病毒載體。載體正如本領(lǐng)域眾所周知的，載體是一種允許或促進一種實體從一個環(huán)境轉(zhuǎn)移至另一個環(huán)境的工具。作為實例，重組DNA技術(shù)中使用的某些載體允許實體例如DNA區(qū)段(例如異源DNA區(qū)段，例如異源cDNA區(qū)段)轉(zhuǎn)移到靶細胞中。任選的是，所述載體一旦在靶細胞中，則可以用來在所述細胞中維持所述異源DNA，或可以用作DNA復(fù)制單位。重組DNA技術(shù)中所用載體的實例包括質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。
術(shù)語“載體”包括表達載體和/或轉(zhuǎn)化載體。
術(shù)語“表達載體”是指能夠在體內(nèi)或體外/離體表達的構(gòu)建體。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”是指能夠從一個種類轉(zhuǎn)移至另一個種類的構(gòu)建體。病毒載體在本發(fā)明中，可以采用病毒傳遞系統(tǒng)(病毒載體)將所述NOI導(dǎo)入合適的宿主細胞中。多種病毒技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如用重組病毒載體例如反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒感染。
合適的重組病毒載體包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、痘病毒載體或細小病毒載體(參見Kestler等1999 Human GeneTher 10(10)1619-32)。在病毒載體的情況下，基因傳遞通常通過病毒感染靶細胞來介導(dǎo)。反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括但不限于鼠類白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝爾遜鼠類白血病病毒(A-MLV)、禽髓細胞瘤病病毒-29(MC29)和禽紅細胞性白血病病毒(AEV)。
按照本發(fā)明使用的優(yōu)選載體是重組病毒載體，特別是重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體(RRV)，例如慢病毒載體。
術(shù)語“重組病毒載體”(RRV)是指具有足夠的反轉(zhuǎn)錄病毒遺傳信息以在包裝組分存在下允許將RNA基因組包裝到能夠感染靶細胞的病毒粒子中的載體。靶細胞的感染包括反轉(zhuǎn)錄和整合到靶細胞基因組中。RRV攜帶將由所述載體傳遞到靶細胞的非病毒編碼序列。RRV不能獨立地復(fù)制，以在最終的靶細胞中產(chǎn)生感染性反轉(zhuǎn)錄病毒粒子。通常所述RRV缺乏一個功能性gag-pol和/或env基因和/或復(fù)制必需的其它基因。
可以在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press，編著JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763頁)中找到詳細的反轉(zhuǎn)錄病毒表。非病毒性傳遞所述藥用活性劑(例如RARβ2)可以用非病毒技術(shù)給予。
作為實例，所述藥用活性劑可以用肽傳遞法來傳遞。肽傳遞利用得自能夠穿過質(zhì)膜和/或核膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域或序列。
通過微注射或采用能夠與細胞膜融合的囊泡例如脂質(zhì)體傳遞，可以將目的多肽例如RARβ2直接導(dǎo)入細胞。病毒融合肽也可以用來促進膜融合和傳遞至所述細胞的胞質(zhì)。
最好是，所述RARβ2或其片段可以作為與能夠跨越質(zhì)膜和/或核膜的蛋白的蛋白融合體或綴合物，而被傳遞至細胞中。最好是，所述RARβ2或其片段可以與得自負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運活性的這種蛋白的結(jié)構(gòu)域或序列融合或綴合。優(yōu)選的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和序列包括得自HIV-1反式激活蛋白(Tat)、果蠅屬(Drosophila)觸角足同源域蛋白和單純皰疹病毒-1VP22蛋白的結(jié)構(gòu)域和序列。
外源加入的HIV-1反式激活蛋白(Tat)可以通過質(zhì)膜轉(zhuǎn)運，并達到細胞核以反式激活病毒基因組。已經(jīng)在HIV-Tat的氨基酸37-72(Fawell等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，664-668)、37-62(Anderson等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，876-884)和49-58(具有基本序列RKKRRQRRR)中鑒定出轉(zhuǎn)運活性。Vives等(1997)，J Biol Chem 272，16010-7鑒定出由氨基酸48-60(CGRKKRRQRRRPPQC)組成的序列，該序列看來對于轉(zhuǎn)運、核定位和細胞基因的反式激活是重要的。果蠅屬觸角足同源域蛋白的第三個螺旋也已經(jīng)表現(xiàn)出具有相似的特性(綜述，Prochiantz，A.，1999，Ann NY Acad Sci，886，172-9)。在觸角足中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)定位至16個氨基酸長的肽，該肽富含堿性氨基酸，具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(Derossi等，1994，J Biol Chem，269，10444-50)。該肽已經(jīng)用來在培養(yǎng)物中將生物活性物質(zhì)導(dǎo)向胞質(zhì)和細胞核(Theodore等，1995，J.Neurosci 15，7158-7167)。單純皰疹病毒的VP22間層蛋白能夠在細胞間轉(zhuǎn)運，其中在一個細胞亞群中表達的VP22蛋白傳播至該群體的其它細胞(Elliot和O’Hare，1997，Cell 88，223-33)。由GFP(Elliott和O’Hare，1999，Gene Ther 6，149-51)、胸苷激酶蛋白(Dilber等，1999，Gene Ther 6，12-21)或p53(Phelan等，1998，NatBiotechnol 16，440-3)與VP22組成的融合蛋白已經(jīng)以這種方式被靶向細胞。上述結(jié)構(gòu)域或序列的任何一種都可以用來將RARβ2或其片段導(dǎo)向細胞。上述結(jié)構(gòu)域或序列的任何一種或鑒定為具有轉(zhuǎn)運活性的其它結(jié)構(gòu)域或序列，可以用來將RARβ2或其片段導(dǎo)向細胞。藥用組合物本發(fā)明也提供一種藥用組合物，包括給予治療有效量的本發(fā)明因子(例如RARβ2和/或如本文討論的其激動劑)和一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
所述藥用組合物可以包含兩種組分，其中第一種組分包含RARβ2，而第二種組分包含其激動劑。所述第一種組分和第二種組分可以順序、同時或一起傳遞，甚至可以通過不同的給藥途徑傳遞。
所述藥用組合物可以在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上用于人類或用于動物，通常將包含一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑中的任何一種或更多種。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑是藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，描述于例如Remington’s Pharmaceutical Science，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro編著，1985)。可以根據(jù)計劃的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實踐，選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
所述藥用組合物可以包含作為載體、賦形劑或稀釋劑的任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑，或除所述載體、賦形劑或稀釋劑外，還包含任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。
可以在所述藥用組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
根據(jù)不同的傳遞系統(tǒng)，有不同的組成和配方需求。作為實例，本發(fā)明的藥用組合物可以配制成用微量泵傳遞，或通過粘膜途徑傳遞，例如作為吸入或可食入溶液用的鼻噴霧劑或氣霧劑，或通過胃腸外給予，其中所述組合物配制為注射形式，通過例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑傳遞?；蛘?，可以設(shè)計配方，以通過這兩種途徑傳遞。
當(dāng)所述因子通過胃腸粘膜進行粘膜傳遞時，它應(yīng)該能夠在通過胃腸道轉(zhuǎn)運期間保持穩(wěn)定；例如，它應(yīng)該抗蛋白水解降解、在酸性pH下穩(wěn)定并且抗膽汁的去垢劑效應(yīng)。
如果合適，可以通過吸入、以栓劑或子宮托形式、通常以洗劑、溶液、乳膏、軟膏或粉劑形式、利用皮膚貼劑、以含例如淀粉或乳糖的賦形劑的片劑形式、或在單獨的或與賦形劑混合的膠囊或卵狀小體(ovule)中、或以含調(diào)味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮劑的形式，口服給予所述藥用組合物，或可以將所述藥用組合物胃腸外注射，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。對于胃腸外給藥，所述組合物最好以無菌水溶液形式使用，所述無菌水溶液可以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖，以使溶液與血液等滲。對于口腔含化給藥或舌下給藥，所述組合物可以以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑給予。藥物組合本發(fā)明的因子可以與一種或更多種其它藥學(xué)活性物質(zhì)一起給予。例如，本發(fā)明包括用按照本發(fā)明的因子和一種或更多種類固醇、止痛藥、抗病毒劑或其它藥學(xué)活性物質(zhì)同時或順序治療。
人們會理解，這些方案包括所述物質(zhì)的順序、同時或一起給予。
實施例本發(fā)明現(xiàn)在將僅作為實例來描述，其中參考以下附圖圖1(是實施例1中所稱的圖1)顯示照片。
圖2，(是實施例1中所稱的圖2)顯示柱狀圖表和照片。
圖3，(是實施例2中所稱的圖1)顯示照片。
圖4，(是實施例2中所稱的圖2)顯示照片。
圖5，(是實施例2中所稱的圖3)顯示照片。
圖6，(是實施例2中所稱的圖4)顯示照片。
圖7，(是實施例2中所稱的圖5)顯示照片。
圖8，(是實施例2中所稱的圖6)顯示柱狀圖表。
圖9，(是實施例3中所稱的圖1)顯示照片。
圖10，(是實施例3中所稱的圖2)顯示照片。
圖11，(是實施例3中所稱的圖3)顯示照片。
圖12，(是實施例3中所稱的圖4)顯示照片。
圖13，(是實施例3中所稱的圖5)顯示照片。
圖14，(是實施例3中所稱的圖6)顯示照片。
圖15，(是實施例3中所稱的圖7)顯示柱狀圖表。
圖16，(是實施例3中所稱的圖8)顯示照片。
圖17顯示化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
所述附圖在以下實施例小節(jié)中更全面地描述。實施例1神經(jīng)突向外生長的刺激神經(jīng)生長因子通過視黃酸合成刺激神經(jīng)突向外生長起作用。
神經(jīng)生長因子(NGF)刺激來自培養(yǎng)的成體背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)突向外生長1。維生素A衍生物視黃酸(RA)也誘導(dǎo)來自各種胚胎來源包括DRG的神經(jīng)突向外生長2，3。NGF和RA效應(yīng)的這種相似性是因為它們都是導(dǎo)致神經(jīng)突向外生長的同一遺傳級聯(lián)的組分嗎？RA正調(diào)節(jié)低親和性和高親和性NGF受體3，4，并且誘導(dǎo)NGF自身的轉(zhuǎn)錄5，提示RA在該級聯(lián)中可以位于NGF上游。然而，這里我們指出，相反，即NGF位于RA上游。我們證明，當(dāng)在NGF和一種抑制參與RA合成的酶的化合物存在下培養(yǎng)成體小鼠DRG時，不發(fā)生神經(jīng)突向外生長。相反，當(dāng)將RA與NGF的封閉性抗體一起加入時，神經(jīng)突向外生長正常發(fā)生。我們進一步證明，NGF誘導(dǎo)視黃酸合成酶RALDH-2和視黃酸受體-β兩者的轉(zhuǎn)錄以及所合成RA的可檢測釋放。我們提出，RA是成體DRG神經(jīng)突再生所需的，并且NGF在RA上游起作用以誘導(dǎo)其合成。
RA的細胞效應(yīng)是通過與作為激活轉(zhuǎn)錄因子的配體的核受體結(jié)合而介導(dǎo)的。存在兩類受體-視黃酸受體(RAR)和類維生素AX受體(RXR)，每類有三個亞型α、β和γ6，7。另外，每個亞型由于可變剪接和差別啟動子用法而有多種同種型。RAR受體通過與RXR形成異二聚體而介導(dǎo)基因表達，而RXR可以或者作為同二聚體介導(dǎo)基因表達，或者通過與孤獨受體例如LXR形成異二聚體而介導(dǎo)基因表達8。核受體NGFIB與RXRs形成異二聚體8，而通過給予NGF，NGFIB在PC12細胞中被快速誘導(dǎo)9，這些發(fā)現(xiàn)提示NGF和RA途徑之間有另一種機制聯(lián)系。
雖然顯然RA在從胚胎DRG刺激神經(jīng)突向外生長方面有作用2，3，但尚不了解在成體DRG中是否發(fā)生同樣的作用。為了測試這一點，我們在NGF(100ng/ml)或RA(100nM)存在下，在去脂血清中培養(yǎng)小鼠成體DRG達5天。在兩種情況下，都發(fā)生神經(jīng)突向外生長(圖1b)。在單獨的去脂血清中培養(yǎng)的成體DRG中神經(jīng)突向外生長很少或沒有發(fā)生(圖1a)。神經(jīng)突數(shù)目的差異是顯著的(圖2a；1，2和3)。重要的是注意到從RA或NGF處理的成體DRG延伸的神經(jīng)突數(shù)目雖然顯著高于從未經(jīng)處理的DRG延伸的神經(jīng)突數(shù)目，但小于用胚胎組織獲得的數(shù)目。當(dāng)將RA與NGF一起加入時，沒有兩種處理的加和作用(圖1c)，在RA、NGF或RA加NGF各組之間沒有觀察到顯著差異(圖2a；2、3和4)。雖然可能NGF和RA的濃度都是各自的飽和濃度，但缺乏協(xié)同作用也暗示NGF和RA通過同一途徑起作用，以引起神經(jīng)突向外生長。人們可能想象或者RA誘導(dǎo)NGF產(chǎn)生5，或者NGF通過刺激RA合成酶誘導(dǎo)RA產(chǎn)生。
為了測試這些假說中的哪一個是最為可能的，我們在NGF和10μM二硫化四乙基秋蘭姆存在下培養(yǎng)成體DRG，二硫化四乙基秋蘭姆是一種化合物，它通過抑制醛脫氫酶而阻斷視黃醛轉(zhuǎn)化為RA10。如果RA的作用是刺激NGF產(chǎn)生，則二硫化四乙基秋蘭姆應(yīng)該對NGF刺激的神經(jīng)突向外生長沒有影響，而如果NGF誘導(dǎo)RA合成，則二硫化四乙基秋蘭姆應(yīng)該抑制向外生長。如圖1d所示，加入10μM二硫化四乙基秋蘭姆與NGF，完全消除了NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)突向外生長(顯著差異；圖2a，2和5)，而加入DMSO(二硫化四乙基秋蘭姆的載體)和NGF不影響神經(jīng)突向外生長(圖2a，2和6)。為了證實二硫化四乙基秋蘭姆不影響外植體中的細胞存活，我們進行了兩種類型的拯救。在兩種情況下，外植體均在補充二硫化四乙基秋蘭姆的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天。在第一種拯救下，從實驗開始時，將100nM RA加入外植體中；在第二種拯救下，在第4天加入RA。在兩種情況下，與在僅補充二硫化四乙基秋蘭姆的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)物相比，均發(fā)生顯著增加的神經(jīng)突向外生長(圖1e、f和2b)。這些實驗也證實二硫化四乙基秋蘭姆對于RA合成途徑的特異性，因為RA可以拯救所述細胞應(yīng)答。
二硫化四乙基秋蘭姆抑制NGF的誘導(dǎo)效應(yīng)，而不抑制RA的誘導(dǎo)效應(yīng)，這提示NGF在導(dǎo)致神經(jīng)突向外生長的級聯(lián)中可以位于RA之前。為了測試這一點，我們使用了抗NGF的封閉性抗體。在NGF和該封閉性抗體存在下，完全沒有神經(jīng)突向外生長發(fā)生(圖1g；與在僅NGF存在下培養(yǎng)的DRG相比，圖1b)。另一方面，在NGF封閉性抗體和100nM RA存在下培養(yǎng)的DRG(圖1h)顯示出與僅用NGF所獲結(jié)果相同的神經(jīng)突向外生長(圖1b和2c)。
如果NGF位于RA上游，則它應(yīng)該在加入DRG培養(yǎng)物之后誘導(dǎo)RA合成。為了測試這種預(yù)測，我們使用了F9受體細胞系，該細胞系由于用1.8kb與lacZ基因連接的含視黃酸效應(yīng)元件(RARE)的小鼠RARβ2基因啟動子轉(zhuǎn)染，而對RA的存在特異性應(yīng)答(Sonneveld，E.，van den Brink，C.E.，van der Leede，B.J.，Maden，M.和van der Saag，P.T.(1999)用mRARb2-lacZ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胚胎癌性細胞系用于測定活性類維生素A水平的靈敏系統(tǒng)。Exp.Cell.Res.第250卷第284-297頁)。在存在RA的情況下，在β-半乳糖苷酶組織化學(xué)染色后可以檢測到活化細胞。我們首先消除了這樣一種可能性由于在NGF(100ng/ml)存在下培養(yǎng)F9細胞，NGF自身激活F9細胞，因此沒有高于背景的F9細胞的標(biāo)記。然后，我們在去脂血清中于三種不同條件下將成體DRG培養(yǎng)5天在缺乏NGF的情況下、在存在NGF的情況下或在存在NGF和NGF封閉性抗體的情況下。然后對培養(yǎng)的DRG進行超聲處理，并置于F9報道細胞上。與未經(jīng)處理的DRG相比，經(jīng)NGF處理的DRG勻漿產(chǎn)生清晰的RA信號(圖2d)。當(dāng)除NGF外用封閉性抗體培養(yǎng)所述DRG時，阻止了這種激活(圖2d)。
我們下一步考慮到，視黃酸合成酶可能由NGF誘導(dǎo)。視黃醇通過兩步氧化過程轉(zhuǎn)化為一種醛-視黃醛，然后視黃醛被氧化為視黃酸(關(guān)于綜述，參見文獻11)。已經(jīng)表明，2型視黃醛脫氫酶(RALDH-2)在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)(包括DRG)中表達12。運用在RT-PCR，我們發(fā)現(xiàn)NGF也在培養(yǎng)的成體DRG中強誘導(dǎo)RALDH-2(圖2e)。最后，我們還發(fā)現(xiàn)在NGF刺激的培養(yǎng)物中正調(diào)節(jié)RARβ受體(圖2e)，這是一種表明涉及神經(jīng)突向外生長的現(xiàn)象13。
我們的結(jié)果表明，RA可以刺激來自成體神經(jīng)組織-DRG的神經(jīng)突向外生長。NGF同樣刺激來自該組織的神經(jīng)突向外生長，我們已經(jīng)證明，NGF通過一種酶-RALDH-2誘導(dǎo)RA合成而刺激神經(jīng)突向外生長。在存在或者NGF封閉性抗體或RA合成抑制劑的情況下，則NGF不能起作用。因此，在NGF誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長的過程中最為可能的事件順序是NGFRALDH-2RARARβ神經(jīng)突向外生長。我們尚未確定NGF是否直接負(fù)責(zé)誘導(dǎo)RALDH-2，或者該過程是否需要某些中間蛋白。然而，由于NGFIB是NGF誘導(dǎo)的最早的基因之一9，并且其產(chǎn)物可以與RXRs形成異二聚體8，因此NGFIB/RXR異二聚體可能負(fù)責(zé)激活RALDH-2基因。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白傳統(tǒng)上一直被認(rèn)為是誘導(dǎo)神經(jīng)再生14和治療神經(jīng)變性性疾病15的潛在的藥物，但其應(yīng)用的一個主要問題是缺乏傳遞至損傷位點的有效方式。因為再生性反應(yīng)需要RA，并且RA位于NGF下游，那么因為RA是可以口服給予的低分子量親脂性化合物，所以可以解決傳遞至所述損傷的問題。因此，RA在神經(jīng)學(xué)方面可能具有臨床用途。實施例1的附1.在去脂血清加以下物質(zhì)存在下培養(yǎng)5天(a-d，g，h)或8天(e，f)的小鼠成體DRG的神經(jīng)突向外生長(a)不加入；(b)NGF，100ng/ml；(c)NGF和100nM tRA；(d)NGF和10M二硫化四乙基秋蘭姆；(e)在第0天加入的二硫化四乙基秋蘭姆和tRA；(f)二硫化四乙基秋蘭姆；(g)NGF和封閉性抗體；(h)NGF封閉性抗體和tRA。
圖2(a-c)在cellogen中培養(yǎng)的成體DRG所產(chǎn)生的神經(jīng)突。(a)5天時NGF、RA和二硫化四乙基秋蘭姆的影響(1，不加入；2，NGF，100ng/ml；3，RA，100nM；4，NGF，100ng/ml和RA，100nM；5，100ng/mlNGF和10M二硫化四乙基秋蘭姆；6，NGF，100ng/ml和DMSO)。誤差范圍(error bar)，s.e.；n＝6，所有組別。NGF處理組(2)和其它組別之間的差異*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-檢驗。(b)用10M二硫化四乙基秋蘭姆處理的DRG的RA拯救(從左至右無RA；100nM RA，第0天；100nM RA，第4天)。誤差范圍，s.e.；n＝6，所有組別。與不存在RA的培養(yǎng)物的差異*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-檢驗。(c)NGF封閉性抗體對5天DRG培養(yǎng)物的影響。左，NGF，100ng/ml；中，NGF加封閉性抗體；右，封閉性抗體加100nM RA；n＝4。與NGF加封閉性抗體的差異*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-檢驗。(d)對用或不用NGF培養(yǎng)的DRG應(yīng)答的β-gal陽性F9細胞百分比的增加。左，不加入；中，NGF，100ng/ml；右，NGF與封閉性抗體。由NGF處理的DRG產(chǎn)生的β-gal陽性細胞百分比的差異；*p＜0.025，Student t-檢驗；對于每組，n＝9。(e)用或不用NGF(100ng/ml)培養(yǎng)5天的成體DRG中RALDH-2酶和RARβ表達的RT-PCR分析。用GAPDH來指示兩種樣品中cDNA的存在。已經(jīng)描述了應(yīng)用F9報道細胞研究雞胚中RA分布[16]。實施例2成體神經(jīng)組織中神經(jīng)突發(fā)育的誘導(dǎo)此中出乎意料地表明，視黃酸受體β2在小鼠成體脊髓中誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長。
已經(jīng)表明神經(jīng)突向外生長需要視黃酸。最近我們已經(jīng)證明，在外周神經(jīng)再生中的其作用機制是通過激活視黃酸受體β2。成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生。因此，我們已經(jīng)研究了在成體脊髓中不能再生是否與視黃酸受體β2的表達有關(guān)。
結(jié)果我們在此報道，在可以再生的小鼠胚胎脊髓中RARβ2被正調(diào)節(jié)到最大程度刺激神經(jīng)突向外生長的濃度。相反，在小鼠成體脊髓中，檢測不到RARβ2，RA也不誘導(dǎo)RARβ2，在體外沒有神經(jīng)突延伸。當(dāng)成體脊髓用RARβ2轉(zhuǎn)染時，可以誘導(dǎo)神經(jīng)突再生。當(dāng)脊髓用RARβ的另一同種型RARβ4轉(zhuǎn)染時，沒有神經(jīng)突向外生長。這表明在神經(jīng)突再生中受體特異性的重要性。
結(jié)論這些數(shù)據(jù)提示，成體CNS的再生潛力的損失部分由于RARβ2的表達損失引起的，并且是神經(jīng)元自身固有的。我們建議，用RARβ2進行基因治療可能導(dǎo)致受損脊髓的功能恢復(fù)。
背景成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中軸突再生的誘導(dǎo)是神經(jīng)生物學(xué)的主要目標(biāo)。CNS軸突在正常環(huán)境下不能再生已經(jīng)歸因于一種原因或多種原因的組合神經(jīng)營養(yǎng)因子的豐度低；缺乏促進生長的分子；存在抑制生長的分子。因此，在CNS中再刺激軸突生長的嘗試集中在這三種可能性上。當(dāng)使用外周神經(jīng)移植物提供許可環(huán)境時，在成年大鼠中脊髓和髓神經(jīng)元將軸突延伸多至30mm1。與成纖維細胞生長因子應(yīng)用聯(lián)合的相似策略導(dǎo)致后肢功能的部分恢復(fù)2。用抗體中和髓鞘質(zhì)中存在的神經(jīng)突生長抑制劑，使得軸突比在對照幼鼠中延伸得更長3，并且導(dǎo)致在脊髓損傷后特異性反射和運動功能的恢復(fù)4。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3和這些抗體的組合成功地誘導(dǎo)皮質(zhì)脊髓束(CST)軸突的遠程再生5。嗅成髓鞘細胞(olfactory ensheathing cells)的懸浮液也有效地為大鼠的受損CST恢復(fù)運動功能6。如果神經(jīng)營養(yǎng)蛋白僅僅用來保持軸突切開的神經(jīng)元存活7，則在誘導(dǎo)再生的這些方法中，正是軸突周圍的環(huán)境是注意的焦點，而不是神經(jīng)元自身固有的能力。然而，至少CNS再生損失的一部分是神經(jīng)元自身固有的(4個參考文獻)。這提示不在非再生性成體CNS中表達、而在可以再生神經(jīng)突的發(fā)育中的CNS中表達的基因的鑒定，可以產(chǎn)生通過基因療法治療脊髓損傷的新策略。
我們在此證明，一種這樣的基因是RARβ2，它由維生素A的生物活性代謝物視黃酸(RA)激活。RA存在于發(fā)育中的胚胎和成年動物的各種組織中，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)中8-13。當(dāng)缺乏RA時，CNS的發(fā)育中的神經(jīng)元沒有使神經(jīng)突延伸到外周中14，15。相反，當(dāng)應(yīng)用于培養(yǎng)的神經(jīng)元時，RA誘導(dǎo)更多數(shù)目和更長的神經(jīng)突16以及能夠決定其生長方向17。RA在基因轉(zhuǎn)錄水平上起作用，因為它們是兩類核轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體(RAR)和類維生素A X受體(RXR)的配體18，19。每類類維生素A受體有3個成員a、b和g，并且每個成員有數(shù)種同種型，這種多樣性可能導(dǎo)致RA對細胞的多效性效應(yīng)。
我們已經(jīng)一直在研究RA對神經(jīng)元作用的分子機制，已經(jīng)得出的結(jié)論是這些視黃酸受體之一-RARβ2是神經(jīng)元中RA信號的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)物，因為它在RA刺激神經(jīng)突向外生長的情況下被正調(diào)節(jié)20。因此我們假設(shè)在成體脊髓中這種核受體缺乏或低閾值水平可能導(dǎo)致該組織不能再生軸突突出物。結(jié)果和討論RA在體外對小鼠胚胎脊髓的效應(yīng)我們開始通過證實小鼠胚胎脊髓同胚胎CNS其它區(qū)域一樣通過延伸神經(jīng)突的對RA應(yīng)答12，17，21-23，并且這種行為涉及RARβ2的正調(diào)節(jié)。從置于cellogen基質(zhì)中并在10％去脂血清中培養(yǎng)的小鼠胚胎解剖出E13.5脊髓。以3種不同濃度(10-8M、10-7M、10-6M)加入全反式RA，5天后該外植體用神經(jīng)絲抗體染色，并檢查神經(jīng)突的存在。隨著RA濃度的增加，從培養(yǎng)的脊髓發(fā)出的神經(jīng)突的數(shù)目也增加，在10-6M下效應(yīng)最大(圖1C、E、G)。因為RA及其前體視黃醇的內(nèi)源含量高9，13，所以可推測甚至在缺乏RA的情況下，所述胚胎脊髓也延伸神經(jīng)突(圖1A)。實際上，當(dāng)用二硫化四乙基秋蘭姆抑制RA的內(nèi)源合成時，則沒有神經(jīng)突延伸24。為了證明神經(jīng)突的誘導(dǎo)涉及RARβ2的正調(diào)節(jié)，在同樣范圍的RA處理中在5天后，對培養(yǎng)物進行RT-PCR。這揭示RARβ2在所用的所有RA濃度下，正常地在胚胎脊髓中表達(圖2A，1-5道)，并且在1×10-6M RA處理后被強烈正調(diào)節(jié)(圖2A，5道)，而這一濃度產(chǎn)生最大神經(jīng)突向外生長。在體外RA對小鼠成體脊髓的效應(yīng)缺乏我們下一步不用胚胎脊髓，而用10月齡成體脊髓進行同樣的一系列實驗。與胚胎脊髓相反，RA在所測試的任何濃度下都對神經(jīng)突向外生長沒有影響，并且同未處理的對照一樣，這些RA處理的成體脊髓根本不能延伸任何神經(jīng)突(圖1B、D、F、H)。通過RT-PCR檢查RARβ2的參與，揭示出對照成體脊髓有很少的這種受體或沒有可檢測的內(nèi)源水平的這種受體(圖2B，1道)，并且與胚胎脊髓不同，對任何濃度的RA處理反應(yīng)時其水平都沒有變化(圖2，2-5道)。成體脊髓中神經(jīng)突的誘導(dǎo)因此我們假設(shè)這是缺乏RARβ2表達，這可能導(dǎo)致成體脊髓的完全惰性的行為。我們先前觀察到，通過延伸神經(jīng)突而對RA應(yīng)答的成體DRG也正調(diào)節(jié)RARβ224，這一觀察證明所述同樣的行為由胚胎神經(jīng)元和合適的成體神經(jīng)元誘發(fā)，并且增強了PNS和CNS神經(jīng)元之間調(diào)節(jié)行為的差異。為了測試我們的假說，我們用1型缺陷型單純皰疹病毒(HSV-1)載體轉(zhuǎn)染成年(10月齡)小鼠脊髓段。
進行了3種不同的轉(zhuǎn)染，其中兩種用作對照。第一種轉(zhuǎn)染，僅用含lacZ的載體(pHSVlacZ)；第二種轉(zhuǎn)染，用含RARβ2的載體(pHSVRARβ2)；第三種轉(zhuǎn)染，用含另一同種型RARb基因RARβ4的載體(pHSVRARβ4)。后者用作非常準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)染對照，因為在我們先前的實驗中我們在RA處理神經(jīng)元后沒有檢測到RARβ4同種型20，因此它不參與神經(jīng)突向外生長。我們首先確保所述轉(zhuǎn)染是成功的，并且相關(guān)的受體同種型在培養(yǎng)的脊髓中表達。用合適的構(gòu)建體對脊髓段轉(zhuǎn)染過夜，并且或者在3天后或者在4天后進行分析。根據(jù)對成體脊髓的b-半乳糖苷酶染色判斷，pHSVlacZ處理的脊髓表明發(fā)生了顯著量的轉(zhuǎn)染(圖3B)。RT-PCR證明，用所述RARβ2載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)致RARβ2表達(圖4，3道)，但RARβ4不表達(圖4，4道)，而用所述RARβ4載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)致RARβ4表達(圖4，8道)，而RARβ2不表達(圖4，7道)。在非轉(zhuǎn)染的脊髓中，既沒有檢測到RARβ2，也沒有檢測到RARβ4(圖4，2道和6道)。
這些轉(zhuǎn)染對神經(jīng)突向外生長的效應(yīng)是明確的。用pHSVlacZ轉(zhuǎn)染，不能改變培養(yǎng)的成體脊髓的行為，培養(yǎng)的成體脊髓在神經(jīng)突向外生長方面完全保持不反應(yīng)(圖5A，12/12轉(zhuǎn)染)。同樣，用pHSVRARβ4轉(zhuǎn)染在培養(yǎng)的脊髓中沒有產(chǎn)生反應(yīng)，培養(yǎng)的脊髓保持無作用(圖5C，12/12轉(zhuǎn)染)。然而，用pHSVRARβ2同種型轉(zhuǎn)染，清楚地產(chǎn)生一種不同的行為，在培養(yǎng)物中出現(xiàn)許多神經(jīng)突(圖5B，8/12轉(zhuǎn)染)。在pHSVRARβ2脊髓中產(chǎn)生的神經(jīng)突數(shù)目不等，在3和23之間。在pHSVlacZ轉(zhuǎn)染中，每個外植體的lacZ陽性細胞數(shù)目有相當(dāng)大的變異。這提示神經(jīng)突數(shù)目的變異性可能是由于轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)目變異而引起的。
這些結(jié)果為我們的假說提供了強有力的支持，我們的假說是RARβ2同種型在應(yīng)答RA而誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長方面起重要作用，并且RARβ2同種型可能是在損傷成體CNS中不能被正調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組分。我們的假說基于幾個涉及或者再生型或者非再生型神經(jīng)元組織及其對RA應(yīng)答的實驗。因此，小鼠胚胎脊髓、小鼠胚胎DRG和小鼠成體DRG都通過正調(diào)節(jié)RARβ2且延伸神經(jīng)突而對RA應(yīng)答。相反，小鼠成體脊髓不能正調(diào)節(jié)RARβ2并且不能延伸神經(jīng)突。此外，NGF刺激神經(jīng)突向外生長，并且通過正調(diào)節(jié)RARβ2而起作用24，而來自小鼠胚胎DRG的神經(jīng)突向外生長可以受RARβ激動劑刺激20。
這些結(jié)果表明，當(dāng)操作神經(jīng)元本身的基因組時，再生可以被重新喚醒。這與最近的神經(jīng)突向外生長的體內(nèi)誘導(dǎo)相反，所述神經(jīng)突向外生長的體內(nèi)誘導(dǎo)集中在CNS環(huán)境中存在于的抑制性因子1-5。在發(fā)育期間，脊髓再生能力的損失與髓鞘質(zhì)相關(guān)神經(jīng)突生長抑制分子的出現(xiàn)相關(guān)，并且這些抑制分子中的某些分子被認(rèn)為是由少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的25。我們在我們的培養(yǎng)物中以及在環(huán)境已經(jīng)被操作的培養(yǎng)物中觀察到的兩種神經(jīng)突再生是兩種不同的神經(jīng)突再生機制，或者它們是相關(guān)的過程。已經(jīng)表明CNS神經(jīng)元本身參與髓鞘形成26，這一事實為后一觀點提供了支持。因此這使得我們推測在發(fā)育期間神經(jīng)元中RARβ2的存在，可能調(diào)節(jié)參與髓鞘形式的基因，并且通過RARβ2基因的轉(zhuǎn)染，這一過程在成體CNS中重演。
在RARβ2轉(zhuǎn)染的脊髓中觀察到的神經(jīng)突中沒有一個延伸超過適當(dāng)?shù)木嚯x。這提示神經(jīng)突的延伸可能需要一組不同基因的表達。成體PNS中軸突再生，其中從分枝到延伸生長的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于轉(zhuǎn)錄依賴性開關(guān)27，這一證據(jù)提供了這可能是事實的證據(jù)。另一方面，在我們的培養(yǎng)基中神經(jīng)突不能延伸可能是由于這樣一個事實引起的有可能由于所述轉(zhuǎn)染的瞬時性質(zhì)而致使在規(guī)定時間內(nèi)RARβ2表達喪失，并且這沒有為延伸的發(fā)生提供足夠的時間。
然而，我們提出這些初步數(shù)據(jù)支持RARβ2在成體CNS中神經(jīng)突再生中起作用，并且用這種轉(zhuǎn)錄物的基因療法聯(lián)合其它療法可能在某一天導(dǎo)致受傷脊髓的功能恢復(fù)。方法培養(yǎng)物。從或者E13.5小鼠或者10月齡小鼠解剖出脊髓，并將其切成約5mm的橫切段。將這些橫切段培養(yǎng)在cellogen基質(zhì)(ICN flow)中，所述基質(zhì)通過將1體積的7.5％碳酸氫鈉、1體積10x MEM(Gibco)和8份cellogen (ICN flow)混合而制備。通過滴加5M NaOH，將pH調(diào)至7.5。每2天飼喂外植體。培養(yǎng)基由含有谷氨酰胺(Gibco)、6％葡萄糖、GMS-A(Gibco)、10％去脂血清和全反式RA(儲備液，1×10-5M，Sigma)的DMEM-F12組成。第5天，將它們固定在4％低聚甲醛中，并用神經(jīng)絲抗體NF200(Sigma)染色。
RT-PCR分析。提取RNA(trizol，Gibco)，并利用Pharmacia試劑盒，如生產(chǎn)商的說明中所述，制備cDNA。所用的引物來自GAPDH、RARβ2和RARβ4，(細節(jié)根據(jù)要求)。對于胚胎脊髓，進行25個循環(huán)的PCR，而對于成體脊髓，進行40個循環(huán)的PCR。如下進行擴增于95℃變性30秒，于55℃退火30秒，并且于72℃延伸1分鐘。然后將所得產(chǎn)物的1/5進行凝膠電泳。
轉(zhuǎn)染。制備病毒儲備液，并如參考文獻28中所述方法進行B半乳糖苷酶染色。所用的效價是pHSV RARβ2，5×10-4ip/ul，pHSVRARβ4，4×10-4ip/ul，pHSVlacz 5×10-4ip/ul。實施例2的附圖圖1視黃酸對培養(yǎng)的E13.5(A，C，E，G)和10月齡成體脊髓(B，D，F(xiàn)，H)上神經(jīng)突向外生長的影響的比較。脊髓段在在10％去脂血清和RA存在下cellogen中培養(yǎng)5天。培養(yǎng)基每2天進行更換。A，B，無RA；C，D，1×10-8MRA；E，F(xiàn)，1×10-7MRA；G，H，1×10-6MRA。
圖2RARβ2在E13.5和10月齡成體脊髓中的表達。脊髓段在不同濃度的RA存在下培養(yǎng)5天，此后進行RARβ2的RT-PCR分析。A.E13.5(2-5道)和B.10月齡成體脊髓(2-5道)。泳道1.bluescript/HPAII大小標(biāo)記物，2.無RA，3.1×10-8MRA，4.1×10-7MRA，5.1×10-6MRA。GAPDH的存在用來指示樣品中等量的cDNA。
圖3用pHSVlacZ轉(zhuǎn)染成體脊髓。培養(yǎng)的10月齡成體脊髓用5×10-4ipu/ul pHSVlacZ轉(zhuǎn)染過夜，并在3天后分析B半乳糖苷酶染色。A.非轉(zhuǎn)染的成體脊髓。B.用pHSVlacZ轉(zhuǎn)染的成體脊髓。
圖4用或者pHSVRARβ2或pHSVRARβ4轉(zhuǎn)染的成體脊髓。成體脊髓在cellogen中培養(yǎng)，并且或者用5×10-4ipu/ul pHSVRARβ2或者用4×10-4ipu/ul pHSVRARβ4轉(zhuǎn)染過夜。轉(zhuǎn)染后4天，經(jīng)RT-PCR分析用以下轉(zhuǎn)染的成體脊髓中RARβ2(2-4道)和RARβ4(6-8道)的表達泳道2、6，無病毒，泳道3、7，pHSVRARβ2，泳道4、8，pHSVRARβ4。GAPDM的存在用來指示樣品中的等量cDNA。泳道1、2，bluescript/HPA II大小標(biāo)記物。
圖5在培養(yǎng)的成體脊髓中或者pHSVlacZ、pHSVRARβ2或者pHSVRARβ4的轉(zhuǎn)染對神經(jīng)突向外生長的影響。10月齡脊髓在cellogen中培養(yǎng)，并且或者用5×10-4ipu/ul pHSVlacZ、5×10-4ipu/ulpHSVRARβ2或者用4×10-4 ipu/ul pHSVRARβ4轉(zhuǎn)染過夜，并且轉(zhuǎn)染后4天，經(jīng)用NF200分析神經(jīng)突染色。用A.pHSVlacZ，B.pHSVRARβ2，C.pHSVRARβ4轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的脊髓。
圖6是每個脊髓外植體的神經(jīng)突平均數(shù)的柱狀圖表。實施例3來自小鼠神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長視黃酸受體在來自小鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)不同群體的神經(jīng)突向外生長中的作用。
根據(jù)生存對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的需求，可以將背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元分為至少3個類型。我們已經(jīng)分析了在從胚胎第13.5天的小鼠DRG中分離的NGF、NT-3和BDNF依賴性神經(jīng)元中視黃酸受體(RAR)和類維生素A X受體(RXR)的表達。我們證明，每個神經(jīng)元群體表達三個RXR-α、β和γ中的每一個。然而，NGF和NT-3依賴性神經(jīng)元表達RARα、β和γ中的每個，而BDNF依賴性神經(jīng)元僅表達RARα和RARβ。當(dāng)將視黃酸加入每個所述類別的神經(jīng)元中時，僅NGF和NT-3依賴性神經(jīng)元通過延伸神經(jīng)突的應(yīng)答，這種應(yīng)答涉及RARβ2的正調(diào)節(jié)。利用受體選擇性激動劑證實了這種特異性，因為僅RARβ選擇性化合物刺激神經(jīng)突向外生長。這些結(jié)果表明通過RARβ2的RA作用在神經(jīng)突向外生長中的作用。導(dǎo)入神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是一個生長因子家族，它們是發(fā)育中的外周神經(jīng)系統(tǒng)中多種初級感覺神經(jīng)元的生存所需的(Snider，1994)。該家族包括神經(jīng)生長因子(NGF)(Levi-Montalcini，1987)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)(Maisonpierre等，1990)和腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)(Barde等，1982)。它們在受外周神經(jīng)元支配的靶區(qū)域中合成，并且被認(rèn)為通過一個逆行機制從所述靶區(qū)域轉(zhuǎn)運，以支持發(fā)育中的神經(jīng)元的存活。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白通過稱為Trk的受體酪氨酸激酶發(fā)揮作用。NGF特異性地激活TrkA；BDNF激活TrkB，而NT-3激活TrkC(綜述，參見Snider，1994)。導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和受體酪氨酸激酶功能喪失實驗的表型分析，已經(jīng)揭示出，背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元可以被分為至少3個類型。其生存需要NGF的神經(jīng)元介導(dǎo)感受傷害(疼痛)和感受熱的功能。在外周中，所述軸突終止于皮膚淺層，并且神經(jīng)支配脊髓淺層(Crowley等，1994；Smeyne等，1994)。比NGF型神經(jīng)元大得多、在外周中投射至肌梭的主要末端并且延伸一個側(cè)支至脊髓中的運動原庫(pool)的本體感受神經(jīng)元(感覺肢體在空間的位置)，其生存依賴于NT-3(Ernfors等，1994；Farinas等，1994；Klein等，1994)。BDNF神經(jīng)元小至中等大小，并且可以包括某些類別的機械感受器(Klein等，1993；Jones等，1994)。
除涉及神經(jīng)元存活的生長因子外，類維生素A也執(zhí)行同樣的作用。類維生素A是由維生素A衍生而來的一類分子家族，包括生物活性代謝物視黃酸(RA)。RA的細胞效應(yīng)通過兩類受體的作用而介導(dǎo)，所述兩類受體是視黃酸受體(RAR)，全反式RA(tRA)和9-順式-RA(9-cis-RA)均激活它們；和類維生素A X受體(RXR)，它們僅由9-cis-RA所激活(Kastner等，1994；Kleiwer等，1994)。所述受體有三個主要亞類-α、β和γ，每個亞類由于可變剪接和差別啟動子用法而具有多種同種型(Leid等，1992)。RAR通過與RXR形成異二聚體或通過與多種孤獨受體形成異二聚體介導(dǎo)基因表達，而RXR可以作為同二聚體而介導(dǎo)基因表達(Mangelsdorf和Evans，1995)。有趣的是，在PC12細胞中由NGF誘導(dǎo)的最早的基因之一是孤獨受體NGFI-B(NURR1)(Millbrandt，1989)。這提示所述生長因子和類維生素A介導(dǎo)發(fā)育中的神經(jīng)元可以相互作用的途徑。這種相互作用可能對于所述神經(jīng)元的存活是關(guān)鍵性的，因為已經(jīng)表明RA涉及神經(jīng)元的存活和分化(Wuarin和Sidell，1991；Quinn和De Boni，1991)。此外，對多種胚胎神經(jīng)元類型的許多研究已經(jīng)表明，RA可以刺激神經(jīng)突數(shù)目和長度(綜述，參見Maden，1998)，實際上，所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白也可以刺激神經(jīng)突數(shù)目和長度(Campenot，1977；Lindsay，1988；Tuttle和Mathew，1995)。最近，我們已經(jīng)證明，RA對于成體DRG中神經(jīng)突的再生是關(guān)鍵性的，并且其合成可以受NGF調(diào)節(jié)(Corcoran和Maden，1999)。
在此中所述的研究中，我們使用E13.5小鼠DRG，通過查詢RAR和RXR中的哪些在其生存依賴于不同神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的神經(jīng)元中表達，進一步研究類維生素A介導(dǎo)的途徑和所述生長因子途徑之間的相互作用的性質(zhì)。我們證明，實際上在NGF、NT-3和BDNF神經(jīng)元中表達一種不同的類維生素A受體分布型，并且這種分布型在RA處理后改變，這誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長。具體地說，RARβ2在NGF神經(jīng)元和NT-3神經(jīng)元中被正調(diào)節(jié)，但在BDNF型神經(jīng)元中不被正調(diào)節(jié)。利用受體選擇性激動劑證實了這一結(jié)果，因為僅RARβ激動劑取代RA誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長。這些結(jié)果表明通過RARβ2的RA作用在神經(jīng)突向外生長中的作用。材料和方法DRG培養(yǎng)物。DRG得自E13.5小鼠，無非神經(jīng)節(jié)組織，并且將其收集到冰冷的無鈣鎂磷酸緩沖鹽溶液中。為了制備游離的細胞懸浮液，用0.05％胰蛋白酶將所述神經(jīng)節(jié)于15℃處理15分鐘。通過加入1％血清終止反應(yīng)，并且通過用23號針研磨獲得單細胞。然后將所述細胞以1000g離心10分鐘，并重懸于培養(yǎng)基中。將它們以約25000細胞/cm2的密度接種于各孔中，在所述各孔中已經(jīng)用100μg/ml多聚D賴氨酸預(yù)包被2小時。每2天飼喂所述培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基由含有谷氨酰胺(Gibco)、6％葡萄糖、ITS(Gibco)的DMEM-F12組成。所用的生長因子或者是50ng/ml NGF(7s，Promega)、50ng/ml NT3(Promega)或者是50ng/ml BDNF(Promega)。類維生素A的使用濃度為1×10-7M。全反式視黃酸得自Sigma，而所述受體激動劑由CIRD Galderma合成CD366激活RARα，CD2019激活RARβ，CD437激活RARγ，而CD2809激活所有的RXR。
RT-PCR分析。提取RNA(trizol，Gibco)，并且利用Pharmacia試劑盒，如生產(chǎn)商的說明中所述，制備cDNA。所用的引物得自小鼠RAR、RXR和GAPDH(細節(jié)根據(jù)要求)。為了鑒定出哪種RAR/RXR受體涉及神經(jīng)突向外生長，使用半定量PCR。在每種RAR和RXR的線性范圍內(nèi)進行擴增，將其表達水平與GAPDH比較。對于RXR，進行28個循環(huán)，而對于RARα和RARγ進行25個循環(huán)，而對于RARβ和GAPDH進行22個循環(huán)。如下進行擴增于95℃變性30秒，于55℃退火30秒，并且于72℃延伸1分鐘。將所得產(chǎn)物的1/5進行凝膠電泳，并且進行吸印。然后將其用合適的RAR、RXR或GAPDH探測，以進行歸一化。
原位雜交細胞用PBS洗滌1次，并且在4％PFA中固定30分鐘。然后將其在PBS-0.05％Tween(PBT)中洗滌2次，每次5分鐘。雜交于55℃過夜進行。所述緩沖液由0.1M Tris-Cl，pH9.5、0.05MMgCl2、0.1M NaCl和0.1％Tween-20構(gòu)成。然后將細胞于65℃順序在50％雜交緩沖液、50％2x SSC、100％2x SSC中洗滌15分鐘，最后在0.2％SSC中洗滌。然后將它們在RT下分別在75％0.2X SSC、25％PBT、50％0.2x SSC、50％PBT、25％0.2X SSC、75％PBT和100％PBT中洗滌，每次5分鐘。將細胞在2％綿羊血清的PBT溶液中封閉1小時，然后與抗DIG抗體一起于4℃孵育過夜。然后將細胞在PBT中洗滌8次，達2小時。通過用NBT/BCIP，按照生產(chǎn)商的說明(Boehringer Mannheim)進行顯色。
免疫組織化學(xué)和神經(jīng)突長度的測量細胞用PBS洗滌1次，并且在4％PFA中固定30分鐘。然后將其在PBS-0.05％Tween(PBT)中洗滌2次，每次5分鐘。然后將它們在第一抗體NF200(sigma)中于4℃孵育過夜，并且在PBT中洗滌8次，達2小時。然后于室溫應(yīng)用第二抗體達2小時，然后將細胞再次在PBT洗滌8次，達2小時。然后將其在含0.5mg/ml DAB和6％H2O2的PBS中孵育5分鐘。利用NIH圖象軟件測量神經(jīng)突的長度。將實驗重復(fù)3次，每個實驗取3個隨機視野進行分析。每個視野平均有40個神經(jīng)元，測量給定神經(jīng)元的最長的神經(jīng)突分支。結(jié)果通過原位雜交測定的受體表達我們首先通過原位雜交研究了所述RAR和RXR在E13.5小鼠DRG的原代培養(yǎng)物中的表達。解離的DRG神經(jīng)元在NGF、NT-3或BDNF存在下無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。在無神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的情況下所述細胞死亡。我們發(fā)現(xiàn)，所有三種類型的神經(jīng)元均表達RXRα(圖1D，J，P)、RXRβ(圖1E，K，Q)和RXRγ(圖1F，L，R)。相比之下，所述RAR在所述三種類型的神經(jīng)元中表現(xiàn)出差別表達。NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元表達RARα(圖1A，G)、RARβ(圖1B，H)和RARγ(圖1C，I)，而BDNF依賴性神經(jīng)元僅表達RARα(圖1M)和RARβ(圖1N)。通過原位雜交在BDNF依賴性培養(yǎng)物中不能檢測到RARγ(圖10)。RA對神經(jīng)突向外生長的影響為了消除RA對不同神經(jīng)元群體的任何營養(yǎng)效應(yīng)，我們在加有相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的無血清培養(yǎng)基中將所述神經(jīng)元培養(yǎng)2天，然后將1×10-7M RA加入培養(yǎng)物中達3天。對照培養(yǎng)物不加入RA，并且僅在神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中維持。在有或無RA的情況下培養(yǎng)的神經(jīng)元數(shù)目沒有顯著差異。這提示RA對神經(jīng)突向外生長有影響，并且該影響不是由于神經(jīng)元亞群在所用的不同培養(yǎng)條件下的選擇性存活而引起的。為了分析神經(jīng)突向外生長，5天后將培養(yǎng)物固定，并且用單克隆抗體NF200染色。神經(jīng)突長度通過NIH圖象軟件測量。將該實驗重復(fù)3次。每個實驗總共對約120個神經(jīng)元進行計數(shù)，并且測量每個神經(jīng)元的最長神經(jīng)突，從中取每種處理的平均神經(jīng)突長度。在無RA的情況下，BDNF依賴性神經(jīng)元(圖2E和圖7C的柱1)生長出神經(jīng)突，而NGF依賴性神經(jīng)元(圖2A)和NT-3依賴性神經(jīng)元(圖2C)表現(xiàn)出有限的神經(jīng)突向外生長(圖7A和B的柱1)。相比之下，當(dāng)將RA加入培養(yǎng)基中，在NGF依賴性神經(jīng)元(圖2B)和NT-3依賴性神經(jīng)元(圖2D)中神經(jīng)突的長度和數(shù)目有顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)比較所述神經(jīng)突的長度時，這種差異是顯著性的(圖7 A和B，柱1和柱2)。相反，RA對BDNF依賴性神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長沒有影響(圖2F和圖7C的柱1和柱2)。通過RT-PCR測定的受體表達和對RA的應(yīng)答為了鑒定出所述受體中哪些受體涉及神經(jīng)突向外生長，用針對所述RXR的引物和個別RAR同種型，如在材料和方法中所述進行半定量PCR。在用或不用RA培養(yǎng)的所述三個類型的神經(jīng)元中的每種類型中，在所述RXR的表達中沒有差異。相反，在所述RAR受體分布型中有變異。所述三個類型神經(jīng)元的每個類型均表達RARα1(圖3A，B，C，柱1)，在NGF依賴性神經(jīng)元(圖3A，8道)和NT-3依賴性神經(jīng)元(圖3B，8道)中，對RA應(yīng)答RARα1被強正調(diào)節(jié)，在BDNF依賴性神經(jīng)元(圖3C，8道)中RARα1僅被略為正調(diào)節(jié)。從圖3中明顯看出，在這些DRG神經(jīng)元中僅RARα1同種型容易被檢測出，盡管在所述印跡過度暴露時NT-3依賴性神經(jīng)元表達RARα5和RARα7同種型，而BDNF依賴性神經(jīng)元表達RARα6和RARα7同種型。
在所述四種可能的RARβ同種型中，僅RARβ2同種型在所有三種類型的神經(jīng)元中均檢測到。與非刺激的培養(yǎng)物相比(圖4A，B，C，2道)相比，在NGF依賴性神經(jīng)元(圖4A，6道)和NT-3依賴性神經(jīng)元(圖4B，6道)中該同種型被RA強正調(diào)節(jié)，但在BDNF依賴性神經(jīng)元(圖4C，6道)中該同種型未被正調(diào)節(jié)。
在7種RARγ同種型中，在所述神經(jīng)元培養(yǎng)物中僅檢測出RARγ1同種型，該同種型隨后僅在NGF依賴性神經(jīng)元(圖5A，1道和8道)和NT-3依賴性神經(jīng)元(圖5B，1道和8道)中檢測出。在BDNF依賴性神經(jīng)元中通過RT-PCR沒有檢測出RARγ1。受體選擇性類似物和神經(jīng)突向外生長以上數(shù)據(jù)表明，不是RARα1就是RARβ2的正調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中觀察到的神經(jīng)突向外生長的增加(圖2B，D)。更可能是RARβ2同種型，因為該受體在BDNF依賴性神經(jīng)元中不被正調(diào)節(jié)，并且當(dāng)用RA刺激時神經(jīng)突向外生長不增加(圖2F)，而RARα1同種型被正調(diào)節(jié)，雖然缺乏對RA的神經(jīng)突應(yīng)答。為了區(qū)別這兩種受體，我們使用已經(jīng)研制的特異性地激活個別受體的受體選擇性合成類維生素A。CD366激活RARα，CD2019激活RARβ，CD437激活RARγ，而CD2809激活所有RXR。
在所述RARα激動劑的存在下，在任何神經(jīng)元群體中神經(jīng)突向外生長均沒有顯著增加(圖6A，E，I和圖7A，B和C，柱1和柱3)。相反，與未處理的神經(jīng)元相比，所述RARβ激動劑在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中顯著增加神經(jīng)突向外生長(圖6B，F(xiàn)和圖7AB，柱1和柱4)，但所述RARβ激動劑不影響B(tài)DNF依賴性神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長(圖6J和圖7C，柱1和柱4)。當(dāng)在所述RARγ激動劑存在下培養(yǎng)不同神經(jīng)元群體時，在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中神經(jīng)突向外生長顯著減少(圖6C，G和圖7AB，柱1和柱5)，而在BDNF依賴性神經(jīng)元中仍發(fā)生神經(jīng)突向外生長(圖6K和圖7C，柱1和柱5)。當(dāng)將它們在所述RXR激動劑存在下培養(yǎng)時，在任何所述神經(jīng)元群體中對神經(jīng)突向外生長均沒有顯著影響(圖6D，H，L和圖7AB和C，柱1和柱6)。
因此，與我們的RT-PCR數(shù)據(jù)相一致，RARβ2是神經(jīng)突向外生長所需要的。此外，RARγ可以抑制神經(jīng)突向外生長。RAR之間的相互關(guān)系最后，我們嘗試研究在受體RARβ2和RARγ1之間是否有任何調(diào)節(jié)性相互作用，因為這些受體對神經(jīng)突向外生長具有相反的效應(yīng)。為了檢查這一點，我們在或者所述RARγ激動劑或者所述RARβ激動劑存在下在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元，并且24小時后，通過半定量RT-PCR在受體表達水平上查看。與非刺激的培養(yǎng)物(圖8，1道和4道)相比，所述RARβ激動劑在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中都正調(diào)節(jié)RARβ2的表達(圖8B，3道和6道)，但不影響RARγ1的表達(圖7A，3道和6道)。然而，與非刺激的培養(yǎng)物(圖8B，1道和4道)相比，在所述RARγ激動劑存在下，在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中RARβ2均降低(圖8B，2道和5道)。所述RARγ激動劑對RARγ1的水平?jīng)]有影響(圖8A，2道和5道)。因此，RARγ1可以調(diào)節(jié)RARβ2的表達。實施例3的討論我們的結(jié)果表明，我們已經(jīng)分離的三種背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元群體(NGF、NT-3和BDNF依賴性的)的每種都表達一組共同的類維生素A受體和一組獨特的類維生素A受體。關(guān)于所述RXR，它們分別表達RXRα、RXRβ和RXRγ，并且這些中沒有一種發(fā)現(xiàn)直接參與神經(jīng)突向外生長。相反，根據(jù)用來選擇神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，所述神經(jīng)元表達不同的RAR。對于每個群體共同的主要的RAR同種型是RARα1和RARβ2。另外，NGF群體和NT-3群體表達RARγ1，而在所分析的時間點RARγ1在BDNF群體中不表達。
僅NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元通過延伸神經(jīng)突而對RA應(yīng)答，而無論RA是否存在，BDNF依賴性神經(jīng)元都產(chǎn)生神經(jīng)突。平行的是，在RA加入后RAR分布型有變化。在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元中RARα1和RARβ2均被強正調(diào)節(jié)，而在BDNF依賴性神經(jīng)元中，僅RARα1被正調(diào)節(jié)。這表明RARβ2是誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長所需的，并且證實我們使用受體選擇性激動劑的這一觀察結(jié)果。
受體選擇性激動劑的開發(fā)已經(jīng)提供了一種非常有價值的工具，以開始檢查個別受體在任何特定生物學(xué)過程中的作用。我們在此表明，僅RARβ激動劑CD2019通過在NGF神經(jīng)元和NT-3神經(jīng)元中誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長而模擬RA的效應(yīng)，因此證實我們的RT-PCR結(jié)果。
我們也觀察到，所述RARγ激動劑引起NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長的減少。在表明這是否與RARβ2表達有關(guān)的研究中，我們檢查了所述RAR激動劑是否對受體表達有任何影響。所述RARβ激動劑正調(diào)節(jié)RARβ2的表達，但對RARγ1的表達沒有影響。相比之下，所述RARγ激動劑對RARγ1的表達沒有影響，但它減量調(diào)節(jié)RARβ2的表達水平，這種現(xiàn)象也是神經(jīng)突向外生長的前序。這表明所述RARβ轉(zhuǎn)錄物可以被RARγ/RXR異二聚體調(diào)節(jié)。BDNF依賴性神經(jīng)元沒有對RA應(yīng)答的神經(jīng)突向外生長的增加，也提示在所研究的胚胎階段，在該類型的神經(jīng)元中RARβ受到的調(diào)節(jié)可能不同于在NGF依賴性神經(jīng)元和NT-3依賴性神經(jīng)元的RARβ。
我們的結(jié)果表明，正是所述RAR途徑的激活導(dǎo)致神經(jīng)突向外生長，因為激活RXR/孤獨受體的RXR激動劑對神經(jīng)突向外生長沒有影響，而激活RAR/RXR異二聚體的所述RARβ激動劑增加神經(jīng)突向外生長的量。這提示，如果NGF通過利用例如NGFI-B而通過RXR/孤獨受體途徑起作用，則在這些胚胎階段中，這不直接負(fù)責(zé)神經(jīng)突向外生長，而是它可能是神經(jīng)元生存所需要的。有趣的是，在所述成體中，所述差別看來是真實的。NGF不是神經(jīng)元生存所需的，但它是神經(jīng)突向外生長所需的(Lindsay，1988)。因此，在發(fā)育中的神經(jīng)突和成體再生神經(jīng)突中，神經(jīng)突向外生長可能有不同的機制。然而，在發(fā)育期間神經(jīng)突向外生長中，絕對需要RA。在維生素A缺乏的鵪鶉中，神經(jīng)管不能將神經(jīng)突延伸到外周中(Maden等，1996；Maden等，1998)。
這些神經(jīng)元對RA和所述受體激動劑的差別反應(yīng)對于其發(fā)育和/或生存需要類維生素A的胚胎組織和成體組織而言，可能具有某些重要性。為了激活不同的RAR/RXR和RXR/孤獨受體組合，在所述組織中可能存在不同的類維生素A。有許多產(chǎn)生RA的酶在發(fā)育期間表現(xiàn)出局部化的表達(McCaffery等，1992；Drager和McCaffery，1995；Godbout等，1996；Neiderreither等，1997；Ang和Duester，1997)，并且這些酶中每種酶可能產(chǎn)生不同的類維生素A，這一事實提供了對這種觀點的某些支持。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種新型類維生素A，例如在腸中發(fā)現(xiàn)的5，6-環(huán)氧視黃酸(McCormick等，1978)、負(fù)責(zé)鼠胚胎F9細胞分化的生物活性代謝物的4-氧代-視黃醇(Achkar等，1996)和在B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的14-羥基-4，14-倒視黃醇(retroretinol)(Buck等，1991)。
因此，所述胚胎能夠通過合成不同的類維生素A，調(diào)節(jié)神經(jīng)突向外生長的量。通過激活RARβ2/RXR異二聚體，可能發(fā)生神經(jīng)突向外生長，而通過激活RARγ/RXR異二聚體，可能終止神經(jīng)突向外生長。另外，神經(jīng)突向外生長的量可能受視黃酸量的調(diào)節(jié)。例如，在發(fā)育中的小鼠脊髓中，在臂和腰增大過程中有高濃度的類維生素A(McCaffery和Drager，1994)。這可能是神經(jīng)突必須通過大距離到達其最終目標(biāo)的四肢神經(jīng)支配的固有需要，而在類維生素A濃度較低的胸區(qū)，這類廣泛的神經(jīng)突向外生長可能不需要。實施例3的


圖1或者在NGF、NT-3或者BDNF存在下培養(yǎng)的E13.5小鼠胚胎DRG神經(jīng)元的RAR和RXR的表達。在原位雜交中A-F，NGF神經(jīng)元；G-L，NT-3神經(jīng)元；M-R，BDNF神經(jīng)元。表達A，G，M，RARα；B，H，N，RARβ；C，I，O，RARγ；D，J，P，RXRα；E，K，，RXRβ；F，L，R，RXRγ。
圖2 RA對來自DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長的影響。DRG神經(jīng)元在或者NGF、NT-3或者BDNF存在下培養(yǎng)2天，此時加入1×10-7M全反式RA。然后在總共5天后，用NF200抗體檢查它們的神經(jīng)突向外生長。A，NGF；B，NGF+1×10-7M RA；C，NT-3；D，NT-3+1×10-7M；E，BDNF；F，BDNF+1×10-7M RA。
圖3在有或沒有RA的情況下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中RARα同種型的表達。DRG神經(jīng)元在存在或者NGF、NT-3或者BDNF的情況下培養(yǎng)2天，然后加入1×10-7M RA，隨后通過RT-PCR分析RARα同種型的存在。對照不加入RA。A，對照NGF神經(jīng)元，1-7道；NGF神經(jīng)元+1×10-7M RA，8-14道。B，對照NT-3神經(jīng)元，1-7道；NT-3神經(jīng)元+1×10-7M RA，8-14道。C，對照BDNF神經(jīng)元，1-7道；BDNF神經(jīng)元+1×10-7M RA，8-14道。泳道1和8，RARα1；2和9，RARα2；3和10，RARα3；4和11，RARα4；5和12，RARα5；6和13，RARα6；7和14，RARα7。
圖4在有或沒有RA的情況下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中RARβ同種型的表達。DRG神經(jīng)元在存在或者NGF、NT-3或者BDNF的情況下培養(yǎng)2天，然后加入1×10-7M RA，隨后通過RT-PCR分析RARβ同種型的存在。對照不加入RA。A，對照NGF神經(jīng)元，1-4道；NGF神經(jīng)元+1×10-7M RA，5-8道。B，對照NT-3神經(jīng)元，1-4道；NT-3神經(jīng)元+1×10-7M RA，5-8道。C，對照BDNF神經(jīng)元，1-4道；BDNF神經(jīng)元+1×10-7M RA，5-8道。泳道1和5，RARβ1；2和6，RARβ2；3和7，RARβ3；4和8，RARβ4。
圖5在有或沒有RA的情況下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中RARγ同種型的表達。DRG神經(jīng)元在存在或者NGF、NT-3或者BDNF的情況下培養(yǎng)2天，然后加入1×10-7M RA，隨后通過RT-PCR分析RARγ同種型的存在。對照不加入RA。A，對照NGF神經(jīng)元，1-7道；NGF神經(jīng)元+1×10-7M RA，8-14道。B，對照NT-3神經(jīng)元，1-7道；NT-3神經(jīng)元+1×10-7M RA，8-14道。泳道1和8，RARγ1；2和9，RARγ2；3和10，RARγ3；4和11，RARγ4；5和12，RARγ5；6和13，RARγ6；7和14，RARγ7。
圖6 RAR和RXR激動劑對來自DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長的影響。DRG神經(jīng)元在或者NGF、NT-3或者BDNF存在下培養(yǎng)2天，此時將1×10-7M的或者CD366(RARα激動劑)、CD2019(RARβ激動劑)、CD437(RARγ激動劑)或者CD2809(泛(pan)-RXR激動劑)加入培養(yǎng)基中。5天時，培養(yǎng)物的神經(jīng)突向外生長用NF200抗體染色。A-D，NGF型神經(jīng)元；E-H，NT-3型神經(jīng)元；I-L，BDNF型神經(jīng)元。激動劑RARαA，E，I；RARβB，F(xiàn)，J；RARγC，G，K；RXR D，H，L。
圖7類維生素A激動劑對來自以下的神經(jīng)突長度的影響A.NGF型神經(jīng)元；B.NT-3型神經(jīng)元；C.BDNF型神經(jīng)元。柱1.無激動劑，2.RA，3.RARα，4.RARβ，5.RARγ，6.RXR。誤差范圍s.e.m.，n＝50。*p＜0.01。
圖8 RARγ激動劑或RARβ激動劑對在NGF或NT-3存在下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中RARγ1和RARβ2表達的表達影響。DRG神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)。2天后，將1×10-7M RARγ或RARβ激動劑加入培養(yǎng)物中達24小時。RT-PCR分析A，RARγ1；B，NGF型神經(jīng)元(1-3道)和NT-3型神經(jīng)元(4-6道)中的RARβ2表達。泳道1、4道，無激動劑；2、5道，RARγ激動劑；3、6道，RARβ激動劑。總結(jié)實施例證明RARβ2和/或其激動劑可以用來引起神經(jīng)突發(fā)育。
特別是，我們表明特別是應(yīng)用類維生素A，通過激活RARβ2，刺激外周神經(jīng)中神經(jīng)突的再生。
當(dāng)外周神經(jīng)損害時可以發(fā)生某些再生，這與表明不再生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)不同。然而，外周神經(jīng)的再生是有限的，特別是當(dāng)有創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷時，在所述損傷中神經(jīng)組織損失，使得產(chǎn)生再生中的神經(jīng)突不能生長跨過的缺口。這種神經(jīng)再生的延遲可以導(dǎo)致肌肉萎縮，和導(dǎo)致永久性殘廢。
對外周神經(jīng)損傷應(yīng)答，產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。有一個生長因子家族是多種神經(jīng)元生存所需的。該家族包括神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。人們希望神經(jīng)營養(yǎng)蛋白可以用來治療外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)損傷。然而，所述結(jié)果一直沒有得到支持。已經(jīng)遇到兩個主要問題，首先是傳遞至所述損傷的問題，其次是由于不同神經(jīng)元需要不同的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，需要給予所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的混合劑以使所有所述神經(jīng)再生。我們已經(jīng)研究了神經(jīng)營養(yǎng)蛋白如何刺激神經(jīng)突再生。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素A衍生物全反式視黃酸(tRA)與NGF一樣，誘導(dǎo)來自各種胚胎來源包括PNS的神經(jīng)突向外生長。tRA的細胞效應(yīng)通過與作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子的核受體結(jié)合而介導(dǎo)。有兩類受體-視黃酸受體(RAR)和類維生素A X受體(RXR)，每類有3個亞型α、β和γ。RAR受體通過與RXR形成異二聚體來介導(dǎo)基因表達，而RXR可以或者作為同二聚體或者通過與孤獨受體形成異二聚體來介導(dǎo)基因表達。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅RARβ2是我們已經(jīng)培養(yǎng)的所有類型神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長所需的。此外，當(dāng)將小鼠成體DRG在NGF和一個tRA合成抑制劑存在下培養(yǎng)時，不發(fā)生神經(jīng)突向外生長。相反，當(dāng)將tRA與NGF的封閉性抗體一起加入時，神經(jīng)突向外生長如通常一樣發(fā)生。我們也已經(jīng)表明，NGF誘導(dǎo)tRA合成酶RALDH-2和RARβ2兩者的轉(zhuǎn)錄以及合成的tRA的可檢測釋放。
我們提出RARβ2的刺激是外周神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)突再生的固有需求，并且關(guān)鍵是這是位于所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的下游。因此，關(guān)于外周神經(jīng)系統(tǒng)，我們要給予可以激活RARβ2受體的類維生素A，以讓神經(jīng)突再生。
我們已經(jīng)將我們的觀察擴展至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎脊髓表達RARβ2，并且其表達量與神經(jīng)突向外生長的量相關(guān)。相反，成體脊髓不表達RARβ2，也不能再生神經(jīng)突。我們已經(jīng)表明，通過利用缺陷型1型單純皰疹病毒(HSV-1)載體將RARβ2轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的成體脊髓中，我們已經(jīng)將通常惰性的脊髓轉(zhuǎn)化為可以延伸神經(jīng)突的脊髓。因此，我們提出用RARβ2對損傷的脊髓進行基因治療將導(dǎo)致功能恢復(fù)。
利用類維生素A治療PNS損傷應(yīng)該具有至少3個優(yōu)于應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的主要優(yōu)勢。首先，類維生素A與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白不同，是親脂小分子，它們可以容易地給予至損傷部位，因此再生應(yīng)該以比用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白所達到的快得多的速率發(fā)生，這應(yīng)該導(dǎo)致肌肉萎縮和隨后的麻痹的減少。其次，由于RARβ2的刺激對于我們已經(jīng)測試的所有神經(jīng)元的再生是關(guān)鍵性的，僅需要一種類型的類維生素A將避開給予神經(jīng)營養(yǎng)蛋白混合劑的需要。第三，與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白不同，類維生素A的合成相對容易。
用RARβ2治療CNS損傷的基因治療應(yīng)該導(dǎo)致功能恢復(fù)，并因此預(yù)防麻痹。
PNS和CNS損傷的發(fā)生遍及全世界，不幸的是，這類損傷發(fā)生率將要降低是不可能的。在世界范圍內(nèi)，一年每百萬人口1000個人患有脊髓損傷，10倍于此數(shù)目的人患有某些種類的PNS損傷。
另外，在三個其它領(lǐng)域中類維生素A可能具有應(yīng)用價值。在麻風(fēng)病、糖尿病和AIDS中發(fā)生神經(jīng)病(神經(jīng)突死亡)，這與PNS損傷相同。在麻風(fēng)和糖尿病中，已經(jīng)表明在兩種類型的患者皮膚中，都有導(dǎo)致疼痛感覺喪失的NGF的損失和可以導(dǎo)致潰瘍發(fā)生的炎癥。在AIDS患者中，感覺神經(jīng)病是HIV感染的最常見的效應(yīng)之一，已經(jīng)用NGF來治療這種疾病。
因此，我們提出RARβ2激動劑可以用來治療PNS損傷，包括與麻風(fēng)病、糖尿病和AIDS相關(guān)的神經(jīng)病。采用RARβ2的基因治療可以用來治療CNS損傷。
總之，我們的結(jié)果表明通過RARβ2的RA作用在來自某些神經(jīng)元類別的神經(jīng)突向外生長中的作用。
因此，本發(fā)明包括其中確定視黃酸受體RARβ2表達影響細胞或組織的神經(jīng)變性性疾病的治療方法。通過用RARβ2受體的激動劑治療或通過基因治療，即插入編碼該受體的核酸，可以達到這一目的。本發(fā)明也可以看作是將這些激動劑用于外周神經(jīng)損傷和脊髓再生(例如在截癱的情況下)的治療藥物中。
說明書中提及的所有出版物均通過引用結(jié)合到本文中。在不偏離本發(fā)明范圍和精神情況下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案進行了描述，但應(yīng)該理解，要求保護的本發(fā)明不應(yīng)該被過分限制于這類具體實施方案。實際上，對于生物化學(xué)、生物技術(shù)、化學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的所述模式的各種修改，將屬于以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。例如，用RARβ2拮抗劑的抑制劑取代某些或所有本發(fā)明的RARβ2和/或某些或所有本發(fā)明的RARβ2激動劑是可能的。
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序列表<110>King’s College London<120>因子<130>申請?zhí)朠CT/GB00/01211<140><141><160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>1tgtagctctc tgagcactc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>2tacgccttct tctttcccc 19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>3cttttataac cagaaccggg c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>4caagtagaag ccaggaaagt c 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>5ctaagaagac ccacacttct g 21<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>6aagtgaggtg aaaactggg 19<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>7ttcacagcct ggcataac 18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>8gagaaggaag tgagccatc 19<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>9tctctgtgca ttcctgcttt g 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>10tggacacatg actcactacc20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>11atgttctgtc agtgagtccc20<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>12gcatgtcaga ggacaactg 19<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>13agcctggaaa atgccatc 18<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>14ttacagcttc cttggacatg cc 22<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>15agatgctgag ccctagcttc20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>16ttactacgca gagccactgg20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>17ggaagatgga agagggaac 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>18caaatttact gggggttgg 19<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>19ggctggattt tggattgaag20<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>20ttctgtcctc tcactacctt gg 22<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>21cattaccgcg agtcactaac20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>22cgtagacaaa atggtgaagg20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>23gactccacga catactcagc20<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>24gcttcttcat tgacccac 18<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>25cttcaccgtc aggtctttac20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>26gcaaggaccg gaatgagaac20<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>27tctaggggca gctcagaaaa g 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>28agaataaagg ggtagtgaag g 21<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>29catcaatgtc cccacttg 18<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>30tgccagtagt agccacgaag20<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>31tgagcagttc attccaccc 19
權(quán)利要求
1.RARβ2和/或其激動劑的用途，所述用途是用于制備引起神經(jīng)突發(fā)育的藥物。
2.權(quán)利要求1的RARβ2和/或其激動劑的用途，其中所述激動劑是視黃酸(RA)和/或CD2019。
3.RARβ2和/或其激動劑的用途，所述用途是用于制備神經(jīng)性病癥的治療藥物。
4.權(quán)利要求3的RARβ2和/或其激動劑的用途，其中所述神經(jīng)性病癥包括神經(jīng)損傷。
5.一種治療神經(jīng)性病癥的方法，所述方法包括給予藥理學(xué)有效量的RARβ2受體和/或其激動劑。
6.一種權(quán)利要求5的方法，其中所述激動劑是RA和/或CD2019。
7.一種權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法，其中所述RARβ2受體通過包含RARβ2表達系統(tǒng)的一種實體給予。
8.一種引起受治療者神經(jīng)突發(fā)育的方法，所述方法包括提供一種能夠指導(dǎo)RARβ2受體的至少一部分表達的核酸構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體導(dǎo)入所述受治療者的一種或多種細胞中，并且任選地給予所述受治療者一種RARβ2激動劑，例如RA和/或CD2019。
9.一種藥用組合物，所述組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合的RARβ2和/或其激動劑；其中所述藥用組合物用來引起神經(jīng)突發(fā)育。
全文摘要
本發(fā)明涉及RARβ2和/或其激動劑在引起神經(jīng)突發(fā)育的藥物制備中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/38GK1355706SQ00808088
公開日2002年6月26日 申請日期2000年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者M·馬登, J·P·T·科科蘭 申請人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司