專利名稱：作為cdk2抑制劑的吡唑并苯并二氮的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能抑制依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(CDK)，特別是CDK2的新型吡唑并苯并二氮。這些化合物和它們藥物可接受的鹽以及所述化合物的前體為抗增生劑，被用于治療或控制細(xì)胞增生疾病，特別是癌癥。本發(fā)明還涉及含有這些化合物的藥物組合物，以及用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，特別是治療或控制實(shí)體腫瘤。本發(fā)明的化合物特別用于治療或控制乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。本發(fā)明還涉及用于制備上述抗增生劑的中間體。
不受控制的細(xì)胞增生是癌癥的特點(diǎn)。癌癥腫瘤細(xì)胞通常是直接或間接調(diào)控細(xì)胞分裂周期遺傳基因受到某種程度的損傷。
依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(CDK)是對控制細(xì)胞周期特別重要的酶。這些酶能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期不同階段間的轉(zhuǎn)變，如從G1階段進(jìn)化到S階段(活性DNA合成的時(shí)期)，或從G2階段進(jìn)化到M階段，在該階段出現(xiàn)有絲分裂和細(xì)胞分裂。
CDK由起催化作用的CDK亞基和起調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白亞基組成。細(xì)胞周期蛋白亞基是CDK活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，其中每種CDK與細(xì)胞周期蛋白特定的亞型相作用例如細(xì)胞周期蛋白A(CDK1，CDK2)。不同的激酶/細(xì)胞周期蛋白對調(diào)控細(xì)胞周期特定階段的進(jìn)程。
細(xì)胞周期控制系統(tǒng)失常暗示著癌細(xì)胞會不受控制地生長。能抑制CDK的化合物用作抗增生治療藥物已得到很多文獻(xiàn)的驗(yàn)證。
本發(fā)明涉及能抑制一種或多種CDK活性，特別是CDK2活性的吡唑并苯并二氮。這些化合物被用于治療癌癥，特別是實(shí)體腫瘤。具體地，本發(fā)明的化合物特別用于治療或控制乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。本發(fā)明還涉及用于制備上述抗增生劑的中間體。
本發(fā)明的化合物為下式I的化合物 其中R1為氫，-NO2，-CN，-鹵素，-OR5，-R6OR7，-COOR7，-CONR8R9，-NR10R11，-NHCOR12，-NHSO2R13，或任選被羥基和/或鹵素取代的直鏈低級烷基；R2和R4分別獨(dú)立為氫，-鹵素，-NO2，-CF3，或直鏈低級烷基；R3為氫，環(huán)烷基，芳基，雜環(huán)，雜芳基，-COOR7，-CN，烯基，-CONR8R9，炔基，或任選被羥基、-OR9、F和/或芳基取代的低級烷基；R5為任選被鹵素取代的低級烷基；R6為低級烷基；R7為氫或低級烷基；R8和R9分別獨(dú)立為氫或其本身任選被羥基和/或NH2取代的低級烷基；或者R8和R9可以形成任選被羥基、-NH2、和/或低級烷基取代的五元或六元雜環(huán)；R10、R11和R12分別獨(dú)立為氫或低級烷基；R13為任選被鹵素和/或-NR14R15取代的低級烷基；以及R14和R15分別獨(dú)立為氫或任選被鹵素取代的低級烷基；或者-NR14R15為雜環(huán)。
并且，本發(fā)明涉及式I化合物的前體藥物和藥物活性代謝物，以及上述化合物的藥物可接受的鹽。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及式I化合物、或式I化合物的前體藥物和藥物活性代謝物、以及上述化合物的藥物可接受的鹽作為藥物的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及含有藥物有效量的任何一種或多種上述化合物或其藥物可接受的鹽或前體藥物，和藥物可接受的載體或賦型劑。
本發(fā)明還涉及式I化合物、或式I化合物的前體藥物和藥物活性代謝物、以及上述化合物的藥物可接受的鹽在制備用于治療實(shí)體腫瘤，具體是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌，更具體是乳腺癌或結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。
在本文中，下列術(shù)語具有如下定義。
“芳基”指具有5至10個(gè)原子并由1或2個(gè)環(huán)組成的芳香基。芳基的例子包括苯基和1-或2-萘基。
“烯基”指含有雙鍵的具有2-6個(gè)碳原子，優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、取代或未取代的脂肪族不飽和烴。典型的烯基包括乙烯、丙烯、異丙烯、丁烯等。優(yōu)選的烯基為直鏈烯基。
“炔基”指含有叁鍵的具有2-6個(gè)碳原子，優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、取代或未取代的脂肪族不飽和烴。典型的烯基包括乙炔等。優(yōu)選的炔基為直鏈炔基。
“環(huán)烷基”指含有3至8個(gè)原子的非芳香的部分或完全飽和的環(huán)狀脂肪烴。環(huán)烷基的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
“有效量”指至少一種式I化合物或其藥物可接受的鹽、前體藥物或代謝物的量，其能夠明顯抑制包括人腫瘤細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞的增生。
“鹵素”指氟，氯，溴或碘。優(yōu)選的鹵素為氟和氯。
“雜芳基”是具有5至10個(gè)原子、1或2個(gè)環(huán)、并含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的芳香基。雜芳基的例子有2-、3-或4-吡啶基，四唑基，噁二唑基，吡嗪基，喹啉基，吡咯基和咪唑基。
“雜原子”指選自N、O和S的原子。
“雜環(huán)”指3-至10-元非芳香的部分或完全飽和的烴基，如四氫喹啉基，其含有一個(gè)或兩個(gè)環(huán)，至少一個(gè)雜原子。
“IC50”指抑制50％的具體測定的活性所需要的特定的吡唑并苯并二氮的濃度，IC50尤其可以采用下文實(shí)施例4所描述的方法所測定。
“低級烷基”指具有1至6個(gè)、優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、取代或未取代的飽和脂肪烴。典型的低級烷基包括甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，2-丁基，戊基，己基等。
“藥物可接受的鹽”指保留了式I化合物的生物效力和性質(zhì)，并與合適的非毒性有機(jī)或無機(jī)酸或有機(jī)或無機(jī)堿形成的常規(guī)酸加成鹽或堿加成鹽。酸加成鹽的例子包括從無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、氨磺酸、磷酸和硝酸衍生的鹽，和從有機(jī)酸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸等衍生的鹽。堿加成鹽的例子包括從銨、鉀、鈉和季銨的氫氧化物(例如氫氧化四甲基銨)衍生的鹽。
“藥學(xué)上可接受的”如藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、前體藥物等，指藥理學(xué)上可接受的、并對給藥具體化合物的患者基本上無毒性。
“藥學(xué)活性代謝物”指藥學(xué)上可接受并且有效的式I化合物的代謝產(chǎn)物。
“前體藥物”指在生理?xiàng)l件下或通過溶劑分解可以轉(zhuǎn)化為任何式I化合物或轉(zhuǎn)化為式I化合物的藥物可接受的鹽的化合物。當(dāng)對患者給藥時(shí)，前體藥物可以是無活性的，但其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為式I的活性化合物。
“取代的”如取代的烷基，除非另外說明，指取代基可以在一個(gè)或多個(gè)位置存在，在每個(gè)位置取代基獨(dú)立地選自具體的選項(xiàng)?；衔镌谝粋€(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有下式的化合物 和式I化合物的前體藥物和藥物活性代謝物，以及上述化合物的藥物可接受的鹽，其中R1至R15如上所定義。
在式I化合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R1為氫，NO2，CN，CONH2，鹵素或未取代的低級烷基。優(yōu)選的低級烷基為甲基和乙基。更優(yōu)選地，R1為NO2，CN，或CONH2。R1優(yōu)選在7-位或8-位。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R1在2’位，為氫或鹵素。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R3為未取代的低級烷基，羥基低級烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)，或雜芳基。優(yōu)選的低級烷基為甲基、乙基和羥基甲基。優(yōu)選的環(huán)烷基為未取代的C3-C5。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R4在4’位，為氫或鹵素，更優(yōu)選R4為氫。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R5和R6獨(dú)立為甲基或乙基，它們每一個(gè)可以任選被鹵素取代。更具體地，R5為三氟甲基。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R7為氫、甲基或乙基。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R8和R9分別獨(dú)立為氫、甲基、乙基或羥乙基。當(dāng)R8和R9形成雜環(huán)時(shí)，優(yōu)選的雜環(huán)基團(tuán)為六元、未取代、最優(yōu)選包括兩個(gè)雜原子的基團(tuán)。最優(yōu)選的雜原子選自O(shè)和N。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R10、R11和R12分別獨(dú)立為氫、甲基或乙基。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R13為可以任選被鹵素取代的低級烷基，最優(yōu)選R13為甲基、乙基或三氟甲基。
在式I化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R14和R15分別獨(dú)立為氫、甲基、乙基或雜環(huán)。優(yōu)選的雜環(huán)為包括至少一個(gè)氮原子的3-7元環(huán)。
下列的中間體也是按照本發(fā)明的其它優(yōu)選化合物的例子 其中R1、R2和R4如上所定義。 其中，在以上各式中，每個(gè)R1、R2、R3和R4如上文所定義。這些中間體用于合成式I化合物。
本文公開的和通過上式所包括的化合物可以表現(xiàn)出互變異構(gòu)或結(jié)構(gòu)異構(gòu)現(xiàn)象。本發(fā)明還包括這些化合物的任何互變異構(gòu)或結(jié)構(gòu)異構(gòu)型，或者這些異構(gòu)型的混合物，并且不限于以上結(jié)構(gòu)式所示的任何一種互變異構(gòu)或結(jié)構(gòu)異構(gòu)型。式I化合物的合成本發(fā)明的化合物可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備。在實(shí)施例中給出了用于合成這些化合物的適當(dāng)方法。一般地，這些化合物可以按照下面給出的合成路線進(jìn)行制備。
合成路線1R3＝H a)Lawesson試劑反應(yīng)(已知的對于大多數(shù)取代基的反應(yīng))b)與Me2N-CH(OEt)2反應(yīng)c)與肼反應(yīng)。
化合物可以通過商業(yè)來源獲得，或通過本領(lǐng)域公知的方法合成。
合成路線2R3不為H a)Lawesson試劑反應(yīng)(已知對于大多數(shù)取代基的反應(yīng))d)在堿存在下、優(yōu)選在哌啶存在下與R3-CHO反應(yīng)c)與肼反應(yīng)e)二氫吡唑氧化成吡唑(在空氣中、DMSO、RT-150℃的條件下，或在空氣和堿(Cs2CO3/DMF)存在下)。
合成路線2R3不為H的其它合成路線 a)Lawesson試劑反應(yīng)(已知對于大多數(shù)取代基的反應(yīng))f)在堿、優(yōu)選在二氮雜雙環(huán)十一碳烷或2，2，6，6-四甲基哌啶存在下，與R3-CHO反應(yīng)g)通過弱酸處理(對甲苯磺酸吡啶鎓、醋酸吡啶鎓等)或在吡啶存在下與三甲基氯硅烷回流，進(jìn)行脫水c)與肼反應(yīng)e)二氫吡唑氧化成吡唑(在空氣中、DMSO、室溫-150℃的條件下，或在空氣和堿(Cs2CO3/DMF)存在下)。
反應(yīng)路線4R1或R3官能團(tuán)的轉(zhuǎn)變 其中R1’可以是如上述定義的R1的任何基團(tuán)，同樣地，其中R3’可以是如上述定義的R3的任何基團(tuán)。
如上面反應(yīng)路線4所示例，應(yīng)用已知方法通過對已存在的官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，可以獲得幾種取代基。例如，當(dāng)所需的R1＝NH2，該取代可以通過還原相應(yīng)的硝基獲得。同樣地，當(dāng)所需的R1＝NHR’(其中R’＝-COR12，-SO2R13，或-R10R11)，該取代可以通過相應(yīng)的R1＝NH2化合物與酸性鹵化物或酸酐反應(yīng)獲得。當(dāng)所需的R1＝CONRR”(其中R＝氫或低級烷基，R”＝低級烷基)，該取代可以通過在鈀催化劑存在下，R1＝I的相應(yīng)化合物與一氧化碳和伯或仲胺反應(yīng)獲得。
另外，如果起始原料中的R3為CO2Et，標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)修飾可以用于制備具有下式相應(yīng)R3基團(tuán)的化合物CH2OH(還原)；CHO(部分還原)；CH2NMe2(醛的還原氨化)；CH2OMe(醇的烷化)；CH＝CH2(醛的烯化)；CONRR”(其中R＝H或低級烷基，R”＝H或低級烷基，與相應(yīng)的胺HNRR”進(jìn)行氨解，其中R＝H或低級烷基，R”＝H或低級烷基)；CONHNHR(其中R＝H、低級烷基或芳基)(肼解-與肼反應(yīng))；CN(酰胺CONH2的脫水)。
在上述反應(yīng)路線中，化合物1可以商業(yè)購買，例如從Sigma購買，或者通過本領(lǐng)域公知的方法容易地合成。因此，化合物2可以通過Sternbach等J.Org.Chem.29231(1964)的方法或通過與Lawesson試劑進(jìn)行反應(yīng)，從相應(yīng)的內(nèi)酰胺(化合物1)制備。組合物/配方在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述組合物包括至少一種式I化合物或其前體藥物，或者式I化合物或其前體藥物的藥物可接受的鹽。
這些組合物可以口服給藥，例如以片劑、包衣片、糖衣丸、硬或軟明膠膠囊、溶液劑、乳劑、混懸液的的形式。它們還可以直腸給藥，例如以栓劑的形式，或非胃腸給藥，例如以注射液的形式。
包含式I化合物、這類化合物的前體藥物或其鹽的本發(fā)明藥物組合物可以用本專業(yè)已知的方法生產(chǎn)，例如通過常規(guī)混合、制膠囊、溶解、制粒、乳化、捕集、制糖丸、或凍干法制備。這些藥物制劑可以用治療惰性的無機(jī)或有機(jī)載體配制。乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽可以用作片劑、包衣片劑、糖丸和硬膠囊的載體。軟膠囊的合適載體有植物油、蠟、脂肪。根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，在軟膠囊的情況下通常不用載體。生產(chǎn)溶液劑或糖漿所用的載體是水、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖和葡萄糖。注射液的合適載體是水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂和表面活性劑。栓劑的合適載體是天然或硬化的油、蠟、脂肪和半固體多元醇。
該藥物制劑還可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、調(diào)味劑、改變滲透壓的鹽、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。它們也可以含有其它有治療價(jià)值的物質(zhì)，包括式I化合物之外的其它活性成分。劑量如上所述，式I化合物、其前體藥物、和其鹽、以及含有這些化合物的藥物組合物用于治療或控制細(xì)胞增生疾病，特別是腫瘤疾病。這些化合物和含有所述化合物的配方特別治療或控制實(shí)體腫瘤，如例如乳腺癌和結(jié)腸癌。
按照本發(fā)明化合物的治療有效量指能夠有效預(yù)防、減緩或改善被治療患者疾病癥狀或延長治療患者生存時(shí)間的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定治療有效量。
式I化合物的治療有效量或劑量可以在很寬的限制內(nèi)變化，并可以在各種具體情況下根據(jù)個(gè)體需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般說來，在對體重約70kg的成人口服或腸胃外給藥的情況下，日劑量約10mg至約10000mg，優(yōu)選約200mg至約1000mg將是合適的，盡管當(dāng)特殊情況時(shí)上限可以被超過。日劑量可以分單劑量或多劑量給藥，或者對于腸胃外給藥，可以連續(xù)灌注。
在下列實(shí)施例中，在ppm水平給出了相對于四甲基硅烷的NMR數(shù)據(jù)，溶劑和光譜數(shù)據(jù)如下所述。實(shí)施例1按照反應(yīng)路線1制備的吡唑步驟a內(nèi)酰胺(化合物1)與Lawesson試劑反應(yīng)，制備硫代內(nèi)酰胺(Thiolactam)(化合物2)1.1化合物A1R1＝H，R1＝F，R4＝H在75℃下，向5.085g(20mmol)內(nèi)酰胺1(其中R1＝H，R1＝F，R4＝H)的50mL二甲氧基乙烷中，加入8.9g(22mmol)Lawesson試劑(2，4-雙(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫代-2，4-二phosphetane-2，4-二硫化物；Pedersen，B.S.；Scheibye，S.；Nilsson，N.H.；Lawesson，S.-O.，Bull.Soc.Chim.Belg.，1978，87223.)。將混合物攪拌30分鐘，冷卻，倒入10％碳酸氫鈉水溶液中。將該水性混合物用二氯甲烷萃取，將萃取液用水洗滌，無水硫酸鈉干燥，在減壓下過濾并濃縮。將殘?jiān)诙燃淄?甲醇中重結(jié)晶，得到4.0g化合物A1(硫代內(nèi)酰胺2)。
1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.56(s，1H，NH)，7.10-7.65(in，8H)，4.59(s，2H)。1.2化合物A2R1＝F，R2＝R4＝H化合物A2按照與上述制備化合物A1相同的方法進(jìn)行制備。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.50(s，1H，NH)，7.37-7.56(m，7H)，7.06(dd，J＝3，9 Hz，1H)，4.60(br s，2H)。步驟b硫代內(nèi)酰胺2與DMF乙縮醛反應(yīng)，制備二甲基氨基亞甲基衍生物31.3化合物A3R1＝Cl，R2＝Cl，R4＝H0.999g(3.1mmol)硫代內(nèi)酰胺2(R1＝Cl，R2＝Cl，R4＝H)的10mL四氫呋喃和10mL二甲基甲酰胺二乙基乙縮醛的溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。在減壓下除去揮發(fā)物，留下桔紅色固體殘?jiān)?。從己?乙酸乙酯中結(jié)晶，得到0.716g化合物A3(衍生物3，其中R1＝Cl，R2＝Cl，R4＝H)，其為紅色固體，mp 196～198℃1H nmr(DMSO-d6，400mHz)10.21(s，1H)，7.84(s，1H)，7.43-7.56(m，4H)，7.32(dd，J＝3，9Hz，1H)，7.00(d，J＝9Hz，1H)，6.60(d，J＝3Hz，1H)，3.27(s，6H)。步驟c二甲基氨基亞甲基衍生物3轉(zhuǎn)化為吡唑41.4化合物A4R1＝Cl，R2＝Cl，R3＝R4＝H5-(2-氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮向0.265g(0.71mmol)在10mL干燥二氯甲烷的溶液中加入大約39.8毫升(1.27mmole)無水肼。將混合物在氬氣下攪拌85分鐘，然后溶在二氯甲烷中，用水洗滌，無水硫酸鈉干燥，在減壓下過濾并濃縮，得到0.219g化合物A4(吡唑，其中R1＝Cl，R2＝Cl，R4＝H)棕褐色固體。分析樣品通過薄層硅膠過濾，用乙酸乙酯洗脫，然后在乙酸乙酯中重結(jié)晶。mp＞300℃1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.07(s，1H，NH)，8.03(s，1H，NH)，7.58(s，1H)，7.4-7.5(m，4H)，7.17(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.79(d，J＝9Hz，1H)，6.25(s，1H)。
下列吡唑(化合物4)按照上述合成路線1步驟a-c所描述進(jìn)行制備1.5化合物A5R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝H，R4＝H5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)9.16(s，1H，NH)，7.90(dd，J＝2，8Hz，1H)，7.4-7.6(m，5H)，7.08(d，J＝2Hz，1H)，6.75(d，J＝8Hz，1H).1.6化合物A6R1＝Cl，R2＝H，R3＝H，R4＝H5-苯基-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，200mHz)7.97(s，1H，NH)，7.62(s，1H)，7.35-7.60(m，5H)，7.29(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.93(d，J＝9Hz，1H)，6.60(d，J＝2Hz，1H).1.7化合物A7R1＝Cl，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.10(s，1H，NH)，8.01(s，1H)，7.60(s，1H)，7.5(m，2H)，7.18-7.33(m，3H)，6.83(d，J＝8Hz，1H)，6.47(s，1H).1.8化合物A8R1＝Cl，R2＝Cl，R3＝H，R4＝Cl5-(2，4-二氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.09(s，1H，NH)，8.05(s，11H，NH)，7.68(s，1H)，7.56(s，1H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)，7.48(d，J＝10Hz，1H)，7.19(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H)，6.27(d，J＝2Hz，1H).1.9化合物A9R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H5-苯基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.04(s，1H)，7.77(s，1H)，7.58(s，1H)，7.32-7.47(m，5H)，7.22(dt，J＝2，8Hz，1H)，6.92(d，J＝8Hz，1H)，6.76(d，J＝8Hz，1H)，6.67(dd，J＝1，8Hz，1H).1.10化合物A10R1＝H，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，200mHz)12.00(s，1H，NH)，7.79(s，1H)，7.32-7.56(m，3H)，7.00-7.32(m，3H)，6.78(d，J＝6Hz，1H)，6.64(t，J＝6Hz，1H)，6.48(d，J＝6Hz，1H).1.11化合物A11R1＝F，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，200mHz)12.10(s，1H，NH)，7.85(s，1H)，7.4-7.7(m，3H)，7.18-7.39(m，2H)，7.05(m，1H)，6.86(m，1H)，6.26(br d，J＝8Hz，1H).1.12化合物A12R1＝CH3O，R2＝Cl，R3＝H，R4＝H5-(2-氯苯基)-7-甲氧基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，200mHz)12.00(s，1H，NH)，7.35-7.60(m，5H)，6.81(d，J＝8Hz，1H)，6.75(d，J＝8Hz，1H)，5.89(s，1H)，3.46(s，3H).1.13化合物A13R1＝NO2，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.14(s，1H，NH)，9.06(s，1H，NH)，7.89(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.4-7.5(m，2H)，6.76(d，J＝9Hz，1H).1.14化合物A14R1＝CH3SO2，R2＝H，R3＝H，R4＝H5-苯基-甲磺?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.18(s，1H，NH)，8.54(s，1H，NH)，7.72(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.43(m，5H)，7.14(d，J＝2，Hz，1H)，7.06(d，J＝9Hz，1H)，3.01(s，3H).1.15化合物A15R1＝CN，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-氰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.16(s，1H，NH)，8.63(s，1H，NH)，7.59(s，1H)，7.4-7.58(m，3H)，7.2-7.37(m，2H)，6.82(dd，J＝2，8Hz，1H)，6.78(s，1H).1.16化合物A16R1＝NO2，R2＝H，R3＝H，R4＝H5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.19(s，1H，NH)，8.96(s，1H，NH)，8.03(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.35-7.5(m，6H)，6.94(d，J＝9Hz，1H).1.17化合物A17R1＝NO2，R2＝CF3，R3＝H，R4＝H5-(2-三氟甲基苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.12(s，1H，NH)，9.18(s，1H，NH)，7.45-7.9(m，6H)，7.00(s，1H)，6.71(d，J＝9Hz，1H).1.18化合物A18R1＝CO2CH3，R2＝H，R3＝H，R4＝H5-苯基-7-甲氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.15(s，1H，NH)，8.42(s，1H，NH)，7.78(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.35-7.45(m，5H)，7.29(d，J＝2 Hz，1H)，6.93(d，J＝9Hz，1H)，3.66(s，3H).1.19化合物A19R1＝I，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.09(s，1H，NH)，7.99(s，1H，NH)，7.58(s，1H)，7.4-7.55(m，3H)，7.19-7.35(m，2H)，6.76(s，1H)，6.62(d，J＝8Hz，1H).1.20化合物A20R1＝CO2Et，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-乙氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.08(s，1H，NH)，8.50(s，1H，NH)，7.62(d，J＝8Hz，1H)，7.57(s，1H)，7.4-7.5(m，2H)，7.18-7.35(m，2H)，7.14(s，1H)，6.80(d，J＝8Hz，1H)，4.15(q，J＝6Hz，2H)，1.17(t，J＝6Hz，3H).1.21化合物A21R1＝H，R2＝Cl，R3＝H，R4＝H5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.95(s，1H)，8.40(s，1H)，7.84(s，1H)，7.53(s，1H)，7.38-7.48(m，4H)，7.09(t，J＝8Hz，1H)，6.78(d，J＝8Hz，1H)，6.61(t，J＝8Hz，1H)，6.34(d，J＝8Hz，1H).實(shí)施例2按照合成路線2和3將硫代內(nèi)酰胺2轉(zhuǎn)化成取代的吡唑72.1化合物B1R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝吡咯基，R4＝H；合成路線23-(2-吡咯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮0.995g(3mmol)硫代內(nèi)酰胺2(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝吡咯基，R4＝H)、0.571g(6mmol)吡咯-2-醛、0.383g(4.5mmol)(Aldrich)哌啶和10mL二甲氧基乙烷的混合物氬氣下攪拌2小時(shí)。將混合物置于乙酸乙酯中，連續(xù)用0.1M硫酸、水和鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓下濃縮。通過硅膠色譜分離相應(yīng)的烯烴(用己烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脫)紅色固體(0.309g)，直接用于下一步。將烯烴5(0.309g)溶解于6mL二甲亞砜中，在氬氣下與72.5mg(2.2mmol)肼反應(yīng)。20分鐘后，將混合物置于乙酸乙酯中，連續(xù)用水和鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓下濃縮，得到二氫吡唑6(0.296g)。將6的混合物溶解于二甲亞砜中，在空氣中130℃下加熱2小時(shí)，冷卻，置于乙酸乙酯中，連續(xù)用水和鹽水洗滌。萃取物用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓下濃縮。通過硅膠色譜(用己烷/乙酸乙酯25/75洗脫)純化產(chǎn)物化合物B1。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.12(s，1H，NH)，10.39(s，1H，NH)，9.07(s，1H，NH)，7.96(dd，J＝2，8Hz，1H)，7.4-7.65(m，4H)，7.15(d，J＝2Hz，1H)，6.90(s，1H)，6.79(d，J＝8Hz，1H)，6.48(s，1H)，6.12(d，J＝2Hz，1H).2.2化合物B2R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CO2Et，R4＝H；合成路線33-乙氧甲?；?5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮5.0g(15.1mmol)硫代內(nèi)酰胺2(R1＝NO2，R2＝Cl)、6mL 50％乙醛酸乙酯的甲苯溶液、4.5mL(31mmol)二氮雜雙環(huán)十一碳烷和100mL二甲氧基乙烷的混合物氬氣、室溫下攪拌30分鐘。將混合物用0.005 M H2SO4酸化，乙酸乙酯萃取。得到的萃取物用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓下濃縮。通過硅膠色譜(用己烷/乙酸乙酯60/40洗脫)洗脫，得到非對映異構(gòu)體的混合物(5.6g)羥醛加成物8。
將4.7g(10.8mmol)上面得到的羥醛加成物8、100mL吡啶和6.9mL(54.4mmol)三甲基氯硅烷的混合物在室溫下攪拌10分鐘，然后在120℃下加熱1.5小時(shí)。將混合物冷卻，加入到1L乙酸乙酯中，連續(xù)用水和鹽水洗滌。乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥。在減壓下過濾和蒸發(fā)掉揮發(fā)性物質(zhì)后，通過硅膠過濾粗品殘?jiān)?，用己?乙酸乙酯(1∶1)洗脫，得到4.3g烯烴5。
將上述得到的4.3g烯烴5的210mL二氯甲烷溶液用0.68mL(21.6mmol)無水肼攪拌30分鐘。然后將混合物置于水中分配，水相用二氯甲烷萃取。合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓下過濾和濃縮。將二氫吡洛6的混合物中含有的殘?jiān)芙庥?0mL二甲亞砜中，在空氣中130℃下加熱3小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻，加入到乙酸乙酯中，用水洗滌。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)層，減壓下過濾和濃縮。通過硅膠色譜分離產(chǎn)物，己烷/乙酸乙酯(40/60)洗脫，得到0.580g化合物B2(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CO2Et，R4＝H)。1H nmr(DMSO-d6，400mHz)13.33(s，1H)，9.15(s，1H)，8.02(dd，J＝2，9Hz，11-1)，7.46-7.55(m，4H)，7.18(d，J＝2Hz，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，4.25(q，J＝7Hz，2H)，1，27(t，J＝7Hz，3H).
按照上述合成路線2或3制備下列吡唑(化合物7)2.3化合物B3R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.85(s，1H，NH)，9.04(s，1H，NH)，7.83(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.39-7.52(m，4H)，7.05(d，J＝2Hz，1H)，6.69(d，J＝9Hz，1H)，1.98(s，3H).2.4化合物B4R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2CH3，R4＝H；(合成路線2)3-乙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.91(s，1H，NH)，9.05(s，1H，NH)，7.85(dd，J＝2，8Hz，1H)，7.35-7.58(m，4H)，7.04(d，J＝2Hz，1H)，6.71(d，J＝8Hz，1H)，2.41(q，J＝7Hz，2H)，1.06(t，J＝7Hz，3H).2.5化合物B5R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2CH2Ph，R4＝H；(合成路線2)3-(2-苯基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，200mHz)11.95(s，1H，NH)，9.05(s，1H，NH)，7.82(dd，J＝2，8Hz，1H)，7.05-7.60(m，10H)，6.70(d，J＝8Hz，1H)，2.82(m，2H)，2.64(m，2H).2.6化合物B6R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝i-Pr，R4＝H；(合成路線2)3-(1-甲基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.90(s，1H，NH)，9.02(s，1H，NH)，7.84(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.35-7.55(m，4H)，7.04(d，J＝2Hz，1H)，6.74(d，J＝9Hz，1H)，2.86(sept，j＝9Hz，1H)，1.14(d，J＝9Hz，6H).2.7化合物B7R1＝CN，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-腈1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.05(s，1H，NH)，8.55(s，1H，NH)，7.45(m，3H)，7.25(m，2H)，6.78(d，J＝8Hz，1H)，6.71(s，1H)，2.03(s，3H).2.8化合物B8R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2Ph，R4＝H；(合成路線2)3-(苯基甲基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.08(s，1H，NH)，9.08(s，1H)，7.85(d，J＝9Hz，1H)，7.40-7.56(m，4H)，7.16-7.34(m，5H)，7.06(brs，1H)，6.71(d，J＝9Hz，11H)，3.71(s，2H).2.9化合物B9R1＝CO2Et，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-乙氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.81(s，1H)，8.37(s，1H)，7.59(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.39-7.51(m，2H)，7.16-7.31(m，2H)，7.09(s，1H)，6.74(d，J＝9HZ，1H)，4.08(q，J＝7Hz，2H)，2.04(s，3H)，1.12(t，J＝7Hz，3H).2.10化合物B10R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝5-(4-Me)-吡唑基，R4＝H；(合成路線2)3-(4-甲基吡唑-5-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.58(s，1H)，9.26(s，1H)，8.75(brs，1H)，7.95(d，J＝8Hz，1H)，7.42-7.6(m，5H)，7.12(s，1H)，6.81(d，J＝8Hz，1H)，2.32(s，3H).2.11化合物B11R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2-iPr，R4＝H；(合成路線2)3-(2-甲基丙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)11.91(s，1H)，9.06(s，1H)，7.87(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.4-7.56(m，4H)，7.08(d，J＝2Hz，1H)，6.74(d，J＝9Hz，1H)，2.28(d，J＝7Hz，2H)，1.89(n，J＝7Hz，1H)，0.88(d，J＝7Hz，6H).2.12化合物B12R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CF3，R4＝H；(合成路線3)3-三氟甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(CDCl3+DMSO-d6，300mHz)7.98(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.2-7.6(m，6H)，7.02(br s，1H)，6.62(d，J＝9Hz，1H).2.13化合物B13R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝1-噻唑基，R4＝H；(合成路線3)3-(1-噻唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)13.08(s，1H)，9.21(s，1H)，7.88-7.92(m，2H)，7.84(d，J＝3Hz，1H)，7.42-7.62(m，4H)，7.12(d，J＝2Hz，1H)，6.79(d，J＝8Hz，1H).2.14化合物B14R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝4-咪唑基，R4＝H；(合成路線2)3-(4-咪唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.33(s，1H)，12.29(s，1H)，9.07(s，1H)，7.90(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.76(S.1H)，7.44-7.63(m，4H)，7.35(s，1H)，7.11(d，J＝2Hz，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H).2.15化合物B15R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝2-吡唑基，R4＝H；(合成路線2)3-(2-吡唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)13.11(s，1H)，12.48(s，1H)，9.12(s，1H)，7.93(d，J＝9Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.39-7.60(m，4H)，7.11(s，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H)，6.59(s，1H).2.16化合物B16R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝3-吡唑基，R4＝H；(合成路線2)3-(3-吡唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)13.09(s，1H)，12.31(s，1H)，9.13(s，1H)，7.80-8.05(m，4H)，7.40-7.62(m，3H)，7.13(s，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H).2.17化合物B17R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH(Me)CH2Me，R4＝H；(合成路線2)3-(1-甲基丙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.90(s，1H)，9.04(s，1H)，7.85(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.38-7.55(m，4H)，7.05(d，J＝2Hz，1H)，6.72(d，J＝9Hz，1H)，2.65(m，1H)，1.52(m，2H)，1.13(d，J＝7Hz，3H)，0.79(t，J＝8Hz，3H).2.18化合物B18R1＝MeO，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-甲氧基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.69(s，1H)，7.34-7.50(m，5H)，6.77(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.72(d，J＝9Hz，1H)，5.86(d，J＝9Hz，1H)，5.86(d，J＝2Hz，1H)，3.44(s，3H)，2.05(s，3H).2.19化合物B19R1＝Cl，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)11.85(s，1H)，7.90(s，1H)，7.46-7.52(m，2H)，7.39-7.44(m，3H)，7.29(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.92(d，J＝9Hz，1H)，6.62(d，J＝2Hz，1H)，2.16(s，3H).2.20化合物B20R1＝Cl，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.78(s，1H)，7.95(s，1H)，7.38-7.55(m，4H)，7.17(dd，J＝2，9Hz，1H)，6.75(d，J＝9Hz，1H)，6.22(d，J＝2Hz，1H)，2.03(s，3H).2.21化合物B21R1＝H，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.75(s，1H)，7.69(s，1H)，7.36-7.52(m，2H)，7.04-7.30(m，3H)，6.77(d，J＝8Hz，1H)，6.63(t，J＝8Hz，1H)，6.50(d，J＝8Hz，1H)，2.07(s，3H).2.22化合物B22R1＝F，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.85(s，1H)，7.70(s，1H)，7.46-7.55(m，2H)，7.35-7.43(m，2H)，7.11(dt，J＝3，9Hz，1H)，6.92(dd，J＝5，9Hz，1H)，6.41(dd，J＝3，10Hz，1H)，2.14(s，3H).2.23化合物B23R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝苯基，R4＝H；(合成路線2)3-苯基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.65(s，1H)，9.18(s，1H)，7.95(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.78(d，J＝8Hz，2H)，7.32-7.63(m，7H)，7.14(d，J＝2Hz，1H)，6.85(d，J＝9Hz，1H).2.24化合物B24R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝正丙基，R4＝H；(合成路線2)3-丙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)11.91(s，1H)，9.06(s，1H)，7.86(d，J＝8Hz，1H)，7.41-7.53(m，4H)，7.08(s，1H)，6.72(d，J＝8Hz，1H)，2.38(t，J＝8Hz，2H)，1.54(tq，J＝8，7Hz，2H)，0.88(t，J＝7Hz，3H).2.25化合物B25R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝環(huán)丙基，R4＝H；(合成路線2)3-環(huán)丙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，400mHz)11.72(s，1H)，9.05(s，1H)，7.87(dd，J＝2，9Hz，51H)，7.41-7.55(m，4H)，7.08(d，J＝2Hz，1H)，6.72(d，J＝9Hz，1H)，1.79(p，J＝7Hz，1H)，0.88(d，J＝7Hz，4H).2.26化合物B26R1＝F，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.82(s，1H)，7.76(s，1H)，7.41-7.58(m，2H)，7.18-7.35(m，2H)，7.05(dt，J＝3，9Hz，1H)，6.84(dd，J＝6，9Hz，1H)，6.25(dd，J＝3，9Hz，1H)，2.08(s，3H).2.27化合物B27R1＝NO2，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮2.28化合物B28R1＝H，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.78(s，1H)，7.66(s，1H)，7.47(m，2H)，7.39(m，3H)，7.20(dt，J＝1，8Hz，1H)，6.88(d，J＝8Hz，1H)，6.75(t，J＝8Hz，1H)，6.68(dt，J＝1，8Hz，1H)，2.14(s，3H).2.29化合物B29R1＝I，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.81(s，1H)，7.90(s，1H)，7.39-7.57(m，3H)，7.18-7.36(m，2H)，6.75(s，1H)，6.59(d，J＝9Hz，1H)，2.07(s，3H).2.30化合物B30R1＝H，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮2.31化合物B31R1＝NO2，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.90(s，1H)，9.00(s，1H)，7.87(dd，J＝3，9Hz，1H)，7.47(m，21-1)，7.18-7.32(m，3H)，6.73(d，J＝9Hz，1H)，2.02(s，3H).2.32化合物B32R1＝Cl，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.81(s，1H)，7.96(s，1H)，7.40-7.55(m，2H)，7.17-7.32(m，3H)，6.79(d，J＝9Hz，1H)，6.42(s，1H)，2.08(s，3H).2.33化合物B33R1＝I，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.82(s，1H)，7.85(s，1H)，7.36-7.55(m，6H)，6.91(d，J＝2Hz，1H)，6.70(d，J＝9Hz，1H)，2.15(s，3H).2.34化合物B34R1＝Br，R2＝H，R3＝CH3，R4＝H；(合成路線2)3-甲基-5-苯基-7-溴-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)7.89(s，1H)，7.49(m，2H)，7.38(m，4H)，6.85(d，J＝9Hz，1H)，6.74(d，J＝2Hz，1H)，2.15(s，3H).2.35化合物B35R1＝CN，R2＝F，R3＝-CH2OH，R4＝H；(合成路線2)3-羥基甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-腈實(shí)施例3按照合成路線4進(jìn)行官能團(tuán)修飾參照上述合成路線4，通過現(xiàn)有官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化，可以很容易地得到某些化合物。下面進(jìn)一步舉例描述了一些官能團(tuán)轉(zhuǎn)化。A.碘被羰基取代R1＝I到R1＝CONRR’3.1化合物C1R1＝CON(-CH2CH2-O-CH2CH2-)，R2＝F，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-嗎啉基羰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮攪拌0.0712g(0.17mmol)吡唑4(R1＝I，R2＝F，R3＝H，R4＝H)、0.0082g(0.0012mmol)雙三苯膦二氯化鈀催化劑、1mL嗎啉的混合物，在一氧化碳的的大氣下加熱(75℃)90分鐘。冷卻混合物，然后通過反相硅膠色譜純化(應(yīng)用水-乙腈梯度洗脫)，得到0.06g化合物C1(吡唑4，其中R1＝CON(-CH2CH2-O-CH2CH2-)，R2＝F，R3＝H，R4＝H)。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.05(s，1H，NH)，8.18(s，1H，NH)，7.59(s，1H)，7.4-7.5(m，2H)，7.18-7.35(m，3H)，6.84(d，J＝9Hz，1H)，3.25(m，8H).下列化合物應(yīng)用上述方法A制備3.2化合物C2R1＝CONHCH2CH2OH，R2＝F，R3＝H，R4＝HN-(2-羥基乙基)-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.08(5，1H，NH)，8.20(s，1H，NH)，8.16(m，1H，NH)，7.61(d，J＝9Hz，1H)，7.57(s，1H)，7.4-7.5(m，2H)，7.14-7.3(m，2H)，7.11(s，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，4.63(m，1H，OH)，3.40(m，2H)，3.18(m，2H).3.3化合物C3R1＝CON(CH2CH2OH)2，R2＝F，R3＝H，R4＝HN，N-雙-(2-羥基乙基)-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.10(s，1H，NH)，8.11(s，1H，NH)，7.59(s，1H)，7.4-7.52(m，2H)，7.15-7.3(m，3H)，6.80(d，J＝9Hz，1H)，6.58(s，1H)，4.65(m，2H，OH)，3.30(m，8H).B.硝基還原到氨基R1＝NO2到R1＝NH23.4化合物C4R1＝NH2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮將0.20g(0.57mmol)的吡唑7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H)的8mL乙醇溶液在室溫、氫氣下與阮內(nèi)鎳(0.5mL 50％在水中的稀漿，使用前用乙醇洗滌)攪拌。4小時(shí)后，減壓過濾、濃縮混合物，得到0.177g化合物4(氨基衍生物7，其中(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H)。mp.260-263℃。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.62(s，1H)，7.38-7.47(m，4H)，7.07(s，s，1H)，6.53(d，J＝8Hz，1H)，6.38(dd，J＝2，9Hz，1H)，5.74(d，J＝2Hz，1H)，4.52(s，2H)，2.06(s，3H).
下列化合物應(yīng)用上述方法B制備3.5化合物C5R1＝NH2，R2＝Cl，R3＝H，R4＝H5-(2-氟苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(CD3OD，300mHz)7.35-7.55(m，5H)，6.72(dd，J＝3，7Hz，1H)，6.62(d，J＝7Hz，1H)，6.13(d，J＝3Hz，1H).3.6化合物C6R1＝NH2，R2＝Cl，R3＝i-Pr，R4＝H3-(1-甲基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.65(2，1H)，7.38-7.4(m，4H)，7.08(s，1H)，6.75(d，J＝8Hz，1H)，6.39(dd，J＝2，8Hz，1H)，5.74(d，J＝2Hz，1H)，2.98(sept，J＝7Hz，1H)，1.18(d，J＝7Hz，6H).C.氨基化合物的衍生化(Derivitization)R1＝NH2到R1＝NHR’(如上面合成路線4所定義)3.7化合物C7R1＝NHAc，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝HN-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-乙酰胺0.323g(1mmol)吡唑7(R1＝NH2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H)在20mL二氯甲烷中的混懸液與0.112g(1.1mmol)乙酸酐在惰性氣體、室溫下反應(yīng)。然后將混合物用乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用水和鹽水洗滌。用乙酸乙酯萃取水層，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓下濃縮并過濾。應(yīng)用硅膠色譜分離產(chǎn)物，采用己烷-乙酸乙酯(30/70)洗脫，得到0.175g化合物C7。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.71(s，1H)，9.56(s，1H)，7.56(s，1H)，7.38-7.57(m，5H)，6.67(d，J＝8Hz，1H)，6.57(d，J＝2Hz，1H)，2.05(s，3H)，1.83(s，3H).
按照上述方法C制備化合物7的方法，制備下列化合物3.8化合物C8R1＝丙烯酰NH，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝HN-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-丙烯酰胺(propenamide)1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.71(s，1H)，9.78(5，1H)，7.63(s，1H)，7.52(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.35-7.50(m，4H)，6.71(d，J＝9Hz，1H)，6.69(d，J＝2Hz，1H)，6.23(dd，J＝10，18Hz，1H)，6.08(dd，J＝2，18Hz，1H)，5.60(dd，J＝2，10Hz，1H)，2.05(s，3H).3.9化合物C9R1＝CH3SO2NH，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝HN-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-甲磺酰胺0.323g(1mmol)吡唑7(R1＝NH2，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H)、0.122g(1mmol)4-二甲基氨基吡啶和5mL四氫呋喃的混合物在惰性氣體、室溫下攪拌2小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用水和鹽水洗滌，應(yīng)用乙酸乙酯從水相中再萃取。合并乙酸乙酯萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓下濃縮并過濾。應(yīng)用硅膠色譜分離產(chǎn)物，采用己烷-乙酸乙酯(10/90)洗脫，得到0.244g化合物C9(吡唑7，其中R1＝CH3SO2NH，R2＝Cl，R3＝CH3，R4＝H)(在乙酸乙酯中重結(jié)晶)mp 196-198℃。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.74(s，1H)，9.12(s，1H)，7.71(s，1H)，7.36-7.46(m，4H)，6.94(dd，J＝2，8Hz，1H)，6.72(d，J＝8Hz，1H)，6.31(d，J＝2Hz，1H)，2.70(s，3H)，2.05(s，3H).D.R3＝CO2Et到R3＝CONRR’的氨解3.10化合物C10R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CONH2，R4＝H5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺0.15g(0.36mmol)吡唑7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CO2Et，R4＝H)與氨水(15mL)在乙醇(50mL)中的溶液在室溫下攪拌48小時(shí)。在減壓下除去揮發(fā)物質(zhì)，通過硅膠色譜純化產(chǎn)物。應(yīng)用乙酸乙酯-異丙醇(95/5)洗脫，得到0.074g化合物C10固體(吡唑7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CONH2，R4＝H)mp＞340℃，(在乙酸乙酯中重結(jié)晶)。1H nmr(DMSO-d6，400mHz)12.95(brs，1H)，9.23(brs，1H)，7.92(d，J＝8Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.45-7.61(m，4H)，7.21(s，1H)，7.08(s，1H)，6.75(d，J＝8Hz，1H).
按照上述方法D制備化合物10的方法，制備下列化合物3.11化合物C11R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CONMe2，R4＝HN，N-二甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.65(s，1H)，9.18(s，1H)，7.91(d，J＝9Hz，1H)，7.41-7.55(m，4H)，7.08(s，1H)，6.75(d，J＝9Hz，1H)，3.01(5，3H)，2.88(s，3H).3.12化合物C12R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CONHNH2，R4＝HN-氨基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺1H nmr(DMSO-d6，300mHz)13.02(s，1H)，9.19(s，1H)，8.58(t，J＝5Hz，1H)，7.91(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.41-7.62(m，4H)，7.09(d，J＝2Hz，1H)，6.75(d，J＝9Hz，1H)，4.54(d，J＝5Hz，2H).E.R3＝CO2Et至R3＝CHO和R3＝CH2OH的還原3.13化合物C13R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CHO，R4＝H；和化合物C14R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2OH，R4＝H0.48g(1.17mmol)吡唑7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CO2Et，R4＝H)與30mL四氫呋喃在-15℃、惰性氣體下用1.52mL的1M氫化鋁鋰的四氫呋喃溶液處理30分鐘。將混合物用乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用硫酸鉀水溶液和鹽水洗滌，應(yīng)用乙酸乙酯從水相中再萃取。合并乙酸乙酯萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓下濃縮并過濾。應(yīng)用硅膠色譜分離產(chǎn)物，采用己烷-乙酸乙酯洗脫，得到0.21g化合物C13(吡唑7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CHO，R4＝H)紅色固體，和0.11g化合物C13(吡唑7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2OH，R4＝H)紅色固體?；衔顲135-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-醛1H nmr(DMSO-d6，300mHz)13.29(s，1H)，9.66(s，1H)，9.27(s，1H)，7.96(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.45-7.59(m，4H)，7.13(d，J＝2Hz，1H)，6.79(d，J＝9Hz，1H).化合物C143-羥基甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.11(s，1H)，9.08(s，1H)，7.85(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.42-7.50(m，4H)，7.06(d，J＝2Hz，1H)，6.71(d，J＝9Hz，1H)，5.23(t，J＝5Hz，1H)，4.27(d，J＝5Hz，2H).F.醛的還原氨化R3＝CHO到R3＝CH2NR23.14化合物C15R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2NMe2，R4＝H3-(N，N-二甲基氨基甲基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮0.142g(0.39mmol)吡唑7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CO2Et，R4＝H)、0.0631g(0.78mmol)二甲胺鹽酸鹽、0.11mL(0.78mmol)三乙胺、0.165g(1mmol)三乙酸基硼氫化物、0.2的4A分子篩和20mL二氯甲烷的混懸液在惰性氣體下攪拌3小時(shí)。過濾混合物，用乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用硫酸鉀水溶液和鹽水洗滌，應(yīng)用乙酸乙酯從水相中再萃取。合并乙酸乙酯萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓下濃縮并過濾。應(yīng)用反相硅膠色譜(應(yīng)用水-乙腈-三氟乙酸進(jìn)行梯度洗脫)進(jìn)行純化，得到0.147g化合物C15(吡唑7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2NMe2，R4＝H)三氟乙酸鹽。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.54(s，1H)，9.92(s，1H)，9.25(s，1H)，7.91(dd，J＝2，8Hz，1H)，7.45-7.55(m，4H)，7.10(d，J＝2Hz，1H)，6.76(d，J＝8Hz，1H)，4.08(s，2H)，2.75(s，6H).G.醇的烷基化R3＝CH2OH到R3＝CH2OCH33.15化合物C16R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2OCH3，R4＝H0.075g(0.2mmol)吡咯7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2OH，R4＝H)、0.2g硅膠和20mL四氫呋喃的混合物用重氮甲烷在乙醚中的溶液(50mL，大約9.2mmol)攪拌。2小時(shí)后，在減壓下過濾混合物并干燥。通過硅膠色譜純化產(chǎn)物，用己烷-乙酸乙酯洗脫，得到紅色固體的化合物C16(吡咯7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CH2OCH3，R4＝H)。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.27(s，1H)，9.11(s，1H)，7.86(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.43-7.50(m，4H)，7.06(d，J＝2Hz，1H)，6.72(d，J＝9Hz，1H)，4.20(s，2H)，3.25(s，3H).H.醛的亞甲基化(Methylenation)R3＝CHO到R3＝CHCH23.16化合物C17R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CHCH2，R4＝H3-次乙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮在-78℃、惰性氣體下，向通過在5mL四氫呋喃中的0.109g(0.31mmol)甲基三苯基溴化鏻和0.29mL 1 M叔丁氧化鉀的四氫呋喃溶液反應(yīng)得到的亞甲基三苯基正膦中，加入0.080g(0.22mmol)的吡咯7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CHO，R4＝H)，將混合物保溫回流，攪拌過夜，其后將混合物冷卻至室溫，乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用水和鹽水洗滌。應(yīng)用無水硫酸鈉干燥乙酸乙酯萃取物，在減壓下過濾混合物并干燥。通過硅膠色譜純化產(chǎn)物，用己烷-乙酸乙酯(70/30)洗脫，得到0.043g紅色固體的化合物C17(吡咯7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CHCH2，R4＝H)。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)12.33(s，1H)，9.11(s，1H)，7.88(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.40-7.50(m，4H)，7.08(d，J＝2Hz，1H)，6.74(d，J＝9Hz，1H)，6.40(dd，J＝12，18Hz，1H)，5.85(d，J＝18Hz，1H)，5.36(d，J＝12Hz，1H).I.酰胺的脫水R3＝CONH2到R3＝CN3.17化合物C18R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CN，R4＝H5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-腈0.47g(1.23mmol)吡咯7(R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CONH2，R4＝H)、0.34g(2.46mmol)碳酸鉀、0.94g(6.15mmol)磷酰氯和20mL乙腈的混合物在惰性氣體下加熱至回流4小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和鹽水洗滌，用乙酸乙酯再萃取水相。應(yīng)用無水硫酸鈉干燥。合并的乙酸乙酯萃取物，在減壓下過濾混合物并干燥。通過硅膠色譜純化產(chǎn)物，用己烷-乙酸乙酯(70/30)洗脫，得到0.24g橙色固體的化合物C18(吡咯7’，其中R1＝NO2，R2＝Cl，R3＝CN，R4＝H)(從二氯甲烷重結(jié)晶得到)。mp193-196℃。IR(KBr)2240cm-1.1H nmr(DMSO-d6，300mHz)9.36(s，1H)，7.96(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.48-7.58(m，4H)，7.11(d，J＝2Hz，1H)，6.77(d，J＝9Hz，1H).J.腈的水解R1＝CN至R3＝CONH23.18化合物C19R1＝CONH2，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺向0.5g(1.6mmol)吡咯7(R1＝CN，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H)在79mL二甲亞砜的溶液中，加入47mL冰凍的過氧化氫(30％水溶液)和24mL 1 M氫氧化鈉。反應(yīng)完全后，將混合物用乙酸乙酯萃取，萃取液連續(xù)用水和鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。將混合物在減壓下過濾混合物并干燥。通過硅膠色譜純化(用乙酸乙酯/甲醇(95∶5)洗脫)，得到0.5g黃色固體的化合物C19(吡咯7’，其中R1＝CONH2，R2＝F，R3＝CH3，R4＝H)。mp 323-324℃。1H nmr(DMSO-d6，300mHz)11.79(s，1H)，8.08(s，1H)，7.64(s，1H)，7.58(dd，J＝2，9Hz，1H)，7.38-7.52(m，2H)，7.02-7.30(m，4H)，6.73(d，J＝9Hz，1H)，2.05(s，3H).
在上述實(shí)施例1-3中沒有特別列出的其它化合物也是采用上述方法制備。這些用“D”表示的化合物列在下表I-IV中。
CDK2閃光板試驗(yàn)為了測定CDK2活性的抑制，將純化過的重組成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)蛋白涂在96孔閃光板上(New England Nuclear，Boston，MA)。Rb是通過CDK2進(jìn)行磷酸化的天然物質(zhì)(Herwig和Strauss，Eurr.J.Biochem.，Vol.246(1997)pp.581-601，在本文引用作為參考)。從昆蟲細(xì)胞提取物中部分純化重組活性人細(xì)胞周期蛋白E/CDK2復(fù)合物。將這些活性細(xì)胞周期蛋白E/CDK2以及33P-ATP和測試化合物的稀釋液加入到Rb涂布的閃光板上。將該板在振蕩下室溫溫育25分鐘，然后洗滌，并在Topcount閃爍計(jì)數(shù)器(Packard Instrument Co.，DowneersGrove，IL)上計(jì)數(shù)。試驗(yàn)化合物的稀釋液在各種試驗(yàn)中被重復(fù)試驗(yàn)。Rb磷酸化抑制百分?jǐn)?shù)(其為CDK2活性抑制的衡量標(biāo)準(zhǔn))根據(jù)下式確定100×[1-(試驗(yàn)化合物-非特異性數(shù))/(總數(shù)-非特異性數(shù))]其中“試驗(yàn)化合物”指重復(fù)試驗(yàn)每分鐘的平均計(jì)數(shù)，“非特異性數(shù)”指當(dāng)不加入細(xì)胞周期蛋白E/CDK2時(shí)的每分鐘平均計(jì)數(shù)，而“總數(shù)”指不加入化合物時(shí)每分鐘的平均計(jì)數(shù)。
上述體外試驗(yàn)的結(jié)果在下表IA至1C中給出。
表1ACdk2的抑制IC50范圍0.01-0.99uM
*除非另有說明**3′位在其余表中，R1，R2，R3和R4的取代位與上述表1A相同表1BCdk2的抑制IC50范圍0.01-0.99um
表1CCdk2的抑制IC50范圍10-30uM
基于細(xì)胞的檢測從American Type Cell Culture Collection(ATOC；Rockvilie，MD)購買雌激素受體陰性上皮乳腺癌系(MDA-MB435)，在ATCC推薦的介質(zhì)中培養(yǎng)。為了分析測試化合物對這些細(xì)胞生長的影響，將該細(xì)胞在96孔組織培養(yǎng)板上每孔2000細(xì)胞進(jìn)行鋪板，然后在37℃、5％CO2下溫育過夜。第二天，將測試化合物溶解于100％二甲基亞砜(DMSO)中，制成10mM儲備液。將每種化合物用足夠量的無菌介質(zhì)稀釋，得到最終濃度120μM。然后將該化合物連續(xù)用1.2％DMSO稀釋。將四分之一最終體積的稀釋化合物轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板上。重復(fù)檢測該測試化合物。將DMSO加入到一組“對照細(xì)胞”中，使每孔中DMSO的濃度達(dá)到0.3％。加入沒有細(xì)胞的孔作為“空白”。加入沒有抑制劑的孔作為“無抑制劑對照”。將該板再重新置于培養(yǎng)箱中，加入測試化合物后，如下進(jìn)行分析。
將3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴鎓(噻唑蘭；MTT)加入到每孔上，得到最終濃度1mg/mL。然后將該板在37℃下溫育3小時(shí)。在將含MTT介質(zhì)吸出前，將該板在1000rpm下離心5分鐘。然后取出含MTT介質(zhì)，將100μL 100％乙醇加入到每孔中，以溶解最終的甲代謝物。為了保證能夠完全溶解，將該板在室溫下振搖15分鐘。570nm下在微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Dynamics)上讀出吸收度讀數(shù)，650nm下讀數(shù)作為對照。通過所有孔的值減去空白孔(沒有細(xì)胞)的吸收度，然后1.00減去每個(gè)測試化合物重復(fù)測定的平均值與對照平均值的比值，得到百分比抑制。通過繪出濃度的對數(shù)值/百分比抑制，進(jìn)行線性回歸，確定抑制濃度(IC50)。
上述MDA-MB-435基于細(xì)胞檢測的結(jié)果在下表IIA-IIC中給出。
表11AMDA-MB435(乳腺)的抗增生活性檢測IC50范圍0.01-1uM
表11BMDA-MB435(乳腺)的抗增生活性檢測IC50范圍1.1-9.99uM
表IICMDA-MB435(乳腺)的抗增生活性檢測IC50范圍10-30uM
從ATCC獲得結(jié)腸腺癌SW480和結(jié)腸癌HCT-116，按照上述與MDA-MB-435基于細(xì)胞檢測相同的方案進(jìn)行檢測，只是進(jìn)行以下修改。細(xì)胞系SW480以每孔1000細(xì)胞進(jìn)行鋪板，在加入測試化合物后6天后進(jìn)行檢測。細(xì)胞系HCT-116以每孔1000細(xì)胞進(jìn)行鋪板，在加入測試化合物后4天后進(jìn)行檢測。
上述基于SW480(結(jié)腸)和HCT-116(結(jié)腸)檢測的結(jié)果分別在下表IIIA-IIIC和IVA-IVC中給出。
表IIIASW480(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍0.01-1uM
表IIIBSW480(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍1.1-9.99uM
表IIICSW480(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍10-30uM
表IVAHCT16(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍0.01-1uM
表IVBHCT16(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍1.1-9.99uM
表IVCHCT16(結(jié)腸)抗增生活性檢測IC50范圍10-30Um
實(shí)施例5片劑配方
*化合物1代表本發(fā)明化合物。生產(chǎn)工藝1.將項(xiàng)目1，2和3在合適的混合器中混合15分鐘。2.將步驟1的粉末混合物用20％Povidone K30溶液(項(xiàng)目4)制粒。3.在50℃干燥步驟2的顆粒。4.將步驟3的顆粒通過合適的整粒(milling)裝置。5.將項(xiàng)目5加入磨碎后的步驟4的顆粒中，并混合3分鐘。6.將步驟5的顆粒在合適的壓片機(jī)上壓片。實(shí)施例6膠囊配方
*化合物1代表本發(fā)明化合物。生產(chǎn)工藝1.將項(xiàng)目1，2和3在合適的混合器中混合15分鐘。2.加入項(xiàng)目4和5并混合3分鐘。3.填充到膠囊內(nèi)。
盡管通過參考特定和優(yōu)選的方案舉例來說明本發(fā)明，本專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該理解各種改變和修飾都可以通過本發(fā)明的常規(guī)實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐而進(jìn)行。因此，本發(fā)明不限于前面的說明，而由權(quán)利要求書和其等同替換來限定。
權(quán)利要求
1.一種下式I的化合物，和式I化合物的前體藥物和藥物活性代謝物，以及上述化合物的藥物可接受的鹽 其中R1為氫，-NO2，-CN，-鹵素，-OR5，-R6OR7，-COOR7，-CONR8R9，-NR10R11，-NHCOR12，-NHSO2R13，或任選被羥基和/或鹵素取代的直鏈低級烷基；R2和R4分別獨(dú)立為氫，-鹵素，-NO2，-CF3，或直鏈低級烷基；R3為氫，環(huán)烷基，芳基，雜環(huán)，雜芳基，-COOR7，-CN，烯基，-CONR8R9，炔基，或任選被羥基、-OR9、F和/或芳基取代的低級烷基；R5為任選被鹵素取代的低級烷基；R6為低級烷基；R7為氫或低級烷基；R8和R9分別獨(dú)立為氫或其本身任選被羥基和/或-NH2取代的低級烷基；或者R8和R9可以形成任選被羥基、-NH2、和/或低級烷基取代的五元或六元雜環(huán)；R10、R11和R12分別獨(dú)立為氫或低級烷基；R13為任選被鹵素和/或-NR14R15取代的低級烷基；以及R14和R15分別獨(dú)立為氫或任選被鹵素取代的低級烷基；或者-NR14R15為雜環(huán)。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R1為氫，NO2，CN，CONH2，鹵素或低級烷基。
3.按照權(quán)利要求1或2的化合物，其中R1為NO2，CN，或CONH2。
4.按照權(quán)利要求1-3中任何一個(gè)的化合物，其中R1在2’位，為氫或鹵素。
5.按照權(quán)利要求1-4中任何一個(gè)的化合物，其中R3為低級烷基，羥基低級烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)，或雜芳基。
6.按照權(quán)利要求1-4中任何一個(gè)的化合物，其中R3為甲基、乙基和羥基甲基。
7.化合物3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮。
8.化合物3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-腈。
9.化合物3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺。
10.化合物3-羥基甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-腈。
11.按照權(quán)利要求1的式I化合物，其為5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-苯基-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2，4-二氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-苯基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氯苯基)-7-甲氧基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-苯基-甲磺酰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-7-氰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(3-硝基苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-三氟甲基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-苯基-7-甲氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，(5-苯基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-羧酸鈉鹽，5-(2-氟苯基)-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氟苯基)-7-乙氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，N-(2-羥基乙基)-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺，5-(2-氟苯基)-7-嗎啉基羰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，N，N-雙-(2-羥基乙基)-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺，(5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-羧酸，5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺，或5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮。
12.按照權(quán)利要求1的式I化合物，其為3-乙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-苯基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-甲基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-甲基乙基)-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(苯基甲基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-乙氧甲?；?吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-甲基丙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-三氟甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-羥基甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，N-(2-羥基乙基)-3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺，3-(N，N-二甲基氨基甲基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-甲基丙基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲氧基甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-次乙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-甲氧基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-苯基-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，N-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-乙酰胺，N-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-甲磺酰胺，N-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-丙烯酰胺，3-甲基-5-苯基-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-嗎啉基羰基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-苯基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-氯-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-三氟甲基苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，N’-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-4-N，N-二甲基胺基磺酰胺，N’-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-4-N-氯甲基胺基磺酰胺，N’-(3-甲基-5-(2-氯苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-基)-4-嗎啉基磺酰胺，N-[2-(4-嗎啉基)乙基]-3-甲基-5-(2-氟苯基)-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-7-酰胺，3-甲基-5-苯基-7-碘-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-苯基-7-溴-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-甲基-5-(2-氟苯基)-7-氟-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-環(huán)丙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-環(huán)丙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，或3-丙基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮。
13.按照權(quán)利要求1的式I化合物，其為3-乙氧甲酰基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺，N，N-二甲基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺，N-氨基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-酰胺，5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-醛，或5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮-3-腈。
14.按照權(quán)利要求1的式I化合物，其為3-(4-甲基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-二甲基氨基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-氰基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-苯基-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-甲基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-硝基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-三氟甲基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-三氟甲基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-萘基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-甲氧基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-(甲基硫)苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-三氟甲氧基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-羥基-2-甲氧基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-羥基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-((1，1’-聯(lián)苯基)-4基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-萘基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-硝基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-苯氧基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-氰基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-乙氧基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-甲基苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，或3-(2-氟苯基)-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮。
15.按照權(quán)利要求1的式I化合物，其為3-(4-甲基吡唑基-5-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-噻唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1，3，4-噁二唑-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-咪唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-吡唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-吡唑基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-噻吩基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-呋喃基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-甲基噻吩-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-甲基噻吩-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(吲哚-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-吡啶)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-(1-吡咯基)苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-吡咯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(4-異喹啉基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-苯并呋喃基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(3-噻吩基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(5-甲基噻吩-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-咪唑基)-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2-吡啶基)-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2，3-二氫-1，4-苯并二氧芑-6-基)-5-苯基-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，3-(2，3-亞甲基二氧苯基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮，或3-(5-乙基呋喃-2-基)-5-(2-氯苯基)-7-硝基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮。
16.下式的化合物或 其中R1-R4如權(quán)利要求1所定義。
17.一種藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1-15中任何一個(gè)的化合物和藥物可接受的載體或賦型劑。
18.權(quán)利要求1-15中任何一個(gè)的化合物作為醫(yī)藥的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求1-15中任何一個(gè)的化合物在制備用于治療或控制乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌的醫(yī)藥中的應(yīng)用。
20.本文前面描述的、特別是參照實(shí)施例描述的新化合物、組合物及其應(yīng)用。
全文摘要
具有式(I)結(jié)構(gòu)的新的吡唑并苯并二氮及其藥物可接受的鹽,其中R
文檔編號A61P35/00GK1348455SQ00806554
公開日2002年5月8日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者丁清杰, 劉進(jìn)軍, 文森特·斯圖爾特·麥迪遜, 賈科莫·皮佐拉托, 魏仲成, 彼得·米夏埃爾·沃庫利希 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司