專(zhuān)利名稱(chēng)：腦血管疾病的基因療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防腦血管疾病的新的基因治療劑和施用該基因治療劑的新方法。更具體地，本發(fā)明涉及腦血管疾病的治療或預(yù)防劑，其含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因和/或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因作為活性成分。本發(fā)明還涉及新的施用方法，其包括向人蛛網(wǎng)膜下隙施用所述治療或預(yù)防劑。
新的血管和血管生成的產(chǎn)生與內(nèi)皮細(xì)胞的激活同時(shí)被引發(fā)。已顯示不僅刺激體內(nèi)血管生成而且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有體外促有絲分裂作用的生長(zhǎng)因子被稱(chēng)為“血管生成生長(zhǎng)因子”。
血管生成生長(zhǎng)因子的治療應(yīng)用首次被Folkman等(N.Eng.J.Med.2851182-1186(1971))在文獻(xiàn)中描述。隨后的研究證實(shí)，重組血管生成因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族(科學(xué)(Science)2571401-1403(1992)；自然(Nature)362844-846(1993))、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(J.Surg.Res.54575-583(1993))和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可用于促進(jìn)和/或增強(qiáng)心肌和后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭袀?cè)支循環(huán)分流(collateral circulation shunt)的形成(循環(huán)(Circulation)90II-228-II-234(1994))。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)HGF和VEGF一樣起內(nèi)皮特異性生長(zhǎng)因子的作用(J.Hypertens.141067-1072(1996))。
上述利用血管生成生長(zhǎng)因子治療血管疾病的策略被稱(chēng)為“治療性血管生成”。后來(lái)，該策略被應(yīng)用于人的缺血疾病。但是，該策略在腦缺血中的有效性至今尚不知道。
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是在多種細(xì)胞中顯示促有絲分裂、促游動(dòng)性和形態(tài)發(fā)生活性的多效細(xì)胞因子(自然342440-443(1989))。
HGF對(duì)腦的作用已有如下報(bào)道。例如，已知HGF和跨膜酪氨酸激酶的c-Met/HGF受體一起在腦的各個(gè)區(qū)域表達(dá)，而且，HGF和c-Met的可操作連接增強(qiáng)海馬原代培養(yǎng)物中神經(jīng)元的存活，并在神經(jīng)元的體外發(fā)育中誘導(dǎo)neutrite延伸(細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)126485-494(1994)；日本未審查專(zhuān)利公開(kāi)文本(Kokai)7-89869)。最近，已報(bào)道缺血神經(jīng)元誘導(dǎo)HGF(腦研究(Brain Res.)799311-316(1998))，在海馬中重組HGF對(duì)缺血后的延遲神經(jīng)元死亡有神經(jīng)保護(hù)作用，向腦連續(xù)注射重組HGF有效減小梗死的大小(J.Cereb.Blood Flow Metab.18345-348(1998))。這些發(fā)現(xiàn)提示HGF在腦缺血中起著重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。
另一方面，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有促有絲分裂作用的二聚體糖蛋白，并具有增強(qiáng)血管透性的能力。VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接和特異的促有絲分裂作用(Biochem.Biophys.Res.Commun.161851-858(1989))。VEGF的結(jié)合位點(diǎn)包括酪氨酸激酶受體Flt、Flk-1和KDR存在于內(nèi)皮細(xì)胞上，但不存在于其它類(lèi)型細(xì)胞上，由此將VEGF的作用限制在內(nèi)皮細(xì)胞。
關(guān)于VEGF對(duì)腦的作用，已報(bào)道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的VEGF被腦缺血疾病快速誘導(dǎo)(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)164604-4613(1996))，而且給腦表面施用重組VEGF有效降低梗死的量(J.Cereb.Blood Flow Metab.18887-895(1998))。但其細(xì)節(jié)尚不知道。
另一方面，除了HGF和VEGF的上述作用外，如上所述，這些因子還是有效的血管生成生長(zhǎng)因子(細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)119629-641(1992)；Biochem.Biophys.Res.Commun.161851-858(1989))。缺血發(fā)病已知在缺血周?chē)鸹钴S的血管生成，這與人存活的延長(zhǎng)有關(guān)(中風(fēng)251794-1798(1994))。因此，血管生成被認(rèn)為在腦缺血的康復(fù)和防止未來(lái)發(fā)病中起重要作用。但是，使用重組HGF或VEGF的治療性血管生成對(duì)腦缺血等實(shí)際上是否可行還不知道。而且，重組血管生成生長(zhǎng)因子從腦中迅速消失，因此需要向腦中不斷注射，該程序在臨床治療中相當(dāng)危險(xiǎn)和不切實(shí)際。因此，如果將基因?qū)爰夹g(shù)用于在缺血性腦及其周?chē)B續(xù)表達(dá)和分泌血管生成生長(zhǎng)因子，將是合理的。至今還沒(méi)有HGF基因或VEGF基因應(yīng)用于(基因治療)腦中的缺血性疾病的例子，而且可能因?yàn)槟X組織的獨(dú)特特征，對(duì)于其適用性也沒(méi)有建議。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防腦血管疾病的新的基因治療劑，和用于施用所述基因治療劑的新的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防腦血管疾病的新的藥劑，其包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)基因作為活性成分。本發(fā)明還涉及新的施用方法，其包括向蛛網(wǎng)膜下隙施用所述治療或預(yù)防劑。
本發(fā)明人在體內(nèi)研究了HGF基因和VEGF基因的導(dǎo)入是否能在缺血腦的表面誘導(dǎo)血管生成。結(jié)果，我們揭示(a)轉(zhuǎn)染HGF基因或VEGF基因后，在延長(zhǎng)的期間內(nèi)在腦中檢測(cè)到這些蛋白質(zhì)，(b)用HGF基因或VEGF基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行治療可在缺血腦的表面誘導(dǎo)血管生成，(c)HGF基因或VEGF基因的轉(zhuǎn)染可有效治療血管阻塞引起的腦中血流量減少，和(d)該治療在阻塞之前實(shí)施時(shí)也是有用的。而且，我們還證明這些基因的導(dǎo)入通過(guò)新的施用方法，即導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下隙，可更為有效地獲得。
此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)由于缺血在海馬CA-1區(qū)引起的延遲神經(jīng)元死亡可被HGF基因的導(dǎo)入抑制。
基于以上發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供描述于下列(1)到(23)項(xiàng)的發(fā)明。(1)腦血管疾病的治療和預(yù)防劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分；(2)上述(1)中的治療或預(yù)防劑，其中腦血管疾病是腦血管梗阻、腦梗死、腦血栓形成、腦栓塞、中風(fēng)、腦出血、煙霧陰影疾病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默癡呆和腦出血或腦梗死的后遺癥等；(3)腦中血流量減少的治療或預(yù)防劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分；(4)腦中血管生成的促進(jìn)劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分；(5)腦中神經(jīng)元死亡的抑制劑，其包含HGF基因作為活性成分；(6)上述(5)的抑制劑，其中腦中神經(jīng)元死亡是腦缺血引起的延遲神經(jīng)元死亡；(7)腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制劑，其包含HGF基因作為活性成分；(8)上述(1)-(7)之任一項(xiàng)的藥劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分，并且其聯(lián)合HGF蛋白和/或VEGF蛋白一起使用；(9)上述(8)的藥劑，其包含HGF基因作為活性成分，并且其聯(lián)合HGF蛋白一起使用；(10)(1)-(9)之任一項(xiàng)的藥劑，其中HGF基因和/或VEGF基因采用HVJ-脂質(zhì)體的形式；(11)(1)-(10)之任一項(xiàng)的藥劑，其被施用至蛛網(wǎng)膜下隙中；(12)制備(1)-(11)之任一項(xiàng)的藥劑的方法，其包括將HGF基因和/或VEGF基因與藥學(xué)上可接受的溶劑混合；(13)腦血管疾病的治療或預(yù)防方法，其包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因；(14)血流量減少的治療或預(yù)防方法，其包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因；(15)促進(jìn)腦血管生成的方法，其包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因；(16)抑制腦中神經(jīng)元死亡的方法，其包括向人導(dǎo)入HGF基因；(17)抑制腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的方法，其包括向人導(dǎo)入HGF基因；(18)(13)-(17)之任一項(xiàng)的方法，其包括向人蛛網(wǎng)膜下隙施用HGF基因和/或VEGF基因；(19)(13)-(18)之任一項(xiàng)的方法，其包括施用HGF蛋白和/或VEGF蛋白并導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因；(20)上述(19)的方法，其包括施用HGF蛋白并導(dǎo)入HGF基因；(21)HGF基因和/或VEGF基因在制備腦血管疾病的治療或預(yù)防劑中的應(yīng)用；(22)HGF基因和/或VEGF基因在制備腦中血流量減少的治療或預(yù)防劑中的應(yīng)用；(23)HGF基因和/或VEGF基因在制備腦中血管生成的促進(jìn)劑中的應(yīng)用；(24)HGF基因在制備腦中神經(jīng)元死亡的抑制劑中的應(yīng)用；和(25)HGF基因在制備腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制劑中的應(yīng)用。
圖2是在腦中顯示β-gal(β-半乳糖苷酶)表達(dá)之生物的形態(tài)學(xué)照片。左圖，注射至頸內(nèi)動(dòng)脈；中圖，注射至側(cè)腦室；右圖，注射至所述池(蛛網(wǎng)膜下隙)。
圖3是采用ELISA法顯示人HGF蛋白在大鼠腦脊液中體內(nèi)表達(dá)的圖。圖中，“UT”代表用不含HGF基因的表達(dá)載體處理的大鼠，“7d”代表導(dǎo)入HGF基因后第7天的大鼠，而“14d”代表導(dǎo)入HGF基因后第14天的大鼠。圖中，“-”表示沒(méi)有阻塞，而“+”代表在頸動(dòng)脈中存在阻塞?？v坐標(biāo)表示HGF的濃度(ng/ml)。**對(duì)于UT，P＜0.01。所有組均為n＝4。
圖4是采用ELISA法顯示人VEGF蛋白在大鼠腦脊液中體內(nèi)表達(dá)的圖。圖中，“UT”代表用不含VEGF基因的表達(dá)載體處理的大鼠，“7d”代表導(dǎo)入VEGF基因后第7天的大鼠，而“14d”代表導(dǎo)入VEGF基因后第14天的大鼠。圖中，“-”表示在頸動(dòng)脈中沒(méi)有阻塞，而“+”代表存在阻塞?？v坐標(biāo)表示VEGF的濃度(pg/ml)。**對(duì)于UT，P＜0.01。所有組均為n＝4。
圖5是顯微照片，顯示轉(zhuǎn)染HGF基因之前和之后第7天腦和其周?chē)袃?nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞組織化學(xué)染色結(jié)果。A(左上)，用載體(不含HGF基因的表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染的腦，未阻塞頸動(dòng)脈；B(右上)，用HGF基因轉(zhuǎn)染的腦，未阻塞頸動(dòng)脈；C(左下)，用載體轉(zhuǎn)染的、頸動(dòng)脈阻塞后第7天的腦；D(右下)，用HGF基因轉(zhuǎn)染的、阻塞頸動(dòng)脈后第7天的腦。所有組均為n＝4。
圖6是顯示用激光多普勒?qǐng)D像儀(laser Doppler imager，LDI)測(cè)量的腦血流量隨時(shí)間變化的圖。在該圖中，“pre”代表頸動(dòng)脈阻塞前，“post”代表頸動(dòng)脈阻塞后，“7d”代表阻塞后第7天，“14d”代表阻塞后第14天?？v坐標(biāo)(灌流量)代表平均腦灌流量。相對(duì)于pre，*P＜0.05，**P＜0.01。所有組均為n＝6。
圖7是顯示頸動(dòng)脈阻塞后第7天用LDI測(cè)量的CBF的圖。在該圖中，“UT”代表用表達(dá)載體處理的大鼠，“RC”代表用重組HGF(200μg)處理的大鼠，“GENE”代表用HGF基因(10μg)處理的大鼠，“GENE&RC”代表用重組HGF(200μg)和HGF基因(10μg)處理的大鼠，而“VEGF”中的“GENE”代表用VEGF基因(20μg/ml)處理的大鼠的結(jié)果?？v坐標(biāo)(灌流量)是平均腦灌流量。相對(duì)于“pre”，*P＜0.05，**P＜0.01。所有組均為n＝6。
圖8是顯示阻塞頸動(dòng)脈之前或之后即刻用LDI測(cè)量的CBF的圖。在該圖中，“pre”代表對(duì)照大鼠的頸動(dòng)脈阻塞前，“post”代表頸動(dòng)脈阻塞后即刻，“HGF”代表動(dòng)脈阻塞前7天進(jìn)行了HGF轉(zhuǎn)染的大鼠在頸動(dòng)脈阻塞后即刻的結(jié)果，而“VEGF”代表動(dòng)脈阻塞前7天進(jìn)行了VEGF轉(zhuǎn)染的大鼠在頸動(dòng)脈阻塞后即刻的結(jié)果。相對(duì)于“post”，**P＜0.01。所有組均有n＝5。
圖9是在腦表面(該圖中的“腦表面”)和海馬CA-1區(qū)(該圖中的“CA1”)中顯示β-gal(β-半乳糖苷酶)表達(dá)的顯微照片。


圖10是顯微照片，顯示如下結(jié)果，其中通過(guò)雙側(cè)頸動(dòng)脈的缺血刺激在海馬CA-1區(qū)觀察到延遲神經(jīng)元死亡。在該圖中，“Sham ope.第7天”代表對(duì)照(手術(shù)處理，僅未缺血刺激)第7天的結(jié)果，“Vehicle(第4天，第7天)”分別代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后第4天和第7天的結(jié)果。
圖11是顯示如下結(jié)果的顯微照片，其中在雙側(cè)頸動(dòng)脈的缺血刺激之前和之后導(dǎo)入HGF基因或重組HGF蛋白，抑制海馬CA-1區(qū)的延遲神經(jīng)元死亡。在該圖中，“Post HGF基因(第4天，第7天)”代表第4天和第7天的結(jié)果，其中HGF基因在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入，“Pre HGF基因第7天”代表第7天的結(jié)果，其中HGF基因在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血前即刻導(dǎo)入，而“r-HGF第7天”代表第7天的結(jié)果，其中重組HGF蛋白在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入。
圖12顯示通過(guò)對(duì)活的神經(jīng)細(xì)胞染色測(cè)量海馬CA-1區(qū)中神經(jīng)細(xì)胞的密度所獲得的結(jié)果。在該圖中，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞密度(活神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)/mm)。橫坐標(biāo)中“sham”代表對(duì)照的結(jié)果(未缺血刺激)，“vehicle”代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血的結(jié)果，“PostG”代表HGF基因在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入的結(jié)果，“PreG”代表HGF基因在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血前導(dǎo)入的結(jié)果，“PostR”代表重組HGF蛋白在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后導(dǎo)入的結(jié)果。相對(duì)于“vehicle”，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
圖13顯示在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后導(dǎo)入HGF基因然后用ELISA法測(cè)量7天后腦脊液中HGF的蛋白濃度所獲得的結(jié)果。在該圖中，縱坐標(biāo)代表HGF的蛋白濃度(ng/ml)，橫坐標(biāo)上的“post HGF”代表導(dǎo)入HGF基因的結(jié)果，“sham”代表對(duì)照(未缺血刺激)的結(jié)果?！癗.D.”代表結(jié)果未檢測(cè)。
圖14是顯微照片，顯示通過(guò)免疫染色方法分析的C-Met在海馬CA-1區(qū)的表達(dá)的結(jié)果。
圖15是顯微照片，顯示通過(guò)TUNEL方法對(duì)海馬CA-1區(qū)發(fā)生細(xì)胞凋亡的神經(jīng)細(xì)胞染色的結(jié)果。在該圖中，“DND第7天”代表在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后第7天有延遲神經(jīng)元死亡的神經(jīng)細(xì)胞，“Post HGF基因第7天”代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入HGF基因之后第7天的結(jié)果，“Pre HGF基因第7天”代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血前即刻導(dǎo)入HGF基因之后第7天的結(jié)果。
圖16是顯微照片，顯示通過(guò)免疫染色方法分析Bcl-xL在海馬CA-1區(qū)的表達(dá)的結(jié)果。在該圖中，“sham.”代表對(duì)照(未缺血刺激)的結(jié)果，“post HGF(第4天，第7天)”代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入HGF基因之后第4天和第7天的結(jié)果。
圖17是顯示如下結(jié)果的顯微照片，其中通過(guò)免疫染色方法分析了雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入HGF基因之后第7天HSP70在海馬CA-1區(qū)的表達(dá)。
圖18是顯示如下結(jié)果的顯微照片，其中通過(guò)免疫染色方法分析了HSP70在海馬CA-1區(qū)的表達(dá)。在該圖中，“sham.”代表對(duì)照(未缺血刺激)的結(jié)果，“Post HGF 7D”代表雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血后即刻導(dǎo)入HGF基因之后第7天的結(jié)果。
而且，本發(fā)明的HGF基因不限于上述那些基因，而是，只要所述基因表達(dá)的蛋白質(zhì)實(shí)際上能以與HGF相同的方式起作用，則可使用任何基因作為本發(fā)明的HGF基因。因此，從1)在嚴(yán)格條件下與所述cDNA雜交的DNA和2)其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列中相對(duì)所述cDNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有一或許多(優(yōu)選幾個(gè))氨基酸替代、缺失和/或插入的DNA等，那些編碼具有HGF作用的蛋白質(zhì)的基因均包括在本發(fā)明HGF基因的范圍內(nèi)。上述1)和2)中的DNA可容易地通過(guò)定點(diǎn)誘變、PCR方法、或標(biāo)準(zhǔn)雜交方法等獲得，具體地，它們可參考基本教科書(shū)如上面的分子克隆等來(lái)進(jìn)行。
本文所用“VEGF基因”是指能表達(dá)VEGF(VEGF蛋白)的基因。因此，按下文所述整合進(jìn)適合表達(dá)載體(非病毒載體，病毒載體)的基因可作為說(shuō)明的例子。已報(bào)道通過(guò)在人體內(nèi)轉(zhuǎn)錄時(shí)VEGF基因的選擇性剪接，存在4種亞型(VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206)(科學(xué)219983(1983)；J.Clin.Invest.841470(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.161851(1989))。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何這些VEGF基因，但從生物學(xué)上最有效的觀點(diǎn)看，最優(yōu)選VEGF165基因。而且，象上述HGF的情況一樣，只要編碼的蛋白質(zhì)具有VEGF活性，這些VEGF基因的修飾版本均包括在本發(fā)明的VEGF基因的范圍內(nèi)。
象HGF基因的情況一樣，基于先前描述的序列(如科學(xué)2461306(1989))和數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地克隆所述VEGF基因，也可容易地進(jìn)行它們的修飾。
根據(jù)本發(fā)明，首次證明腦血管疾病可用HGF基因或VEGF基因治療或預(yù)防。因此，本發(fā)明首次揭示，(a)轉(zhuǎn)染HGF基因或VEGF基因后，在一個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)在腦中檢測(cè)到這些蛋白質(zhì)，(b)通過(guò)用HGF基因或VEGF基因轉(zhuǎn)染治療，可在缺血腦的表面誘導(dǎo)血管生成，(c)HGF基因或VEGF基因的轉(zhuǎn)染可有效治療血管阻塞引起的腦中血流量減少，和(d)該治療方法在阻塞之前進(jìn)行時(shí)也有效。因此，HGF基因或VEGF基因可有效地用作各種腦血管疾病如腦缺血造成的疾病、與腦中血流量減少有關(guān)的疾病、期望通過(guò)促進(jìn)腦中血管生成改善的疾病等的治療或預(yù)防劑。
具體地，它們可有效地用作腦血管梗阻、腦梗死、腦血栓形成、腦栓塞、中風(fēng)(包括蛛網(wǎng)膜下出血、短暫腦缺血、腦動(dòng)脈粥樣硬化)、腦出血、煙霧陰影疾病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默癡呆和腦出血或腦梗死的后遺癥等的治療劑或預(yù)防劑(下文中，本發(fā)明的治療或預(yù)防劑簡(jiǎn)稱(chēng)為基因治療劑)。
而且，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，HGF基因的導(dǎo)入抑制海馬CA-1區(qū)中由于缺血引起的延遲神經(jīng)元死亡，也就是說(shuō)，HGF有抑制腦中神經(jīng)元死亡的作用。我們還證明，該作用基于c-Met介導(dǎo)的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
本文所用海馬CA-1區(qū)是一個(gè)密集了神經(jīng)并對(duì)腦缺血引起的神經(jīng)元死亡敏感的區(qū)域。已發(fā)現(xiàn)所述HGF基因能基于血管生成作用(抑制血流量減少)和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用治療和預(yù)防腦血管疾病。
因?yàn)镠GF基因具有上述c-Met介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，所以它可有效地用作神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默疾病、阿爾茨海默老年性癡呆、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化或帕金森病的治療或預(yù)防劑。
根據(jù)本發(fā)明，HGF基因和VEGF基因可單獨(dú)使用或彼此聯(lián)合使用。它們還可聯(lián)合其它血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因使用。而且，HGF基因和/或VEGF基因可與HGF蛋白和/或VEGF蛋白聯(lián)合使用。優(yōu)選HGF基因和HGF蛋白聯(lián)合或VEGF基因和VEGF蛋白聯(lián)合，更優(yōu)選HGF基因和HGF蛋白聯(lián)合。詳情見(jiàn)下面實(shí)施例4。
本文所用HGF蛋白可通過(guò)任何方法獲得，只要它純化至可用作藥學(xué)藥品的程度。也可使用商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品(例如Toyoboseki k.k.編號(hào)為HGF-101的產(chǎn)品等)。通過(guò)上文提到的克隆獲得的HGF cDNA插入任何適合的表達(dá)載體，將后者導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體，從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物上清液中可獲得目的重組HGF蛋白(見(jiàn)例如，自然342440(1989)；專(zhuān)利公開(kāi)文本2777678)。VEGF蛋白也可以以類(lèi)似方式獲得。
然后，闡述用于本發(fā)明基因治療的基因?qū)敕椒?、?dǎo)入形式、導(dǎo)入的量等。
當(dāng)給患者施用包含上述基因作為活性成分的基因治療劑時(shí)，劑量方案大致分為兩類(lèi)一種情況是使用非病毒載體，一種情況是使用病毒載體。其制備和施用方法在實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中有詳細(xì)解釋(基因治療基本技術(shù)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分卷(Separate volume of Experimental Medicine，Basic Technology in gene therapy)，Yodosha(1996)；基因?qū)牒捅磉_(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分卷(Separate volume of ExperimentalMedicine，Experimental Methods in Gene Introduction andExpression Analysis)，Yodosha(1997)；基因治療的開(kāi)發(fā)和研究手冊(cè)(Handbook for Development and Research of Gene Therapy)，日本基因治療學(xué)會(huì)(Japan Society of Gene Therapy)編，NTS(1999))。這將在下文中具體解釋。
A.當(dāng)使用非病毒載體時(shí)使用已將目的基因整合進(jìn)常用基因表達(dá)載體產(chǎn)生的重組表達(dá)載體，可通過(guò)下列方法等將目的基因?qū)爰?xì)胞或組織。
作為將基因?qū)爰?xì)胞的方法，可提及脂轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、采用微玻璃管的直接DNA導(dǎo)入法等。
作為將基因?qū)虢M織的方法，重組表達(dá)載體可通過(guò)任何如下方法摻入細(xì)胞用內(nèi)部型(internal type)脂質(zhì)體導(dǎo)入基因的方法，用靜電型(electrostatic type)脂質(zhì)體導(dǎo)入基因的方法，HVJ-脂質(zhì)體法，改進(jìn)的HVJ-脂質(zhì)體法(HVJ-AVE脂質(zhì)體法)，受體介導(dǎo)的基因?qū)敕?，通過(guò)基因槍將DNA分子和載體(金屬顆粒)一起導(dǎo)入的方法，直接導(dǎo)入裸DNA的方法，用帶正電荷的聚合物導(dǎo)入的方法，等等。
其中，HVJ-脂質(zhì)體是通過(guò)將DNA封入由脂雙層組成的脂質(zhì)體制備的融合產(chǎn)物，所述脂質(zhì)體已與滅活仙臺(tái)病毒(Sendai virus)(日本血凝病毒HVJ)融合。和傳統(tǒng)脂質(zhì)體方法相比，HVJ-脂質(zhì)體法的特征在于，與細(xì)胞膜具有非常高的的融合活性，因而是優(yōu)選的導(dǎo)入方式。關(guān)于制備HVJ-脂質(zhì)體的方法，詳情請(qǐng)見(jiàn)文獻(xiàn)(基因治療基本技術(shù)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分卷(Separate volume of Experimental Medicine，BasicTechnology in gene therapy)，Yodosha(1996)；基因?qū)牒捅磉_(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法(Experimental Methods in Gene Introduction andExpression Analysis)，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996)等)和下文描述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例。對(duì)于HVJ，優(yōu)選Z株(可從ATCC獲得)，但也可使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。
此外，直接導(dǎo)入裸DNA的方法是上述方法中最簡(jiǎn)單的方法，因而在這一點(diǎn)上是優(yōu)選的導(dǎo)入方法。
本文所用表達(dá)載體可是任何表達(dá)載體，只要它們?cè)试S目的基因在體內(nèi)表達(dá)，它們包括例如表達(dá)載體如pCAGGS(基因(Gene)108193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)等。
B.當(dāng)使用病毒載體時(shí)對(duì)于病毒載體，代表性方法使用例如重組腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。更具體地，目的基因可導(dǎo)入DNA病毒或RNA病毒如去毒逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、新培斯病毒(Sindbis virus)、仙臺(tái)病毒、SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)等，然后將其感染細(xì)胞，以將該基因?qū)朐摷?xì)胞。
在上面的病毒載體中，已知使用腺病毒比使用其它病毒載體具有更高的感染效率。在這一點(diǎn)上，優(yōu)選使用腺病毒載體系統(tǒng)。
作為將基因治療劑導(dǎo)入患者的方法，有允許基因治療劑直接導(dǎo)入體內(nèi)的體內(nèi)法，和離體法，在離體法中，從人體內(nèi)取出一些細(xì)胞，并將基因治療劑導(dǎo)入所述細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞返回體內(nèi)(NikkeiScience，1994年4月期第20-24頁(yè)；Monthly Yakuji，36(1)23-48(1994)；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊(Supplement to Experimental Medicine)12(15)(1994)；基因治療的開(kāi)發(fā)和研究手冊(cè)(Handbook for Development andResearch of Gene Therapy)，日本基因治療學(xué)會(huì)(Japan Society ofGene Therapy)編，NTS(1999))。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選體內(nèi)方法。
給患者施用的部位基于待治療的疾病、疾病狀態(tài)等來(lái)選擇。例如，除了直接給顱骨打洞并由此導(dǎo)入基因外，還有向側(cè)腦室施用或向蛛網(wǎng)膜下隙施用。其中，向蛛網(wǎng)膜下隙施用是本發(fā)明公開(kāi)的一種新的有效施用方法。當(dāng)旨在根據(jù)原來(lái)的目的治療疾病，即通過(guò)血管生成和/或抑制腦中神經(jīng)元死亡治療腦中血流量減少時(shí)，向蛛網(wǎng)膜下隙施用是期望的。
根據(jù)上述各種施用方案，劑量形式可采用多種形式(如液體)。例如，當(dāng)要使用含有所述基因作為活性成分的注射液時(shí)，所述注射液可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，在適當(dāng)溶劑(緩沖液如PBS，生理鹽水，無(wú)菌水等)中溶解后，如果需要?jiǎng)t用濾器過(guò)濾除菌，然后裝入無(wú)菌容器中?？上蜃⑸湟褐屑尤氤Ｓ幂d體等。對(duì)于脂質(zhì)體如HVJ-脂質(zhì)體，它們可采用懸浮液、冷凍制劑、離心濃縮的冷凍制劑等形式。
為了利于基因遞送至損傷部位周?chē)芍苽涑掷m(xù)釋放制劑(小粒制劑(minipellet formulation)等)，并植入損傷區(qū)域附近，或者它可用滲透泵等持續(xù)和逐漸地向損傷區(qū)域施用。
制劑中DNA含量可根據(jù)待治療的疾病、患者的年齡和體重等適當(dāng)控制，而且通常其范圍是，本發(fā)明DNA為0.0001-100mg，優(yōu)選0.001-10mg，優(yōu)選每幾天到幾個(gè)月給一次。
現(xiàn)在，將參考下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做具體解釋。但是，應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明不以任何方式被這些實(shí)施例限制。實(shí)驗(yàn)I.
用HGF基因和VEGF基因進(jìn)行血管生成及其改善腦中血流量的效果的研究材料和實(shí)驗(yàn)方法1)雙側(cè)頸動(dòng)脈的結(jié)扎用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內(nèi))麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(350-400g；Charles River Japan，Atsugi city，Japan)，并使其在手術(shù)中能自發(fā)呼吸。通過(guò)頸正中切開(kāi)，暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈，并用2-0絲緊緊結(jié)扎。
2)HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物的制備用于制備HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物的方法先前已有描述(J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996))。簡(jiǎn)單地說(shuō)，以重量比1∶4.8∶2混合磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和膽固醇。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去四氫呋喃以使脂質(zhì)混合物(10mg)沉淀在燒瓶的側(cè)壁上。干燥的脂質(zhì)在200μl含有已插入了目標(biāo)基因的表達(dá)載體的平衡鹽溶液(BSS133μM NaCl，5.4μM KCl，10μM Tris-HCl，pH7.6)中水化。對(duì)照組中的脂質(zhì)體含有無(wú)目的基因的表達(dá)載體(BSS 200μl)。脂質(zhì)體通過(guò)振蕩和超聲處理制備。
臨用前用紫外線照射(每秒110erg/mm2)3分鐘滅活純化的HVJ(Z株)。將脂質(zhì)體混合物(0.5ml，含10mg脂質(zhì))與HVJ(在4ml總體積中含10,000血細(xì)胞凝集單位)混合?；旌衔镌?℃孵育5分鐘，然后在37℃輕輕振蕩孵育30分鐘。通過(guò)蔗糖密度梯度離心從HVJ-脂質(zhì)體中除去游離HVJ。收集和使用蔗糖梯度的最上層。當(dāng)按先前的報(bào)道(J.Clin.Invest.931458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-1220(1996))計(jì)算時(shí)，質(zhì)粒DNA的終濃度等于20μg/ml。制備的方法已被優(yōu)化，以便獲得最大轉(zhuǎn)染效率。
3)體內(nèi)基因?qū)霝榱私⒂行У捏w內(nèi)基因?qū)敕椒?，我們測(cè)試了3種遞送與HVJ-脂質(zhì)體形成了復(fù)合物的質(zhì)粒的不同方法1)直接導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈，2)注射至側(cè)腦室，和3)注射至所述池(蛛網(wǎng)膜下隙)。
為導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈，用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內(nèi))麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(350-400g)，并切開(kāi)左側(cè)頸總動(dòng)脈，向其中引入聚乙烯導(dǎo)管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)(Rakugi等)。通過(guò)暫時(shí)用結(jié)扎關(guān)閉，短時(shí)間隔離頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)。將HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物(1ml)注射至該頸外動(dòng)脈區(qū)。注射后，除去注射插管，松開(kāi)結(jié)扎以恢復(fù)血流進(jìn)入頸總動(dòng)脈。
為注射至側(cè)腦室，將麻醉大鼠放置在立體定位儀(NarishigeScientific Instrument Laboratory，Tokyo，Japan)上以暴露顱骨。按先前描述的方法(Am.J.Physio.271R1212-1220(1996))將帶有特別設(shè)計(jì)的特氟隆(Teflon)連接器(FEP管，Bioanalytical Systems，WestLafayette，IN)的不銹鋼插管(30號(hào)針頭；Becton Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)插入左側(cè)腦室。立體定位坐標(biāo)如下前鹵點(diǎn)后，1.3mm；中線一側(cè)，2.1mm；顱表面以下，3.6mm。將HVJ脂質(zhì)體復(fù)合物注射至側(cè)腦室(20μl)。注射HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物后，除去注射導(dǎo)管。在所有接受注射的動(dòng)物中均未觀察到行為變化如四肢痙攣和異常運(yùn)動(dòng)。
為注射至蛛網(wǎng)膜下隙，將各動(dòng)物的頭在水平位置固定，通過(guò)枕骨正中切開(kāi)，暴露寰枕膜。將不銹鋼導(dǎo)管(27號(hào)針頭；Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)插入蛛網(wǎng)膜下隙。確認(rèn)導(dǎo)管的位置，為了避免顱內(nèi)壓增加，取出100μl腦脊液。然后在一分鐘以上的時(shí)間內(nèi)小心注射HVJ-脂質(zhì)體溶液(100μl100μg/ml)至所述池(蛛網(wǎng)膜下隙)內(nèi)。然后將動(dòng)物頭朝下放置30分鐘。施用預(yù)防性劑量的抗生素(30,000 U青霉素)以完成無(wú)菌過(guò)程。
4)激光多普勒成像使用激光多普勒?qǐng)D像儀(LDI)，在手術(shù)后連續(xù)記錄血流量?jī)芍堋榱水a(chǎn)生持續(xù)掃描600μm深度的12×12cm組織表面的光束，LDI系統(tǒng)(Moore Instruments Ltd.，Devon，UK)具有2W的內(nèi)置氦-氖激光器。根據(jù)多普勒原理(Doppler principle)，在掃描過(guò)程中，在血液系統(tǒng)中移動(dòng)的血細(xì)胞改變?nèi)肷涔獾念l率。光二極管在相反方向收集散射光，并由此將初始光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)換成0-10V范圍內(nèi)的電壓變化。0V灌流輸出值標(biāo)度為0％灌流量，而10V標(biāo)度為100％灌流量。在掃描結(jié)束而且從所有測(cè)量點(diǎn)收集反方向的散射光后，顯示血流量的色彩標(biāo)記圖像顯示在電視監(jiān)視器上。灌流信號(hào)分為六個(gè)不同的部分，每一個(gè)均以不同的顏色顯示。血流量降低或無(wú)灌流用深藍(lán)色表示，而最大灌流量顯示為紅色。
使用LDI，在阻塞之前、之后即刻、之后第7和14天記錄腦表面的灌流量。沿著頭皮上的正中切口，用電鉆制作12×12cm的骨窗口。在該骨窗口上，獲得連續(xù)的測(cè)量值。記錄色彩標(biāo)記的圖像，并通過(guò)計(jì)算每只大鼠的平均灌流量進(jìn)行分析。為了考慮包括周?chē)h(huán)境光線和溫度的變量，將灌流量的計(jì)算值表示為之后(缺血)與之前(未處理)腦的比值。
5)組織病理學(xué)檢查在3％低聚甲醛/20％蔗糖溶液中固定一天后，每100μm冠板制備25μm冷凍切片用于X-gal染色。該切片用X-gal染色以鑒定表達(dá)β-半乳糖苷酶的染色神經(jīng)元。每100μm冠板制備25μm冷凍切片用于堿性磷酸酶(ALP)染色。這些切片與含0.3％過(guò)氧化氫的PBS一起孵育，以降低內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶活性，然后在室溫下與用含10％馬血清的PBS稀釋的第一抗體或凝集素孵育60分鐘。在含2％馬血清的Tris緩沖鹽溶液中洗3次后，與該物種相適宜的、生物素標(biāo)記的第二抗體孵育，然后與抗生物素蛋白-生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(VectastainABC試劑盒，PK6100，Vector laboratories，Burlingame，CA)孵育。用二氨基聯(lián)苯胺顯現(xiàn)抗體結(jié)合。為了用作每一個(gè)抗體的陰性對(duì)照，略去第一抗體并用與該類(lèi)型和種類(lèi)相適宜的無(wú)關(guān)免疫球蛋白染色。
6)針對(duì)腦脊液(CSF)中的HGF和VEGF的ELISA法在該實(shí)驗(yàn)中，使用雙側(cè)頸動(dòng)脈阻塞之前、之后第7天和之后第14天從大鼠獲得的CSF(100μl)。用ELISA試劑盒(免疫學(xué)研究所(Institute of Immunology)，Tokyo)測(cè)定大鼠和人的HGF，而且人的VEGF也用ELISA試劑盒(R&D systems，Minneapolis，MN)測(cè)定。
7)實(shí)驗(yàn)材料用標(biāo)準(zhǔn)方法克隆人HGF的cDNA(專(zhuān)利2777678)，將其插入表達(dá)載體pcDNA(Invitrogen產(chǎn))并用作人HGF基因。
用標(biāo)準(zhǔn)方法克隆人VEGF165的cDNA(科學(xué)2461306(1989))，將其插入表達(dá)載體pUC-CAGGS(Invetrogen產(chǎn))并用作人VEGF基因。
使用人HGF cDNA(專(zhuān)利2777678)插入表達(dá)載體pcDNA(Invitrogen產(chǎn))產(chǎn)生的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(ATCC)或C-127細(xì)胞(ATCC)，并用標(biāo)準(zhǔn)方法從其培養(yǎng)基中純化人重組HGF，并使用該重組HGF。
基于上述材料和實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)施下列實(shí)施例1-4。
首先，將HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物直接注射頸內(nèi)動(dòng)脈，使其到達(dá)腦。然而，在上述頸動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈內(nèi)注射，注射后第3天和第7天在腦或微血管內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎沒(méi)有產(chǎn)生表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，將HVJ-脂質(zhì)體注射至側(cè)腦室和蛛網(wǎng)膜下隙。用HVJ-脂質(zhì)體法注射β-半乳糖苷酶基因在注射后第3天和第7天產(chǎn)生β-gal的顯著表達(dá)(圖1和圖2)。當(dāng)注射至側(cè)腦(lateral brain)時(shí)，主要在側(cè)腦室和脈絡(luò)膜叢(perichoroidal plexus)中觀察到β-gal表達(dá)。相反，當(dāng)注射至蛛網(wǎng)膜下隙時(shí)，在腦表面觀察到到β-gal表達(dá)。前面的結(jié)果揭示，當(dāng)要通過(guò)血管生成治療腦中血流量減少時(shí)，注射至蛛網(wǎng)膜下隙更佳。
然后，測(cè)定HGF基因(HVJ-脂質(zhì)體中的濃度20μg/ml)在頸動(dòng)脈阻塞之后即刻導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下隙的大鼠的CSF中人HGF蛋白的濃度。轉(zhuǎn)染后第7天，檢測(cè)到人HGF，但沒(méi)有大鼠HGF(圖3)。在頸動(dòng)脈阻塞的大鼠(1.63±0.16ng/ml)和未阻塞頸動(dòng)脈的大鼠(1.67±0.29ng/ml)之間沒(méi)有觀察到顯著差別。甚至在轉(zhuǎn)染后第14天，還檢測(cè)到人HGF(0.40±0.04ng/ml)(圖3)。
以類(lèi)似上述HGF基因的程序，將VEGF基因(HVJ-脂質(zhì)體中的濃度20μg/ml)導(dǎo)入蛛網(wǎng)膜下隙，結(jié)果CSF中人VEGF濃度比HGF低得多(圖4)(第7天；頸動(dòng)脈未阻塞的大鼠為18.9±2.9pg/ml，頸動(dòng)脈阻塞的大鼠為16.8±5.8pg/ml，第14天；頸動(dòng)脈未阻塞的大鼠為11.7±1.6pg/ml，頸動(dòng)脈阻塞的大鼠為9.9±1.5pg/ml)。這些差別的原因尚未知，但為了治療血流量慢性減少，通過(guò)應(yīng)用HGF引起血管生成看來(lái)是優(yōu)選的。
然后，測(cè)定用重組HGF(200μg)、HGF基因(HVJ-脂質(zhì)體中的濃度20μg/ml)和重組HGF與HGF基因的組合處理的大鼠。以實(shí)施例2和3類(lèi)似的方式向蛛網(wǎng)膜下隙注射HGF基因和重組HGF。每種處理在頸動(dòng)脈阻塞后10分鐘時(shí)進(jìn)行。在用重組HGF處理的大鼠中，與對(duì)照相比，沒(méi)有觀察到CBF顯著增加(對(duì)照886.1±99.6，重組HGF985.5±142.4)(圖7)。但是，在用HGF基因?qū)脒M(jìn)行的處理中，在阻塞后第7天CBF顯示顯著增加(1214.5±145.1)。而且，出乎意料地，在用重組HGF和HGF基因聯(lián)合導(dǎo)入處理的大鼠中，在第7天CBF比僅導(dǎo)入HGF基因高得多(1490.3±197.9)。這些結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)導(dǎo)入HGF基因產(chǎn)生的血管生成改善了腦血流量的慢性減少，而且，當(dāng)在動(dòng)脈阻塞后治療時(shí)，HGF基因和重組HGF的聯(lián)合是最有效的。
另一方面，因?yàn)閂EGF基因也增加CBF(1122.8±265.3)(圖7)，所以VEGF基因也顯示可有效改善腦中血流量減少。
其次，研究了在動(dòng)脈阻塞之前實(shí)施時(shí)所述處理的有效性。有趣的是，在動(dòng)脈阻塞之前用HGF基因或VEGF基因處理預(yù)防了由于頸動(dòng)脈阻塞引起的CBF減少(對(duì)照459.4±97.4，HGF796.4±204，VEGF737.6±211.5)(圖8)。這些結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)在缺血前遞送時(shí)，HGF基因和VEGF基因的導(dǎo)入可有效預(yù)防由動(dòng)脈阻塞引起的血流量減少。實(shí)驗(yàn)II關(guān)于HGF基因?qū)δX中神經(jīng)元死亡的抑制性作用的研究實(shí)驗(yàn)方法按上述實(shí)驗(yàn)I相同的方式制備本實(shí)驗(yàn)中使用的含有人HGF基因和人重組HGF的HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物。
在本實(shí)驗(yàn)中，使用雄性蒙古沙土鼠(Mongolian gerbils)(體重50-70g)。將動(dòng)物飼養(yǎng)在如下室內(nèi)，其中溫度維持在24℃，水和食物無(wú)限制供給。蒙古沙土鼠分為5組?！皊ham”對(duì)照組(未缺血刺激的組)，“vehicle”雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血5分鐘組，“post G”雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血5分鐘后導(dǎo)入HGF基因的組，“pre G”雙側(cè)頸動(dòng)脈5分鐘缺血前導(dǎo)入HGF基因的組，“post R”雙側(cè)頸動(dòng)脈5分鐘缺血后施用一次重組HGF基因的組。戴上面罩，進(jìn)行3％鹵烷的麻醉，并維持在1.5％鹵烷、20％氧氣和80％氮?dú)獾幕旌蠚怏w中。不斷檢測(cè)體溫(直腸溫度)以用熱墊板維持在37℃左右。暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈后，用血管夾完全阻斷血流5分鐘。然后釋放夾子以恢復(fù)血流。手術(shù)處理之前即刻或之后即刻，用HVJ-脂質(zhì)體法從蛛網(wǎng)膜下隙導(dǎo)入人HGF基因(20μg)至腦脊髓腔(cerebrospinal cavity)。手術(shù)處理之后立即從蛛網(wǎng)膜下隙給予重組HGF(30μg)至腦脊髓腔。手術(shù)后，將籠子維持在37℃等待出現(xiàn)康復(fù)。對(duì)照組以與其它組相同的方式處理，只是不阻斷血流。缺血后第4天和第7天，取出腦，并對(duì)切片進(jìn)行HE染色、TUNEL染色和免疫染色，然后進(jìn)行組織病理學(xué)分析。通過(guò)人HGF ELISA分析測(cè)定腦脊液中HGF的濃度。
基于上述實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行下面的實(shí)施例5。
通過(guò)在雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血5分鐘，在腦的海馬CA-1區(qū)觀察到延遲神經(jīng)元死亡(圖10，vehicle組)。相反，施用HGF基因(PreG組和PostG組)或重組HGF(PostR組)顯著抑制神延遲經(jīng)元死亡(圖11和圖12)。當(dāng)用ELISA法測(cè)定PostG組的腦脊液中HGF濃度時(shí)，甚至在7天后還觀察到HGF表達(dá)(圖13)。因此，說(shuō)明HGF可有效抑制由腦缺血引起的延遲神經(jīng)元死亡。
當(dāng)用免疫染色方法研究HGF受體c-Met的表達(dá)部位時(shí)，在CA-1區(qū)觀察到表達(dá)，說(shuō)明HGF信號(hào)通過(guò)c-Met傳遞(圖14)。
而且，當(dāng)用TUNEL法對(duì)CA-1區(qū)中發(fā)生細(xì)胞凋亡的神經(jīng)細(xì)胞染色時(shí)，在vehicle組觀察到大量神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(圖15)。相反，在HGF基因施用組(PreG組和PostG組)中檢測(cè)到只有少許細(xì)胞凋亡(圖15)。因此，HGF基因的施用被認(rèn)為抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。為了探索抑制機(jī)制，通過(guò)免疫染色檢查CA-1區(qū)中具有細(xì)胞凋亡抑制作用的Bcl-xl和HSP70的表達(dá)。Bcl-xL的表達(dá)顯示在圖16中，HSP70的表達(dá)顯示在圖17和圖18中。通過(guò)施用HGF基因證實(shí)了在神經(jīng)細(xì)胞中兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)。上文揭示，HGF基因的施用誘導(dǎo)了Bcl-xL和HSP70的表達(dá)，并抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可提供用于腦血管疾病的新的治療或預(yù)防劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分。本發(fā)明還提供新的施用方法，其包括向蛛網(wǎng)膜下隙施用所述治療或預(yù)防劑。
權(quán)利要求
1.腦血管疾病的治療或預(yù)防劑，所述藥劑包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的治療或預(yù)防劑，其中腦血管疾病是腦血管梗阻、腦梗死、腦血栓形成、腦栓塞、中風(fēng)、腦出血、煙霧陰影疾病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默癡呆和腦出血或腦梗死的后遺癥等。
3.腦中血流量減少的治療或預(yù)防劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分。
4.腦中血管生成的促進(jìn)劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分。
5.腦中神經(jīng)元死亡的抑制劑，其包含HGF基因作為活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的抑制劑，其中腦中神經(jīng)元死亡是腦缺血引起的延遲神經(jīng)元死亡。
7.腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制劑，其包含HGF基因作為活性成分。
8.權(quán)利要求1-7之任意一項(xiàng)的藥劑，其包含HGF基因和/或VEGF基因作為活性成分，并且其聯(lián)合HGF蛋白和/或VEGF蛋白一起使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥劑，其包括HGF基因作為活性成分，并且其聯(lián)合HGF蛋白一起使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任意一項(xiàng)的藥劑，其中HGF基因和/或VEGF基因采用HVJ-脂質(zhì)體的形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之任意一項(xiàng)的藥劑，其被施用至蛛網(wǎng)膜下隙中。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求1-11之任意一項(xiàng)的藥劑的方法，包括將HGF基因和/或VEGF基因與藥學(xué)上可接受的溶劑混合。
13.腦血管疾病的治療或預(yù)防方法，包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因。
14.血流量減少的治療或預(yù)防方法，包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因。
15.促進(jìn)腦血管生成的方法，包括向人導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因。
16.抑制腦中神經(jīng)元死亡的方法，包括向人導(dǎo)入HGF基因。
17.抑制腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的方法，包括向人導(dǎo)入HGF基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17之任意一項(xiàng)的方法，包括向人的蛛網(wǎng)膜下隙施用HGF基因和/或VEGF基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-18之任意一項(xiàng)的方法，包括施用HGF蛋白和/或VEGF蛋白并導(dǎo)入HGF基因和/或VEGF基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，包括施用HGF蛋白并導(dǎo)入HGF基因。
21.HGF基因和/或VEGF基因在制備腦血管疾病的治療或預(yù)防劑中的應(yīng)用。
22.HGF基因和/或VEGF基因在制備腦中血流量減少的治療或預(yù)防劑中的應(yīng)用。
23.HGF基因和/或VEGF基因在制備腦中血管生成的促進(jìn)劑中的應(yīng)用。
24.HGF基因在制備腦中神經(jīng)元死亡的抑制劑中的應(yīng)用。
25.HGF基因在制備腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
通過(guò)向人蛛網(wǎng)膜下隙導(dǎo)入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因和/或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因可有效治療或防止腦血管疾病,如腦血管梗阻、腦梗死、腦血栓形成、腦栓塞、中風(fēng)、腦出血、煙霧陰影疾病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默癡呆等。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1322143SQ00802004
公開(kāi)日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月21日
發(fā)明者森下龍一, 荻原俊男 申請(qǐng)人:森下龍一, 美得基因生物醫(yī)學(xué)株式會(huì)社