專利名稱：基因工程魚生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種新的魚生長激素，其制法，以及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
我國水產(chǎn)品生產(chǎn)以前是以海淡水捕撈為主，70年代開始提倡發(fā)展海淡水養(yǎng)殖，加之海洋捕撈資源衰退，目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在水產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。90年代海淡水養(yǎng)殖得到迅猛發(fā)展。目前我國我國水產(chǎn)品海淡水養(yǎng)殖的總量已躍居世界首位。主要養(yǎng)殖品種有對蝦，沼蝦、甲魚，河蟹，淡水魚等等。由于社會對水產(chǎn)品具有很大的需求量，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)己成為國民經(jīng)濟中不可缺少的一部分。以近十年來發(fā)展趨勢看，它將是21世紀(jì)的一個有前途的發(fā)展產(chǎn)業(yè)。
國內(nèi)外對魚類生長激素的研究始于八十年代，其體內(nèi)代謝，分泌調(diào)控及作用機制的研究為魚類生長激素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了理論基礎(chǔ)，八十年代后期，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，許多魚類生長激素基因被克隆，使采用基因工程技術(shù)制備魚類生長激素并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖成為可能。主要研究進(jìn)展有建立了放射免疫測定和酶聯(lián)免疫吸附測定等高靈敏度的魚類生長激素檢測方法；對多種魚類的生長激素體內(nèi)代謝動力學(xué)的研究表明，外源生長激素不會在魚體內(nèi)產(chǎn)生積累；魚類生長激素的分泌調(diào)控主要受下丘腦分泌的生長激素釋放因子和釋放抑制因子的雙重調(diào)節(jié)；已有幾十種魚類生長激素基因被分離、克隆、表達(dá)與序列分析。目前對魚類生長激素的作用機制的研究，包括魚類生長激素受體研究，生長激素對魚類的滲透調(diào)控原理，口服外源生長激素的作用方式，都有比較清楚的闡明。
采用基因工程技術(shù)表達(dá)魚類生長激素，利用魚生長激素促進(jìn)魚類生長的研究在國內(nèi)外均有報道，國外研究魚類生長激素的目的偏重于其作用機制和生理效應(yīng)的闡明，國內(nèi)研究單位較多偏重于魚類生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用。然而，尚沒有將基因工程的魚生長激素制劑大規(guī)模有效地用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的報道。因此，本領(lǐng)域迫切需要對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖品有刺激生長作用的新生長激素。此外，本領(lǐng)域還迫切需要高效和/或低成本地生產(chǎn)該類生長激素的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種新的生長激素-鰱魚生長激素(簡稱為“fGH”)，它對多種魚類、蝦類、蟹類和甲魚等有顯著的刺激生長的作用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種高效和/或低成本地生產(chǎn)該鰱魚生長激素的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述鰱魚生長激素的促進(jìn)生長的制劑。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種分離的鰱魚生長激素，它具有如下所示的氨基酸序列ATGTCAGAGAACCAGCGGCTCTTCAACAACGCAGTCATCCGTGTTCAACACCTGCACCAG 60MetSerGluAsnGlnArgLeuPheAsnAsnAlaValIleArgValGlnHisLeuMisGlnCTGGCTGCAAAAATGATTAACGACTTTGAGGACAACCTGTTGCCTGAGGAACGCAGACAG 120LeuAlaAlaLysMetIleAsnAspPheGluAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGlnCTGAGTAAAATCTTTCCTCTGTCTTTCTGCAACTCTGACTCCATTGAGGCGCCCACTGGA 180LeuSerLysIlePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerIleGluAlaProThrGlyAAAGATGAAACGCAGAAGAGCTCTATGTTGAAGCTCCTTCGCATCTCTTTCCGCCTCATT 240LysAspGluThrGlnLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArgIleSerPheArgLeuIleGAGTCCTGGGAGTTCCCCAGCCAGACCCTGAGCGGAGCCGTCTCAAACAGCTTGACCGTC 300GluSerTrpGluPheProSerGlnThrLeuSerGlyAlaValSerAsnSerLeuThrValGGTAACCCCAACCAGATCACTGAGAAGCTGGCCGACTTGAAAGTGGGCATCAGCGTGCTC 360GlyAsnProAsnGlnIleThrGluLysLeuAlaAspLeuLysValGlyIleSerValLeuATCAAGGGATGTCTGGATGGTCAACCAAACATGGATGATAACGACTCCCTGCCGCTGCCT 420IleLysGlyCysLeuAspGlyGlnProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuProLeuProTTTGAGGATTTCTACTTGACCATGGGGGAGAGCGACCTCAGAGAGAGCTTTCGTCTTCTG 480PheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluSerAspLeuArgGluSerPheArgLeuLeuGCTTGCTTCAAGAAGGACATGCACAAGGTGGAAACTTACCTAAGGGTTGCAAATTGCAGG 540AlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgAGATCCCTGGATTCAAACTGCACCCTGTAG570ArgSerLeuAspSerAsnCysThrLeu*** 。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發(fā)明的鰱魚生長激素。本發(fā)明還提供了含有所述DNA序列的表達(dá)載體，以及含有所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)鰱魚生長激素的方法，它包括步驟(a)在適合表達(dá)鰱魚生長激素的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有鰱魚生長激素。
在本發(fā)明的一個實例中，分離步驟(b)是如下進(jìn)行的離心收集菌體；
破碎菌體；收集包涵體；洗滌包涵體；溶解包涵體；和透析復(fù)性。
在本發(fā)明的另一實例中，該方法還包括在透析復(fù)性之后，對復(fù)性后的鰱魚生長激素進(jìn)行DEAE-Sepherose柱層析；用G-25 Sepharose脫鹽；再經(jīng)C8柱HPLC反向?qū)游?，從而進(jìn)一步純化鰱魚生長激素。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的生長促進(jìn)制劑，它含有本發(fā)明的鰱魚生長激素作為主要成分，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖上可接受的載體。較佳地，該鰱魚生長激素是通過重組的鰱魚生長激素。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在附圖中，

圖1顯示了獲得鰱魚生長激素產(chǎn)品的技術(shù)路線。
圖2是質(zhì)粒pET-5a(Novagen公司產(chǎn)品)的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示了鰱魚生長激素的核苷酸序列和氨基酸序列。
圖4顯示了質(zhì)粒pUC18fGH、pET-5F612和pET-5F567的構(gòu)建過程。
本說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語除非特別說明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，有義鏈或反義鏈。類似地，術(shù)語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的鰱魚生長激素”是指鰱魚生長激素基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化鰱魚生長激素?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。鰱魚生長激素多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明提供了一種新的多肽—鰱魚生長激素，它具有圖3所示的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的鰱魚生長激素核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用TLP23編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，例如pUC，pET-5a等。
在本發(fā)明的一個實施例中，首先，本發(fā)明的發(fā)明人在分析了已知的生長激素基因序列后，用RT-PCR方法從鰱魚的腦垂體中得到了鰱魚生長激素基因的cDNA，并構(gòu)建了含T7啟動子的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-5F567，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，完成了基因工程菌的構(gòu)建，表達(dá)的重組鰱魚生長激素蛋白占細(xì)胞總蛋白的20％以上，達(dá)到了比較高的基因表達(dá)水平。
然后，本發(fā)明人建立了用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組鰱魚生長激素的技術(shù)。即通過高密度發(fā)酵技術(shù)，使單位體積發(fā)酵液中的外源蛋白表達(dá)量保持穩(wěn)定的技術(shù)，發(fā)酵密度為A600＝30，表達(dá)量為600mg/L。建立了包括菌體破碎，包涵體收集、洗滌，包涵體溶解，蛋白質(zhì)復(fù)性、純化和凍干等步驟的鰱魚生長激素的制備技術(shù)。
再次，發(fā)展了將重組鰱魚生長激素用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖的方法。通過實驗，掌握了使用鰱魚生長激素，提高水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量的方法。使鰱魚生長激素的使用范圍擴大，不僅僅適用于魚類養(yǎng)殖，也適用于蝦，蟹，鱉類的養(yǎng)殖。
本發(fā)明的的鰱魚生長激素，可廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，應(yīng)用范圍包括魚類，蝦類，蟹類和鱉等。魚類生長激素能夠促進(jìn)魚體蛋白質(zhì)的合成，產(chǎn)生正氮平衡，提高肝臟或肌肉細(xì)胞對氨基酸的吸收率和RNA的合成率，達(dá)到提高食物的轉(zhuǎn)化率，從而促進(jìn)魚體生長的目的。外源生長激素在魚體內(nèi)不會產(chǎn)生積累，并能夠增加魚體蛋白質(zhì)的合成、增強魚體對餌料中必需氨基酸的吸收，提高魚肝臟脂肪分解酶活力，促進(jìn)脂肪的分解以作為能量物質(zhì)促進(jìn)魚體生長。改變我國現(xiàn)有水產(chǎn)養(yǎng)殖的面貌，發(fā)展出先進(jìn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，縮短水產(chǎn)品養(yǎng)殖周期，提高產(chǎn)量，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的效益。為社會提供優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品。滿足社會需求具有重大意義。
本發(fā)明還提供了用基因工程生產(chǎn)的鰱魚生長激素和含該鰱魚生長激素的、用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的生長促進(jìn)制劑。它含有本發(fā)明的鰱魚生長激素作為主要成分，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖上可接受的載體。在本發(fā)明的一個實施例中，在大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)了基因工程鰱魚生長激素。經(jīng)過基因工程菌發(fā)酵，破碎菌體，包涵體收集、洗滌和溶解，重組蛋白復(fù)性，離子交換柱層析純化等工藝，獲得了能滿足用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的質(zhì)量要求的基因工程鰱魚生長激素。該產(chǎn)品為易溶于水的白色固體粉劑，在常溫下穩(wěn)定，保質(zhì)期為六個月。
如本文所用，“水產(chǎn)養(yǎng)殖上可接受的載體”指在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常規(guī)采用的各種對魚、蝦等水產(chǎn)動物無毒、無害的物質(zhì)。適用于本發(fā)明的水產(chǎn)養(yǎng)殖上可接受的載體包括(但并不限于)水、緩沖液(如Tris-HCl緩沖液)、餌料等。在制得的用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的生長促進(jìn)制劑中，鰱魚生長激素的含量沒有特別限制。例如對于未稀釋型產(chǎn)品，本發(fā)明鰱魚生長激素的含量可高至95％，通常為10-90％，較佳地30-80％(重量)。對于直接使用的制劑(如含鰱魚生長激素的餌料)，鰱魚生長激素的含量可低至0.001％，通常為0.001-5％，較佳地為0.01-1％(重量)。
研究表明使用鰱魚生長激素后，對養(yǎng)殖對象無任何毒副作用并不在其體內(nèi)殘留，對養(yǎng)殖對象肌肉中蛋白質(zhì)，脂肪，氨基酸等組分也不產(chǎn)生化學(xué)異質(zhì)性。委托上海浦東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，東海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖場，蘇州市華夏甲魚養(yǎng)殖技術(shù)研究所，江蘇省太湖漁業(yè)生產(chǎn)管理委員等通過浸泡處理和餌料飼喂的方法對基因工程鰱魚生長激素進(jìn)行促生長效應(yīng)測試，試驗對象有金魚，錦鯉，鱖魚，對蝦，河鰻、中華鱉、中華絨螯蟹等。試驗結(jié)果表明使用魚生長激素能明顯加快個體的生長速度，在相同的飼養(yǎng)時間段內(nèi)平均增重10％-20％。
綜上所述，本發(fā)明與國內(nèi)外同類技術(shù)相比有以下特點，[1]魚生長激素基因表達(dá)水平高，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的20％以上。[2]在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用范圍比較廣，可應(yīng)用于金魚，錦鯉，鱖魚，對蝦，河鰻、中華鱉、中華絨螯蟹等水產(chǎn)品的養(yǎng)殖。[3]使用方法簡單易行，不對水生動物產(chǎn)生傷口或應(yīng)激反應(yīng)。[4]在基因工程魚生長激素的制備工藝中，根據(jù)其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的要求，充分考慮了經(jīng)濟合理的原則，制備成本較一般基因工程產(chǎn)品為低，預(yù)計其銷售價格能夠控制在較低的范圍內(nèi)。使用后對飼養(yǎng)成本增加不大，但收益增加十分可觀，具有很好的推廣應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1鰱魚生長激素(fGH)基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建用手術(shù)刀切開鰱魚魚頭部位，在魚腦底部一個小窩內(nèi)可見一粒白色組織，這就是腦垂體，取出后立即凍入液氮中，-70C保存。
根據(jù)已知的銀鯽生長激素基因的序列，設(shè)計并合成了兩個引物引物(1)5’-TCGAATTCCTACAGGGTGCAGTTTGAAT-3’引物(2)5’-TCGGATCCACGGCCTCAGAGAACCAGCG-3’從凍存的腦垂體組織中提取出總mRNA，然后用引物(1)和(2)通過RT-PCR方法得到了約600bp左右的cDNA片段，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切純化后，在質(zhì)粒pUC18相應(yīng)的BamHI和EcoRI位點之間插入此片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α宿主，得到質(zhì)粒pUC18fGH(參見圖4)。
從轉(zhuǎn)化板上挑選白斑單克隆菌株進(jìn)行酶切鑒定，選擇正確的菌株進(jìn)行序列測定，序列如圖3所示。
與已知的銀鯽序列比較，只有C端附近的一個Gly(GGG)改變?yōu)镚lu(GAG)，其余氨基酸序列相同。
用BamHI和EcoRI將鰱魚生長激素(fGH)基因從pUC18fGH上切下，將此片段插入用BamHI和EcoRI酶切的表達(dá)載體pET-5a(圖2)的相應(yīng)位點之間，就得到了帶有6個融合肽表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒pET-5F612，融合蛋白大小22.6kD(參見圖4)。
為了進(jìn)一步提高鰱魚生長激素的表達(dá)，另行設(shè)計并合成了一個N端含NdeI位點的引物(3)5’-CCCATATGTCAGAGAACCAGCGGCTC-3’用引物(3)與原來已有的含EcoRI位點的引物(2)以pET-5F612為模板進(jìn)行PCR擴增，得到的基因片段5’端有NdeI位點，3’端有EcoRI位點，將此片段的NdeI位點做成平端，EcoRI位點做成粘端，插入載體質(zhì)粒pET-5a相應(yīng)的NdeI和EcoRI位點之間，經(jīng)測序證明，得到了不帶融合肽的表達(dá)質(zhì)粒pET-5F567(圖4)。轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小為21kD左右，以包涵體形式出現(xiàn)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的20％以上。
實施例2鰱魚生長激素基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)和分離純化從新鮮轉(zhuǎn)化的Amp平板上挑取一個單克隆菌株，轉(zhuǎn)接100mlLB搖瓶，37℃培養(yǎng)過夜，一級種子接入10L發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，4小時后進(jìn)入對數(shù)生長期，1mMIPTG誘導(dǎo)，半小時后開始連續(xù)補料30％胰化蛋白胨，30％酵母提取物，50％甘油，維持pH7.0左右。選擇了高密度發(fā)酵的方法，提高了單位體積發(fā)酵液中的外源蛋白表達(dá)量，表達(dá)量基本穩(wěn)定在600mg/L，發(fā)酵密度A600＝30。
將培養(yǎng)好的菌體發(fā)酵液于4℃，4000rpm，30min離心，收集菌體。用Tris-EDTA緩沖液充分懸浮菌體，于400公斤壓力下勻漿破菌，循環(huán)勻漿兩次至菌液不再粘稠，在此過程中保持低溫冰浴。再次于4℃，8000rpm，20min離心，收集沉淀部分，洗滌數(shù)次，就得到了包涵體粗品。用超聲波儀繼續(xù)洗滌，包涵體的蛋白純度為60％。
用8M的尿素溶液將包涵體充分溶解，進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性在4℃條件下進(jìn)行48小時，其間10小時左右更換一次復(fù)性液。經(jīng)離心去除不溶物，上清液為復(fù)性后的鰱魚生長激素溶液，純度80％以上。經(jīng)冷凍干燥后保存。凍干樣品可根據(jù)實際需要的濃度用水稀釋使用，直接用于水產(chǎn)魚苗，蝦苗等的浸泡或飼料喂養(yǎng)。
實施例3
鰱魚生長激素的鑒定復(fù)性后的鰱魚生長激素溶液用DEAE-Sepherose柱層析純化，收集蛋白單峰，純度可達(dá)80％以上；用G-25Sepharose脫鹽，再經(jīng)C8柱HPLC反相層析，收集蛋白單峰，產(chǎn)品純度達(dá)90％以上。純品可用于質(zhì)譜，蛋白序列等指標(biāo)的鑒定。
質(zhì)譜測定鰱魚生長激素蛋白純品的分子量為21,543道爾頓。
N端氨基酸序列測定鰱魚生長激素蛋白樣品的N端前16個氨基酸順序為Met Ser Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln。與預(yù)計的鰱魚生長激素氨基酸序列(圖3)相一致。
實施例4鰱魚生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用中科院上海生物工程研究中心在實驗室飼養(yǎng)缸中對金魚進(jìn)行試驗的結(jié)果為經(jīng)鰱魚生長激素浸泡的金魚幼苗18個月后平均重量為410克，最大個體重量近600克，比對照組平均重量有明顯增長。其它種類的水產(chǎn)品大田養(yǎng)殖委托有關(guān)單位開展的試驗，結(jié)果如下[1]中國水產(chǎn)科學(xué)研究所東海水產(chǎn)研究所用鰱魚生長激素對中華對蝦和鰻鱺進(jìn)行對比試驗鰱魚生長激素的使用方法用Tris-HCl緩沖液將鰱魚生長激素配制成溶液，放置在低溫下備用，每次投餌料前按每公斤配合餌料加20毫升鰱魚生長激素溶液的比例，將餌料浸泡在鰱魚生長激素溶液中5-10分鐘，取出陰干10分鐘后投喂。
或者，將鰱魚生長激素混合在原料中配制成配合餌料。
結(jié)果中華對蝦
鰻鱺
試驗結(jié)果表明中華對蝦在125天的飼養(yǎng)試驗期內(nèi)，使用鰱魚生長激素后能增重20％左右。鰻鱺在43天的飼養(yǎng)試驗期內(nèi)，使用鰱魚生長激素后能增重10％左右。上海浦東孫橋名特水產(chǎn)開發(fā)有限公司用鰱魚生長激素對中華絨鰲蟹的養(yǎng)殖進(jìn)行對比試驗的結(jié)果
試驗表明中華絨鰲蟹在130天的試驗期內(nèi)，使用鰱魚生長激素能增重20％左右。蘇州華夏甲魚養(yǎng)殖技術(shù)研究所用鰱魚生長激素對中華鱉進(jìn)行對比試驗的結(jié)果
試驗表明中華鱉在303天的飼養(yǎng)試驗期內(nèi)，使用鰱魚生長激素能夠增重10％左右。上海錦洋觀賞魚有限公司用鰱魚生長激素對錦鯉魚養(yǎng)殖對比試驗的結(jié)果
試驗表明錦鯉魚在144天的試驗期內(nèi)，使用鰱魚生長激素后錦鯉魚長度能增加20％左右。
從以上的研究結(jié)果看，鰱魚生長激素對金魚，鰻鱺，對蝦，甲魚，中華絨鰲蟹和錦鯉魚的生長均有明顯的促進(jìn)作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的鰱魚生長激素，其特征在于，它具有如下所示的氨基酸序列ATGTCAGAGAACCAGCGGCTCTTCAACAACGCAGTCATCCGTGTTCAACACCTGCACCAG 60MetSerGluAsnGlnArgLeuPheAsnAsnAlaValIleArgValGlnHisLeuHisGlnCTGGCTGCAAAAATGATTAACGACTTTGAGGACAACCTGTTGCCTGAGGAACGCAGACAG120LeuAlaAlaLysMetIleAsnAspPheGluAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGlnCTGAGTAAAATCTTTCCTCTGTCTTTCTGCAACTCTGACTCCATTGAGGCGCCCACTGGA180LeuSerLysIlePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerIleGluAlaProThrGlyAAAGATGAAACGCAGAAGAGCTCTATGTTGAAGCTCCTTCGCATCTCTTTCCGCCTCATT240LysAspGluThrGlnLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArgI1eSerPheArgLeuIleGAGTCCTGGGAGTTCCCCAGCCAGACCCTGAGCGGAGCCGTCTCAAACAGCTTGACCGTC300GluSerTrpGluPheProSerGlnThrLeuSerGlyAlaValSerAsnSerLeuThrValGGTAACCCCAACCAGATCACTGAGAAGCTGGCCGACTTGAAAGTGGGCATCAGCGTGCTC360GlyAsnProAsnGlnIleThrGluLysLeuAlaAspLeuLysValGlyIleSerValLeuATCAAGGGATGTCTGGATGGTCAACCAAACATGGATGATAACGACTCCCTGCCGCTGCCT420IleLysGlyCysLeuAspGlyGlnProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuProLeuProTTTGAGGATTTCTACTTGACCATGGGGGAGAGCGACCTCAGAGAGAGCTTTCGTCTTCTG480PheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluSerAspLeuArgGluSerPheArgLeuLeuGCTTGCTTCAAGAAGGACATGCACAAGGTGGAAACTTACCTAAGGGTTGCAAATTGCAGG540AlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgAGATCCCTGGATTCAAACTGCACCCTGTAG 570ArgSerLeuAspSerAsnCysThrLeu*** 。
2.一種分離的DNA序列，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的鰱魚生長激素。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的DNA序列。
4.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
6.一種生產(chǎn)鰱魚生長激素的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合表達(dá)鰱魚生長激素的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有鰱魚生長激素。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，分離步驟(b)是如下進(jìn)行的離心收集菌體；破碎菌體；收集包涵體；洗滌包涵體；溶解包涵體；和透析復(fù)性。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該方法還包括在透析復(fù)性之后，對復(fù)性后的鰱魚生長激素進(jìn)行DEAE-Sepherose柱層析；用G-25 Sepharose脫鹽；再經(jīng)C8柱HPLC反向?qū)游觯瑥亩M(jìn)一步純化鰱魚生長激素。
9.一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的生長促進(jìn)制劑，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的鰱魚生長激素作為主要成分，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的生長激素——鰱魚生長激素(簡稱為“fGH”),它對多種魚類、蝦類、蟹類和甲魚等有顯著的刺激生長的作用。本發(fā)明還提供一種高效和/或低成本地生產(chǎn)該鰱魚生長激素的方法,以及含有上述鰱魚生長激素的促進(jìn)生長的制劑。試驗結(jié)果表明本發(fā)明的鰱魚生長激素能明顯加快個體的生長速度,在相同的飼養(yǎng)時間段內(nèi)平均增重10%－20%。
文檔編號A61K38/27GK1328061SQ0011639
公開日2001年12月26日 申請日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者龔毅, 趙蓉, 陸瑋, 虞谷松, 陳燕 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心