專利名稱：利用生物物質(zhì)從香煙煙氣中除去有害的氧化劑和致癌的揮發(fā)性亞硝基化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提出了一種防止吸煙時(shí)吸入有害化合物，即氧化氮、自由基、醛、過氧化氫、一氧化碳、微量元素和致癌的揮發(fā)性亞硝基化合物的方法，這些物質(zhì)迄今尚不能被常規(guī)的香煙濾嘴有效濾除。
國際期刊上的很多文章都提出，香煙煙氣可分為兩相；a)固相(焦油)；和b)氣相。這種分離在使用典型的劍橋玻璃纖維時(shí)會發(fā)生，這種纖維能留住99.9％的粒度大于0.1μm的微粒。香煙焦油含有極高濃度的、非常穩(wěn)定的自由基，這些自由基至少可分為四種不同的類型。與醌和羥醌平衡的半醌被認(rèn)為是具有最有趣的化學(xué)特性的自由基。該醌系統(tǒng)將分子氧還原成超氧化物(O2)，后者通過自發(fā)歧化生成過氧化氫(H2O2)。在被吸入的氣相中，每一口煙里面有1015個半衰期不足1秒的有機(jī)基團(tuán)?？雌饋砻艿氖?，盡管其半衰期很短，但它們在氣相中維持較高活性的時(shí)間達(dá)10分鐘以上。事實(shí)上，在靠近香煙濾嘴末端的地方，上述自由基的濃度明顯提高了。對這種矛盾的一種解釋是出現(xiàn)了持續(xù)的穩(wěn)態(tài)情形；因?yàn)樽杂苫粩喈a(chǎn)生(Pryor，W.A.，stone，K.，Ann.N.Y.Acad.Sci.68612-28，1993)。
氧化氮(NO)是吸煙時(shí)煙氣氣相中最重要的自由基，它參與生成二氧化氮、異戊二烯基、過氧化氫基和烷氧基的一系列反應(yīng)。煙氣中還含有構(gòu)成其毒害作用的相當(dāng)數(shù)量的醛類。已經(jīng)證實(shí)，從煙氣中提取出的微量醛類可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解代謝和血漿蛋白質(zhì)巰基的氧化。醛類的這些特性是由于醛的羰基與血漿蛋白質(zhì)的-SH基和-NH2基之間的反應(yīng)導(dǎo)致的。例如，煙氣中的丙烯醛快速同-SH基反應(yīng)生成羰基化合物(Alving，K.，F(xiàn)orhem，C.，和Lundberg，J.M.，Br.J.Pharmacol.110739-746，199 3)。煙氣焦油中含有微量元素，如鐵、銅、錳和鎘，它們涉及到很多的自由基產(chǎn)生反應(yīng)，并導(dǎo)致極為活躍的二級基團(tuán)的形成(例如，過氧化氫基、烷氧基、超氧化物、細(xì)胞毒性醛類等)。吸煙時(shí)進(jìn)入肺部的微量元素會導(dǎo)致肺液和肺泡巨噬細(xì)胞的一系列氧化還原反應(yīng)，這些反應(yīng)會導(dǎo)致很活躍的羥基(OH-)的形成。這些羥基主要是在存在鐵的條件下通過芬頓反應(yīng)(Fento reaction)生成的。銅在肺部通過與過氧化氫反應(yīng)也能生成羥基。低濃度的錳(10-7M)能激活肺內(nèi)皮細(xì)胞的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，從而通過一個正反饋機(jī)制生成氧化氮和超氧化物(Youn，Y.K.Lalo-nde，C.，和Demling，R.，F(xiàn)ree Rad.Biol.Med.12409-415，1992)。煙草燃燒時(shí)會產(chǎn)生一氧化碳，即使在吐出煙氣以后仍有一定量的CO留在肺里，它在與肺組織的內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞里的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的血紅素部分反應(yīng)之后將其激活。與正反饋機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞中環(huán)GMP的較高含量會增加氧化氮和超氧化物的產(chǎn)生(Watson，A.，Joyce，H.，Hopper，L.，和Pride，N.B.，Thorax48119-124，1993)。NO氣體可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括維管內(nèi)皮細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞，能導(dǎo)致平滑肌松馳(Lowenstein，C.J.，Din-erman，J.L.，Snyder，S.H.Ann.Intern.Med.120227-237，1994)。還有被認(rèn)為同樣會損害血管和其它組織的外源NO。業(yè)已證實(shí)，仲胺和叔胺可與亞硝酸根和其它亞硝基化劑反應(yīng)以生成N-亞硝胺(Low-enstein，C.J.，Dinerman，J.L.，Snynder，S.H.Ann.Intern.Med.120227-237，1994)。自1974年以來，很多研究都證實(shí)，在收獲、煙草加工和吸煙時(shí)，生物堿被亞硝基化成煙草專一性N-亞硝胺(TSNA)。在煙草和/或其煙氣中鑒定的TSNA中，N-亞硝基去甲煙堿(NNN)，4-(甲基亞硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)和4-(甲基亞硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)是強(qiáng)動物致癌物。NNN會誘發(fā)家鼠肺部腫瘤，倉鼠氣管腫瘤和大鼠鼻腔和食管腫瘤。NNK會誘發(fā)家鼠、倉鼠和大鼠的肺癌，以及大鼠肝癌、鼻腔癌和胰腺癌?？谇粌?nèi)拭抹NNN和NNK混合物能誘發(fā)大鼠口腔癌和肺癌。生流煙氣中NNK和NNN的一般含量為200ng/支煙(Hecht，S.S.，Spr-att，T.E.，和Trushin，N.Carcinogenesis，9161-165，1988)。
發(fā)明人目前有關(guān)煙氣對肺組織的影響的研究業(yè)已揭示出NO與超氧化物反應(yīng)生成強(qiáng)氧化基團(tuán)過亞硝酸鹽(ONOO-)，它會導(dǎo)致重要生物分子的次級損壞反應(yīng)。在我們的實(shí)驗(yàn)室中通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了NO在細(xì)胞中的代謝和破壞作用。
當(dāng)存在氧氣時(shí)，NO被氧化成二氧化氮(NO2)。其氧化速度取決于氧的濃度和NO濃度的平方。已清楚二氧化氮的細(xì)胞毒性，當(dāng)它進(jìn)入水溶液中時(shí)會轉(zhuǎn)變成亞硝酸根和硝酸根。而且，NO可與微量元素和/或金屬蛋白，如血紅蛋白形成配合物(Wink，D.A.，Darbyshire，J.F.，Nims，R.W.，Saavedra，J.E.，和Ford，P.E.，Chem.Res，Toxicol.623-27，1993)。
NO與超氧化物反應(yīng)生成有害化合物ONOO-，可證實(shí)幾種超氧化物毒性。就其強(qiáng)氧化電勢(+1.4V)而言，ONOO-異常穩(wěn)定。在其分解過程中，它會生成強(qiáng)氧化衍生物，包括羥基、二氧化氮和硝鎓離子。因此，組織對NO和超氧化物產(chǎn)生的任何改進(jìn)都會導(dǎo)致強(qiáng)次級氧化基團(tuán)的生成(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrid-es，J.C.，Cancer Mol.Biol.177-86，1994)。最終，ONOO-及其酯(RO-ONO或RO-ONO2)能導(dǎo)致α-1-蛋白酶抑制劑(α1PI)失活。這一點(diǎn)可由以下事實(shí)證實(shí)a)僅有過氧化氫還不能使α1PI快速失活，只有在存在NO時(shí)才發(fā)生作用，生成ONOO-并使α1PI快速失活，b)叔丁基過亞硝酸鹽(RO-O-O-NO2)或ONOO-溶液本身就能使α1PI失活，以及c)胺和氨基酸能防止α1PI蛋白酶快速失活(Mor-eno，J.J.，和Pryor，W.A.，Chem.Res.Toxicol.5425-431，1992)。除煙氣中所含的自由基以外，對吸煙者來說被激活的肺泡巨噬細(xì)胞是另一個重要的自由基產(chǎn)生源。被煙氣激活的肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致更多的有氧自由基(主要是O2-，NO和H2O2)的產(chǎn)生。吸煙者有更大數(shù)量的肺泡巨噬細(xì)胞和循環(huán)中性白細(xì)胞。煙氣中的有氧自由基也與肺癌的發(fā)生有關(guān)。吸入的煙氣使得肺細(xì)胞氧化應(yīng)力提高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑濃度下降。H2O2通過羥基的產(chǎn)生與細(xì)胞中DNA生反應(yīng)，并導(dǎo)致雙鏈斷裂。由于這種斷裂可通過添加過氧化氫酶得以避免，這就間接證實(shí)了H2O2和羥基對細(xì)胞DNA的破壞作用(Leanderson，P.，Ann.N.Y.Acad.Sci.686249-261，1993)。此外，H2O2能導(dǎo)致肺部氣管上皮的變化，并同吸煙者支氣管癌的發(fā)病有關(guān)。因此，H2O2(煙氣中所含)對肺細(xì)胞的損害作用和對肺癌發(fā)病的作用得到了有力的證實(shí)。煙氣焦油既含有半醌基，又含有鐵，因而形成了一種羥基產(chǎn)生系統(tǒng)。煙氣焦油中所含的各種微量元素(Fe、Cu、Mn、Cd)既可作用于細(xì)胞內(nèi)，又可作用于細(xì)胞間。Fe2+能發(fā)生已知的芬頓反應(yīng)通過羥基可導(dǎo)致多種氧化反應(yīng)。類似地，Cd2+也可導(dǎo)致羥基產(chǎn)生。Mn2+是可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的代表性激活劑。煙氣中所含的Cd2+對肺的危害尤其大。吸煙者肺中Cd2+的含量為正常濃度的2倍。這表明，Cd2+取代了肺管上皮中正常存在的Zn2+(Kostial，K.，見.“TraceElements in Human and Animal Nutrition(ed.W.Mertz)第五版，Vol.2319-345，Academic Press，Inc.Orlando，F(xiàn)l.，1986)。存在于煙氣中的醛與蛋白質(zhì)中的-SH和-NH2基反應(yīng)，最終變成惰性的。煙氣中所含的丁烯醛(α，β不飽和醛類)能降低-SH基濃度，并提高羰基蛋白質(zhì)的濃度(Stadtman，E.R.，Science 2571220-1224，1991)。
今天，香煙上的濾嘴備受推崇。在香煙上加裝濾嘴的終極目標(biāo)是能最大限度地留住氣相和固相煙氣中的有害化合物。對吸煙者的流行病學(xué)研究業(yè)已證實(shí)，無論是以氣相、固相或混合相攝入煙氣，發(fā)病都與劑量正相關(guān)(Surgeon General of the U.S.Public Hea-lth Service.The health Consequences of using smokelesstobacco，N.H.Publ.No 862874，Bethesda，MD，1986)。業(yè)已證實(shí)，對煙草進(jìn)行改進(jìn)本身就是減少煙氣中有害化合物含量的實(shí)用途徑。起初是這樣實(shí)現(xiàn)的；采用普通過濾嘴，然后通過化學(xué)處理改變煙草的組成。還可以通過采用多孔紙或由煙葉制成的紙對香煙生產(chǎn)加以改進(jìn)。在過去15年里，已做出減少吸煙對健康危害的很多嘗試，有以下措施減少每支香煙的煙量改變香煙直徑；以及采用多孔過濾嘴。多孔過濾嘴能夠用空氣把煙氣稀釋50％?；钚蕴恳才c多孔過濾嘴結(jié)合在一起使用。這樣可以顯著減少煙氣中的焦油和尼古丁。該技術(shù)尤其在發(fā)達(dá)國家像奧地利、加拿大、法國、德國、瑞典、英國和美國得到采用。美國香煙中焦油和尼古丁的含量分別從1955年時(shí)的38mg和2.7mg降至1991年時(shí)的13mg和1mg。在歐共體，這種降低煙氣中焦油和尼古丁含量的趨勢仍在繼續(xù)。1993年1月時(shí)焦油的允許上限為15mg，到1998年1月初，這一上限將下降到12mg。但在其它國家，煙氣中焦油含量為22mg(Mitacek，E.J.，Brunne-man，K.D.，Pollednak，A.P.，Hoffman，D.，和Suttajit，M.，Prev.Med.20764-773，1991)。香煙生產(chǎn)中所作的改進(jìn)導(dǎo)致特導(dǎo)性地除去煙氣中的一些有毒物質(zhì)；更具體地說，引入了乙酸纖維素濾嘴，因而可以部分地除去半揮發(fā)性的酚和揮發(fā)性N-亞硝胺(Bru-nnemann，K.D.，Hoffman，d.，Recent.Adv.Tobacco Res.1771-112，1989)。采用多孔過濾嘴，可選擇性地減少CO。采用富含亞硝酸鹽的煙草，可選擇性地降低致癌的多核芳烴(PAH)的濃度。但是，通過高濃度的亞硝酸鹽來降低煙草的PAH會導(dǎo)致不希望的致癌N-亞硝胺的增加，因此，必須用其它方法來減少PAH(Hoffman，D.，Hoffman，I.，Wynder，E.L.，Lung Cancer and the ChangingCigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-comp-ounds，Tobacco Smoke and Mycotoxins(eds.O′Neil，I.K.，Chen，J.，和Bartsch，H.)Vol.105449-459，1991)。
通過以上說明可清楚地看到，有必要制造一種能留住有害NO，自由基，H2O2，醛類和致癌的亞硝基化合物的過濾嘴，這些物質(zhì)都對煙氣對呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的損害作用負(fù)責(zé)。為了鑒定煙氣中的有害化合物，我們做了化學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行的化學(xué)實(shí)驗(yàn)有
a)用一種新的化學(xué)和生物學(xué)方法(該方法是由我們的實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立的)鑒定并定量測定NO和NOx。
b)采用依賴于光澤精的化學(xué)發(fā)光方法鑒定自由基。
c)通過激活熒光素-熒光素酶酶促系統(tǒng)鑒定醛類和醌類(該方法也是由我們實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立的)。
d)在存在ATP的條件下，通過由熒光素酶實(shí)現(xiàn)的氧化熒光素的方法鑒定并定量測定微量元素(該方法由我們實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立)。
e)采用依賴于異魯米諾微過氧化物酶(isoluminolmicroperox-idase)的化學(xué)發(fā)光方法鑒定并定量測定H2O20f)通過魯米諾增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光方法對ONOO-進(jìn)行分光光度鑒定和定量測定。
g)通過魯米諾增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光鑒定致癌的亞硝基化合物。
所進(jìn)行的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如下a)用提取的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶活性作為功能參數(shù)鑒定NO。
b)通過對由ONOO-引起的人血紅細(xì)胞氧化應(yīng)力(oxidativestress)的測定鑒定ONOO-。
c)用提取的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶活性作為功能參數(shù)鑒定CO。
此外，我們還做了以下體外實(shí)驗(yàn)a)從大鼠肺部提取肺泡巨噬細(xì)胞。
b)測定由叔丁基過氧化氫(t-BHP)引起的肺泡巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)力。
c)測定由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO/NO2-/ONOO-。
d)測定由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的H2O20e)外源H2O2對由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用。
為了測定以下化合物，用人類志愿者做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)a)測定不吸煙者吐出的空氣中的NO。
b)測定吸煙者吐出的空氣中的NO。
c)測定吐出的煙氣中的NO。
d)測定吐出的煙氣中的ONOO-。
e)測定吐出的煙氣中的自由基。
f)測定吐出的煙氣中的醛類。
為了測定a)煙氣中的，b)在用煙氣攻擊以后由肺泡巨噬細(xì)胞釋出的和c)由志愿者吐出的煙氣中所含的NO，NOx，我們用一個直徑為2.5cm的透明有機(jī)玻璃實(shí)芯棒設(shè)計(jì)并制造了一個腔室，用機(jī)床將實(shí)芯有機(jī)玻璃棒的一端鏤空，在每根有機(jī)玻璃棒上制造出相同的錐形腔。然后對開口端作進(jìn)一步的機(jī)加工和拋光，以制成匹配的楔形結(jié)合，在兩個錐形腔之間形成非常緊的結(jié)合。將一個薄的特氟隆(te-flon)片(厚O.0015英寸的聚四氟乙烯)夾在上述組件之間，通過蝶形螺釘將其再壓在一起。膜兩側(cè)的兩個可用管進(jìn)入部分可在生物反應(yīng)期間在膜的任意一側(cè)注入、抽出或修飾生物活性樣品和活性物質(zhì)。
A、通過化學(xué)發(fā)光測定NO按照文獻(xiàn)制備標(biāo)準(zhǔn)NO溶液(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，F(xiàn)assitsas，C.，(1992)J.Cardiovasc.Pharmacol.12，S63-S65)和(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrides，J.C.，(1994)見“Biology of Nitric Oxide”，eds.Feelish，M.，Busse，R.，Moncanda，S.，Portland Press，印刷中)。反應(yīng)溶液由漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)pH 7.4；H2O2(500μM)；魯米諾(30μM)組成，總體積為500μl。劇烈攪拌小瓶，然后在Bedrthold Auto-Lumat LB953發(fā)光計(jì)上記錄發(fā)光。
B、NO/NO2-的化學(xué)測定。
NO的化學(xué)測定是基于酸性pH下NO對磺胺的重氮化作用以及隨后莨菪亭的氧化作用。如上所述，可通過發(fā)光方法對其進(jìn)行測定(De-liconstantinos，G.，Villiotou，V.，F(xiàn)assitsas，C.，J.Cardi-ovasc.Pharmacol 12S63-S65，1992)。將存在于HBSS中的肺泡巨噬細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)與100μl的由溶解在20％H3PO4中的20％的磺胺和25μM莨菪亭組成的試劑混合。在室溫條件(22℃)下用一臺Amin-co SPF-500型熒光分光光度計(jì)監(jiān)測熒光的衰變。連續(xù)監(jiān)測熒光，直到線的斜度可測(大約8分鐘)。然后用由各種純NO濃度構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將斜度測量值轉(zhuǎn)換成NO的nmol濃度?；谄湓谒囵B(yǎng)的細(xì)胞上清液中的積累，通過與格瑞斯試劑的反應(yīng)測量NO合成的最終產(chǎn)物亞硝酸根(NO2-)。
C、過亞硝酸根(ONOO-)的分光光度測定ONOO-按前述方法合成、滴定并保存(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrides，J.C.，見“Biology of nitric Oxi-de(eds.Feelish，M.，Busse，R.，和Moncada，S.)Portland Pre-ss(印刷中))。由于ONOO-在pH 7.4時(shí)的不穩(wěn)定性，在H2O2和NO溶液混合后馬上記錄UV光譜。根據(jù)1670 M-1Cm-1的ε302nm值測定ONOO-的濃度。減去H2O2相應(yīng)濃度的基礎(chǔ)UV光譜，就得到UV光譜。
D、自由基的測定自由基的測定是按上述方法，采用由光澤精/DAMCO(1，4二氮雜二環(huán)-[2，2，2]辛烷)誘發(fā)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行的(Deliconstantinos，G.，Krueger，G.R.F.，J.Viral Dis.122-27，1993)。反應(yīng)混合物由HBSS，pH 7.4；光澤精(30μM)；DAMCO(100μM)組成。劇烈攪拌試劑瓶，并在一臺Bedrthold AutoLumat LB953型發(fā)光計(jì)上記錄發(fā)光。采用有氧自由基的清除劑(SOD，甘露糖醇，組氨酸，蛋氨酸)。
E、微量元素和醛類的測定這一測定是基于在有ATP-鎂鹽的條件下由熒光素酶催化的D-熒光素氧化作用，根據(jù)下面的反應(yīng)進(jìn)行的 微量元素Cd2+，Cu2+，F(xiàn)e2+可提高熒光素酶的活性，而且最大化學(xué)發(fā)光響應(yīng)根據(jù)微量元素的濃度成比例提高，直至10μg。該反應(yīng)在pH 7.4的HBSS中進(jìn)行，總體積為0.5ml。
為了測定醛類，采用了同樣的酶促系統(tǒng)熒光素/熒光素酶，但缺乏ATP。在沒有ATP的條件下醛與該酶促系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。所用試劑取自ATP試劑盒(Calbiochem-Novabiochem CA，U.S.A.)。
F、肺泡巨噬細(xì)胞的提取簡而言之，通過靜脈注射戊巴比妥殺死大鼠，切開胸腔，并用無Ca2+的冷(4℃)磷酸緩沖鹽水(PBS，pH 7.4)洗去肺里的血，將肺從胸腔完整地取出。大鼠肺勻漿是這樣獲得的用注射器反復(fù)吸抽肺組織，然后在衡定的Finkelstein平衡鹽溶液(FBSS；pH 7.4)流下使其順序地通過越來越細(xì)的不銹鋼篩，分別為每英寸32孔、62孔和68孔的篩。收集肺泡巨噬細(xì)胞的最終懸浮液，過濾并以300×g離心10分鐘，使細(xì)胞沉淀。包括98％以上的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞沉淀被洗滌，并再懸浮于Ringer′s溶液中。再將以上過程重復(fù)兩次。每只大鼠可提取大約10×108的巨噬細(xì)胞。通過錐蟲藍(lán)排除法估測其存活性。
F、亞硝基化合物的鑒定亞硝基化合物是在用H2O2對其進(jìn)行處理以后通過氧化氮(NO)的釋放進(jìn)行鑒定的。反應(yīng)溶液由二甲基亞硝胺和/或二乙基亞硝胺(1μM)；H2O2，(500μM)；魯米諾(30μM)，溶于HBSS中，pH 7.4組成，總體積為0.5ml。劇烈攪動試劑瓶，在一臺Bedrthold AutoLumatLB953型發(fā)光計(jì)上記錄發(fā)光。甘露糖醇(100mM)；DMSO(100mM)和半胱氨酸(3.0mM)被用于證實(shí)ONOO-的生成。
G、肺泡巨噬細(xì)胞的分離簡而言之，通過靜脈注射戊巴比妥殺死大鼠，切開胸腔，并用無Ca2+的冷(4℃)磷酸緩沖鹽水(PBS，pH 7.4)洗去肺里的血，將肺從胸腔完整地取出。大鼠肺勻漿是這樣獲得的用注射器反復(fù)抽吸肺組織，然后在穩(wěn)定的Finkelstein平衡鹽溶液(FBSS；pH 7.4)流下使其順序地通過越來越細(xì)的不銹鋼篩，分別為每英寸32孔、62孔和68孔的篩。收集肺泡巨噬細(xì)胞的最終懸浮液，過濾并以300×g離心10分鐘；使細(xì)胞沉淀。包括98％以上的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞沉淀被洗滌，并再懸浮于Ringer′s溶液中。再將以上過程重復(fù)兩次。每只大鼠可提取大約10×108個巨噬細(xì)胞。通過錐蟲藍(lán)排除法估測其存活性。
H、由叔丁基過氧化物(t-BHP)誘發(fā)的肺泡巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)力通過魯米諾化學(xué)發(fā)光法測定由t-BHP(2.5mM)誘發(fā)的肺泡巨噬細(xì)胞有氧自由基的產(chǎn)生。如上所述，在一臺Bedrthold AutolumatLB 953發(fā)光計(jì)上記錄化學(xué)發(fā)光響應(yīng)(Deliconstantinos，G.，krue-ger，G.R.F.，J.Viral Dis.1，22-27，1993)。
I、過氧化氫(H2O2)的測定制備異魯米諾/微過氧化物酶混合液(100mM硼酸鈉，1mM異魯米諾，溶于70％的水和30％甲醇中的0.01mM微過氧化物酶pH8)。將50μl上述試劑與提取的肺泡巨噬細(xì)胞(106個細(xì)胞)在HBSS中混合，總體積為0.5 ml。利用由各種純H2O2濃度構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)換成H2O2的nmol數(shù)。
J.用于CO測定的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的制備和純化通過GTP-瓊脂糖色譜法純化從人體內(nèi)皮細(xì)胞中提取的sGC。將細(xì)胞溶質(zhì)(10mg蛋白質(zhì))加入GTP瓊脂糖柱(1.8×9cm)中，該柱是用含有250mM蔗糖和10mM MnCl2的25mM Tris·HCl緩沖液(pH7.6)預(yù)平衡過的。然后用添加了10mM GTP的5ml平穩(wěn)緩沖液將sGC從柱上洗脫下來。
K、環(huán)GMP的測定在用乙酐對樣品作乙?；幚硪院螅ㄟ^放射免疫測定法測定cGMP的濃度(Delikonstantinos，G.，和Kopeikina，L.，AnticancerRes.9753-760，1989)。反應(yīng)混合物中含有三乙醇胺/HCl(50mM)；磷酸肌酸(5mM)；MgCl2(3mM)；異丁基甲基黃嘌呤(1mM)；肌酸激酶(0.6單位)；GTP(1mM)；可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(1μg蛋白質(zhì))，總體積為150μl。通過添加GTP啟動反應(yīng)，并在37℃溫育10分鐘。吸出上述溫育液，并通過加入冰鎮(zhèn)HCl(0.1M)提取cGMP。10分鐘以后，將樣品轉(zhuǎn)移到一個新的皿上，干燥，并再溶解在5mM乙酸鈉(pH 4.75)中用于cGMP測定。用cGMP試劑盒(Amersham)測定生成的cGMP。
本發(fā)明的目的是提出并應(yīng)用采用了生物物質(zhì)的方法，該生物物質(zhì)能與吸煙時(shí)吸入的下列物質(zhì)反應(yīng)，并將其清除
a)NO和NOx，b)CO，c)H2O2，d)自由基，e)醛-醌類，f)致癌的亞硝基化合物，g)留住微量元素鎘、銅、錳、鐵等。
本發(fā)明很大程度上有賴于這樣的概念a)有可選擇的合適清除劑，如血紅蛋白或紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物或含有立體專一地結(jié)合的鐵的物質(zhì)b)有可供選擇的含有帶鐵的卟啉環(huán)(如原卟啉)的清除劑c)有可供選擇的含有不一定帶鐵的卟啉環(huán)的清除劑d)有可供選擇的含有與其它金屬，如Mg2+、Cu2+配合的卟啉環(huán)的清除劑e)將設(shè)計(jì)一種生物技術(shù)方法，用于加強(qiáng)目前用于香煙過濾嘴生產(chǎn)的普通的常規(guī)材料，以使其含有上述生物物質(zhì)-清除劑。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于這樣的理論浸漬普通的常規(guī)香煙過濾嘴和/或含有活性炭的過濾嘴，可用生物物質(zhì)對其加強(qiáng)，其特征在于具有與卟啉環(huán)配合的Fe2+、Cu2+、Mg2+，以及與蛋白質(zhì)分子立體專一地結(jié)合的Fe2+，這樣，可以使吸煙者在吸入煙氣之前留住香煙中所含的有害化合物。這一事實(shí)是本發(fā)明的主要特征，并且構(gòu)成了具有很大的工業(yè)應(yīng)用前景的無可辯駁的革新。工業(yè)應(yīng)用的方法本發(fā)明是以其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的角度以下述方法進(jìn)行準(zhǔn)備的
制備溶于磷酸緩沖溶液(PBS)(pH 7.4)中的1mg/ml的血紅蛋白和/或紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并在溶液中加入100mg活性炭。在室溫下將其溫育30分鐘，并用S&S Carl Schleicher&Schuell Co U.S.A.生產(chǎn)的濾紙過濾。通過分光光度法測定濾液中未被吸收的血紅蛋白量。在室溫下干燥用血紅蛋白加強(qiáng)的炭。將200mg由血紅蛋白加強(qiáng)的干炭夾在兩個普通過濾嘴之間，以使所有抽吸通過的煙氣接觸該分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+、-SH，-NH2)(圖2)。這種親和材料將用于新型香煙過濾嘴的生產(chǎn)，從現(xiàn)在起，這種過濾嘴將被稱為生物過濾嘴。
另外，血紅蛋白可以用含有與卟啉環(huán)配合的金屬離子Fe2+，Cu2+，Mg2+以及與蛋白質(zhì)分子立體專一地結(jié)合的Fe2+的生物物質(zhì)取代，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、過氧化氫酶、原卟啉、細(xì)胞色素C、葉綠素。
另外，制備一種溶于磷酸緩沖溶液(PBS)(pH 7.4)中的5mg/ml血紅蛋白和/或紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物溶液，并在25℃用一臺Acta Beck-man記錄分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。在540nm和575nm處重復(fù)地觀察到吸收峰(Smith，R.P.，Kruszyma，H.J.Pharmacol.Exper.Ther.191，557-563，1974)。用該溶液浸泡普通的常規(guī)香煙過濾嘴，并在25-35℃將其風(fēng)干。這樣的親和材料即可用于制造新型的香煙過濾嘴，從現(xiàn)在起我們稱之為生物過濾嘴。這種新的生物過濾嘴能保證被吸入的煙氣與過濾嘴中血紅蛋白分子和/或溶解產(chǎn)物的活性基團(tuán)發(fā)生全面接觸，同時(shí)又不會改變煙氣的物理特性或口味。出于美觀，可將一小部分(3mm)的常規(guī)過濾嘴用在生物過濾嘴的可見到的一端。其它的工業(yè)生產(chǎn)方法包括以下內(nèi)容將原卟啉溶于緩沖液(PBS，pH 7.4)中制備成濃度為5mg/ml的溶液，并在25℃用一臺Acta Backman記錄分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。用紫外線(498-408)激發(fā)原卟啉能產(chǎn)生橙紅色熒光(620-630nm)。然后用上述溶液浸漬(浸泡)常規(guī)過濾嘴，并用熱風(fēng)(25-35℃)干燥。
另外，用Acta Beckman記錄分光光度計(jì)掃描溶于PBS(pH 7.4)中的5mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液。該轉(zhuǎn)鐵蛋白表現(xiàn)出470nm的特征光譜。采用上述浸漬目前被使用的浸漬常規(guī)過濾嘴的方法。
另外，制備溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml過氧化氫酶溶液。
接下來采用上述用于制備生物過濾嘴的方法。
另外，制備溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml細(xì)胞色素C溶液。接下來采用上述制備生物過濾嘴的方法。
另外，制備溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml葉綠素溶液。采用上述制備生物過濾嘴的方法。
另外，將上述生物物質(zhì)以固體形式夾在兩個普通過濾嘴之間，使所有從該過濾嘴中抽吸通過的煙氣都能接觸該分子的活性基團(tuán)(Fe2+、Fe3+、-SH、-NH2)。結(jié)果分析如下表所示，用于加強(qiáng)常規(guī)過濾嘴的各種生物物質(zhì)被證實(shí)能不同程度地留住煙氣中的有毒化合物(NO，CO，自由基，H2O2，醛類，微量元素和亞硝基化合物)。清除劑 NO CO 自由基 H2O2醛類 亞硝基化合物 微量元素％％％％％％％血紅蛋 90909080909095白轉(zhuǎn)鐵蛋 85906060607550白過氧化 85909090808080氫酶原卟啉 85907080707580細(xì)胞色 85807080606070素C葉綠素 15104015101080獲取了對煙氣中高度有害物質(zhì)的滯留程度，并將從生物過濾嘴中濾過的香煙煙氣(20ml)同從常規(guī)過濾嘴中濾過的煙氣(20ml)進(jìn)行比較。僅將1ml從常規(guī)過濾嘴中濾過的煙氣同40ml從生物過濾嘴中濾過的煙氣作比較。結(jié)果表明，生物過濾嘴留住微量元素的能力為常規(guī)過濾嘴的40倍。
在下面詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)說明中給出了具代表性的結(jié)果，以便更好地理解這種生物物質(zhì)的活力。
a)用化學(xué)發(fā)光方法鑒定煙氣中所含的NO采用在實(shí)驗(yàn)部分所述的魯米諾加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光方法鑒定NO。圖3和4表示NO鑒定和測定、及煙氣從生物過濾嘴中通過后NO被清除情況的典型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，90％以上的NO被血紅蛋白留住。在留住和中和NO方面，生物過濾嘴的作用是顯著的，NO與肺細(xì)胞和肺液中的有毒反應(yīng)有關(guān)，特別是當(dāng)它參與強(qiáng)氧化劑ONOO-的形成時(shí)。
b)用化學(xué)發(fā)光方法鑒定煙氣中所含的自由基通過化學(xué)發(fā)光響應(yīng)鑒定煙氣中的自由基。發(fā)光響應(yīng)是在光澤精/DAMCO系統(tǒng)與自由基反應(yīng)以后造成的。圖5表示，在化學(xué)發(fā)光響應(yīng)2秒內(nèi)出現(xiàn)的特征光譜，在煙氣從生物過濾嘴中通過以后被100％地抑制。生物過濾嘴留住自由基意味著由常規(guī)香煙煙氣導(dǎo)致的肺泡巨噬細(xì)胞里的氧化應(yīng)力被減弱。
c)用化學(xué)發(fā)光方法鑒定煙氣中所含的H2O2通過由異魯米諾/微過氧化物酶系統(tǒng)所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)測定H2O20圖6表示由于H2O2在煙氣中的存在所導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光的特征峰。在存在過氧化氫酶(100單位/ml)時(shí)，化學(xué)發(fā)光響應(yīng)被抑制大約90％。當(dāng)煙氣從生物過濾嘴中通過以后，可見到化學(xué)發(fā)光響應(yīng)被抑制80％。該異魯米諾/微過氧化物酶系統(tǒng)是專門用于H2O2鑒定的。煙氣中所含的自由基在同異魯米諾作用以后能引起微弱的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。由于過氧化氫酶抑制了最大發(fā)光響應(yīng)的近90％，該微弱的化學(xué)發(fā)光看來僅占存在自由基時(shí)由H2O2引起的化學(xué)發(fā)光的約10％。H2O2的留住顯著降低了由肺泡巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化應(yīng)力和NO。
d)用熒光素/熒光素酶酶促系統(tǒng)鑒定煙氣中所含的微量元素和醛類。
煙氣中所含的微量元素是通過其激活熒光素酶活性的能力進(jìn)行鑒定的。圖7表示1)在存在ATP時(shí)由熒光素氧化所引起的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，2)存在Cd2+離子(0.5mg)時(shí)被增強(qiáng)了的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，3)存在Cu2+離子(0.5mg)時(shí)被增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，4)由煙氣(1ml)引起的增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)和5)當(dāng)40ml煙氣通過生物香煙過濾嘴后所導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光抑制(與由煙氣引起的化學(xué)發(fā)光相比)。很明顯，由常規(guī)煙氣中所含微量元素引起的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)比由從生物過濾嘴中通過的煙氣所引起的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)高40倍。生物過濾嘴對微量元素的滯留既有短期效果又有長期效果。短期效果表現(xiàn)為對發(fā)生于肺部氧化還原反應(yīng)的抑制(Fe，Mn)，長期效果表現(xiàn)為對血液中的組分和物質(zhì)的損害的抑制(Cd)。
煙氣中所含醛類的鑒定和測定是在無ATP的條件下用同樣的熒光素/熒光素酶酶促系統(tǒng)做的。醛類能導(dǎo)致熒光素氧化。圖8表示一個可持續(xù)1小時(shí)以上的特征化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。當(dāng)所用的煙氣通過生物過濾嘴以后，化學(xué)發(fā)光響應(yīng)被抑制了100％，這表明，生物過濾嘴留住有毒的醛類的作用是顯著的。
e)煙氣中亞硝基化學(xué)物的鑒定煙氣所含亞硝基化合物的鑒定是在用H2O2處理以后通過測定NO從亞硝基化合物中的緩慢釋放獲得的。如圖9所示，大約900秒時(shí)得到一個化學(xué)發(fā)光響應(yīng)高峰。煙氣在通過生物過濾嘴以后，可見其化學(xué)發(fā)光響應(yīng)被抑制90％，其高峰在約1200秒時(shí)出現(xiàn)。還示出了在用H2O2處理硝普酸鈉(SNP)以后NO的緩慢釋放。

圖10表示亞硝基化合物二乙基亞硝胺和二甲基亞硝胺的NO緩慢釋放；以及用H2O2處理的富集了煙氣中的亞硝基化合物的血紅蛋白的NO緩慢釋放。很明顯，與血紅蛋白形成了加合物的煙氣亞硝基化合物的NO釋放，遵循與亞硝基化合物二乙基亞硝胺和二甲基亞硝胺的NO釋放相同的模式。圖11表示在用UVB照射(100mJ/cm2)血紅蛋白-亞硝基化合物加合物1分鐘以后，已與血紅蛋白形成加合物的煙氣亞硝基化合物的NO釋放。在存在H2O2條件下測定NO釋放，并給出1秒時(shí)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。圖11中所見到的逐漸上升是由于H2O2對血紅蛋白的作用(芬頓反應(yīng))。
f)由肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO體外實(shí)驗(yàn)是借助于我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的特殊腔室進(jìn)行的，如圖1所示。分開該腔室的兩個部分的特氟隆膜可通過NO，但不能通過NO2-和ONOO-。按實(shí)驗(yàn)部分所述方法提取的未受刺激的肺巨噬細(xì)胞被懸浮于HBSS緩沖液(1×106細(xì)胞/ml)中，并將其放在上述腔室的A部分。在腔室的B部分放置2.5ml格瑞斯試劑或磺胺/莨菪亭試劑。A部分中的巨噬細(xì)胞釋放的NO通過特氟隆膜擴(kuò)散到B部分，并與留在B部分的格瑞斯試劑和/或磺胺/茛菪亭試劑結(jié)合。這表明肺巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生NO氣體。然后通過分光光度法或熒光光度法測定存在于B部分的NO量。A部分所含的ONOO-和NO2-量也用格瑞斯和/或磺胺/茛菪亭試劑測定。用在被放入A部分之前煙氣刺激過的巨噬細(xì)胞重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。圖12所示結(jié)果表明，煙氣能減少肺巨噬細(xì)胞中NO產(chǎn)生量，同時(shí)增加ONOO-的產(chǎn)生，這間接地證明大量產(chǎn)生的NO和O2-相互作用生成了ONOO-。
用生物過濾嘴重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)(即煙氣通過生物過濾嘴抽吸)證實(shí)，所采用的生物物質(zhì)與未用煙氣刺激的巨噬細(xì)胞一樣，在A部分產(chǎn)生相同數(shù)量的NO2-和ONOO-，并在B部分產(chǎn)生相同數(shù)量的NO。在本申請中，格瑞斯反應(yīng)的成分也被用于對在生理pH下的水溶液中NO/O2反應(yīng)所生成的中間物的亞硝化動力學(xué)進(jìn)行檢測。將煙氣(50ml)加入含有25mM磺胺和2.5mM N-(1-萘基乙二胺二氫氯化物(NEDD)的100mM磷酸緩沖液(pH7.4)中會在λmax＝496mm處產(chǎn)生一個吸收峰，證實(shí)了硝化所產(chǎn)生的特征偶氮化合物。值得通過比較相關(guān)生理?xiàng)l件下的NO預(yù)期的反應(yīng)性來考慮以上觀察結(jié)果的含意，據(jù)估計(jì)，NO在細(xì)胞微環(huán)境中的最大濃度為0.5-10μM。在吸煙時(shí)NO濃度急劇增加，對肺細(xì)胞造成損害作用。
g)肺巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)力圖13中給出了煙氣對肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)力影響的結(jié)果。用t-BHP測定氧化應(yīng)力表明，煙氣導(dǎo)致的氧化應(yīng)力為未受剌激的巨噬細(xì)胞的2倍。當(dāng)煙氣從生物過濾嘴中通過以后，所觀察到的氧化應(yīng)力與未受刺激的肺巨噬細(xì)胞的類似。這清楚地表明了它對煙氣在巨噬細(xì)胞上引起的氧化應(yīng)力的消除作用?，F(xiàn)在的煙氣中不再有導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)力的物質(zhì)。
h)由肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2由經(jīng)煙氣刺激過的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的H2O2，其產(chǎn)率為未受刺激的巨噬細(xì)胞的10倍以上。與常規(guī)過濾嘴相比，采用生物過濾嘴可使H2O2的產(chǎn)生降低90％(圖14)。很明顯，如煙氣能誘發(fā)巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)力一樣，它可以提高這些細(xì)胞對H2O2的產(chǎn)生。
i)重建實(shí)驗(yàn)用圖1所示的腔室測定通過肺泡巨噬細(xì)胞釋放的NO所生成的環(huán)GMP的量，其中，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶被放在A部分，而肺巨噬細(xì)胞被放在B部分。在有和沒有用煙氣刺激過的細(xì)胞的條件下，在50分鐘時(shí)間里測定由巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的NO量。用煙氣(10ml)處理過的巨噬細(xì)胞所釋放的NO量比未經(jīng)處理的細(xì)胞約低10倍，因此，表現(xiàn)為環(huán)GMP的產(chǎn)量少10倍。用從生物過濾嘴中通過的煙氣重復(fù)上述過程。結(jié)果表明，與未刺激過的巨噬細(xì)胞(對照)(圖15)相比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。如圖16所示，當(dāng)肺泡巨噬細(xì)胞用H2O2(5mM)處理時(shí)，B部分所積累的NO增加5倍以上。這表明H2O2通過一個正反饋機(jī)制促進(jìn)NO的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞中的L-精氨酸/NO途徑是與煙氣導(dǎo)致NO/ONOO-釋放的理論相一致的。
k)煙氣中一氧化碳(CO)的鑒定采用基于CO對可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的激發(fā)的生物學(xué)方法測定存在于煙氣中的CO。
將用煙氣飽和的HBSS引入腔室的A部分，其中存在超氧化物，以便中和NO；并將可溶性鳥苷酸環(huán)化酶引入B部分，由于CO從A部分?jǐn)U散到B部分導(dǎo)致環(huán)GMP產(chǎn)量的增加。煙氣在從生物過濾嘴中通過以后能使環(huán)GMP的產(chǎn)生量減少近80％(圖17)。上述結(jié)果表明，煙氣中的有害物質(zhì)NOx和CO被生物過濾嘴留住并中和了。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)a)我們首先證實(shí)NO和ONOO-在呼出的煙氣中的存在。由志愿者吸一支帶有常規(guī)過濾嘴的香煙，在把呼出的煙氣引入酸性溶液(50ml)(pH 4)中后鑒定呼出的煙氣中存在的NO。用實(shí)驗(yàn)部分所講述的魯米諾增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光方法測定NO的濃度，采用由商品NO制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得NO濃度為0.045mM。用生物過濾嘴重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，與常規(guī)過濾嘴相比，吸入的煙氣中NO濃度降低近70％(圖18)。用1.2M的NaOH溶液測定ONOO-濃度，在303nm(圖19)處表現(xiàn)一個吸收的增加(ε303nm＝1670 M-1cm-1)。我們的實(shí)驗(yàn)表明，吸煙時(shí)吐出的煙氣中含有大量的ONOO-(將50ml吐出的煙氣通入5ml 1.2M NaOH中產(chǎn)生0.9mM ONOO-的溶液)。測得吐出煙氣中NO/ONOO-比為1∶20。
因此，看起來肺里的NOx在與超氧化物反應(yīng)以后被轉(zhuǎn)變成ONOO-。超氧化物是由巨噬細(xì)胞和吸煙時(shí)肺里所發(fā)生的氧化還原反應(yīng)所釋放的。用泵抽吸的煙氣中不合有ONOO-，但有一定量的NOx與超氧化物或氧反應(yīng)生成亞硝酸根離子(NO2-)。煙氣只有在進(jìn)入肺里時(shí)才生成ONOO-。生物過濾嘴的采用可使吐出的NO和ONOO-量減少70％。
b)ONOO-根據(jù)下面的反應(yīng)式與人體紅細(xì)胞中的碳酸氫根反應(yīng)碳酸氫根能氧化魯米諾以及芳族和雜環(huán)分子。另外，ONOO-可以使碳酸氫根過氧化以生成過碳酸氫根，另一種強(qiáng)氧化劑。另一方面，超氧化物歧化酶(SOD)催化ONOO-和多種酚，包括蛋白質(zhì)里酪氨酸的硝化。
因此，存在幾種潛在的機(jī)制，碳酸氫根和SOD可通過這些機(jī)制影響ONOO-在細(xì)胞中的總反應(yīng)性。由于吸入煙氣而引起的在肺中產(chǎn)生ONOO-，表現(xiàn)為紅細(xì)胞氧化應(yīng)力的急劇增加，這是通過發(fā)生在5秒之內(nèi)的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)檢測到的。用生物過濾嘴做相同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是幾乎能100％地抑制人體紅細(xì)胞的氧化應(yīng)力(圖20)。血紅蛋白或紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物接觸ONOO-(含于吐出的煙氣中)后會使其失去正常情況下可見到的血紅蛋白在54Onm和575nm處的兩個吸收峰。在12個志愿者中實(shí)施與上述一個實(shí)驗(yàn)類似的代表性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖21所示。當(dāng)血紅蛋白和/或裂解產(chǎn)物接觸少量的吐出煙氣(10ml)后，可見到吸收峰從540和575偏移到525和555nm，這與亞硝酰血紅蛋白的生成相符合。用生物過濾嘴重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。所觀察到的吸收峰維持了其特征波長。
d)通過其特征化學(xué)發(fā)光峰鑒定由志愿者吐出的煙氣中的醛類。用生物過濾嘴重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，可見其化學(xué)發(fā)光響應(yīng)與采用常規(guī)過濾嘴的所觀察到的最大化學(xué)發(fā)光響應(yīng)減少了90％(圖22)。很明顯，生物過濾嘴能留住并中和煙氣中的醛類，同時(shí)留住氧化劑，從而顯著地抑制了肺里所發(fā)生的氧化還原反應(yīng)，這樣的反應(yīng)會導(dǎo)致內(nèi)源醛類的產(chǎn)生。
e)通過其特征化學(xué)發(fā)光峰鑒定由志愿者吐出的煙氣中的自由基。自愿者所使用的香煙帶有常規(guī)過濾嘴和生物過濾嘴。志愿者被告知將煙氣吐入酸性溶液(0.01N HCl)(50ml，pH6)中，并在5分鐘和60分鐘后測得化學(xué)發(fā)光響應(yīng)。當(dāng)pH＝6時(shí)，吐出的ONOO-自動分解。與從生物過濾嘴中通過的煙氣相比，所吐出的從常規(guī)過濾嘴通過的煙氣的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)在5分鐘內(nèi)提高了160％(圖23)。當(dāng)用吐出的煙氣飽和的酸性溶液放置1小時(shí)之后，化學(xué)發(fā)光響應(yīng)的差別從160％提高到250％(圖24)。這與煙氣中持續(xù)地通過醌發(fā)生氧化還原反應(yīng)的理論相符合，這樣的反應(yīng)能產(chǎn)生一系列活性有氧物質(zhì)，這些物質(zhì)能造成生物損害。討論我們的研究證實(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞與其它細(xì)胞一樣具有內(nèi)源性NO合成酶，在接觸煙氣以后能長時(shí)間地釋放NO/ONOO-。另外，這些細(xì)胞一旦開始釋放NO，NO的產(chǎn)生就變成自主支持的了，即使在去掉激發(fā)源以后也是如此。這樣的反應(yīng)能說明煙氣里的NO能激發(fā)肺泡巨噬細(xì)胞釋放NO和ONOO-，并在去掉激發(fā)源后能持續(xù)幾個小時(shí)時(shí)間。當(dāng)用煙氣激發(fā)肺泡巨噬細(xì)胞時(shí)，肺里所產(chǎn)生的H2O2也能啟動這樣的反應(yīng)。H2O2能激發(fā)肺細(xì)胞NO合成酶的活性，從而在去掉激發(fā)源后NO和ONOO-的產(chǎn)生持續(xù)1小時(shí)以上。我們的實(shí)驗(yàn)確實(shí)證明了煙氣從生物過濾嘴中通過能使大鼠巨噬細(xì)胞中的氧化應(yīng)力下降(與常規(guī)濾嘴比較)90％。在肺中生成的ONOO-基有可能攻擊α1-蛋白酶抑制劑(α1PI)并使其失活。人肺中α1PI的抑制通常會導(dǎo)致氣腫，從而使肺活量減少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，吸煙會使人傾向于發(fā)生肺氣腫(Southon，P.A.，Pwis，G.，F(xiàn)ree Radicals in Medicine.Invovement in humanDisease.Mayo Clin.Proc.63390-408，1988)。在由12個自愿吸煙者所做的體內(nèi)試驗(yàn)中，當(dāng)吸入的煙氣通過生物過濾嘴時(shí)，吐出的NO/ONOO-減少90％。
有氧自由基也參與了由IgA抗原抗體復(fù)合體引起的小泡炎發(fā)病。用超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、鐵螯合劑-去鐵胺、或羥基清除劑(DMSO)對動物進(jìn)行預(yù)處理，可抑制對肺部損害的發(fā)生。相反，未處理過的正對照動物的肺以出現(xiàn)較多的肺泡巨噬細(xì)胞為特征。還會出現(xiàn)間質(zhì)水腫和出血。另外，在這種類型的肺損傷中，L-精氨酸具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，已證實(shí)其可以減少血管通透性；血管出血；和對血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的損害。上述發(fā)現(xiàn)表明，巨噬細(xì)胞是由NO，O2-，H2O2和OH化合物引起的損害的根源(Mullingan，M.S.，Johnson，K.J.，Ward，P.A.，見“Biological OxidantsGeneration and Injurious Consequences”(eds.COchrane，C.G.，和Gilbrone，M.A.，Jr.Academic Press 157-172，1992)。
生物過濾嘴對煙氣中所含氧化劑的阻留和中和作用，在降低直接關(guān)系到肺細(xì)胞的氧化應(yīng)力的氧化還原酶的活性方面有明顯作用。生物過濾嘴可大幅度降低由吸入的煙氣所引起的氧化應(yīng)力。煙氣中所含的NO、NOx、有氧自由基和/或醛類可誘發(fā)肺巨噬細(xì)胞和肺血管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)力。另外，生物過濾嘴對醛類和微量元素(尤其是Cd)的阻留，在保存細(xì)胞質(zhì)抗氧化劑和抑制關(guān)節(jié)硬化的發(fā)展方面具有相當(dāng)長時(shí)間的作用。血紅蛋白有幾個嗜中性中心，它可與親電子體發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。上述中心可引誘α-和β-鏈的N-末端纈氨酸殘基，組氨酸殘基的N1和N3原子，以及半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)。在香煙燃燒過程中，煙草中的致癌亞硝基化合物4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)被轉(zhuǎn)移到煙氣中，其在每支香煙的主流煙氣中的含量在4-1700ng范圍內(nèi)波動。NNK可與血紅蛋白形成加合物(Hecht，S.S.，Karan，S.，和Carmella，S.G.，見“Humam Carcinogen expose”(eds.Garmer，R.C.，F(xiàn)armer，P.B.，steel，G.I.，和Wricht，A.S.)IRL Press pp267-274，1991)。很清楚，避免與煙草有關(guān)的疾病的唯一途徑是戒掉咀嚼和抽吸煙草。然而，對現(xiàn)有吸煙者的統(tǒng)計(jì)表明，可采取的重大步驟是減少接觸煙草致癌物并改進(jìn)其作用方式。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要途徑是1)煙草制品的改進(jìn)，2)通過某些小營養(yǎng)成分和大營養(yǎng)成分以及化學(xué)抑制劑抑制煙草致癌物的代謝激活作用及其內(nèi)源生成作用，3)使用能適用于煙草的特殊過濾嘴，留住煙草致癌物。我們的發(fā)明，用生物物質(zhì)來生產(chǎn)生物過濾嘴，最終涉及這樣的發(fā)現(xiàn)被吸入的煙氣中的亞硝基化合物被生物物質(zhì)留住，這不僅保護(hù)了吸煙者的健康，而且也保護(hù)了不吸煙者的健康。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1、一種用于過濾香煙煙氣的過濾嘴，其特征在于它包括一種用生物物質(zhì)加強(qiáng)的纖維基質(zhì)。該生物物質(zhì)選自含有與卟啉環(huán)配合的鐵、銅和/或鎂和含有與蛋白質(zhì)分子立體專一地結(jié)合的鐵的一種或多種物質(zhì)。
2、如權(quán)利要求1所述的過濾嘴，其特征在于它包括用該生物物質(zhì)加強(qiáng)的活性炭。
3、如權(quán)利要求1或2所述的過濾嘴，其特征在于所述加強(qiáng)過的纖維基質(zhì)的前后是未用所述生物物質(zhì)加強(qiáng)的纖維基質(zhì)。
4、如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的過濾嘴，其特征在于該生物物質(zhì)包括血紅蛋白和/或紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物。
5、如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的過濾嘴，其特征在于該生物物質(zhì)選自立體專一地結(jié)合著Fe2+的轉(zhuǎn)鐵蛋白、過氧化氫酶、原卟啉、細(xì)胞色素C和葉綠素中的一種或多種。
6、如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的過濾嘴，其特征在于所述生物物質(zhì)是固體形式的。
7、一種香煙，其特征在于它帶有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的過濾嘴。
8、一種制造如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的香煙過濾嘴的方法，包括用一種或多種所述生物物質(zhì)浸泡常規(guī)香煙過濾嘴。
9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述過濾嘴包括活性炭。
10、如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)包括血紅蛋白和/或紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物。
11、如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)是以溶于pH 7.4的磷酸緩沖的鹽溶液中的1-10mg/ml的溶液提供的。
12、一種過濾煙草煙氣的方法，包括提供一個如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的過濾嘴，并讓煙草煙氣從其中通過。
13、如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述過濾嘴能留住在通過過濾嘴之前煙草煙氣中所存在的15-90％NO；10-90％CO；40-90％自由基；10-90％醛類；10-90％致癌亞硝基化合物；15-90％H2O2和50-95％的微量元素。
14、如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述過濾嘴能留住在通過過濾嘴之前煙草煙氣中所存在的85-90％NO；80-90％CO；60-90％自由基；60-90％H2O2；60-90％醛類；60-90％致癌亞硝基化合物；和70-95％的微量元素。
權(quán)利要求
1.開發(fā)了一種阻留并中和香煙煙氣中的有害化合物(NO，NOx，自由基，醛類、H2O2、CO、微量元素和致癌的亞硝基化合物)的方法，常規(guī)香煙過濾嘴不能充分阻留這些有害化合物。該方法的特征是，用生物物質(zhì)加強(qiáng)由纖維基質(zhì)或活性炭制成的普通的常規(guī)香煙過濾嘴，所述生物物質(zhì)中單獨(dú)地或以組合方式含有與卟啉環(huán)配合的鐵、銅和/或鎂，以及蛋白質(zhì)分子中立體專一地結(jié)合的鐵。用上述物質(zhì)加強(qiáng)常規(guī)過濾嘴或活性炭既不會改變煙氣的物理特性(氣味、口味和外觀)，又不會改變過濾嘴自身的物理特性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用磷酸緩沖液(PBS)制備血紅蛋白和/或裂解產(chǎn)物溶液，5-10mg/ml(這一用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)，pH7.4。將普通的常規(guī)香煙過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃將浸泡過的生物過濾嘴風(fēng)干。該方法能保證至少留住90％的NO，90％的CO，90％的自由基，90％的醛類，90％的致癌亞硝基化合物，80％的H2O2和95％的微量元素。
3.如權(quán)利1和2所述的方法，其特征在于采用固體形式的血紅蛋白和/或裂解產(chǎn)物。將5-10mg(這一用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)血紅蛋白和/或裂解產(chǎn)物夾在兩部分普通的常規(guī)香煙過濾嘴之間。該方法能確保在吸煙時(shí)具有在權(quán)利要求2中所描述的效果。
4.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于用磷酸鹽緩沖液(PBS)制備1mg/ml(僅為指示性的用量)血紅蛋白和/或紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液，pH7.4。將100mg(僅為指示性的)活性碳加入該溶液中并將該混合物在室溫下溫育約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用血紅蛋白加強(qiáng)的干活性炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得通過該過濾嘴抽吸的所有煙氣都能接觸上述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法也能確保在吸煙時(shí)具有在權(quán)利要求2中所描述的效果。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖液(PBS)制備5-10mg/ml的(該用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，pH7.4。將普通的常規(guī)過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后用25-35℃的熱風(fēng)干燥浸泡過的生物過濾嘴。該方法能確保至少留住85％的NO，90％的CO，60％的自由基，60％的醛類，75％的致癌亞硝基化合物，60％的H2O2和50％的微量元素。
6.如權(quán)利要求1和5所述的方法，其特征在于采用固體形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白。將5-10mg(該用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)轉(zhuǎn)鐵蛋白夾在兩部分普通的常規(guī)香煙過濾嘴之間。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求5所描述的效果。
7.如權(quán)利要求1和5所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)制備1mg/ml(僅為指示性的)的轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，pH7.4。將100mg(僅為指示性的)活性炭加進(jìn)該溶液中并在室溫下溫育約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用轉(zhuǎn)鐵蛋白加強(qiáng)的干炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得所有通過該過濾嘴抽吸的煙氣都能接觸所述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求5所描述的效果。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖液(PBS)制備5-10mg/ml(用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)的過氧化氫酶溶液，pH7.4。將普通的常規(guī)過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃風(fēng)干浸泡過的生物過濾嘴。該方法能確保留住至少85％的NO，90％的CO，90％的自由基，80％的醛類，80％的致癌亞硝基化合物，90％的H2O2和80％的微量元素。
9.如權(quán)利要求1和8所述的方法，其特征在于采用固體形式的過氧化氫酶。將5-10mg(用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)過氧化氫酶夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求8所描述的效果。
10.如權(quán)利要求1和8所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)制備1mg/ml(僅為指示性的)的過氧化氫酶溶液，pH7.4。將100mg(僅為指示性的)活性炭加入該溶液中并在室溫下溫育約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用過氧化氫酶加強(qiáng)的干炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得所有通過該過濾嘴抽吸的煙氣都能接觸所述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求8所述的效果。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖液(PBS)制備5-10mg/ml(用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)的原卟啉溶液，pH7.4。將普通的常規(guī)過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃將浸泡過的生物過濾嘴風(fēng)干。該方法能確保至少留住85％的NO，90％的CO，70％的自由基，70％的醛類，75％的致癌亞硝基化合物，80％的H2O2和80％的微量元素。
12.如權(quán)利要求1和11所述的方法，其特征在于采用固體形式的原卟啉。將5-10mg(用量取決于煙草的質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)的原卟啉夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求11所描述的效果。
13.如權(quán)利要求1和11所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)制備1mg/ml(僅為指示性的)的原卟啉溶液，pH7.4。將100mg(僅為指示性的)活性炭加入該溶液中并將混合物在室溫下溫育約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用原卟啉加強(qiáng)的干炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得所有通過該過濾嘴抽吸的煙氣都能接觸所述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求11所描述的效果。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖液(PBS)制備5-10mg/ml(用量取決于煙草質(zhì)量和卷煙質(zhì)量)的細(xì)胞色素溶液，pH7.4。將普通的常規(guī)過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后將浸泡過的生物過濾嘴在25-35℃風(fēng)干。該方法能確保至少留住85％的NO，80％的CO，70％的自由基，60％的醛類，60％的致癌亞硝基化合物，80％的H2O2和70％的微量元素。
15.如權(quán)利要求1和14所述的方法，其特征在于采用固體形式的細(xì)胞色素C。將5-10mg(用量取決于煙草質(zhì)量和卷煙質(zhì)量)的細(xì)胞色素C夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求14所述的效果。
16.如權(quán)利要求1和14所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖溶液(PBS)制備1mg/ml(僅為指示性的)的細(xì)胞色素C溶液，pH 7.4。將100mg(僅為指示性的)活性炭加入該溶液中，然后將混合物在室溫下溫育約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用細(xì)胞色素C加強(qiáng)的干炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得所有通過該過濾嘴抽吸的煙氣都能接觸所述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求14所描述的效果。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖液(PBS)制備5-10mg/ml(用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)的葉綠素溶液，pH7.4。將普通的常規(guī)過濾嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃用熱風(fēng)干燥浸泡過的生物過濾嘴。該方法能確保至少留住15％的NO，10％的CO，40％的自由基，10％的醛類，10％致癌亞硝基化合物，15％H2O2和80％的微量元素。
18.如權(quán)利要求1和17所述的方法，其特征在于采用固體形式的葉綠素。將5-10mg(該用量取決于煙草質(zhì)量及卷煙質(zhì)量)葉綠素夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求17所描述的效果。
19.如權(quán)利要求1和17所述的方法，其特征在于用磷酸緩沖的鹽溶液制備1mg/ml(僅為指示性的)的葉綠素溶液，pH7.4。將100mg(僅為指示性的)活性炭加入該溶液中，并在室溫下溫育該混合物約30分鐘。將200mg(僅為指示性的)用葉綠素加強(qiáng)的干炭夾在兩部分普通的常規(guī)過濾嘴之間，使得所有通過該過濾嘴抽吸的煙氣都能接觸所述分子的活性基團(tuán)(Fe2+，F(xiàn)e3+，-SH，-NH2)。該方法能確保在吸煙時(shí)具有權(quán)利要求17所描述的效果。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備溶液和/或固體生物物質(zhì)，其共同特征是a)含有血紅素鐵的任何分子(血紅素、羥高鐵血紅素等)。b)含有立體專一地結(jié)合的鐵或銅的任何大分子(鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白等)。c)含有卟啉環(huán)的任何大分子，該卟啉環(huán)并不一定含有鐵。d)含有與鐵以外的金屬(Mg，Cu)相配合的卟啉環(huán)的任何大分子。
21.本發(fā)明要針對的與肺和血液(成分和物質(zhì))損害有關(guān)的生化-致病生理學(xué)機(jī)制和技術(shù)上的對策。這些機(jī)制特別涉及肺的肺泡巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，它在受到香煙煙氣刺激后會產(chǎn)生氧化應(yīng)力，導(dǎo)致長時(shí)間大量產(chǎn)生NO/ONOO-和H2O20H2O2進(jìn)一步刺激NO/ONOO-的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。ONOO-基團(tuán)能抑制肺組織里的重要的保護(hù)機(jī)構(gòu)α1-蛋白酶抑制劑(α1PI)。另外，權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法能夠留住并中和煙氣中所含的有害化合物，即NO，CO，醛類，自由基，H2O2，微量元素，致癌亞硝基化合物，從而在很大程度上保護(hù)主動吸煙者和被動吸煙者免受諸如肺氣腫、肺癌、慢性支氣管炎之類的疾病和心血管系統(tǒng)慢性疾病的折磨。
22.一種新的香煙過濾嘴，其特征在于或是用權(quán)利要求1和20所述的生物物質(zhì)加強(qiáng)過濾嘴，或是將用權(quán)利要求1和20所述的生物物質(zhì)加強(qiáng)過的活性炭放在新型過濾嘴的兩端或一端。這種過濾嘴的兩端或一端是由用于制造普通的常規(guī)過濾嘴的纖維基質(zhì)制成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阻留煙氣中的有害化合物(NO，NOx，致癌的亞硝基化合物，自由基，H
文檔編號A24D3/14GK1133550SQ94193886
公開日1996年10月16日 申請日期1994年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月27日
發(fā)明者約安尼斯·斯塔夫里迪斯, 喬治·德里康斯坦丁諾斯 申請人:約安尼斯·斯塔夫里迪斯, 喬治·德里康斯坦丁諾斯