一種提高納豆水提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高納豆水提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法，包括如下步驟：在熟黃豆中加入納豆枯草芽孢桿菌，混勻，其中，熟黃豆與納豆枯草芽孢桿菌的質(zhì)量體積比為30-60:1，g：ml；所述納豆枯草芽孢桿菌的OD600＝0.5-1.2；發(fā)酵：發(fā)酵溫度為28-32℃，發(fā)酵濕度為60-80％，發(fā)酵時(shí)間為55-72h；后熟：后熟溫度為2-6℃，后熟時(shí)間為24-48h。本發(fā)明選用處于快速生長期的菌液，并改進(jìn)了納豆發(fā)酵條件，制備的納豆對α-葡萄糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
【專利說明】
一種提高納豆水提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的納豆制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高納豆水提取物對α -葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納豆是一種保健食品，是大豆經(jīng)過納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto)發(fā)酵而成的發(fā)酵豆制品。納豆起源于中國，后傳入日本，并在日本盛行1000多年。 納豆含有多種人體所需的生理活性物質(zhì)，比如：納豆激酶、溶菌酶、α -葡萄糖苷酶抑制物、 維生素 Κ、多聚氨基酸、多聚果糖，具有溶血栓、降血壓、降血糖、降血脂以及預(yù)防動脈粥樣硬 化等多種功能。其中，納豆激酶有良好的溶血栓作用而受到廣泛研究，納豆對α-葡萄糖苷 酶的抑制作用則可以降血糖。但是，納豆對α-葡萄糖苷酶的抑制作用一直少有報(bào)道，這是 因?yàn)楝F(xiàn)有生產(chǎn)工藝（納豆枯草芽孢桿菌的〇D_= 1. 7,發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵時(shí)間24h)生產(chǎn) 的納豆對α -葡萄糖苷酶抑制率非常低，降血糖的效果非常有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高納豆水提取物對α -葡萄糖苷酶抑制率的納豆 制備方法，選用處于快速生長期的菌液，使用獨(dú)特的發(fā)酵工藝，大幅度提高納豆對α -葡萄 糖苷酶的抑制率。
[0004] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0005] -種提高納豆水提取物對α -葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法，包括如下步 驟：
[0006] 1)在熟黃豆中加入納豆枯草芽孢桿菌，混勻，其中，熟黃豆與納豆枯草芽孢桿菌的 質(zhì)量體積比為30-60 :1，g :ml ;所述納豆枯草芽孢桿菌的0D6。。= 0. 5-1. 2 ;
[0007] 2)發(fā)酵
[0008] 發(fā)酵溫度為28-32 °C，發(fā)酵濕度為60-80%，發(fā)酵時(shí)間為55-72h ;
[0009] 3)后熟
[0010] 后熟溫度為2-6°C，后熟時(shí)間為24-48h。
[0011] 進(jìn)一步，步驟1)中所述納豆枯草芽孢桿菌的OD6。。優(yōu)選為0. 5-1. 0。
[0012] 步驟2)中所述發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為55-65h。
[0013] 又，本發(fā)明所述提高納豆水提取物對α -葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法，包 括如下步驟：
[0014] 1)在熟黃豆中加入納豆枯草芽孢桿菌，混勻，其中，熟黃豆與納豆枯草芽孢桿菌的 質(zhì)量體積比為50:1，g :ml ;所述納豆枯草芽孢桿菌的0D_= 0. 7 ;
[0015] 2)發(fā)酵
[0016] 發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵濕度為70%，發(fā)酵時(shí)間為60h ;
[0017] 3)后熟
[0018] 后熟溫度為4°C，后熟時(shí)間為24~48h。
[0019] 本發(fā)明中熟黃豆與納豆枯草芽孢桿菌的質(zhì)量體積比為30-60:1，g :ml，納豆枯草 芽孢桿菌可以與熟黃豆充分接觸，有利于納豆枯草芽孢桿菌的快速繁殖。
[0020] 所述納豆枯草芽孢桿菌的〇D6。。= 0. 5~1. 2 :常規(guī)工藝中使用OD 6。。> 1. 6的菌 液，此時(shí)納豆枯草芽孢桿菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期，細(xì)菌的活力降低。為了增加納豆對α-葡萄糖 苷酶的抑制率，本發(fā)明使用〇D_= 0. 5~1. 2的納豆枯草芽孢桿菌，此時(shí)細(xì)菌處于快速生 長期，與熟黃豆接觸后可以直接以指數(shù)級擴(kuò)增，無需經(jīng)過一段時(shí)間再進(jìn)入快速生長期，有效 增加了納豆對α -葡萄糖苷酶的抑制率；同時(shí)，細(xì)菌的0D_= 0. 5~1. 2時(shí)，細(xì)菌內(nèi)各個蛋 白質(zhì)正處于高活性的狀態(tài)，這些蛋白質(zhì)與熟黃豆相互作用，最大效率地生產(chǎn)各種α-葡萄 糖苷酶抑制物，其中，優(yōu)選〇D 6。。= 0. 5~1. 0。
[0021] 本發(fā)明中發(fā)酵溫度為28-32°C，發(fā)酵時(shí)間為55-72h :28-32°C為芽孢桿菌屬細(xì)菌的 最適生長溫度，納豆枯草芽孢桿菌在這個溫度下可以最快速地繁殖，菌量越多，細(xì)菌體內(nèi)與 熟黃豆相互作用生產(chǎn)各種α-葡萄糖苷酶抑制物的蛋白質(zhì)越多，生產(chǎn)的各種α-葡萄糖苷 酶抑制物越多。其中，本發(fā)明中發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選55-65h。
[0022] 本發(fā)明中后熟溫度為2_6°C，后熟時(shí)間為24_48h :經(jīng)過后熟過程，納豆枯草芽孢桿 菌停止生長，此時(shí)口感較佳。
[0023] 本發(fā)明通過改進(jìn)納豆制備工藝，制備得到的納豆可高效抑制α -葡萄糖苷酶，對 α-葡萄糖苷酶的抑制可以有效地降低人和動物體內(nèi)的血糖濃度，大幅提高納豆的降血糖 保健功能。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 1.本發(fā)明選用OD6。。為0. 5~1. 2的納豆枯草芽孢桿菌，此時(shí)細(xì)菌處于快速生長 期，與熟黃豆接觸后可以直接以指數(shù)級擴(kuò)增，有效增加了納豆對α -葡萄糖苷酶的抑制率。
[0026] 2.本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)=OD6。。為0. 5~1. 2的納豆枯草芽孢桿菌在28-32Γ下最適合 生長，可快速繁殖，同時(shí)發(fā)酵時(shí)間為55_72h，在此條件下發(fā)酵可進(jìn)一步提高納豆對α -葡萄 糖苷酶的抑制率。
[0027] 3.本發(fā)明大幅提高了納豆對α -葡萄糖苷酶的抑制作用，具體是納豆對α -葡萄 糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 下列實(shí)施例中如無特殊說明，均為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）》（科學(xué)出版社， 2002年）《微生物實(shí)驗(yàn)》（化學(xué)工業(yè)出版社，2010年）所記載的方法。
[0030] 以下實(shí)施例中，化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)材料從杭州南天生物科技有限公司購買。蒸大豆、 材料滅菌使用上海申安LDZX-50KBS高壓滅菌鍋。所有無菌操作在蘇凈安泰SW-CJ-2FD超 凈工作臺中進(jìn)行。細(xì)菌培養(yǎng)在一恒THZ300C搖床中進(jìn)行。納豆生產(chǎn)所需的溫度和濕度在一 恒LHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行，濕度為70%。納豆后熟在海爾B⑶-649WE冰箱的冷 藏室（4°C )中進(jìn)行，納豆制備完畢后在海爾B⑶-649WE冰箱的冷凍室（零下20°C )中保 存?zhèn)溆?。納豆枯草芽孢桿菌600納米的吸光度（OD6J和葡萄糖檢測中505納米的吸光度 (OD5q5)使用BioTek Elx808酶標(biāo)儀檢測。
[0031] 實(shí)施例1.黃豆和納豆枯草芽孢桿菌的預(yù)處理
[0032] 熟黃豆的處理方法如下：
[0033] 稱取1000 g干黃豆，加入500ml清水，浸泡12小時(shí)；黃豆取出，瀝水，放入高壓滅菌 鍋中，121°C，蒸20分鐘；取出黃豆，降溫至室溫，稱黃豆，此時(shí)熟黃豆質(zhì)量為1560g。
[0034] 納豆枯草芽孢桿菌的處理方法如下：
[0035] 1.購買北京川秀國際貿(mào)易有限公司的川秀納豆菌，稱取lg，溶于500ml-lL滅菌水 中；
[0036] 2.用滅菌牙簽沾取菌液以平板劃線法接種到LB平板（1%胰蛋白胨，0. 5酵母提取 物，1%氯化鈉，1.5%瓊脂，？!17.4，121°(：滅菌15分鐘后，倒入滅菌平板中）上，30°(：培養(yǎng)24 小時(shí)；
[0037] 3.挑取單克隆放入100ml LB液體培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，0. 5酵母提取物，1%氯化 鈉，1.5%瓊脂，pH7.4，121°C滅菌15分鐘）中，在搖床中以30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘的條件培養(yǎng) 納豆枯草芽孢桿菌；
[0038] 4.搖菌6個小時(shí)后，每個小時(shí)檢測一次OD6。。值，取出OD6。。值為0. 5、0. 7、I. 0、1. 2、 1. 7的納豆枯草芽孢桿菌IOml備用。
[0039] 實(shí)施例2.利用不同生長階段的納豆枯草芽孢桿菌生產(chǎn)納豆
[0040] 1.取4個滅菌的塑料飯盒，分別加入實(shí)施例1中處理的熟黃豆50g。
[0041 ] 2.使用LB液體培養(yǎng)基將0D_值為0. 5、1. 0、1. 2的納豆枯草芽孢桿菌菌液均稀釋 到0D6。。= 0. 7,稀釋后的菌液與OD _值為0. 7的菌液的細(xì)菌濃度相同。
[0042] 3.將Iml 0D_值為0· 5的稀釋后的菌液、OD 6。。值為0· 7的菌液、OD 6。。值為L 0、 1. 2的稀釋后的菌液分別加入上述4個裝有熟黃豆的滅菌塑料飯盒中，使用滅菌筷子將塑 料飯盒中的熟黃豆和菌液拌勻。
[0043] 4.將塑料飯盒放入培養(yǎng)箱中，30°C，培養(yǎng)60小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅菌筷子將黃 豆攪拌一次。
[0044] 5.將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小時(shí)后，放入零下20°C冰箱備用，依次標(biāo) 記為ODl納豆、0D2納豆、0D3納豆、納豆0D4。
[0045] 實(shí)施例3.不同發(fā)酵溫度下生產(chǎn)納豆
[0046] 1.取3個滅菌的塑料飯盒，分別加入實(shí)施例1中處理的熟黃豆30g。
[0047] 2.將Iml 0D_值為0. 7的菌液分別加入至上述3個裝有熟黃豆的滅菌塑料飯盒 中，并分別標(biāo)記為1-3號。使用滅菌筷子將塑料飯盒中的熟黃豆和菌液拌勻。
[0048] 3.將1號塑料飯盒放入一個培養(yǎng)箱中，28°C，培養(yǎng)60小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅菌 筷子將黃豆攪拌一次；
[0049] 將2號塑料飯盒放入一個培養(yǎng)箱中，30°C，培養(yǎng)60小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅菌筷 子將黃豆攪拌一次；
[0050] 將3號塑料飯盒放入一個培養(yǎng)箱中，32°C，培養(yǎng)60小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅菌筷 子將黃豆攪拌一次。
[0051] 4.在第60小時(shí)，取出1-3號塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小 時(shí)后，放入零下20°C冰箱備用，分別標(biāo)記為1號納豆、2號納豆、3號納豆。
[0052] 實(shí)施例4.不同發(fā)酵時(shí)間下生產(chǎn)納豆
[0053] 1.取4個滅菌的塑料飯盒，分別加入實(shí)施例1中處理的熟黃豆60g。
[0054] 2.將Iml 0D_值為0. 7的菌液分別加入至上述4個裝有熟黃豆的滅菌塑料飯盒 中，并分別標(biāo)記為4-7號。使用滅菌筷子將塑料飯盒中的熟黃豆和菌液拌勻。
[0055] 3.將4-7號塑料飯盒放入一個培養(yǎng)箱中，30°C，培養(yǎng)72小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅 菌筷子將黃豆攪拌一次。
[0056] 4.在第55小時(shí)，取出4號塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小時(shí) 后，放入零下20°C冰箱備用，標(biāo)記為4號納豆；
[0057] 在第60小時(shí)，取出5號塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小時(shí)后， 放入零下20°C冰箱備用，標(biāo)記為5號納豆；
[0058] 在第65小時(shí)，取出6號塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納放入4°C冰箱，后熟24小時(shí)后， 放入零下20°C冰箱備用，標(biāo)記為6號納豆；
[0059] 在第72小時(shí)，取出7號塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小時(shí)后， 放入零下20°C冰箱備用，標(biāo)記為7號納豆。
[0060] 對比例1現(xiàn)有工藝生產(chǎn)納豆
[0061] 1.取1個滅菌的塑料飯盒，加入實(shí)施例1中處理的熟黃豆50g。
[0062] 2.使用LB液體培養(yǎng)基將OD6。。值為1. 7的納豆枯草芽孢桿菌菌液均稀釋到OD 6。。 =0. 7,稀釋后的菌液與0D_值為0. 7的菌液的細(xì)菌濃度相同。
[0063] 3.將Iml稀釋后的菌液加入至上述裝有熟黃豆的滅菌塑料飯盒中，使用滅菌筷子 將塑料飯盒中的熟黃豆和菌液拌勻。
[0064] 4.將塑料飯盒放入一個培養(yǎng)箱中，35°C，培養(yǎng)24小時(shí)，每隔8個小時(shí)使用滅菌筷子 將黃豆攪拌一次。
[0065] 5.在第24小時(shí)，取出塑料飯盒，將培養(yǎng)好的納豆放入4°C冰箱，后熟24小時(shí)后，放 入零下20°C冰箱備用，標(biāo)記為對比例1納豆。
[0066] 實(shí)施例5.檢測納豆對α -葡萄糖苷酶抑制率
[0067] 本實(shí)施例使用未發(fā)酵的熟黃豆作為陰性對照，標(biāo)記為0號，具體檢測步驟如下：
[0068] 1.分別將實(shí)施例2、3、4、對比例1裝有納豆的塑料飯盒從零下20°C冰箱取出，放 入滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘，這樣可以將納豆中具有類似α -葡萄糖苷酶活性的酶類滅 活。
[0069] 2.在50ml離心管中加入Ig滅菌后的納豆或者未發(fā)酵的熟黃豆（陰性對照）、3ml 滅菌水和2個直徑6mm的滅菌鋼珠。
[0070] 3.將步驟2中的50ml離心管放入凈信JXFSTPRP-24全自動組織研磨機(jī)中，研磨頻 率為50Hz/秒，運(yùn)行1分鐘，納豆被完全磨碎；從50ml離心管中取出lml，轉(zhuǎn)移至I. 5ml離 心管中，在Eppendorff臺式離心中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，除去不溶于水的 沉淀物。
[0071] 4.從離心后的1.5ml離心管中取出上清10 μ 1，加入0.2ml塑料管中，然后加 入10μ1 lU/μΙ的α-葡萄糖苷酶溶液，放入培養(yǎng)箱中，37°C，反應(yīng)10分鐘；在反應(yīng)后的 0. 2ml塑料管中繼續(xù)加入80 μ 1 0. 1 %的麥芽糖溶液，放入培養(yǎng)箱中，37 °C，反應(yīng)30分鐘。
[0072] 5.在酶標(biāo)板中加入20 μ 1步驟6反應(yīng)后的溶液和80 μ 1反應(yīng)液（南京建成生物技 術(shù)有限公司的葡萄糖檢測試劑盒），將酶標(biāo)板放入培養(yǎng)箱中，37°C，反應(yīng)5分鐘。
[0073] 6.將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，檢測各個樣品在505納米的吸光度（ODm5數(shù)值）。使 用公式計(jì)算納豆對α -葡萄糖苷酶抑制率，抑制率（％)= 100X (A-B)/A，A表示未發(fā)酵的 熟黃豆（陰性對照）的OD505數(shù)值，B表示納豆的OD 5。5數(shù)值。
[0074] 實(shí)施例2制備的納豆對α -葡萄糖苷酶抑制率的檢測結(jié)果如表1所示，實(shí)施例3 制備的納豆對α -葡萄糖苷酶抑制率的檢測結(jié)果如表2所示，實(shí)施例4、對比例1制備的納 豆對α -葡萄糖苷酶抑制率的檢測結(jié)果如表3所示。由表1-3可知，與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝相比， 本發(fā)明生產(chǎn)的納豆對α-葡萄糖苷酶的抑制率可提高6倍以上。
[0075] 表 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高納豆水提取物對α -葡萄糖苷酶抑制率的納豆制備方法，其包括如下步 驟： 1) 在熟黃豆中加入納豆枯草芽孢桿菌，混勻，其中，熟黃豆與納豆枯草芽孢桿菌的質(zhì)量 體積比為30-60 :1，g :ml ;所述納豆枯草芽孢桿菌的0D6QQ= 0. 5-1. 2 ; 2) 發(fā)酵 發(fā)酵溫度為28-32 °C，發(fā)酵濕度為60-80%，發(fā)酵時(shí)間為55-72h ; 3) 后熟 后熟溫度為2-6°C，后熟時(shí)間為24-48h。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆制備方法，其特征在于，步驟1)中所述納豆枯草芽孢桿 菌的 〇D6(W= 0· 5-1. 0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆制備方法，其特征在于，步驟2)中所述發(fā)酵時(shí)間為 55-65h。
【文檔編號】A23L1/20GK105982035SQ201510073997
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月12日
【發(fā)明人】方軍, 張小峰, 楊瑞芳, 白建江, 樸鐘澤
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上海創(chuàng)博食品技術(shù)發(fā)展有限公司