動(dòng)物飼料添加劑的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001 ] 本案為針對(duì)CN201510095993.X號(hào)專利的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物飼料添加劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，長(zhǎng)期存在的問(wèn)題是飼料的存放中的微菌毒素污染;動(dòng)物食用被 污染的飼料后，造成養(yǎng)殖動(dòng)物出現(xiàn)免疫抑制、下痢、母豬流產(chǎn)、仔豬假發(fā)情等問(wèn)題。而面對(duì)這 一問(wèn)題，由于飼料的種植生產(chǎn)中與所生長(zhǎng)的氣候環(huán)境等相關(guān)，無(wú)法從源頭保證隔絕微菌的 污染；因此在這一情形下，多采用添加吸附劑這一物理吸附的方式來(lái)有效解決飼料污染的 問(wèn)題。其中，物理吸附的方式多采用"微菌毒素吸附劑"對(duì)飼料中的微菌毒素進(jìn)行吸附去除， 以降低微菌毒素在養(yǎng)殖中的上述毒害。
[0004] 常用的"微菌毒素吸附劑"有水和硅酸鋁、活性炭等等。這些吸附脫霉劑能在液相 下與微菌毒素形成穩(wěn)定的鍵合，進(jìn)行吸附;但是上述的常用吸附劑，僅能對(duì)于部分的微菌毒 素具有吸附效果，比如:無(wú)機(jī)吸附劑對(duì)黃麴毒素(AFL)的吸附效果佳，但是卻對(duì)其他霉菌毒 素卬通、？2、001了2等）的吸附效果非常低。這些吸附劑使用中吸附片面的原因在于，一方面 吸附效果優(yōu)劣UI吸附材料的結(jié)構(gòu)相關(guān)，譬如吸附空洞的大小、吸附結(jié)構(gòu)本身的電荷分布方 式、有效吸附面積等等，無(wú)法保證與所有的微菌毒素相匹配;另一方面不同的吸附結(jié)構(gòu)與不 同毒素具有不同的親和性，而產(chǎn)生親和性的差異影響因素有親水性、疏水性、結(jié)構(gòu)式與電荷 分布等等，因此手吸附自身這些性質(zhì)的限制，也不可能全面地吸附所有的霉菌毒素。
[0005] 因此，現(xiàn)有的"微菌毒素吸附劑"在使用中對(duì)多種微菌毒素的吸附效果較為片面， 不能滿足大量去除微菌污染的需求，同時(shí)在使用中這些微菌毒素會(huì)使養(yǎng)殖的動(dòng)物產(chǎn)生免疫 抑制，而采用吸附劑在吸附之后也不能對(duì)動(dòng)物食用污染飼料已經(jīng)產(chǎn)生的免疫抑制有良好的 緩解和修復(fù)的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有脫霉劑吸附效果片面且無(wú)法修復(fù)已經(jīng)造成的 免疫抑制問(wèn)題的上述不足，提供一種。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0008] -種飼料用抗菌肽脫霉劑的動(dòng)物飼料添加劑，其中飼料用抗菌肽脫霉劑包括酵母 細(xì)胞壁和抗菌肽。
[0009] 采用本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑中采用的脫霉劑為本發(fā)明的上述飼料用抗菌肽脫 霉劑，其添加至飼料中之后，對(duì)飼料中微菌毒素的吸附親和能力有提升，提升了脫霉的效 果;并且還可同時(shí)具有殺霉及修補(bǔ)多重功效。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種飼料用抗菌肽脫霉劑，包括酵母細(xì)胞壁和抗菌肽；
[0012] 其中的酵母細(xì)胞壁本身成分主要是葡萄糖甘露聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與同樣屬于有機(jī) 類的霉菌毒素的親和性非常優(yōu)良，能夠形成較好的親和吸附；相比無(wú)機(jī)的吸附劑，該種類型 的細(xì)胞壁吸附劑針對(duì)霉菌毒素所共有的表面有機(jī)結(jié)構(gòu)進(jìn)行，相對(duì)能彌補(bǔ)無(wú)機(jī)吸附劑的片面 缺點(diǎn)。同時(shí)，脫霉劑在酵母細(xì)胞壁吸附下混合抗菌肽，利用抗菌肽本身具有廣譜抗菌活性的 特點(diǎn)，結(jié)合單純的酵母細(xì)胞壁相對(duì)吸附廣，在吸附的同時(shí)用抗菌肽進(jìn)行增強(qiáng)殺菌，提升脫霉 劑的效果，并且抗菌肽在家畜使用后對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的免疫抑制有修復(fù)作用;整體上本發(fā)明的 脫霉劑可同時(shí)具有殺霉、脫霉、吸附及修補(bǔ)多重功效。
[0013] 其中，在本發(fā)明的上述脫霉劑中，抗菌肽由于本身是生物內(nèi)在免疫的效應(yīng)分子，在 生物體內(nèi)含量甚微，從天然資源中提取成本高、得率低、工序繁瑣，從生物體內(nèi)直接提取大 量抗菌肽的生產(chǎn)不滿足本發(fā)明中大量飼料中添加的使用需求。因此，基于上述目的，本發(fā)明 還提出一種能夠滿足上述飼料用抗菌肽脫霉劑大量制備的方法，包括如下步驟：
[0014] S10,將含有目的抗菌肽的編碼基因與載體重組，構(gòu)建表達(dá)目的抗菌肽的重組表達(dá) 載體；
[0015] S20,將步驟SlO所獲得的重組表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，形成酵母工程菌；
[0016] S30，將步驟S20所獲得的酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0017] S40，將步驟S30發(fā)酵培養(yǎng)所獲得的含有酵母細(xì)胞菌體和工程菌表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn) 物進(jìn)行自溶破壁、分離、純化后即可獲得同時(shí)含有酵母細(xì)胞菌體和目的抗菌肽的產(chǎn)物，即得 到本發(fā)明的上述脫霉劑。
[0018] 在上述整體制備的方法步驟的立意下，采用構(gòu)建酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的方式 進(jìn)行，發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中工程菌大量表達(dá)抗菌肽，因此在最終的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中同時(shí)具備 有酵母菌的細(xì)胞體和抗菌肽的表達(dá)產(chǎn)物;然后使產(chǎn)物中的酵母菌的細(xì)胞體自容破壁之后， 然后進(jìn)行分離純化收集酵母細(xì)胞壁和抗菌肽，即可大量獲得脫霉劑產(chǎn)品。
[0019] 進(jìn)一步在上述整體的方法立意下，本發(fā)明中進(jìn)一步根據(jù)本身酵母細(xì)胞所能夠進(jìn)行 非融合表達(dá)的特性，其中步驟SlO中構(gòu)建的工程菌中表達(dá)的目的基因?yàn)榭咕腎sCT編碼基 因；本身IsCT是一種天然的α-螺旋抗菌肽，來(lái)源于馬達(dá)加斯加黑爪蝎（Opi sthacanthus madagascariensis)，是抗菌肽中最短的多肽，僅由13個(gè)氨基酸殘基（ILGKIWEGIKSLF)組成， 沒(méi)有半胱氨酸，對(duì)哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞都有活性。本發(fā)明中進(jìn)行采用是基于這個(gè)原因設(shè)計(jì) 的 IsCT 衍生物中的[L6，Kll]-IsCT(ILGKILKGIKKLF)中與IsCT- 樣，對(duì) E. coli， P.aeruginosa, S. trphimurium，S. epidermidis，S.aureus有相同的抑菌活性，同時(shí)當(dāng)[L6， Kll]-IsCT濃度達(dá)到100μΜ時(shí)的溶血活性僅為20%，能夠具備在飼料中添加使用的能力。
[0020] 在上述情形下，本申請(qǐng)步驟SlO中針對(duì)采用的抗菌肽IsCT的表達(dá)，重組表達(dá)載體的 步驟可以包括如下：
[0021] Sll，根據(jù)酵母密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)上述IsCT表達(dá)的編碼基因，該基因?yàn)榫哂行?列表SEQ. ID.No. 1的喊基序列的IsCT基因；
[0022] L/iN 丄 UDD 丄 ?????ο λ · * I ^ 〇/ ?
[0023] S12,采用質(zhì)粒pYES2作為載體，并以pYES2a質(zhì)粒的α信號(hào)肽為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0024]在該步驟中采用質(zhì)粒pYES2作為載體，構(gòu)建抗菌肽IsCT的重組表達(dá)載體；
[0025]其中在該步驟S12中，采用質(zhì)粒pYES2,其目的在于在經(jīng)過(guò)對(duì)酵母菌的非融合表達(dá) 特點(diǎn)和本身IsCT的氨基酸結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)反復(fù)的多種驗(yàn)證和考量之后最終采用質(zhì)粒pYES2進(jìn)行； 原因在于:首先，質(zhì)粒PYES2本身具有酵母GALl啟動(dòng)子，其能夠在釀酒酵母中用半乳糖高水 平的進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)能被葡萄糖抑制;且質(zhì)粒PYES的多克隆位點(diǎn)區(qū)域還具有CYCl終止子，能 夠有效終止mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，采用該質(zhì)粒在表達(dá)能力較強(qiáng)的同時(shí)還更加易于控制;其次，質(zhì) 粒PYES2本身的多克隆位點(diǎn)具有多種可用的酶切位點(diǎn)，便于重組操作;第三，質(zhì)粒本身具有 URA3基因和氨芐抗性基因，分別可以用于篩選帶有ura3基因型的酵母宿主菌株轉(zhuǎn)化子，和 在大腸桿菌中進(jìn)行載體篩選。在采用該質(zhì)粒PYES2作為目的基因的表達(dá)載體之后，基于質(zhì)粒 PYES2的采用，針對(duì)其pYES2a質(zhì)粒的α信號(hào)肽為模板設(shè)計(jì)引物，其中pYES2a質(zhì)粒(932-1207堿 基區(qū)段)的a信號(hào)肽的序列具有序列表SEQ. ID.No.2堿基序列；
[0026]以上述α信號(hào)肽為模板，分別設(shè)計(jì)的引物為具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的 上游