/秒的速度將菌懸液滴入到0.4%海藻酸鋼溶液中，用紗網(wǎng)過 濾，并用滅菌的生理鹽水沖洗掉微球表面的海藻酸鋼。然后放入到滅菌的3%氯化巧溶液中 固定化20min，從而使微囊壁更加的堅初，減少微囊的破損。濾出沖洗，再次放入到0.1%殼聚 糖溶液中放置20min，使在微囊的表面形成一層半透膜，提高微囊的抗逆性。最后將微膠囊 濾出保存到滅菌的生理鹽水中備用。
[0027] 6、開菲爾發(fā)酵劑的配制 根據(jù)步驟2中，各分離菌種統(tǒng)計數(shù)量，然后將制作得到的馬克思克魯維酵母CICC1953; 開菲爾乳桿菌CICC20260和腸膜明串珠菌CICC23516(質(zhì)量比1:1);己氏醋桿菌羅旺亞種 CICC7011微膠囊按重量2:7:1進行配比，制成新型的開菲爾發(fā)酵劑。
[0028] 7、開菲爾的制作和比較 將步驟6中制得的發(fā)酵劑，按1%的比例接種到滅菌乳中，20°C，100r/min進行連續(xù)發(fā)酵， 每24小時更換發(fā)酵液。抑作為發(fā)酵效果的指標，通過抑計測定。直到發(fā)酵液pH穩(wěn)定后，取發(fā) 酵液與傳統(tǒng)開菲爾進行比較。利用氣質(zhì)聯(lián)用儀和氨基酸分析儀分別分析兩種樣品中揮發(fā)性 風味成分和游離氨基酸組成。結(jié)果如圖1，圖2和表1，從中可W看出，揮發(fā)性風味成分和游離 氨基酸的組成和含量非常相似，證明運種新型的開菲爾發(fā)酵劑是可行的。
[0029] 實施例2 馬克思克魯維酵母化luyveromyces marxianus):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、，保藏 編號為CICC1953; 開菲爾乳桿菌化actobacillus kefiri):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保藏編號為 CICC20260； 腸膜明串珠菌化euconostoc mesenteroides):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保藏編 號為 CICC23516; 己氏醋桿菌羅旺亞種(Acetobacter lovaniensis):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保 藏編號為CICC7011 具體操作過程如下： 1、菌種分離 取ImL開菲爾發(fā)酵液進行梯度稀釋，然后分別吸取20化L的稀釋液涂布到MRS培養(yǎng)基(乳 酸菌選擇培養(yǎng)基），PDA培養(yǎng)基(酵母菌選擇培養(yǎng)基），Elliker培養(yǎng)基(醋酸菌選擇培養(yǎng)基） 上，其中PDA和Elliker培養(yǎng)基放入30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，MRS培養(yǎng)基放在37°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，直到菌落長出。通過菌落形態(tài)觀察，優(yōu)勢菌有1株酵母菌，2株乳酸菌和1株醋酸菌。統(tǒng)計 各菌株的數(shù)量，來確定各菌株在發(fā)酵劑中所占的比重。
[0030] 2、菌種的鑒定 通過對開菲爾優(yōu)勢菌的鑒定和菌落計數(shù)的結(jié)果，確定優(yōu)勢菌的種屬和相互之間的比 例。確定酵母菌、乳酸菌和酵母菌的比例為4:14:6,其中兩種乳酸菌的比例是1:3。
[0031] 3、菌株的擴增培養(yǎng) 在超凈工作臺上，將購得的馬克思克魯維酵母CICC1953、開菲爾乳桿菌CICC20260和 腸膜明串珠菌CICC23516、己氏醋桿菌羅旺亞種CICC7011各挑取2環(huán)分別接種到PDA液體培 養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基和Elliker液體培養(yǎng)基上進行擴增培養(yǎng)，其中酵母菌和醋酸菌30°C， 12化/min條件下培養(yǎng)，乳酸菌37°C，120r/min條件下培養(yǎng)。通過測定發(fā)酵液的0D值確定菌株 的生長階段。各取lOOmL對數(shù)期的菌液備用。
[0032] 4、菌液的預處理 各取50mL對數(shù)期的菌液，8000g，4°C離屯、15min，去除上清液，用滅菌水清洗菌體Ξ次。 然后將收集到的菌體分別進行稀釋，制成lO^c化/mL的菌液，保存到4°C的冰箱中備用。
[0033] 5、液忍微膠囊的制備 取ImL菌液與19mL含有7%的氯化巧和ο. 6%黃原膠的混合溶液混合，制成20mL菌懸液，然 后在不斷攬拌的情況下，W5滴/秒的速度將菌懸液滴入到0.8%海藻酸鋼溶液中，用紗網(wǎng)過 濾，并用滅菌的生理鹽水沖洗掉微球表面的海藻酸鋼。然后放入到滅菌的7%氯化巧溶液中 固定化50min，從而使微囊壁更加的堅初，減少微囊的破損。濾出沖洗，再次放入到0.2%殼聚 糖溶液中放置50min，使在微囊的表面形成一層半透膜，提高微囊的抗逆性。最后將微膠囊 濾出保存到滅菌的生理鹽水中備用。
[0034] 6、開菲爾發(fā)酵劑的配制 根據(jù)步驟2中，各分離菌種統(tǒng)計數(shù)量，確定酵母菌、乳酸菌和酵母菌的比例為4:14:6，其 中兩種乳酸菌的比例是1:3。然后將所得到的各菌株的微膠囊按重量4:14:6進行配比，制成 新型的開菲爾發(fā)酵劑。
[0035] 7、開菲爾的制作和比較 將步驟6中制得的發(fā)酵劑，按6%的比例接種到滅菌乳中，40°C，150r/min進行連續(xù)發(fā)酵， 每48小時更換發(fā)酵液。抑作為發(fā)酵效果的指標，通過抑計測定。直到發(fā)酵液pH穩(wěn)定后，取發(fā) 酵液與傳統(tǒng)開菲爾進行比較。利用氣質(zhì)聯(lián)用儀和氨基酸分析儀分別分析兩種樣品中揮發(fā)性 風味成分和游離氨基酸組成。結(jié)果如圖1，圖2和表1，從中可W看出，揮發(fā)性風味成分和游離 氨基酸的組成和含量非常相似，證明運種新型的開菲爾發(fā)酵劑是可行的。
[0036] 表 1
【主權(quán)項】
1. 一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于其原料包括： 制備微囊的原料：1〇8~101()cfu/mL的菌液； 混合溶液(其中含有質(zhì)量濃度為0.2~0.6%黃原膠與質(zhì)量濃度為3~7%氯化鈣)和質(zhì)量濃 度為0.4~0.8%的海藻酸鈉溶液用于制備微囊，體積比為1:1~3; 質(zhì)量濃度為〇. 1~〇. 4%的殼聚糖溶液用于固化微囊，微囊與殼聚糖溶液體積比為1:2~5; 利用對數(shù)后期的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌分別制成的微囊按質(zhì)量混合比例為：（2~6): (7~14):(1~4)〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于菌株為馬克思克魯維酵 母CICC1953;開菲爾乳桿菌CICC20260;腸膜明串珠菌CICC23516;巴氏醋桿菌羅旺亞種 CICC7011。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于其中酵母菌是 Kluyveromycesmarxianus，乳酉愛菌是Lactobaci1luskefiri和Leuconostoc mesenteroides，醋酸菌是醋酸菌Acetobacterlovaniensis〇4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于酵母菌，利用PDA培養(yǎng)基 (馬鈴薯200g/L，葡萄糖20.0g/L，水lOOOmL，121°C滅菌20min)，30°C，120r/min進行擴增，通 過測定菌液的0D值來確定酵母菌的生長曲線，取對數(shù)期的菌液，4°C，8000r/min離心15min， 收集菌體備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于乳酸菌，利用MRS培養(yǎng)基 (蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，檸檬酸二銨2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，乙酸鈉 5g/L，硫酸錳0.05g/L，七水硫酸鎂0.58g/L，葡萄糖20g/L，加水至 1000mL，pH6.0-6.5， 121°C滅菌20min)，35°C，120r/min進行擴增，通過測定菌液的0D值來確定醋酸菌的生長曲 線，取對數(shù)期的菌液，4°C，8000r/min離心15min，收集菌體備用。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于醋酸菌，利用LB培養(yǎng)基 (氯化鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，加蒸餾水至1000mL，121°C滅菌20min)，30°C， 120r/min進行擴增，通過測定菌液的0D值來確定醋酸菌的生長曲線，取對數(shù)期的菌液，4°C， 8000r/min離心15min，收集菌體備用。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于酵母菌、乳酸菌和醋酸 菌，分別制成1〇8~10 1()cfu/mL的菌液，然后取lmL菌液與19mL的黃原膠和氯化鈣溶液混合均 勻，利用注射裝置將混合菌液勻速滴入到海藻酸鈉溶液中，形成液芯微膠囊;過濾并用無菌 水沖洗表面的海藻酸鈉，然后放入3~7%的氯化鈣溶液中固化處理20~50min，濾出沖洗，放入 到0.1~0.4%的殼聚糖溶液中處理20~50min，濾出沖洗備用。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型開菲爾發(fā)酵劑，其特征在于按照質(zhì)量比酵母菌微膠 囊:乳酸菌微膠囊:醋酸菌微膠囊=(2~6): (7~14): (1~4)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型的開菲爾發(fā)酵劑的制備方法，屬于發(fā)酵乳制品技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)酵劑是模擬開菲爾粒中的優(yōu)勢菌通過液芯微囊化后按照一定比例而制得。液芯微囊為微生物提供了很好的成長空間，而且有利于內(nèi)外物質(zhì)的流通，同時阻礙外部大分子物質(zhì)進入和內(nèi)部微生物的流出，經(jīng)過持續(xù)的培養(yǎng)，微囊內(nèi)部微生物可以達到很高的密度。本方法易于控制，操作簡便，所制得的發(fā)酵劑微膠囊產(chǎn)量高、穩(wěn)定性很好。本發(fā)明克服了開菲爾粒發(fā)酵不穩(wěn)定，傳統(tǒng)純培養(yǎng)發(fā)酵劑不能循環(huán)利用以及固芯微膠囊生存空間小，不利于微生物生長等缺點。有利于開菲爾的工業(yè)化生產(chǎn)，并利用該發(fā)酵劑發(fā)酵得到營養(yǎng)和風味俱佳的開菲爾。
【IPC分類】A23C9/127
【公開號】CN105454422
【申請?zhí)枴緾N201510809186
【發(fā)明人】王亮, 劉克營, 鐘浩, 郭愛珍, 胡曼, 齊向輝, 蔡梅紅
【申請人】江蘇大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年11月23日