專利名稱：使用酵母的抗壞血酸生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和用于抗壞血酸及抗壞血酸立體異構(gòu)體生產(chǎn)的酵母的用途。
已經(jīng)有報導(dǎo)，酵母中存在ASA(Heick等人，1972，加拿大微生物學(xué)雜志(Can.J.Microbiol.)18597-600)。已經(jīng)公開了，L-半乳糖底物在假絲酵母中轉(zhuǎn)化成ASA(1986年6月17日授權(quán)的美國專利號4,595,659和1990年4月10日授權(quán)的4,916,068)。Costamagna等人(1986，加拿大微生物學(xué)雜志32756-758)公開了通過某些酵母利用ASA的研究結(jié)果。這份報告公開了能夠以ASA以及異抗壞血酸生長的隱球酵母屬(Cryptococcus)和假絲酵母屬(Candida)的物種。
不管ASA及其生物催化中間體生產(chǎn)中的科學(xué)優(yōu)勢，仍然需要生產(chǎn)抗壞血酸的方法以供應(yīng)全球需要。利用可更新的碳源生產(chǎn)抗壞血酸的方法的發(fā)現(xiàn)將是非常有意義的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在酵母中生產(chǎn)抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體。本發(fā)明部分根據(jù)這樣的意外發(fā)現(xiàn)能夠以抗壞血酸或異抗壞血酸作為唯一碳源生長的多個酵母成員能夠利用KLG作為唯一碳源產(chǎn)生抗壞血酸。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了由酵母生產(chǎn)抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的方法。
附圖簡述

圖1圖解了布蘭克假絲酵母(Candida blankii)、休哈塔假絲酵母(Candida shahatae)、和迪門納隱球酵母(Cryptococcus dimmnae)在酵母氮基中以2KLG作為唯一碳源的生長。
圖2圖解了布蘭克假絲酵母、休哈塔假絲酵母、迪門納隱球酵母、和淺黃隱球酵母(Cryptococcus luteolus)在酵母氮基中在艾杜糖酸鈉鹽上的生長。
圖3圖解了使用抗壞血酸氧化酶實(shí)驗(yàn)測定來自全細(xì)胞反應(yīng)混和物的布蘭克假絲酵母和迪門納隱球酵母的上清液中的ASA含量。
發(fā)明詳述定義如此處所用，術(shù)語“抗壞血酸”是生物化學(xué)命名法IUPAC-IUB委員會認(rèn)可的維生素C的名稱。其它名稱包括L-抗壞血酸、L-木糖型抗壞血酸、和L-蘇糖-己-2-烯酸γ內(nèi)酯。純的維生素是C6H8O6，分子量176.13。抗壞血酸可能有四種立體異構(gòu)體L-抗壞血酸、顯示維生素C活性的D-阿拉伯糖型抗壞血酸(赤藻糖酸，異抗壞血酸)、L-阿拉伯糖型抗壞血酸、和D-木糖型抗壞血酸?？箟难嶂虚g體或“途徑中間體”是那些能夠經(jīng)由酶或化學(xué)方法轉(zhuǎn)化成ASA的生化產(chǎn)物，包括(但不限于)葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、山梨醇、山梨糖、山梨酮(sorbosone)、和山梨糖雙丙酮。
術(shù)語“能夠利用KLG產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體”，當(dāng)指酵母時，指能夠通過任何方法，包括生物催化轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化，由KLG產(chǎn)生抗壞血酸的酵母。
本領(lǐng)域清楚了解的，當(dāng)存在于溶液中時，或者不以其所制備的溶液而以固相存在時，糖類的酸性衍生物可以根據(jù)其周圍介質(zhì)以多種離子化狀態(tài)存在。指稱這類分子的術(shù)語，諸如以艾杜糖酸為例，意欲包括所指有機(jī)分子的所有離子化狀態(tài)。由此，例如，“艾杜糖酸”、其環(huán)化形式“艾杜糖酸內(nèi)酯”、和“艾杜糖酸酯/鹽”均指相同的有機(jī)部分，且不欲指定特定的離子化狀態(tài)或化學(xué)形式。
如此處所用，術(shù)語“重組(體)(的)”指包含生物體中非天然存在的核酸的酵母，和/或包含重組導(dǎo)入的內(nèi)源核酸之額外拷貝的酵母。如此處所用，術(shù)語“異源”指在酵母中非天然存在的核酸或氨基酸序列。如此處所用，術(shù)語“內(nèi)源”指在酵母中天然存在的核酸。重組宿主還可以在天然存在的核酸中具有突變和/或刪除，使得不產(chǎn)生核酸編碼的蛋白質(zhì)。
如此處所用，“核酸”指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或一部分，和基因組或合成來源的DNA或RNA，可以是雙鏈或代表有義鏈或反義鏈的單鏈。如此處所用，“氨基酸”指肽或蛋白質(zhì)序列或其一部分。
如此處所用，術(shù)語“氧化性酶”指能夠催化給定氧化狀態(tài)的底物轉(zhuǎn)化成比底物更高氧化狀態(tài)的產(chǎn)物之酶或酶系統(tǒng)。術(shù)語“還原性酶”指能夠催化給定氧化狀態(tài)的底物轉(zhuǎn)化成比底物更低氧化狀態(tài)的產(chǎn)物的酶或酶系統(tǒng)。與六碳糖轉(zhuǎn)化成ASA途徑中間體的生物催化有關(guān)的氧化性酶，包括D-葡萄糖脫氫酶、D-葡萄糖酸脫氫酶、和2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶，以及L-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨糖脫氫酶、和L-山梨醛脫氫酶活性。與ASA途徑中間體轉(zhuǎn)化成期望的終產(chǎn)物的生物催化有關(guān)的還原性酶，包括2，5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶(DKGR)、2-酮還原酶(2-KR)、和5-酮還原酶(5-KR)。這類酶包括宿主酵母天然產(chǎn)生的那些酶和經(jīng)由重組方法導(dǎo)入的那些酶。
如此處所用，術(shù)語“六碳糖酸”特別包括L-半乳糖酸底物，且包括(但不限于)2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸、2-酮葡萄糖磷酸酯、2，5-二酮-L-古洛糖酸、2，3-二酮-L-古洛糖酸、脫氫抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、和D-甘露糖酸。
如此處所用，術(shù)語“六碳糖”包括(但不限于)葡萄糖、古洛糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖、和甘露糖，均可以是D型或L型。
如此處所用，術(shù)語“分離(的)”或“純化(的)”指與其天然相關(guān)的至少一種成分分開的核酸或蛋白質(zhì)或肽。在本發(fā)明中，分離核酸可以包括一種包含核酸的載體。如此處所用，用于描述由發(fā)酵過程衍生的碳源的“純化的”，指將該碳源與發(fā)酵培養(yǎng)物中與其天然相關(guān)的至少一種成分分開。發(fā)明詳述在酵母中生產(chǎn)ASA本發(fā)明涉及在能夠利用KLG作為唯一碳源產(chǎn)生ASA的酵母中生產(chǎn)ASA或抗壞血酸立體異構(gòu)體(如異抗壞血酸)。本發(fā)明特別排除在經(jīng)由L-半乳糖酸內(nèi)酯氧化酶途徑產(chǎn)生ASA的酵母中生產(chǎn)ASA的方法。酵母描述于N.J.W.Kreger-van Rij，“酵母”，第1卷酵母生物學(xué)，第2章，A.H.Rose和J.S.Harrison編，1987，Academic Press，倫敦。屬于半知酵母類群的酵母的一般特征為不形成子囊孢子和擔(dān)孢子。ASA對氧敏感，因此，優(yōu)選能夠厭氧生長的酵母，以降低產(chǎn)生的ASA的氧化。本發(fā)明還涵蓋使用在好氧條件下培養(yǎng)的酵母生產(chǎn)ASA的方法，只要ASA環(huán)境中存在還原劑，如二硫蘇糖醇、谷胱甘肽，金屬螯合劑(如EDTA)，穩(wěn)定劑(如偏磷酸、氨基酸、乙二醇、糖、草酸、三氯乙酸、8-羥基喹啉(D.W.Bradley，G.Emery，和J.E.Maynard，1973，臨床化學(xué)學(xué)報(Clin.Chim.Acta)447-52)。
可以用于本發(fā)明的酵母包括(但不限于)此處所列的那些酵母，并由下列保藏號例示布蘭克假絲酵母CBS1898，ATCC18735；彎假絲酵母(C.curvata)CBS570；土生假絲酵母(C.humicola)；C.incommunisATCC22971；薩地假絲酵母(C.salmanticensis)ATCC16042；假絲酵母屬的種(C.sp.)ATCC28528，ATCC20473；淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)CBS4192；迪門納隱球酵母CBS5770；Cr.heveanensis CBS140；枸杞隱球酵母(Cr.kuetzingii)UCD68-196；淺黃隱球酵母CBS953斯金納隱球酵母(Cr.skinneri)UCD60-82，CBS5029；地生隱球酵母(Cr.terreus)CBS1895，CBS6293，CCY17-8-5；指甲隱球酵母(Cr.uiguttulatus)CBS1730；羅倫隱球酵母(Cr.laurentii)CCY17-3-2，CCY17-3-6，ATCC32044；新型隱球酵母(Cr.neoformans)ATCC32045；Cr.podzolicus CCY17-20-1；皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)UCD54-169，CCY30-5-4；白吉利絲孢酵母(T.beigelii)NRRLY-1490；出芽絲孢酵母(T.pullulans)ATCC10677；出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)DBVA9，A10，A62，A77，A84；碎囊漢遜酵母(Hansenula capsulata)DBV3164，ATCC24204；斯達(dá)油脂酵母(Lipomyces starkeyi)UCD51-55，CBS1809；產(chǎn)油油脂酵母(L.lipofer)NRRL Y]1351；Phaffia rhodoayma ATCC24201；膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)NRC211003；葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)ATCC9373，ATCC9080；肋狀復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)ATCC2082；西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)NRC2782，NRC2783；和耶耳球擬酵母(Torulopsis ernobii)ATCC20000。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母是半知酵母類群的成員。用于生產(chǎn)ASA方法的半知酵母優(yōu)選的科是隱球酵母科。隱球酵母科優(yōu)選的屬是假絲酵母屬和隱球酵母屬。
如實(shí)施例所示，當(dāng)以KLG作為唯一碳源生長時，布蘭克假絲酵母和迪門納隱球酵母能夠產(chǎn)生比背景水平高的ASA，休哈塔假絲酵母雖然能夠以KLG作為唯一碳源生長，但是不能產(chǎn)生ASA。例示性實(shí)施例公開了休哈塔假絲酵母ATCC編號34887、布蘭克假絲酵母ATCC編號18735、迪門納隱球酵母ATCC編號22024、和淺黃隱球酵母ATCC編號32044的用途。本發(fā)明涵蓋已知酵母物種的突變體、衍生物、或后代，特別是屬于隱球酵母科的屬的已知物種的突變體，如屬于假絲酵母屬和隱球酵母屬的那些，只要突變體、衍生物、或后代能夠利用KLG作為唯一碳源產(chǎn)生ASA。本發(fā)明涵蓋用于在酵母中生產(chǎn)ASA或ASA立體異構(gòu)體的方法，其中酵母是天然存在的，即未經(jīng)基因工程改造，以及其中酵母是重組的，且包含編碼與酵母中碳源-KLG轉(zhuǎn)化有關(guān)的氧化性和/或還原性酶的異源核酸。在本發(fā)明中，碳源(諸如六碳糖酸)可以是加入到酵母培養(yǎng)物中的單獨(dú)發(fā)酵過程的產(chǎn)物，諸如通過Lazarus等人(1991，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bact.)1736651-6661)公開的方法或通過Saito等人(1997，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)63454-460)公開的方法制備的KLG。衍生自單獨(dú)發(fā)酵過程的碳源，可以在用于生產(chǎn)ASA或ASA立體異構(gòu)體或者之間進(jìn)行純化，或者由發(fā)酵過程直接使用。碳源還可以衍生自化學(xué)方法。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，酵母經(jīng)基因工程改造包含與在酵母中碳源-KLG轉(zhuǎn)化有關(guān)的異源氧化性酶或異源還原性酶之一，或二者兼有，由此提供能夠?qū)⑻荚?諸如葡萄糖或其它六碳糖)經(jīng)由中間體KLG轉(zhuǎn)化成抗壞血酸的單一生物體。重組酵母宿主可以包含多種異源氧化性酶和/或多種異源還原性酶，從而由六碳糖或六碳糖酸產(chǎn)生抗壞血酸。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源是葡萄糖，且重組酵母包含編碼至少下列一項(xiàng)的異源核酸(a)葡萄糖脫氫酶(GDH)；(b)葡萄糖酸脫氫酶(GADH)；(c)2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)；和(d)2，5-二-酮-D-葡萄糖酸還原酶(2，5-DGKR)，假定如果酵母沒有包含所有(a)-(d)的異源核酸，則酵母包含相應(yīng)的內(nèi)源核酸，使得酵母包含(a)-(d)每一項(xiàng)的核酸，并能夠?qū)⑵咸烟墙?jīng)由中間體KLG轉(zhuǎn)化成ASA。熟練技術(shù)人員清楚了解的，涉及碳底物向ASA轉(zhuǎn)化的氧化和還原反應(yīng)可能需要向酵母培養(yǎng)物中加入輔助因子。例如，1991年7月16日授權(quán)的美國專利號5,032,514中描述的2，5-DGKR需要NADPH。酶反應(yīng)中必需的輔助因子的其它范例包括(但不限于)ATP、NAD+、NADP+、NADH、NADPH和輔酶A。酵母還可以在干擾碳流期望途徑的內(nèi)源氧化性和/或還原性酶中具有刪除或突變。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，碳源是山梨醇，且重組酵母包含編碼至少下列一項(xiàng)的異源核酸(a)D-山梨醇脫氫酶(SLDH)；(b)L-山梨糖脫氫酶；和(c)L-山梨酮(sorbosome)脫氫酶，假定如果酵母沒有包含所有(a)-(c)的異源核酸，則酵母包含相應(yīng)的內(nèi)源核酸，使得酵母包含(a)-(c)每一項(xiàng)的核酸，并能夠?qū)⑸嚼娲冀?jīng)由中間體2KLG轉(zhuǎn)化成ASA。編碼氧化性或還原性酶的核酸的來源包括酶 引文葡萄糖脫氫酶Smith等人，1989，生化雜志(Biochem.
J.)261973；Neijssel等人，1989，AntonieVan Leavrnhoek 56(1)51-61。葡萄糖酸脫氫酶 Matsushita等人，1979，生化雜志(J.
Biochem.)851173；Kulbe等人，1987，紐約科學(xué)院年鑒(Ann.N.Y.Acad.
Sci.)506552。2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶 Stroshane，1977，生物技術(shù)和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)19(4)459。2-酮葡萄糖酸還原酶 普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)1991，1371479。2，5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶 美國專利號5,795,761；5,376,544；5,583,025；4,757,012；4,758,514；5,008,193；5,004,690；5,032,514。L-山梨糖脫氫酶；L-山梨酮Saito等人，1997，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)脫氫酶；和L-山梨醇脫氫酶63454。重組酵母的構(gòu)建可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)構(gòu)建包含由碳源產(chǎn)生ASA必需的核酸的重組酵母。分子生物學(xué)技術(shù)公開于Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州。可以如下文所述由天然宿主分離或者通過化學(xué)方法產(chǎn)生編碼與ASA產(chǎn)生有關(guān)的氧化性酶和還原性酶的基因。例如，如果基因序列是已知的，則可以通過限制性核酸內(nèi)切酶消化構(gòu)建合適的基因組文庫，并用與期望基因序列互補(bǔ)的探針進(jìn)行篩選。一旦分離得到序列，可以使用引導(dǎo)擴(kuò)增方法(諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR)的標(biāo)準(zhǔn)引物擴(kuò)增DNA(US4,683,202)，從而獲得大量適合于使用適當(dāng)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的核酸。適合于在酵母中克隆、轉(zhuǎn)化、和表達(dá)編碼與ASA產(chǎn)生有關(guān)的氧化性和還原性酶的核酸的多種載體和轉(zhuǎn)化和表達(dá)盒，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。用于獲得并使用這類載體的方案，在本領(lǐng)域是眾所周知的(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第1、2、3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約州，1989)。
載體或盒通常包含引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記、和使其能夠自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含控制轉(zhuǎn)錄起始的基因5’區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3’區(qū)。這些控制區(qū)可以衍生自酵母的同源或異源基因，只要這些選定的區(qū)能夠在酵母中行使功能。
能夠在酵母中驅(qū)動氧化性或還原性酶表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動子，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。事實(shí)上，能夠驅(qū)動這些基因的任何啟動子均適合于本發(fā)明，包括(但不限于)CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TP1。
將編碼氧化性或還原性酶的核酸通過起始密碼子與選定的表達(dá)控制區(qū)可操作連接，從而有效表達(dá)氧化性或還原性酶。
一旦構(gòu)建了合適的盒，用它們轉(zhuǎn)化酵母，并對酵母篩選由適當(dāng)碳源產(chǎn)生ASA的能力。例如，在一個實(shí)施方案中，用編碼脫氫酶活性或還原酶活性之一(或二者兼有)的核酸轉(zhuǎn)化酵母，并對經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母篩選由六碳糖(諸如葡萄糖)或六碳糖酸(諸如KLG)產(chǎn)生ASA的能力。ASA的檢測檢測ASA及ASA立體異構(gòu)體的方法包括利用2，6-二氯靛酚的氧化還原滴定(Burton等人，1979，分析家協(xié)會雜志(J.Assoc.Pub.Analysts)17105)；陰離子交換高效液相層析(HPLC)(1980，層析雜志(J.Chrom.)196163)；和電氧化還原方法(Pachia，1976，分析化學(xué)(Anal.Chem.)48364)。還可以采用涉及抗壞血酸氧化酶的酶法。
在本發(fā)明中，通過HPLC、此處所用的比色法抗壞血酸氧化酶實(shí)驗(yàn)、和GC-質(zhì)量分光光度法進(jìn)行ASA檢測。熟練技術(shù)人員熟知用于這些檢測方法的對照。由于KLG和ASA之間存在化學(xué)平衡(即KLG包含背景水平的ASA)，為了使用HPLC UV檢測抗壞血酸，記錄底物KLG的洗脫特性并作為對照。對于抗壞血酸氧化酶實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行不含樣品和酶的空白對照。對于GCMS分析，分析衍生劑和底物KLG作為對照。
還期望有檢測能夠由碳源產(chǎn)生ASA的酵母的篩選方法。篩選能夠產(chǎn)生ASA的酵母的方法包括下列步驟獲得能夠以抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體生長的酵母，在適合產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的條件下在存在KLG時培養(yǎng)所述酵母，并對所述酵母培養(yǎng)物測試抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的產(chǎn)生。發(fā)酵和純化培養(yǎng)基和碳底物將天然存在的酵母或能夠利用KLG產(chǎn)生ASA的重組酵母在存在合適碳源時進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，并回收ASA。合適的碳源包括六碳糖或六碳糖酸。此處公開的酵母生長利用的碳源將只受宿主有機(jī)體的需要限制。例如，天然存在的酵母可以在存在六碳糖酸(如KLG)時生長，而經(jīng)基因工程改造包含編碼脫氫酶和還原酶之一(或二者兼之)的核酸的重組酵母可以在存在六碳糖(如葡萄糖)時生長。除了適當(dāng)碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含合適的礦物質(zhì)、鹽、輔助因子、緩沖液、和其它成分，這些物質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且適合培養(yǎng)物的生長和ASA的產(chǎn)生。Costamagna等人(1986，加拿大微生物學(xué)雜志(Can.J.Microbiology)32756-758)描述了適用于培養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
可以在好氧或厭氧條件下培養(yǎng)酵母。ASA對氧敏感，因此，厭氧培養(yǎng)產(chǎn)生ASA的酵母將降低產(chǎn)生的ASA的氧化?；蛘撸绻诤醚鯒l件下培養(yǎng)酵母，ASA環(huán)境中優(yōu)選存在還原劑，如二硫蘇糖醇、谷胱甘肽，金屬螯合劑(如EDTA)，穩(wěn)定劑(如偏磷酸、氨基酸、乙二醇、糖、草酸、三氯乙酸、8-羥基喹啉。本發(fā)明涵蓋分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，而生產(chǎn)ASA的方法可在一個或兩個發(fā)酵罐中進(jìn)行。例如，如果酵母經(jīng)基因工程改造包含由六碳糖(諸如葡萄糖)轉(zhuǎn)化成六碳糖酸(諸如KLG)的途徑，則ASA生產(chǎn)將以重組酵母作為宿主在一個發(fā)酵罐中進(jìn)行。如果酵母天然存在，且在酵母中由六碳糖酸(如KLG)產(chǎn)生ASA，則ASA生產(chǎn)可能在兩個發(fā)酵罐中進(jìn)行，一個如美國專利5,032,514或Saito等人(見上文)所述產(chǎn)生KLG，另一個在酵母中由KLG產(chǎn)生ASA。
典型的分批發(fā)酵是密閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成于發(fā)酵開始時設(shè)定，且在發(fā)酵過程中不再人為改變。由此，在發(fā)酵開始時給培養(yǎng)基接種期望的有機(jī)體并進(jìn)行發(fā)酵，此后不再向系統(tǒng)中加入任何物質(zhì)。然而，分批發(fā)酵通常指添加碳源是“分批”的，常常嘗試控制諸如pH和氧濃度等因素。分批系統(tǒng)的代謝物和生物量組成不斷變化，直至發(fā)酵停止。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞由靜止的延滯期過渡到快速生長的對數(shù)期，最終達(dá)到生長速率降低或停滯的穩(wěn)定期。如果不經(jīng)處理，穩(wěn)定期的細(xì)胞最終將死亡。對數(shù)期的細(xì)胞通常負(fù)責(zé)終產(chǎn)物或中間體的大量產(chǎn)生。
標(biāo)準(zhǔn)的分批系統(tǒng)的變化是補(bǔ)料-分批發(fā)酵系統(tǒng)，該系統(tǒng)也適合本發(fā)明。在典型的分批系統(tǒng)的這種變化中，隨發(fā)酵過程添加底物。當(dāng)代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞代謝時，當(dāng)期望限制培養(yǎng)基中底物的量時，可以使用補(bǔ)料-分批系統(tǒng)。在補(bǔ)料-分批系統(tǒng)中測量實(shí)際底物濃度是困難的，因此根據(jù)諸如pH、溶解氧、和廢氣(諸如CO2)分壓等可測因素進(jìn)行估計(jì)。分批和補(bǔ)料-分批發(fā)酵是常用的，在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可以在Brock(見上文)中找到范例。
本發(fā)明還涵蓋適用于連續(xù)發(fā)酵法的方法。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加精細(xì)發(fā)酵培養(yǎng)基，同時除去等量的條件培養(yǎng)基進(jìn)行處理。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物維持在持續(xù)高密度，其中細(xì)胞主要處于對數(shù)生長期。
連續(xù)發(fā)酵能夠允許調(diào)整影響細(xì)胞生長或終產(chǎn)物濃度的一種因素或任何數(shù)目的因素。例如，一種方法將有限的營養(yǎng)物(諸如碳源或氮水平)維持在固定速率，而允許調(diào)整所有其它參數(shù)。在其它系統(tǒng)中，當(dāng)細(xì)胞濃度(通過培養(yǎng)基混濁度測量)保持恒定時，能夠連續(xù)改變影響生長的大量因素。連續(xù)系統(tǒng)力爭維持穩(wěn)定狀態(tài)的生長條件，由此必須在發(fā)酵中將由于培養(yǎng)基消耗造成的細(xì)胞損失與細(xì)胞生長速率平衡。用于調(diào)整連續(xù)培養(yǎng)過程的營養(yǎng)和生長速率的方法，以及用于使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)，在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的，且Brock(見上文)詳述了多種方法。本發(fā)明的方法可以使用分批、補(bǔ)料-分批、或連續(xù)過程進(jìn)行。發(fā)酵后，可以通過多種方法由發(fā)酵液回收產(chǎn)生的ASA，包括離子交換樹脂、吸收或離子遲滯樹脂、活性炭、濃縮-結(jié)晶等等。
本發(fā)明的各個方面將由下列特定實(shí)施例進(jìn)一步描述，這些實(shí)施例并非意欲限制本發(fā)明的范圍。
抗壞血酸氧化酶實(shí)驗(yàn)使用購自Boehringer Mannheim的L-抗壞血酸測定試劑盒(產(chǎn)品目錄號409677)，根據(jù)隨試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行抗壞血酸氧化酶實(shí)驗(yàn)。試劑盒包含抗壞血酸氧化酶和用于檢測/定量(578nm)的MTT和PMS的偶聯(lián)染料系統(tǒng)(H.O.Beutler和G.Beinstingl，1984，酶分析方法(H.U.Bergmeyer編)第3版，第7卷，第376-385頁，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield，Beach/Florida，Basel)。
對照和空白0.5％2-KLG溶液含～2ppm抗壞血酸(pH6.1)。在全細(xì)胞KLG-ASA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中，在進(jìn)行含酵母反應(yīng)混和物的每次實(shí)驗(yàn)時，都進(jìn)行只含緩沖液的對照反應(yīng)(含KLG)。在另一個對照中，加熱殺死酵母細(xì)胞，然后與KLG溫育，以確認(rèn)在這些條件下未檢測到KLG向ASA轉(zhuǎn)化。
由于抗壞血酸氧化酶對抗壞血酸的降解作用導(dǎo)致層析峰的消失，通過樣品與抗壞血酸氧化酶的反應(yīng)，進(jìn)一步確認(rèn)了HPLC分析檢測到的抗壞血酸峰。
此實(shí)施例說明布蘭克假絲酵母能夠以KLG或艾杜糖酸作為生長的唯一碳源。此實(shí)施例還顯示，當(dāng)以KLG作為唯一碳源生長時，布蘭克假絲酵母產(chǎn)生抗壞血酸。
將具有ATCC編號18735的布蘭克假絲酵母如材料和方法部分所述進(jìn)行培養(yǎng)。如下文所述進(jìn)行了全細(xì)胞KLG-ASA反應(yīng)。將500ml 48小時培養(yǎng)物于4℃以9000rpm離心，收集了大約3g濕細(xì)胞。將細(xì)胞用冷的含0.5mMEDTA的200mM磷酸鹽緩沖液(pH6.1)進(jìn)行清洗。然后將細(xì)胞重懸于10ml含0.5％KLG的相同緩沖液。取3ml此反應(yīng)混和物，于微波爐中煮沸2分鐘。然后將兩種反應(yīng)混和物都置于30℃搖床中進(jìn)行全細(xì)胞ASA產(chǎn)生。于時間零點(diǎn)取1.5ml樣品，離心除去細(xì)胞沉淀，并保存于-20℃。將上清液用0.2μm濾膜進(jìn)行過濾，進(jìn)行HPLC分析，然后如上所述進(jìn)行抗壞血酸氧化酶和GC-MS分析。于活細(xì)胞反應(yīng)的2、4、和20小時時間點(diǎn)和熱殺死反應(yīng)混和物的20小時時間點(diǎn)，進(jìn)行相同取樣和檢查(表1)。熱殺死樣品不具有ASA的背景水平，且不產(chǎn)生ASA。
于20小時取樣后，通過加入檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液將反應(yīng)混和物的pH降低3個pH單位至pH3.15。于21小時取樣并分析，以標(biāo)定此條件變化的時間零點(diǎn)。將反應(yīng)進(jìn)行過夜。又過了24小時后，取最終樣品。在兩種pH值進(jìn)行平行KLG空白對照(無細(xì)胞)反應(yīng)，以觀察由KLG產(chǎn)生ASA的背景(見表1和圖3)。
如表l和圖3所示，當(dāng)布蘭克假絲酵母全細(xì)胞培養(yǎng)物以KLG作為唯一底物生長時，在反應(yīng)培養(yǎng)基中確認(rèn)了ASA的存在。反應(yīng)混和物中存在的ASA的濃度比背景水平高3倍。通過將反應(yīng)混和物的pH降至pH3，觀察到ASA水平又增加了3倍。降低pH對ASA具有穩(wěn)定作用，以及使得化學(xué)熱力學(xué)傾向于產(chǎn)生ASA。
將具有ATCC編號22024的迪門納隱球酵母如材料和方法部分所述進(jìn)行培養(yǎng)。如實(shí)施例1所述進(jìn)行了全細(xì)胞KLG-ASA反應(yīng)。
如表1和圖3所示，當(dāng)?shù)祥T納隱球酵母全細(xì)胞培養(yǎng)物以KLG作為唯一底物生長時，在反應(yīng)培養(yǎng)基中確認(rèn)了ASA的存在。反應(yīng)混和物中存在的ASA的濃度比背景水平高2倍。
表1HPLC結(jié)果(AU/面積)和樣品中的ASA濃度(mg/L)
權(quán)利要求
1.一種在酵母中生產(chǎn)抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的方法，包括下列步驟a)獲得能夠利用KLG產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的酵母；并b)在適合產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的條件下在存在碳源時培養(yǎng)酵母。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括回收所述抗壞血酸的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述碳源是六碳糖酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述六碳糖酸包括2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、6磷酸葡糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸-6-磷酸、2，5-二酮-L-葡萄糖酸、2，3-L-二酮-古洛糖酸、脫氫抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、和D-甘露糖酸。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述碳源是六碳糖，且所述酵母包含下列二者之一或二者兼有a)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的氧化性酶的異源核酸，和b)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的還原性酶的異源核酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述六碳糖包括葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖和果糖。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述氧化性酶具有脫氫酶活性。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述脫氫酶包括葡萄糖脫氫酶活性、葡萄糖酸脫氫酶活性、2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶活性、半乳糖脫氫酶活性、L-山梨糖活性、D-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨酮脫氫酶活性、L-艾杜糖酸氧化酶、和L-古洛糖酸氧化酶。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述還原性酶是還原酶活性。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述還原酶活性包括2，5-DGK還原酶活性、2，5-DKG還原酶活性、2，3-DKG還原酶、5-酮還原酶、2-酮還原酶、和2-酮古洛糖酸還原酶。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖，且酵母包含編碼至少下列一項(xiàng)的異源核酸(a)葡萄糖脫氫酶(GDH)；(b)葡萄糖酸脫氫酶(GADH)；(c)2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)；和(d)2，5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶(2，5-DGKR)，假定如果酵母沒有包含所有(a)-(d)的異源核酸，則酵母包含相應(yīng)的內(nèi)源核酸，使得酵母包含(a)-(d)每一項(xiàng)的核酸，并能夠?qū)⑵咸烟墙?jīng)由中間體KLG轉(zhuǎn)化成ASA。
12.權(quán)利要求1的方法，其中酵母是半知酵母類群的成員。
13.權(quán)利要求12的方法，其中酵母是隱球酵母科的成員。
14.權(quán)利要求13的方法，其中酵母包括假絲酵母屬和隱球酵母屬。
15.權(quán)利要求14的方法，其中酵母是布蘭克假絲酵母。
16.權(quán)利要求14的方法，其中酵母是迪門納隱球酵母。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含異源葡萄糖脫氫酶活性和2，5-DKG還原酶活性。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包括L-山梨糖活性、D-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨酮脫氫酶活性和半乳糖脫氫酶活性中的至少一種。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗壞血酸立體異構(gòu)體包括D-抗壞血酸、D-阿拉伯糖型抗壞血酸、和L-阿拉伯糖型抗壞血酸。
20.一種包含下列二者之一或二者兼有、能夠利用KLG產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的重組酵母a)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的氧化性酶的異源核酸，和b)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的還原性酶的異源核酸。
21.權(quán)利要求20的酵母，其中所述氧化性酶是脫氫酶活性。
22.權(quán)利要求21的酵母，其中所述脫氫酶包括葡萄糖脫氫酶活性、葡萄糖酸脫氫酶活性、2-酮-D-葡萄糖酸脫氫酶活性、半乳糖脫氫酶活性、L-山梨糖脫氫酶活性、D-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨酮脫氫酶活性、L-艾杜糖酸氧化酶、和L-古洛糖酸氧化酶。
23.權(quán)利要求20的酵母，其中所述還原性酶是還原酶活性。
24.權(quán)利要求23的酵母，其中所述還原酶活性包括2，5-DKG還原酶活性、2，5-DKG還原酶活性、2，3-DKG還原酶、5-酮還原酶、2-酮還原酶、和2-酮古洛糖酸還原酶。
25.權(quán)利要求20的酵母，其中酵母是半知酵母類群的成員。
26.權(quán)利要求25的方法，其中酵母是隱球酵母科的成員。
27.權(quán)利要求26的方法，其中酵母包括假絲酵母屬和隱球酵母屬。
28.權(quán)利要求27的方法，其中酵母是布蘭克假絲酵母。
29.權(quán)利要求27的方法，其中酵母是迪門納隱球酵母。
30.權(quán)利要求20的酵母，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含異源葡萄糖脫氫酶活性和2，5-DKG還原酶活性。
31.權(quán)利要求20的酵母，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包含L-山梨糖活性、D-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨酮脫氫酶活性、和半乳糖脫氫酶活性中的至少一種。
32.一種產(chǎn)生能夠利用六碳糖產(chǎn)生ASA或ASA立體異構(gòu)體的重組酵母的方法，包括下列步驟a)獲得能夠利用KLG產(chǎn)生ASA或ASA立體異構(gòu)體的酵母；并b)導(dǎo)入下列二者之一或二者兼有a)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的氧化性酶的異源核酸，和b)編碼與在所述酵母中產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體有關(guān)的還原性酶的異源核酸。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述酵母是半知酵母類群的成員。
34.權(quán)利要求33的方法，其中酵母是隱球酵母科的成員。
35.權(quán)利要求34的方法，其中酵母包括假絲酵母屬和隱球酵母屬。
36.權(quán)利要求35的方法，其中酵母是布蘭克假絲酵母。
37.權(quán)利要求35的方法，其中酵母是迪門納隱球酵母。
38.權(quán)利要求32的酵母，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含異源葡萄糖脫氫酶活性和2，5-DKG還原酶活性。
39.權(quán)利要求32的酵母，其中所述酵母是布蘭克假絲酵母或迪門納隱球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包含L-山梨糖活性、D-山梨醇脫氫酶活性、L-山梨酮脫氫酶活性、和半乳糖脫氫酶活性中的至少一種。
40.一種篩選能夠產(chǎn)生ASA的酵母的方法，包括下列步驟獲得能夠以抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體生長的酵母，在適合產(chǎn)生抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的條件下在存在KLG時培養(yǎng)所述酵母；并對所述酵母培養(yǎng)物測試抗壞血酸或抗壞血酸立體異構(gòu)體的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用能夠由2－酮－L－古洛糖酸(KLG)產(chǎn)生抗壞血酸(ASA)的酵母的抗壞血酸生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)ASA的方法,以及能夠由碳源產(chǎn)生ASA的重組酵母。
文檔編號C12P7/02GK1331750SQ99814996
公開日2002年1月16日 申請日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
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