專利名稱：Rna病毒拯救的新穎方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生命名為單鏈負義病毒目(Mononegavirales)的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的改良方法。優(yōu)選例涉及產(chǎn)生作為減毒和/或感染性病毒，如麻疹病毒(MV)，呼吸道合胞病毒(RSV)和人副流感病毒(PIV)的這些病毒的方法?？蓮腸DNA克隆中制備重組病毒，因此可獲得基因組中具有確定改變的病毒。
背景技術(shù)：
有包膜、負義單鏈RNA病毒是獨特組成和表達的。負義單鏈病毒的基因組RNA對核衣殼起著兩種模板作用作為信使RNA(mRNA)的合成模板和作為反基因組(+)鏈的合成模板。負義單鏈RNA病毒編碼和包裝其自身的RNA依賴性RNA聚合酶。信使RNA只是在病毒進入感染細胞的細胞質(zhì)后方才合成。病毒復(fù)制在mRNA合成后發(fā)生，而且需要病毒蛋白質(zhì)的不斷合成。新合成的反基因組(+)鏈作為產(chǎn)生(-)鏈基因組RNA其余拷貝的模板。
聚合酶復(fù)合物通過結(jié)合基因組3’末端的順式激活信號，特別是啟動子區(qū)促使并實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。然后病毒基因從基因組模板從其3’到其5’末端單向轉(zhuǎn)錄。相對于其上游的鄰居(即核蛋白基因(N))，從下游基因得到的mRNA總是較少(如聚合酶基因(L))。因此，根據(jù)基因相對于基因組3’末端的位置，總是存在mRNA豐度梯度。
由于裸露的基因組RNA或從轉(zhuǎn)染質(zhì)粒胞內(nèi)產(chǎn)生的RNA是非感染性的(Boyer和Haenni,1994)，證明對這些無節(jié)段RNA病毒的分子遺傳學(xué)分析直到最近都是困難的。通過允許分離重組無節(jié)段、負鏈RNA病毒(Pattnaik等，1992；Schnell,Mebatsion，和Conzelmann,1994)的巧妙cDNA拯救技術(shù)的發(fā)展，已克服了這個技術(shù)問題。拯救這些不同負鏈病毒的技術(shù)遵循一個共同主題，各具成功拯救必需的可鑒別成分(Baron和Barrett,1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；Hoffman和Banerjee,1997；Lawson等，1995；Radecke等，1995；Schneider等，1997；He等，1997；Schnell,Mebatsion和Conzelmann,1994；Whelan等，1995)。基因組cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，通過噬菌體T7 RNA聚合酶與能切割RNA形成3’末端的載體編碼的核酶序列聯(lián)合作用，產(chǎn)生了基因組RNA的精確拷貝。由共轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒提供的病毒蛋白包裝并復(fù)制該RNA。就麻疹病毒(MV)拯救系統(tǒng)而言(Radecke等，1995)，制備了表達T7 RNA聚合酶和MV蛋白N(核衣殼蛋白)和P(磷蛋白聚合酶亞基)的穩(wěn)定細胞系。因此，MV拯救可通過共轉(zhuǎn)染該細胞系和含有合適定位的T7聚合酶啟動子的MV基因組cDNA克隆，以及含有MV聚合酶基因(L)的表達質(zhì)粒來實現(xiàn)。
成功的麻疹病毒cDNA拯救顯然需要在轉(zhuǎn)染后發(fā)生許多分子活動，包括1)T7RNA聚合酶對基因組RNA的準確、全長合成和核酶序列對3’末端的加工；2)以適于引發(fā)復(fù)制的水平合成病毒N、P和L蛋白；3)基因組RNA從頭包裝入轉(zhuǎn)錄活性和有復(fù)制能力的核衣殼結(jié)構(gòu)中；和4)新形成的核衣殼以足夠使復(fù)制進展的水平表達病毒基因。尚未精確確定哪個步驟是成功拯救的限速步驟，但拯救的效率可能通過刺激上述任一步驟來改進。
本發(fā)明尋求改進挽救所需重組RNA病毒，如MV的能力。已提出通過拯救獲得病毒復(fù)制的能力可能減弱，因為編碼所需病毒的天然基因組和反基因組的多核苷酸的變化正在增加。因此，本發(fā)明試圖克服這種障礙，因為這些方法能大大提高通過拯救程序獲得所需重組病毒的可能性。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生單鏈負義病毒目的重組病毒的方法，包括(a)在至少一個宿主細胞中，進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物中包含在能充分允許這些載體共表達和產(chǎn)生重組病毒條件下的宿主細胞中；(ⅰ)一個含有分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體，該核酸分子中含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ⅱ)至少一個表達載體，該表達載體含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種以上的分離的核酸分子；(b)在能充分增加重組病毒挽救的條件下，加熱轉(zhuǎn)染的拯救組合物至有效熱休克溫度；和可任選的，(c)收獲得到的重組病毒。
一種涉及產(chǎn)生重組單鏈負義病毒目的額外方法，包括a)在至少一個宿主細胞中，進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物中包含，在能充分允許載體共表達和產(chǎn)生重組病毒條件下的宿主細胞中；(ⅰ)一個含分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體，該分子編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組，和(ⅱ)至少一個表達載體，該載體含有至少一個分離的核酸分子，該分子含有一條編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的反式作用蛋白的多核苷酸序列；b)將該轉(zhuǎn)染的拯救組合物轉(zhuǎn)移到至少一層Vero細胞上；和可任選的，收獲重組病毒。
本發(fā)明的另一方面涉及聯(lián)合上述方法的非重疊步驟，以及優(yōu)選例，來建立進一步改進的方法。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生減毒、感染性或兩者都有的單鏈負義病毒目RNA病毒的方法。附加的實施例涉及本發(fā)明方法所產(chǎn)生的病毒，和含有這些病毒的疫苗。注意，這些病毒可以是人或非人的，如小鼠或牛的。
在本文中詳細討論的上文指出的實施例和附加實施例，代表了本發(fā)明的目的。
附圖簡述

圖1描述了改良拯救程序的流程圖。該程序包括使用熱休克步驟和將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到單層Vero細胞上。
圖2是通過使用CAT試驗顯示熱休克對實施例4的小復(fù)制子基因表達的影響的放射性自顯影圖。
圖3是顯示實施例5的小復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染實驗的CAT試驗結(jié)果的放射性自顯影圖。
圖4A是用對一表位標(biāo)記(在實施例6涉及hsp70刺激小復(fù)制子基因表達的實驗中由CMV表達載體表達)的特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡。
圖4B是放射性自顯影圖，顯示2933-46細胞和hsp70表達載體，小復(fù)制子DNA和L表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染得到的CAT試驗結(jié)果。
圖5是表格(表1)，描述了6個獨立拯救實驗(用來測試實施例2描述的熱休克的效果)的噬斑計數(shù)。清楚顯示了熱休克程序的優(yōu)點。
圖6是含實施例10的T7基因-1的質(zhì)粒pGK16.2的圖。
發(fā)明詳述如上簡述，本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組RNA病毒的一種新穎方法。本領(lǐng)域的這些方法稱為“拯救”或反向遺傳學(xué)方法。在下列參考出版物中公開了示范性的用于不同的無節(jié)段、負鏈病毒的拯救方法Baron和Barrett,1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；He等，1997；Hoffman和Banerjee,1997；Lawson等，1995；Radecke和Billeter,1997；Radecke等，1995；Schneider等，1997；Schnell,Mebatsion,和Conzelmann,1994；Whelan等，1995。關(guān)于拯救的其它出版物包括已出版的國際專利申請WO 97/06270，關(guān)于MV和其它副粘病毒亞族病毒，和關(guān)于RSV拯救，已出版國際專利申請WO 97/12032；這些出版物納入本文作參考。
基因組cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，由噬菌體T7 RNA聚合酶與能切割RNA形成3’末端的載體編碼的核酶序列聯(lián)合作用，產(chǎn)生了基因組RNA的精確拷貝。由共轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒初步提供的病毒蛋白包裝并復(fù)制該RNA。就麻疹病毒(MV)拯救系統(tǒng)而言(Radecke等，1995)，制備了表達T7 RNA聚合酶和MV蛋白N(核衣殼蛋白)和P(磷蛋白)的穩(wěn)定細胞系。因此，MV拯救可通過共轉(zhuǎn)染該細胞系和含有合適定位的T7聚合酶啟動子的MV基因組cDNA克隆，以及含有MV聚合酶基因(L)的表達質(zhì)粒來實現(xiàn)。
公開了對于麻疹病毒的最初幾種拯救方法之一。麻疹病毒(MV)是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員，而且與該科所有成員一樣，MV是一種含有無節(jié)段、負義RNA基因組的有包膜病毒(Lamb和Kolakofsky,1996)。由于裸露的基因組RNA或從轉(zhuǎn)染質(zhì)粒胞內(nèi)產(chǎn)生的RNA是非感染性的(Boyer和Haenni,1994)，表明對這些無節(jié)段RNA病毒的分子遺傳學(xué)分析直到最近都是困難的。通過允許分離重組無節(jié)段、負鏈RNA病毒(Pattnaik等，1992；Schnell,Mebatsion，和Conzelmann,1994)的巧妙cDNA拯救技術(shù)的發(fā)展，已克服了這個技術(shù)問題。
本文中的這些拯救方法的基本步驟和組合物的簡要概述進一步描述如下通過多聚體蛋白對核糖核蛋白核心(核衣殼)的酶促作用實現(xiàn)了負義、單鏈RNA病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。裸露的基因組RNA不能作為模板。但是，這些基因組序列僅當(dāng)它們完全被N蛋白包裝入核衣殼結(jié)構(gòu)時，才被識別。僅在這一點上，基因組和反基因組末端啟動子序列才被識別而引發(fā)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制途徑。所有副粘病毒都需要三個病毒蛋白N、P和L，來進行聚合酶途徑。肺病毒包括RSV，也需要轉(zhuǎn)錄延伸因子，M2，來充分進行轉(zhuǎn)錄途徑。附加的輔因子也起作用，可能包括病毒編碼的NS1和NS2蛋白，以及可能包括宿主細胞編碼的蛋白質(zhì)。
簡單說，所有單鏈負義病毒目的拯救方法可總結(jié)如下每個都需要與所需病毒基因組等價的、置于合適的DNA依賴性RNA聚合酶啟動子(如T7 RNA聚合酶啟動子)和自身切割核酶序列(如丁型肝炎核酶)之間的克隆的DNA，將其插入合適的轉(zhuǎn)錄載體(如可增殖細菌質(zhì)粒)中。該轉(zhuǎn)錄載體提供易于操縱的DNA模板，使RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)能從該模板如實轉(zhuǎn)錄出具有精確或接近精確的5’和3’末端的病毒反基因組(或基因組)的單鏈RNA拷貝。病毒基因組DNA拷貝的方向和側(cè)翼啟動子以及核酶序列決定了轉(zhuǎn)錄反基因組還是基因組RNA的等價物。新病毒子代拯救還需要將裸露的單鏈病毒反基因組或基因組RNA轉(zhuǎn)錄物包裝入功能性核衣殼模板時所需的病毒特異性反式作用蛋白病毒核衣殼(N或NP)蛋白，聚合酶結(jié)合的磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。這些蛋白包含活性病毒RNA依賴性RNA聚合酶，它必須與該核衣殼模板結(jié)合來實施轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。選來用于拯救的某些病毒可能需要額外蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)錄延伸因子。
因此，在各方法中將使用拯救組合物。這些組合物是本領(lǐng)域熟知的。下列描述不限于本發(fā)明的方法中可使用的拯救組合物。拯救組合物包含在充分允許載體共表達和重組病毒產(chǎn)生的條件下的宿主細胞中(ⅰ)一個含有分離的核酸分子(其含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列)的轉(zhuǎn)錄載體，和(ⅱ)至少一個表達載體，該載體含有至少一個分離的核酸分子(它編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的反式作用蛋白)。
分離的核酸分子包含一個編碼至少一條單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的序列。基于病毒分類學(xué)國際委員會1993年修訂的重分類，已建立了一個被稱為單鏈負義病毒目的目。該目含有三個具有負極性(負義)的單鏈、無節(jié)段RNA基因組包膜病毒科。這些科是副粘病毒科、彈狀病毒科和纖絲病毒科。副粘病毒科進一步分成兩個亞科，副粘病毒和肺病毒。副粘病毒亞科含有三個屬，呼吸道病毒屬(以前稱為副粘病毒屬)，雅司病毒屬(Rubulavirus)和麻疹病毒屬。肺病毒亞科含有肺病毒屬。
新分類根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準，病毒基因組的組成，生物學(xué)活性和基因和基因產(chǎn)物的序列相關(guān)性。副粘病毒亞科的包膜病毒中的形態(tài)學(xué)區(qū)別特征是核衣殼的大小和形狀(直徑18納米，長1微米，螺距5.5納米)，具有左手螺旋對稱。生物學(xué)標(biāo)準是1)屬成員之間的抗原交叉反應(yīng)性，和2)呼吸道病毒屬、雅司病毒屬中存在神經(jīng)氨酸酶活性，麻疹病毒屬中不存在。另外，考慮到P基因編碼能力的變化，如在雅司病毒中存在一個額外基因(SH)。
肺病毒可從形態(tài)學(xué)上與副粘病毒科相區(qū)別，因為它們含有狹窄的核衣殼。另外，肺病毒在編碼蛋白的順反子數(shù)目中有重要區(qū)別(肺病毒中10個，而副粘病毒科中6個)，以及與副粘病毒科的非常不同的是只有一個附著蛋白(G)。雖然副粘病毒和肺病毒具有6個看似功能相應(yīng)的蛋白(N、P、M、G/H/HN、F和L)，只有最后的兩個蛋白在這兩個亞科之間顯示出顯著的序列相關(guān)性。幾個肺病毒蛋白質(zhì)缺乏大多數(shù)副粘病毒中的配對部分，即非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，小疏水蛋白SH，和第二蛋白M2。一些副粘病毒蛋白，即C和V，在肺病毒中缺少配對物。然而，肺病毒和副粘病毒的基本基因組組成是相同的。對于彈狀病毒和纖絲病毒來說也是相同的。表1代表了這些病毒現(xiàn)在的分類學(xué)分類，以及每個屬的例子。
表1單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒分類副粘病毒科(Family Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Subfamily Paramyxoviridae)呼吸道病毒屬(Genus Rispirovirus)(以前稱為副粘病毒屬)仙臺病毒Sendai virus(鼠副流感病毒1型mouse parainfluenza virus type1)人副流感病毒(PIV)1和3型Human parainfluenza virus type 1 and 3牛副流感病毒(BPV)3型Bovine parainfluenza virus type 3雅司病毒屬Genus Rubulavirus猴病毒5(SV5)Simian virus 5(犬副流感病毒2型Canine parainfluenzavirus type 2)腮腺炎病毒Mumps virus新城疫病毒Newcatle disease virus(NDV)(禽副粘病毒lavianParomyxovirus 1)人副流感病毒Human parainfluenza virus(PIV 2、4a和4b型)麻疹病毒屬Genus Morbillivirus麻疹病毒(MV)Measles virus海豚麻疹病毒Dolphin Morbillivirus犬瘟病毒(CDV)Canine distemper virusPeste-des petits-ruminants病毒豬瘟病毒Phocine distemper virus牛瘟病毒Rinderpest virus肺病毒亞科Subfamily Pneumovirinae肺病毒屬Genus Pneumovirus人呼吸道合胞病毒(RSV)Human respiratory syncytical virus牛呼吸道合胞病毒Bovine respiratory syncytial virus小鼠肺病毒Pneumonia virus of mice火雞鼻氣管炎病毒Turkey rhinotracheitis virus彈狀病毒科Family Rhabdoviridae狂犬病毒屬Genus Lyssavirus狂犬病毒Rabies virus水泡病毒屬Genus Vesiculovirus水泡性口炎病毒(VSV)Vesicular stomatitis virus三日病毒屬Genus Ephemerovirus牛三日熱病毒Bovine ephemeral fever virus纖絲病毒科Family Filoviridae纖絲病毒屬Genus Filovirus馬堡病毒Marburg virus如上所述，分離的核酸分子包含編碼至少一條單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的序列。分離的核酸分子可包含編碼基因組、反基因組或其修飾形式的多核苷酸序列。在一個實施例中，多核苷酸編碼可操作性連接的啟動子，所需基因組或反基因組和轉(zhuǎn)錄終止子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼通過核苷酸插入、重排、缺失或取代從野生型RNA病毒修飾而得的基因組或反基因組。已提出通過拯救獲得病毒復(fù)制的能力可能減弱，因為編碼所需病毒的天然基因組和反基因組的多核苷酸的變化正在增加。在這種情況下，本發(fā)明特別有價值，因為這些方法能大大提高通過拯救程序獲得所需重組病毒的可能性。基因組或反基因組序列可能衍生自人或非人病毒。多核苷酸序列還可編碼兩個或多個來源的基因組或反基因組重組性結(jié)合形成的嵌合基因組。例如，將RSV A組的一個或多個基因插入到RSV B組的相應(yīng)基因位置中；或?qū)⑴IV(BPIV)、PIV-1或PIV-2的一個或多個基因插入到PIV-3的相應(yīng)基因位置中；或RSV可以代替PIV的基因等。在額外的實施例中，該多核苷酸編碼單鏈負義病毒目的人、牛、或小鼠RNA病毒的基因組或反基因組。由于本發(fā)明方法形成的重組病毒可用作診斷性研究的工具或治療性或預(yù)防性疫苗，所以該多核苷酸還可編碼所選RNA病毒的野生型或減毒形式。在許多實施例中，該多核苷酸編碼RNA病毒的減毒、感染性形式。在具體優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼在3’基因組啟動子區(qū)有至少一個減毒突變，和在RNA聚合酶基因中有至少一個減毒突變的單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組，如出版的國際專利申請WO 98/13501描述的，此專利納入本文以供參考。
產(chǎn)生重組病毒的各種需要可能不同。因此，可選擇來自任一具體科的一種以上病毒副粘病毒科、彈狀病毒科或纖絲病毒科。
除了編碼上述所需基因組和反基因組的修飾形式的多核苷酸序列外，該多核苷酸序列還可編碼所需的基因組或反基因組，以及一種或多種異源基因。異源基因可按需要變化，由所需重組病毒的應(yīng)用而定，異源基因可編碼輔因子、細胞因子(如白細胞介素)，T-輔助性表位、限制性標(biāo)記、佐劑、或不同微生物病原體(如病毒、細菌或真菌)的蛋白，尤其是能誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的蛋白。也可用異源基因來提供用于基因治療的藥劑。在優(yōu)選例中，異源基因編碼的細胞因子，如白細胞介素-12，被選來改進重組病毒的預(yù)防性或治療性特性。
鑒于目前對改進的疫苗和提高治療病毒病原體可行性的需求，該分離的核酸分子包含編碼選自CDV、VSV、MV、RSV、PIV、腮腺炎病毒和狂犬病毒的RNA病毒。在這組RNA病毒中的進一步優(yōu)選是選自MV、RSV、PIV和BPV。
對于使用減毒病毒的實施例，本領(lǐng)域?qū)@些病毒的多種形式，以及引入減毒突變來產(chǎn)生修飾病毒的基本方法是熟知的。使用常規(guī)方法，如當(dāng)病毒在細胞培養(yǎng)中生長時，加入化學(xué)誘變劑來進行化學(xué)誘變，然后選擇亞適溫度下傳代的病毒來選擇溫度敏感型和/或冷適應(yīng)型突變體，鑒定在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生小噬斑的突變病毒，在異源宿主中傳代，來選擇宿主范圍突變體。引入減毒突變的另一種方法包括用定點誘變產(chǎn)生預(yù)定的突變體。可引入一個或多個突變。然后篩選這些病毒在動物模型中生物活性的減弱。對減毒病毒進行核苷酸測序來對減毒突變的位點進行定位。
進行拯救所需的各種反式作用蛋白在本領(lǐng)域中是熟知的。麻疹病毒拯救所需的反式作用蛋白是衣殼包裝蛋白N，和聚合酶復(fù)合物蛋白P和L。對于PIV-3，衣殼包裝蛋白稱為NP，而聚合酶復(fù)合物蛋白也稱為P和L。對于RSV，病毒特異性反式作用蛋白包括N、P和L，加上一個額外的蛋白M2,RSV編碼的轉(zhuǎn)錄延伸因子。
可從一種或多種編碼所需蛋白的表達載體(如質(zhì)粒)產(chǎn)生病毒反式作用蛋白，雖然在經(jīng)基因工程改造，作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，含有并表達這些病毒特異性基因和基因產(chǎn)物的所選宿主細胞中可產(chǎn)生一些或全部所需的反式作用蛋白。
對表達載體和編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制必需的反式作用蛋白的分離核酸分子的選擇，可以根據(jù)所需病毒的選擇而變化。制備了表達載體，用來在宿主細胞中與轉(zhuǎn)錄載體一起共表達，并在選定的條件下產(chǎn)生重組病毒。
用于拯救的典型(雖然不是必需唯一的)環(huán)境包括合適的哺乳動物細胞環(huán)境，其中存在T7，來驅(qū)動含病毒基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄載體的反基因組(或基因組)單鏈RNA轉(zhuǎn)錄。共轉(zhuǎn)錄或其后不久，核衣殼蛋白將病毒反基因組(或基因組)RNA轉(zhuǎn)錄物衣殼包裝入功能性模板中，與同時由編碼所需病毒特異性反式作用蛋白的共轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒產(chǎn)生的所需聚合酶組分結(jié)合。這些事件和過程導(dǎo)致病毒mRNA的首先必要的轉(zhuǎn)錄，新基因組的復(fù)制和擴增，從而產(chǎn)生新病毒子代，即拯救。
對于狂犬病毒、VSV、SV5和仙臺病毒的拯救，重組痘苗病毒VTF7-3提供了T7聚合酶。然而，該系統(tǒng)要求將拯救系統(tǒng)從痘病毒中通過物理或生物化學(xué)方法，或通過在痘病毒非良好宿主的細胞或組織中重復(fù)傳代來分離出來。對于MV cDNA拯救，通過建立表達T7聚合酶和病毒N和P蛋白的細胞系可避免該要求。通過將基因組表達載體和L基因表達載體轉(zhuǎn)染入輔助細胞系來實現(xiàn)拯救。優(yōu)選的，輔助細胞系在哺乳動物細胞中幾乎不或不產(chǎn)生子代病毒，并可被利用來拯救所需RNA病毒或病毒。輔助細胞可用作T7聚合酶的來源，如MVA/T7(如下所述)。同時表達了必需的衣殼包裝蛋白后，病毒聚合酶蛋白包裝、復(fù)制并轉(zhuǎn)錄合成的全長反基因組病毒RNA，而復(fù)制的基因組被包裝入感染性病毒。除了這些反基因組，現(xiàn)在也已成功拯救了仙臺病毒和PIV-3的基因組類似物(Kato等，和出版的國際專利申請WO 98/53708)。
如上所述，MVA/T7(痘苗病毒的減毒突變體)是可用來拯救RNA病毒的改良輔助病毒。一般，改良輔助病毒是從野生型病毒改變而來，在非允許細胞中顯示減弱的，或無病毒活性的病毒。MVA的特征確定了改良輔助病毒中優(yōu)選的特征。痘病毒的MVA株向更多致細胞病變株提供了引人注目的另一種選擇。在土耳其和德國的天花根除計劃中，通過在雞胚成纖維細胞中系列傳代(＞570)致細胞病變疫苗Ankara病毒開發(fā)出MVA，它已下降到生物安全1級病源，可被未接種過疫苗的實驗室人員使用。MVA含有6個主要缺失(＞基因組15％)，導(dǎo)致失去30,000以上的堿基對(Antoine，等，1998)。MVA可在有限數(shù)目的細胞系中復(fù)制(Carroll和Moss,1997；Drexler等，1998)并在非允許細胞中病毒成形的晚期復(fù)制被阻斷(Sutter和Moss,1992)。另外，MVA不誘導(dǎo)用野生型株觀察到的嚴重細胞病變作用(CPE)。MVA優(yōu)于其它宿主限制性痘病毒(如NYVAC,ALVAC和禽痘)的主要優(yōu)點是病毒的DNA復(fù)制，和因此幾乎所有基因類型的轉(zhuǎn)錄(早，中和晚)未受損傷。異源基因可在所有類型的啟動子作用下有效表達。已報道了表達噬菌體T7基因的兩種重組MVA。MVA/T7雜交病毒含有在7.5弱早/晚啟動子(Sutter等，1995)或11K強晚啟動子(Wyatt等，1995)調(diào)控下的T7基因-1的一個整合拷貝。已用兩者作為瞬時表達系統(tǒng)中的輔助病毒來遺傳性拯救負鏈RNA病毒(Collins等，1995；Leyrer等，1998；Schneider等，1997；Barron,M.D.和Barrett,T.從克隆的cDNA拯救牛瘟病毒，病毒學(xué)雜志，71(2)1265-71 1997年二月；Durbin,A.P.,Hall,S.L.,Siew,J.W.,Whitehead,S.S.,Collins,P.L.,和Murphy,B.R.,從cDNA挽救感染性人副流感病毒3型，病毒學(xué)，235(2):323-332,1997.；He等，1997)。
盡管使用輔助性病毒，如減毒輔助病毒MVA/T7是有益的，MVA/T7或其它輔助病毒的同時復(fù)制周期可能抑制拯救異源重組病毒所需的遺傳學(xué)活動。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選例中，當(dāng)使用輔助病毒時，還使用DNA合成抑制劑。該實施例導(dǎo)致拯救系統(tǒng)的改進。DNA合成抑制劑允許拯救發(fā)生，同時還抑制(或基本抑制)輔助病毒的DNA合成。示范性的DNA合成抑制劑，如AraC(胞苷β-D-阿拉伯呋喃糖)和羥基脲，在病毒生命周期的某關(guān)鍵點阻斷了輔助病毒的復(fù)制周期。因為中晚期病毒基因轉(zhuǎn)錄只在新生病毒基因組上引發(fā)這兩種類型基因由于AraC或羥基脲的阻斷而沉默。AraC通過摻入DNA來阻斷復(fù)制，而羥基脲抑制減少脫氧核糖核苷胞內(nèi)儲蓄池的核糖核苷還原酶。有許多可得到的其它DNA合成抑制劑。其它DNA合成抑制劑在阻斷細胞DNA合成上是已知的，但是它們未被推薦用于阻斷MVA復(fù)制。這些包括DNA聚合酶抑制劑(如Aphidicolin)，拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如喜樹堿等阻斷Ⅰ型拓撲異構(gòu)酶；新生霉素和萘啶酸阻斷Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶)，和DNA回旋酶抑制劑(如HeliQuinomycin)。阻斷細胞DNA合成的DNA合成抑制劑對嚴重依賴于細胞酶起復(fù)制功能的輔助病毒來說更有效。
在基因拯救工作中，使用DNA合成抑制劑的清晰優(yōu)點是被拯救的RNA病毒幾乎沒有或無修飾的輔助病毒污染。對于MVA，非允許細胞中的復(fù)制周期中止于成型的極晚期，得到無感染性的病毒顆粒。半允許細胞的感染導(dǎo)致有限的病毒生長，這在基因拯救實驗中是禁忌的。在AraC或羥基脲的阻斷下，伴隨的晚期蛋白合成的抑制導(dǎo)致完全缺乏病毒顆粒?？稍谠试S輔助病毒生長的細胞系中直接擴增拯救病毒。用于轉(zhuǎn)染的DNA合成抑制劑用量可根據(jù)分析輔助病毒生長的實驗輕易的確定。
一般理解，病毒cDNA轉(zhuǎn)換成重組RNA病毒所需的分子活動涉及通過T7聚合酶的轉(zhuǎn)錄和三個或多個病毒反式作用因子(N、P和L，對MV而言)復(fù)制負或正鏈的全長基因組。同時的MVA復(fù)制導(dǎo)致在整個拯救活動中消耗了胞內(nèi)和胞外資源，可能將其折衷到一定程度。阻斷中期和晚期基因表達導(dǎo)致這些資源的儲存，而且可能是抑制劑存在下增強了基因拯救的一個原因。病毒感染誘導(dǎo)的細胞病變作用(CPE)在MVA-感染的細胞中，與野生型病毒感染的細胞比較，顯著降低了。在用DNA合成抑制劑處理的MVA感染細胞中，它被進一步降低。延長感染細胞的壽命可使更廣泛的各種異源基因表達。這可能是改進基因拯救的另一個有利部分。
用其它啟動子(強早期，早/中期，中期或早/晚期)來驅(qū)動T7表達，能增強基因拯救，優(yōu)選在DNA復(fù)制抑制劑的存在下。痘病毒的啟動子適合本發(fā)明的方法。
然后用至少兩個上述表達載體來轉(zhuǎn)化宿主細胞。將宿主細胞在允許這些載體共表達的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生感染性減毒病毒。
然后首先用體外實驗測試被拯救的感染性病毒是否有所需表型(溫度敏感型、冷適應(yīng)型、噬斑形態(tài)和轉(zhuǎn)錄和復(fù)制弱化)。還用小復(fù)制子系統(tǒng)(其中所需反式作用衣殼包裝和聚合酶活性由野生型或痘苗輔助病毒，或由表達攜帶有基因特異性減毒突變的N、P和不同L基因提供)測試了順式激活3’基因組啟動子區(qū)的突變(Radecke等(1995)和Sidhu等，(1995))。
如果存在被拯救病毒的減毒表型，用合適的動物模型進行攻擊實驗。非人靈長類提供了人疾病病理的優(yōu)選動物模型。首先用減毒、重組產(chǎn)生的病毒免疫這些靈長類，然后用病毒的野生型形式攻擊。
在本發(fā)明的拯救方法中可使用的宿主細胞是那些允許產(chǎn)生所需重組病毒必需組分的載體表達的細胞。這些宿主細胞可選自原核細胞或真核細胞，優(yōu)選是脊椎動物細胞。一般說，優(yōu)選的宿主細胞衍生自人細胞，例如人胚腎細胞。Radecke等，1995公開了衍生自人胚腎細胞系(命名為293 3-46)的使用。Vero細胞和許多其它細胞類型都可用作宿主細胞。下面是合適的細胞例子(1)人二倍體原代細胞系如WI-38和MRC5細胞；(2)猴二倍體細胞系如FRhL-胎恒河猴肺細胞；(3)準原代連續(xù)傳代細胞系如AGMK-非洲綠猴腎細胞；(4)人293細胞(合格)和(5)其它可能的細胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬腎)，原代雞胚成纖維細胞。在其它優(yōu)選例中，加入轉(zhuǎn)染促進劑來提高細胞對DNA的攝入。許多這些藥劑都是本領(lǐng)域已知的。LIPOFECTACE(Life Technologies,Gaithersburg,MD)和EFFECTENE(Qiagen,Valencia,CA)是常見的例子。Lipofectace和Effectene都是陽離子脂。它們都包裹DNA，并增強細胞對DNA的攝入。Lipofectace形成包圍DNA的脂質(zhì)體，而Effectene包裹DNA但不形成脂質(zhì)體。
由于本發(fā)明使用的許多RNA病毒是人病原體，在這樣的情況下優(yōu)選使用靈長類細胞。例外是犬瘟病毒和其它感染非人哺乳動物的麻疹病毒屬。所有這些病毒僅感染真核細胞。麻疹病毒主要限于靈長動物細胞類。一些真核細胞系比其它細胞能更好的增殖病毒，而一些細胞系對某些病毒完全不增殖。用能產(chǎn)生可檢測細胞病變效果的細胞系可輕易的檢測出活病毒的拯救。就麻疹和其它可能的病毒而言，在Vero細胞上培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞，因為病毒在Vero細胞上可迅速傳播，并產(chǎn)生可輕易檢測的噬斑。這是本發(fā)明的另一個重要特征。一般說，使用允許所選病毒生長的宿主細胞。在一些情況下，宿主細胞是“互補細胞型”。就麻疹病毒而言，采用293-3-46細胞(Radecke等，1995)，因為它們表達麻疹病毒的N和P基因，和T7 RNA聚合酶的基因。其它系統(tǒng)沒有這個限制，因為由表達質(zhì)粒和表達T7 RNA聚合酶的痘病毒提供了所有必需的病毒蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)錄載體和表達載體可以設(shè)計成在宿主細胞中表達的質(zhì)粒載體。含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制必需的反式作用蛋白的至少一個分離的核酸分子的表達載體可從相同的表達載體或至少兩個不同載體表達這些蛋白。一般都知道基本拯救方法的這些載體，并不需要在用于本發(fā)明的改進方法中改變它們。
在本發(fā)明的一個改進方法中，使用了有效的熱休克溫度。有效熱休克溫度是進行重組病毒拯救建議的標(biāo)準溫度以上的溫度。在許多情況下，有效熱休克溫度在37℃以上。當(dāng)在有效熱休克溫度下進行拯救方法時，拯救方法增加了所需重組病毒的回收，高于當(dāng)在溫度不提高時進行拯救所回收的重組病毒水平。該有效熱休克溫度和暴露時間可根據(jù)所用的拯救系統(tǒng)而變化。這些溫度和時間變化可由所選病毒基因組或宿主細胞類型的不同而定。雖然溫度可變，但有效熱休克溫度可通過用具體重組病毒進行幾個試驗拯救過程，并隨溫度和暴露時間改變而確定所需重組病毒的回收百分比來確定。當(dāng)然，進行拯救的任何溫度范圍上限是在該溫度下，轉(zhuǎn)染成分受到破壞，或其在轉(zhuǎn)染中起作用的能力喪失或減弱的溫度。
下文顯示了示范性的溫度范圍表從38℃到大約50℃，從39℃到大約49℃，從39℃到大約48℃，從大約40℃到大約47℃，從大約41℃到大約47℃，從大約41℃到大約46℃，而更優(yōu)選是從大約42℃到大約46℃。另外，注意到特別優(yōu)選的熱休克溫度是43℃、44℃、45℃和46℃。
不受下文所束縛，本文推論在拯救中使用作為熱休克溫度的提高溫度觸發(fā)了細胞反應(yīng)和與熱休克蛋白(稱為hsp)有關(guān)的合成。認識到，熱休克誘導(dǎo)細胞應(yīng)激反應(yīng)和稱為熱休克蛋白(hsp)的一組多功能蛋白的合成(Craig,1985；Grunther和Walter,1994；Lindquist,1986)。許多(但不是全部)hsp是由可高度誘導(dǎo)基因編碼的，而這些蛋白以提高的水平合成，來幫助細胞從應(yīng)激中恢復(fù)。在細胞中還存在基線水平的可誘導(dǎo)hsp，表明這些蛋白在正常細胞功能中起各種作用。一些hsp也被稱為侶伴蛋白，因為它們在幫助蛋白正確折疊中起重要作用(Gething,1996；Martin和Hartl,1997)。其它hsp的功能包括在胞內(nèi)蛋白運輸、酶調(diào)節(jié)和蛋白功能、參與DNA復(fù)制和病毒復(fù)制和病理中的作用(Franke,Yaun，和Luban,1994；Friedman等，1984；Gething,1996；Glick,1995；Hu,Toft和Seeger,1997；Lund,1995；Martin和Hartl,1997；Pratt,1992；Santoro,1996)。
哺乳動物熱休克蛋白70(hsp70)家族是大小在大約70kD的一組相關(guān)蛋白。hsp70的主要可誘導(dǎo)形式(hsp72)具有表觀分子量72kD。73kDhsp70蛋白(hsp73)在細胞中連續(xù)表達，并被稱為熱休克關(guān)聯(lián)蛋白(hsc73,(Gunther和Walter,1994))。這些蛋白參與上述的某些功能，并被當(dāng)成增強對熱休克反應(yīng)中增加天然(非拯救)CDV基因表達的宿主細胞因子之一。Hsp72同種型與含有增強病毒轉(zhuǎn)錄活性的CDV核衣殼組分共純化(Oglesbee等，1996)。
鑒于我們上文所述范例的結(jié)果，可推斷熱休克溫度對CDV基因表達的作用和對其它可根據(jù)本文方法拯救的病毒的基因表達的作用，是由于(至少部分由于)Hsp70的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明的其它實施例涉及使用能影響hsp，特別是Hsp70(如Hsp72)的效果的有效熱休克溫度。
在進行為確定所選熱休克溫度的試驗時，還可選擇進行熱休克程序的所需時間。提供有效熱休克溫度的充足時間，是使所需重組病毒的回收增加，高于在進行拯救時不使溫度超過進行拯救所建議的標(biāo)準溫度重組病毒回收水平的時間。時間的合適長度可根據(jù)拯救系統(tǒng)而變化。這些時間的變化還可能隨所選病毒基因組或宿主類型的不同而定。雖然時間可變，但用于有效熱休克溫度的時間量可通過用具體重組病毒進行幾次試驗拯救程序，并隨溫度和時間的變化而確定所需重組病毒的回收率或百分比來確定。當(dāng)然，進行拯救所用時間的上限是在該時間內(nèi)，轉(zhuǎn)染成分受到破壞，或其在轉(zhuǎn)染中起作用的能力喪失或減弱的時間。熱休克程序的時間量變化可從數(shù)分鐘到數(shù)小時，只要能獲得重組病毒回收所需要的增加。
雖然轉(zhuǎn)染細胞暴露在有效熱休克溫度下的時間可隨各拯救系統(tǒng)而變化，下面顯示了一張暴露時間范圍(分鐘)的示范表從大約5到大約300，從大約15到大約300，從15到大約240，從大約20到大約200，從大約20到大約150，而最優(yōu)選范圍是從大約30到大約150。
可使用許多方法來測定所需重組病毒回收的改進水平。如本文實施例中注意到的，可用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報道子基因來監(jiān)測重組病毒的拯救。該報道子基因的相應(yīng)活力確定了重組病毒表達的基線和提高水平。其它方法包括檢測獲得的重組病毒噬斑數(shù)，并通過測序證實拯救病毒的產(chǎn)生。提高的回收率應(yīng)當(dāng)顯示至少約25％或至少約40％的增加。優(yōu)選的，回收的重組病毒增加大約2倍。已觀察到重組病毒量大約5到10倍的增加。
測定所需重組病毒回收水平提高的一種建議的方法，涉及制備許多確定轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物，并使其暴露在不同熱休克條件(時間和溫度可變)下，然后與對照的經(jīng)轉(zhuǎn)染并維持在37℃恒溫下的細胞比較。轉(zhuǎn)染72小時后，將轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移到含有大約75％匯合的Vero細胞(或測定重組病毒噬斑形成所選的細胞類型)單層的10厘米板中，繼續(xù)培養(yǎng)直到可見噬斑。然后，對噬斑進行計數(shù)，并與對照細胞獲得的值比較。最佳熱休克條件應(yīng)有最多噬斑數(shù)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，使轉(zhuǎn)染的拯救組合物，如存在于宿主細胞中的，進行噬斑擴展步驟或擴增步驟。本發(fā)明的這個方面提供了產(chǎn)生重組單鏈負義病毒目病毒的改良拯救方法，該方法包括(a)在宿主細胞中，進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物包含在足夠使載體共表達和重組病毒產(chǎn)生的條件下，(ⅰ)含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子的一個轉(zhuǎn)錄載體，和(ⅱ)至少一個表達載體，它含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一個分離的核酸分子；(b)將轉(zhuǎn)染的拯救組合物轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴展細胞(PE細胞)上；和(c)可任選的，收獲重組病毒。通常，在進行轉(zhuǎn)染中使用的宿主細胞是不利于所需重組病毒生長的?？赏ㄟ^選擇噬斑擴展細胞(其中天然病毒或重組病毒顯示提高的增長)來提高重組病毒從轉(zhuǎn)染細胞的回收?？稍谑砂邤U展步驟中使用任何本領(lǐng)域已知的各種板或容器。優(yōu)選的，將含有拯救組合物的轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移到PE細胞單層上。具體的，PE細胞單層必須是至少匯合了50％的。另外，PE細胞是至少大約60％匯合或甚至至少75％匯合的。為了實現(xiàn)噬斑擴展，將轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移到PE細胞容器中，其中PE細胞表面積比用來制備轉(zhuǎn)染病毒的表面積大?？砂葱枋褂?∶1到100∶1的擴大表面積比。優(yōu)選是至少10∶1的擴大表面積。根據(jù)這些細胞中天然或重組病毒的成功生長選出噬斑擴展細胞。Vero細胞在本文討論的示范性實驗中性能良好，因此它們和PE細胞一樣是優(yōu)選的。
另外，在Vero細胞進行噬斑擴展或熱休克程序之前，或同時替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基來實現(xiàn)拯救方法的改進。在噬斑擴展或熱休克溫度之前的不同時間可進行培養(yǎng)基替換；然而，可在培育轉(zhuǎn)染細胞大約4到20小時后替換培養(yǎng)基，作為起始點，然后按照拯救方法的測試運行所需，進行調(diào)節(jié)。
無節(jié)段、單鏈RNA病毒雖然本發(fā)明的重要方面之一是這些改進方法在無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒挽救中的應(yīng)用，本發(fā)明的方法也可用于提高許多類RNA病毒，包括節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒的拯救。根據(jù)國際病毒分類學(xué)委員會1993年的修訂重分類，病毒的下列組屬于正粘病毒科、布尼亞病毒科和沙粒病毒科的三個病毒科。
正粘病毒科Family Orthomyxoviridae流感病毒A,B屬Genus Influenza A,B脊椎動物，流感A病毒influenza A virus流感病毒C屬Genus Influenzavirus C脊椎動物，流感C病毒influenza C virus“未命名，索戈托樣病毒”屬Genus"unnamed,Thogoto-like viruses"脊椎動物索戈托病毒Thogoto virus布尼亞病毒科Family Bunyaviridae布尼亞病毒屬Genus Bunyavirus脊椎動物布尼奧羅病毒Bunyamwera virus內(nèi)羅病毒屬Genus Nairovirus脊椎動物內(nèi)羅畢綿羊病Nairobi sheep disease白蛉病毒屬Genus Phlebovirus脊椎動物白蛉熱西西里病毒sandfly fever Sicilian virus漢坦病毒屬Genus Hantavirus脊椎動物漢坦病毒Hantaan virusTospovirus屬Genus Tospovirus植物番茄斑萎病毒tomato spotted wilt virus沙粒病毒科Family Arenaviridae沙粒病毒屬Genus Arenavirus脊椎動物淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒lymphocytic choriomeningitis virus細病毒屬Genus Tenuivirus植物水稻條葉枯病毒rice stripe virus在這些節(jié)段病毒科中，對人有潛在健康威脅是特別令人感興趣的。反向遺傳學(xué)(或拯救)提供了通過裝配病毒子RNA和活化的基因組轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物來引發(fā)復(fù)制，從而產(chǎn)生重組流感A的途徑(Enami和Palase)。該方法涉及cDNA拷貝的體外轉(zhuǎn)錄，將所需天然或突變的病毒基因節(jié)段建立在vRNA拷貝中，并回收該病毒。使vRNA與RNP蛋白(從純化的病毒顆粒獲得)混合，然后和輔助病毒(如對應(yīng)于所需重組病毒的野生型病毒)一起轉(zhuǎn)染入細胞。例如，在制備重組流感A時，使用流感A病毒來提供復(fù)制轉(zhuǎn)染的RNA基因所需的蛋白。形成了重組病毒和輔助病毒的混合物。由于大量過量存在輔助病毒，使用強選擇系統(tǒng)，如抗體選擇系統(tǒng)，來選擇性分離子代(Enami和Palase,1991)。可用本發(fā)明的熱休克程序來提高所得混合物的體積，以及通過在與輔助病毒一起共轉(zhuǎn)染時加入合適的RNA、RNP拯救組合物，和活性轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物等其它組分增加了獲得的重組病毒量。
具體的，還可用本發(fā)明的熱休克程序來提高用于在COS-1細胞中包裝合成的流感樣CAT:RNA小基因組，通過表達10個流感A病毒一編碼蛋白的cDNA克隆的痘病毒-T7聚合酶來產(chǎn)生病毒樣顆粒的程序的效率(Mena等，1996)。在另一個實施例中，可用本發(fā)明的熱休克程序來提高輔助獨立系統(tǒng)拯救布尼奧羅布尼亞病毒的節(jié)段、負鏈RNA基因組(Bridgen和Eliott,1996)的效率。該系統(tǒng)類似于無節(jié)段、負義RNA病毒拯救實驗(而不是節(jié)段流感病毒拯救所述的那樣)所用的系統(tǒng)。構(gòu)建了含有三個布尼奧羅布尼亞病毒RNA基因組節(jié)段的全長cDNA拷貝的質(zhì)粒，側(cè)接T7啟動子和核酶序列，來產(chǎn)生具有精確基因組末端的RNA的基因組拷貝。當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了表達T7聚合酶和重組布尼奧羅布尼亞病毒蛋白的細胞時，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并衣殼包裝了全長反基因組RNA，然后這些又被復(fù)制，并包裝入感染性布尼亞病毒顆粒中。
本文描述的對熱休克提高了重組MV的拯救，并提高MV小復(fù)制子的CAT報道基因表達的觀察，聯(lián)合hsp72刺激了CDV L聚合酶活性(Oglesbee等，1996)的結(jié)果，產(chǎn)生了一種觀點hsp72的誘導(dǎo)可能是導(dǎo)致本文所述的熱休克作用的實質(zhì)原因。通過在CAT小復(fù)制子實驗中，從表達載體表達hsp72基因之一檢測了該可能性。用蛋白質(zhì)印跡分析(實施例6)肯定了hsp蛋白的表位一尾形式的表達。hsp表達載體的存在增加了轉(zhuǎn)染細胞的CAT水平20倍(實施例6)。這些結(jié)果提示，hsp72的高水平表達可提高病毒拯救效率。另外，這些結(jié)果暗示表達高水平hsp72的穩(wěn)定細胞系可能是有利于拯救的。理想的，穩(wěn)定細胞系將從可誘導(dǎo)啟動子表達hsp72，從而可調(diào)節(jié)hsp72基因的表達量。這可允許選擇誘導(dǎo)時間期和誘導(dǎo)水平(它能使拯救最大化，還避免了對連續(xù)高水平表達hsp基因的細胞系的可能毒性作用)。
本發(fā)明方法制備的重組病毒可用于診斷和治療用途。優(yōu)選的，用本發(fā)明的方法制備的重組病毒單獨或與藥物、抗原、免疫制劑或佐劑聯(lián)用，在預(yù)防或改善病毒疾病中作為疫苗。這些活性制劑能通過常規(guī)方法，即，用稀釋劑或藥物學(xué)上可接受的載體配制和傳遞。
提供下列實施例用來說明，而不是用來限制上文所述的本發(fā)明。
用磷酸鈣沉淀法(Ausbel等，1987；Graham和van der Eb,1973)進行轉(zhuǎn)染。將用于轉(zhuǎn)染的293-3-46或293細胞接種在6孔板上，生長到約50-75％匯合。轉(zhuǎn)染1-3小時前，用無G418的4.5ml新鮮培養(yǎng)液喂養(yǎng)細胞。將合適DNA組合在最終體積為225微升的水中，然后加入25微升的2.5M CaCl2來制備轉(zhuǎn)染混合物。溫和旋轉(zhuǎn)DNA-鈣混合物，同時緩慢加入250微升2X HEPES緩沖鹽水(280mM NaCl,1.5mM NaH2PO4,50mM HEPES,pH7.05)。將沉淀在室溫下放置20分鐘，然后加到細胞中。培養(yǎng)細胞過夜(14-16小時)，然后除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，淋洗細胞，用無G418的新鮮培養(yǎng)液喂養(yǎng)細胞。除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液后，以每細胞5噬斑形成單位(5pfu)進行轉(zhuǎn)染細胞的感染。在替換培養(yǎng)液之前，培育感染物2小時。此時，將含有待熱休克細胞的培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)ぐ?，轉(zhuǎn)移到44℃水浴中，培育3小時，然后轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染開始48小時后，收集細胞，分析瞬時基因表達或在72小時后(或其它本文描述的時間)收集，以進行拯救實驗。如前述進行氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)試驗(Sidhu等，1995，和Parks和Shenk,1996)。
反復(fù)吹吸單層上方的培養(yǎng)液，使細胞脫落并將單層打碎成小團，從諸孔中取出用于病毒拯救的收集的細胞。不采用細胞解離劑。立即將細胞和5ml培養(yǎng)液分散到在10厘米培養(yǎng)皿中的10毫升培養(yǎng)液中長成幾乎匯合的Vero細胞單層上。4到5天后，可見噬斑，染色單層，用于噬斑計數(shù)或收集單層來制備重組病毒原種。
如上關(guān)于DNA所述，用下列修改進行RNA轉(zhuǎn)染。在體外，用Megascript試劑盒(Ambion)的T7 RNA聚合酶試劑制備了用于轉(zhuǎn)染的RNA。將RNA-磷酸鈣沉淀物與293細胞一起培育5-6小時，然后除去。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液中加入病毒，同時進行轉(zhuǎn)染和感染。替換轉(zhuǎn)染一感染培養(yǎng)液后，在43-44℃熱休克合適的細胞樣品。轉(zhuǎn)染/感染起始24-28小時后收集細胞。
重組DNAMartin Billeter和Frank Radecke慷慨提供了全長MV cDNA質(zhì)粒(p(+)MV)和MV L基因表達質(zhì)粒(pEMC-La)(Radecke等，1995)。已描述了CAT小復(fù)制子的制備(Sidhu等，1995)。擴增從熱休克293-3-46細胞抽提的RNA的cDNA(Hunt和Morimoto,1985)克隆了hsp70表達質(zhì)粒。用Titan試劑盒試劑(BoehringerMannheim)中含有的Moloney小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶高保真酶混合物進行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT/PCR)反應(yīng)。將hsp70 cDNA克隆入表達質(zhì)粒pCGN(Tanaka和Herr,1990)中，產(chǎn)生在氨基末端編碼區(qū)中含有流感HA表位-尾的表達構(gòu)建物。
DNA測序通過RT/PCR擴增的DNA測序確定了MV序列。用異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Chomczynski和Sacchi.,1987)制備了MV感染細胞的RNA，而用Titan試劑盒(Boehringer Mannheim)中的試劑進行RT/PCR。在低熔點瓊脂糖凝膠中凝膠純化擴增的DNA。用染料終止劑反應(yīng)(Applied Biosystems)對PCR片段進行測序，并在ABI PrismTM自動測序儀(Perkin-Elmer)上分析。還用自動測序儀進行了質(zhì)粒DNA的序列確認。
實施例1cDNA拯救方案該方案總結(jié)于圖1。
開始轉(zhuǎn)染前一天，將293-3-46細胞用補充了10％胎牛血清(FBS)和1.5mg/mlG418抗生素的DMEM分置到6孔培養(yǎng)板上。如果希望次日使用，將一塊匯合細胞的10厘米板分割成6孔培養(yǎng)板。每次拯救實驗轉(zhuǎn)染12孔，來提高回收重組病毒的可能性。
轉(zhuǎn)染前大約1到3小時，用補充了10％FBS(無G418)的4.5ml DMEM替換培養(yǎng)液，然后開始轉(zhuǎn)染。
磷酸鈣沉淀在無菌的5毫升聚丙烯試管中聯(lián)合加入體積為225微升的水和DNA。每次轉(zhuǎn)染用5微克p(+)MV和100ng的L表達質(zhì)粒(pEMC-La)。加入25微升2.5M的CaCl2并混合。滴加250微升的2X HBS，同時溫和旋轉(zhuǎn)試管。加入HBS后，將試管置于室溫下15-20分鐘(HBS是2X HEPES緩沖鹽水280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4,50mMHEPES,pH 7.05(Ausubel等，1987))。各孔分別建立轉(zhuǎn)染比制備一個大量轉(zhuǎn)染混合物要有利。將沉淀滴加到培養(yǎng)液中，培育細胞過夜，大約12-16小時。
然后除去培養(yǎng)液并洗滌細胞。用HEPES/鹽水溶液(150mM NaCl,50mMHEPES,1mM MgCl2,pH7.2)淋洗細胞2次。在培育細胞前，加入5毫升培養(yǎng)液(DMEM，10％FBS，無G418)。
熱休克加入上述新鮮培養(yǎng)液后，用石蠟?zāi)っ芊?孔板，轉(zhuǎn)移到有蓋的Tupperware容器中。將該容器浸在43-44℃水浴中，培育3小時。在該熱休克步驟后，除去板上的石蠟?zāi)?，將細胞轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中。在轉(zhuǎn)染開始后，總共培育細胞大約72小時。
培育完成后，用Vero細胞進行噬斑擴展步驟。在使用前一天，將一塊10厘米培養(yǎng)板分割成4或5塊10厘米培養(yǎng)板，制備了Vero細胞。過夜培育后，細胞大約75％匯合。制備了足夠板，從而每轉(zhuǎn)染孔有一塊Vero細胞板。轉(zhuǎn)染開始約72小時后，將各孔轉(zhuǎn)染的293-3-46細胞轉(zhuǎn)移到含有Vero細胞的10厘米板上。用在單層上方反復(fù)吹吸5毫升培養(yǎng)液，使細胞從孔中脫離下來，并將單層打碎成小團，來轉(zhuǎn)移293-3-46細胞。吹吸要溫和，以避免細胞裂解，但要足夠有力，使細胞分離。然后將5毫升含有轉(zhuǎn)染細胞塊的培養(yǎng)液分散到已含有10毫升培養(yǎng)液的Vero細胞10厘米板上。根據(jù)拯救系統(tǒng)，應(yīng)有足夠時間，大約4-5天，來使噬斑可見。刮下細胞收獲重組病毒，并通過離心收集。將細胞重懸浮在1毫升無血清的DMEM(Gibco/BRL)中，凍融一次，來釋放病毒。
實施例2在該實施例中，實施例1中描述的拯救方法重復(fù)了6次，還用了未用熱休克的對照。圖5顯示了6次獨立拯救實驗的結(jié)果。所有實驗中使用的MV cDNA含有Edmonston B序列(Radecke等，1995)。如上所述進行轉(zhuǎn)染，而熱休克培育是44℃3小時。實施例1評估了陽性或陰性噬斑，而在其余實驗中對噬斑進行了計數(shù)。該實施例中進行的實驗揭示了下列結(jié)果常規(guī)拯救技術(shù)的兩種改進(Radecke等，1995)，熱休克步驟和噬斑擴展步驟，在極大提高轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物產(chǎn)生重組病毒數(shù)目中都是有效的。在使用這些修飾方法前，僅大約2-3％轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生重組病毒。在上文程序中，50％-約90％的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物產(chǎn)生重組病毒。
實施例3噬斑擴展改良方法實施例1拯救方案中的噬斑擴展步驟是從下列不用熱休克處理類型的實驗中建立的。
進行了不用實施例2噬斑擴展步驟的實驗，而根據(jù)Radecke等(1995)略述的程序。在這些實驗中，將6孔培養(yǎng)皿孔中轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到10厘米培養(yǎng)板上，使細胞再生長4-5天，并增加時間使噬斑發(fā)展。用該程序未檢測到噬斑。在第二類實驗中，刮下收集轉(zhuǎn)染細胞，離心，并在無血清OPTIMEM(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)培養(yǎng)液中重懸浮。使細胞經(jīng)歷一輪凍融而釋放病毒，并將細胞裂解物加到含有大約75％匯合的Vero細胞的10厘米培養(yǎng)皿上。4到5天后，檢測Vero細胞的噬斑。約2％-3％的培養(yǎng)物為麻疹病毒噬斑陽性。按照實施例2中簡述的噬斑擴展方案，實現(xiàn)了超過剛才所述的2％成功率的10-20倍的提高?？磥碓谑砂邤U展步驟前不進行凍融循環(huán)很重要，如實施例2中所述。
實施例4熱休克提高小復(fù)制子的表達為了檢驗熱休克后提高拯救效果的可能機制，測試了熱休克對MV小復(fù)制子基因表達的影響(見圖2的結(jié)果)。將質(zhì)粒小復(fù)制子(pMV107CAT)設(shè)計成能指導(dǎo)CAT基因(側(cè)接MV末端)的負義RNA拷貝的T7 RNA聚合酶-介導(dǎo)的合成(Sidhu等，1995)。用該質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染293-3-46細胞以胞內(nèi)合成小復(fù)制子RNA。通過補充感染所提供的MV蛋白，或通過補充L表達質(zhì)粒(因為細胞提供N和P蛋白)進行了293-3-46細胞中小復(fù)制子RNA的復(fù)制和表達。用MV-CAT小復(fù)制子質(zhì)粒DNA(1微克)轉(zhuǎn)染293-3-46細胞過夜。一些轉(zhuǎn)染物(泳道3和7)也接受MV L基因表達質(zhì)粒(100ng)來提供L補給。轉(zhuǎn)染大約14小時后，替換培養(yǎng)液，并用MV以每細胞5pfu(噬斑形成單位)感染細胞2小時(泳道4和8)。感染后，替換培養(yǎng)液并在44℃熱休克合適的細胞培養(yǎng)物(泳道5-8)3小時。轉(zhuǎn)染開始48小時后收集細胞，并如上文方法所述進行CAT試驗。
當(dāng)測定熱休克對小復(fù)制子表達的影響時，使用熱休克的拯救方案產(chǎn)生了CAT基因活性的強烈增加(圖2)。用小復(fù)制子DNA進行圖2所示實驗，并進行類似拯救實驗，除了在轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞外。在除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液后，用每細胞5pfu感染轉(zhuǎn)染的細胞進行病毒補給。簡單的通過用小復(fù)制子DNA共轉(zhuǎn)染進行了L表達質(zhì)粒的補給。結(jié)果表明，當(dāng)使用兩種補給形式的任何一種時，熱休克都刺激了表達。在多個實驗中，補給L表達質(zhì)粒誘導(dǎo)的CAT表達被熱休克提高了2-10倍(比較泳道3和7)。類似的，當(dāng)用病毒補給時，CAT活性也提高了，并導(dǎo)致5倍的提高(泳道4和8)。如預(yù)計的那樣，未接受CAT質(zhì)粒(泳道1和5)或L補給(泳道2和6)的陰性對照轉(zhuǎn)染產(chǎn)生非常低水平的背景CAT活性。
實施例5熱休克后小復(fù)制子的表達提高可能與T7聚合酶活性的較高水平相關(guān)。較高的T7聚合酶活性可能是由于293-3-46細胞在熱休克后基因表達的提高引起的。已顯示293-3-46細胞中CMV立即早期啟動子/增強子表達T7聚合酶基因(Radecke等，1995)，和CMV啟動子/增強子對熱休克蛋白反應(yīng)(Andrews,Newbound，和Lairmore,1997)。為了排除這種可能性，用小復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染細胞，并進行實施例4中所用的熱休克處理。除此之外，在本實施例中，為了排除熱休克作用涉及到293-3-46細胞系中存在的MV基因表達提高有關(guān)的可能性，在293細胞中進行了RNA轉(zhuǎn)染(Graham等，1977)。293-3-46細胞不穩(wěn)定表達任何MV基因。修改該實驗中使用的轉(zhuǎn)染方案，來配合RNA轉(zhuǎn)染(見上文方法部分)。用磷酸鈣程序轉(zhuǎn)染了5微克RNA。在轉(zhuǎn)染混合物加到培養(yǎng)液后立即加入病毒，進行了合適細胞的MV感染。將沉淀加到細胞后，將MV(每細胞5pfu，圖3的泳道3和6)加到培養(yǎng)液中，立即引發(fā)感染，以在RNA可能被包裝入核衣殼前減少其胞內(nèi)降解的機會。在5-6小時轉(zhuǎn)染-感染培育后，替換培養(yǎng)液，44℃熱休克合適的細胞樣品2小時，然后回到37℃。開始轉(zhuǎn)染-感染24-48小時后，制備細胞抽提物，用于CAT試驗。
RNA轉(zhuǎn)染的結(jié)果與DNA轉(zhuǎn)染的結(jié)果相似。熱休克大大提高了CAT在轉(zhuǎn)染細胞中的表達(圖3，比較泳道3和6)。在未接受小復(fù)制子RNA(泳道1和4)或無病毒補給(泳道2和5)的細胞中觀察不到CAT活性。RNA轉(zhuǎn)染的結(jié)果還排除了圖2所示的DNA轉(zhuǎn)染實驗中，提高的T7 RNA聚合酶活性引起熱休克作用的可能性。
實施例6Hsp70刺激小復(fù)制子表達Oglesbee等已確定了可誘導(dǎo)hsp70同種型，hsp72，與CDV核衣殼一起共純化，而且這些核衣殼顯示體外轉(zhuǎn)錄活性的提高(Oglesbee,Ringler，和Krakowka,1990；Oglesbee等，1996)。為了評估hsp72是否與上文實施例中觀察到的熱休克作用有關(guān)，進行了基本取代實施例1的熱休克處理的hsp70的過度表達實驗(圖4中顯示了結(jié)果)。從實施例2熱休克細胞制備的RNA，克隆了可誘導(dǎo)的hsp70 cDNA(Hunt和Morimoto,1985,Wu等，1985)。將cDNA和flu表位尾一起克隆入CMV表達載體，質(zhì)粒pCGN(Tanaka,1990)，將hsp70基因的氨基末端編碼區(qū)與具有序列Y P Y D V P D Y A的流感HA表位尾融合(Tanaka和375-386,1990)?？寺×薶sp70 cDNA來表達具有HA表位的氨基末端的hsp70蛋白。該質(zhì)粒的使用使得我們能在即使存在內(nèi)源性hsp70同種型背景的情況下，用抗流感尾的抗體跟蹤hsp70cDNA的表達。用蛋白質(zhì)印跡，使用表位尾特異性的抗體分析了轉(zhuǎn)染細胞制備的全細胞抽提物(Parks和Shenk,1996)(圖4A)。轉(zhuǎn)染細胞抽提物的蛋白印跡分析顯示，表達質(zhì)粒產(chǎn)生了一個比70kD稍大的帶尾多肽。
用hsp70表達載體和L表達質(zhì)粒，以及小復(fù)制子DNA共轉(zhuǎn)染293-3-46細胞導(dǎo)致CAT表達的提高(見圖4B)。在該瞬時試驗系統(tǒng)中，hsp70的過度表達提高了L補給的低水平多達20倍。hsp70表達載體誘導(dǎo)的CAT表達的增加是明顯特異性的，因為它需要L聚合酶質(zhì)粒的存在，而且當(dāng)L不存在，或從轉(zhuǎn)染物中刪去CAT質(zhì)粒時，不提高觀察到的背景CAT活力。這些結(jié)果強烈提示，hsp70至少部分引起熱休克對小基因組表達的作用。
實施例7在Vero細胞中熱休克拯救小復(fù)制子表達如實施例4的后續(xù)試驗，用Vero細胞替換了293-3-46細胞。
材料對于Vero細胞轉(zhuǎn)染實驗，由質(zhì)粒DNA提供麻疹蛋白N、P和L，而由MVA/T7(Wyatt等)感染提供T7 RNA聚合酶。轉(zhuǎn)染物包括100ng小復(fù)制子、400ng N質(zhì)粒，300ng P質(zhì)粒和下文表2所示的L質(zhì)粒量。陰性對照轉(zhuǎn)染物缺少L質(zhì)粒的支持。另外，用LIPOFECTACE(購自Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)作為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Vero細胞。對于各試驗，每次轉(zhuǎn)染反應(yīng)使用2噬斑形成單位(PFU)的MVA/T7(Wyatt等)。測試了兩體積LIPOFECTACE，來確定Vero細胞有效轉(zhuǎn)染的最適量。用兩種不同量的L蛋白表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。對于熱休克，將細胞轉(zhuǎn)移到44℃水浴中3小時。對照細胞不經(jīng)熱休克。
MVA/T7:MVA/T7是含有一個在11K強晚期啟動子(Wyatt等，1995)調(diào)控下的T7基因-1的整合拷貝的雜交病毒。
表達質(zhì)粒Radecke和Billeter提供了L質(zhì)粒?；旧?，將麻疹L基因通過Radecke等(1995)公開的克隆方法克隆入pEMC質(zhì)粒載體(Moss等，1990)，產(chǎn)生質(zhì)粒pEMC-La。該載體包括內(nèi)部核糖體進入位點和3’末端聚腺苷酸序列，來促使克隆基因在真核細胞中表達。用同樣的載體來制備N和P基因的各個載體。用PCR從麻疹病毒基因組cDNA(Radecke等，1995)中擴增N和P蛋白編碼區(qū)，然后克隆入載體pEMC的NcoⅠ和BamHⅠ位點之間，產(chǎn)生pT7-N和pT7-P。
Vero細胞熱休克方案對于LIPOFECTACE和EFFECTENELIPOFECTACEVero細胞在6孔培養(yǎng)皿中生長，直到它們約50-80％匯合。理想的是細胞大約75％匯合，因為在該階段，它們?nèi)匝杆俜至?，而且是健康的，而較高細胞密度有助于補償因轉(zhuǎn)染、MVA/T7感染和熱休克而致的細胞死亡。通過在微量離心管中混合DNA(N、P、L和MV小復(fù)制子)和200微升無血清DMEM制備用于轉(zhuǎn)染的DNA-脂混合物。在DNA-培養(yǎng)液混合物中加入LIPOFECTACE(12或15微升，由實驗而定)，溫和混合，然后室溫培育20分鐘。在培育末，將DNA-LIPOFECTACE混合物與800微升含有適量MVA/T7的無血清DMEM混合，得到大約每細胞2PFU的最終量。從Vero細胞培養(yǎng)物除去培養(yǎng)液，并用含DNA、LIPOFECTACE和MVA/T7的轉(zhuǎn)染混合物替換。在37℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱中培育細胞5-6小時。對于Vero細胞，該培育似乎最適是2-3小時。在培育期末，在細胞中加入1毫升補充了10％胎牛血清的DMEM,44℃熱休克合適的細胞培養(yǎng)物2-3小時(3小時對Vero細胞是最適的)。為了進行熱休克，將6孔板轉(zhuǎn)移到Ziplock塑料袋中，然后浸入44℃水浴中。在2-3小時熱休克期介素時，從塑料袋中取出細胞，放回37℃培養(yǎng)箱中，過夜培育。翌日，用2毫升含有10％胎牛血清的新鮮DMEM替換培養(yǎng)液。大約轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞制備用于CAT試驗的抽提物，或收集細胞，并將其轉(zhuǎn)移到含Vero細胞單層的10厘米培養(yǎng)皿中，使噬斑擴展。
然后分析了細胞的CAT活性。當(dāng)在12微升LIPOFECTACE和100ng L質(zhì)粒條件下使用時，熱休克刺激了大約7倍的CAT活性。當(dāng)在15微升LIPOFECTACE和100ng L質(zhì)粒條件下使用時，熱休克刺激大約2倍的CAT活性。見下列表2。
表2
實施例8在Vero細胞中比較熱休克拯救的轉(zhuǎn)染促進劑用LIPOFECTACE或EFFECTENE(Qiagen Inc.,Valencia,CA)重復(fù)上述實驗。
對于EFFECTENE，方案基本相同，除了DNA-脂混合物的制備。用EFFECTENE試劑提供的100微升緩沖鹽水混合DNA。然后加入8微升EFFECTENE凝聚劑，將混合物室溫培育5分鐘。加入另25微升(或圖中特別指出的量)的EFFECTENE，將混合物再培育15分鐘。15分鐘培育后，將DNA-EFFECTENE復(fù)合物與900微升含足夠MVA/T7的無血清培養(yǎng)液混合以提供每細胞大約2PFU。在該階段，向細胞施加DNA-MVA/T7混合物和所有的后續(xù)步驟與LIPOFECTACE的步驟相同。
表3a和3b中顯示了結(jié)果(Lipo=LIPOFECTACE)。當(dāng)轉(zhuǎn)染2小時后進行熱休克時，提高了小復(fù)制子的活性。
表3a
表3b
實施例9用改良緩沖技術(shù)轉(zhuǎn)染Vero細胞材料BES是{N,N-雙[2-羥乙基]-2-氨基乙磺酸}用BES/磷酸鈣程序轉(zhuǎn)染Vero細胞用于拯救在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)Vero細胞，直到它們大約50-80％匯合。細胞大約75％匯合，因為在該階段，它們?nèi)匝杆俜至眩沂墙】档?，而較高細胞密度有助于補償因轉(zhuǎn)染、MVA/T7感染和熱休克所致的細胞死亡。轉(zhuǎn)染日，每孔用4.5ml新鮮培養(yǎng)液喂養(yǎng)細胞，并轉(zhuǎn)移到37℃(或如果拯救溫度敏感病毒，用更低的溫度)和3％CO2的培養(yǎng)箱中。我們常規(guī)使用的培養(yǎng)液是補充了10％胎牛血清的DMEM(其它的也行)。喂養(yǎng)細胞約2到4小時后，開始轉(zhuǎn)染。在5毫升聚丙烯試管中制備用于轉(zhuǎn)染的DNA-磷酸鈣沉淀。將用于拯救的DNA(包括N、P和L以及MV小復(fù)制子的表達質(zhì)粒)與水混合至最終體積225微升。然后加入25微升2.5M的CaCl2，溫和混合試管。在制備了所有DNA-CaCl2混合物后，加入250微升2X BES-緩沖鹽水(2XBBS:280mM NaCl,1.5mMNa2HPO4,50mM BES,pH6.95-6.98)來制備沉淀。在各試管中滴加2XBBS，同時溫和的不停旋轉(zhuǎn)。加入2XBBS后，室溫下培育試管20分鐘。室溫培育終止時，在細胞中滴加500微升沉淀物，并溫和搖動培養(yǎng)板，以確保沉淀物和培養(yǎng)液混合。在加入沉淀物后，直接在培養(yǎng)液中加入大約2噬斑形成單位(pfu)的MVA/T7或MVA/T7-GK16，溫和搖動培養(yǎng)板以混合。當(dāng)使用GK16時，在該階段加入一種DNA合成抑制劑到培養(yǎng)液中。分別以每毫升20微克或10mM將阿糖胞苷(araC)或羥基脲(HU)加到培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染3小時后，將細胞轉(zhuǎn)移到塑料拉鏈袋中，浸入44℃水浴進行熱休克。44℃培育細胞2-3小時(更長的3小時看來最好)，然后移回3％CO2的培養(yǎng)箱中，培育過夜。翌日，從細胞中除去培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染組分，用hepes緩沖鹽水(20mM Hepes,150mM Nacl,1mMMgCl2)洗滌細胞2次，然后加入新鮮培養(yǎng)液。在被MVA/T7-GK16感染的培養(yǎng)物中補充AraC或HU。在設(shè)定為標(biāo)準的37℃和5％CO2(如果是拯救溫度敏感型病毒，細胞可在加入新鮮培養(yǎng)液后在合適的較低溫度培育2天)的培養(yǎng)箱內(nèi)再培育細胞1天。然后收集轉(zhuǎn)染的細胞，用于病毒拯救的噬斑擴展步驟，或收集細胞用于制備CAT試驗的細胞抽提物。將轉(zhuǎn)染細胞刮到培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移到含有50％匯合的Vero細胞(或選擇的其它允許細胞)單層的10厘米培養(yǎng)皿或T25瓶中。37℃(或上文提到的適合溫度)培育共培養(yǎng)細胞4到6小時，然后替換培養(yǎng)液。當(dāng)轉(zhuǎn)染細胞含有DNA合成抑制劑時，在該階段替換培養(yǎng)液是必需的，以避免噬斑擴展步驟時抑制共培養(yǎng)中的細胞生長。噬斑擴展步驟開始后大約4到5天，可見噬斑，可收集細胞，來產(chǎn)生被拯救病毒的凍融裂解原種。CAT試驗的結(jié)果顯示于下文表4a和4b。BES/磷酸鈣程序增強了活力。
表4a
表4b
對于上文的轉(zhuǎn)染技術(shù)，見Chen等，1987和Tognon等，1996。
實施例10基于使用DNA合成抑制劑和在強早/晚啟動子控制下合成噬菌體T7 RNA聚合酶的重組修飾的痘病毒Ankara(MVA)的改進拯救方法基于前述內(nèi)容，假定通過特異性抑制輔助MVA/T7的病毒DNA復(fù)制，我們能夠1．阻斷所有的MVA/T7生長，2．進一步降低感染細胞中的CPE，和3．增強RNA病毒基因拯救的效率。抑制劑(胞苷β-D-阿拉伯呋喃糖苷，AraC和/或羥基脲)阻斷了病毒的DNA合成和隨后的病毒中期和晚期基因表達。工程改造了含有一個在合成早/晚痘苗病毒強啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7基因-1拷貝的重組MVA/T7(MVGK16)。先前的研究(其中MVGK16被用作麻疹小基因組和全長麻疹cDNA基因拯救的輔助病毒)已表明用AraC或羥基脲處理感染細胞導(dǎo)致異源病毒基因拯救的提高(數(shù)據(jù)未列出)。
質(zhì)粒和病毒。對該研究我們選擇了痘病毒pSC65表達/重組質(zhì)粒。該質(zhì)?？稍诨蚬こ谈脑斓牟《驹?晚啟動子的調(diào)控下表達異源基因；它也提供了在病毒7.5K啟動子調(diào)控下的lacZ選擇標(biāo)記。從pT7-neo(Dr.Sally Lee提供，Wyeth-Lederle Vaccines)切下T7基因-1作為BamHⅠ片段，并將其亞克隆入pSC65(Chakrabarti等，1997)的BgⅢ位點，來產(chǎn)生pGK16.2(圖6)。用染色終止劑循環(huán)測序和377 ABI DNA測序儀(Applied Biosystems)對重組質(zhì)粒進行測序。
用MVA以等于每細胞0.5噬斑形成單位(PFU)的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染雞胚成纖維細胞(CEF；Spafas)，并用pGK16.2使用DOTAP轉(zhuǎn)染促進劑(Boehringer Mannheim)轉(zhuǎn)染。與MVA DNA的同源重組導(dǎo)致病毒tk基因的中斷，并插入T7基因-1和lacZ。用X-gal比色噬斑試驗在CEF細胞上連續(xù)噬斑純化重組病毒(MVGK16)三次。通過在CEF上連續(xù)三輪噬斑純化和四輪擴增，使重組MVGK16穩(wěn)定，如用抗T7聚合酶和痘病毒的兔多克隆抗血清免疫染色證明的那樣(數(shù)據(jù)未列出)。
基因拯救。用含有T7轉(zhuǎn)錄的早/晚啟動子的表達系統(tǒng)MVA/GK16重復(fù)上文的BES/磷酸鈣程序。本文列出了對上文BES/磷酸鈣拯救方案的修改。當(dāng)使用GK16時，在該階段加入DNA合成抑制劑到培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)液中分別以每毫升20微克或10mM加入阿糖胞苷(araC)或羥基脲(HU)。在設(shè)定為3％CO2的培養(yǎng)箱中培育細胞過夜。按照上文BES實施例的方案完成了轉(zhuǎn)染和熱休克。在用MVA/GK16感染的培養(yǎng)物中補充AraC或HU。在設(shè)定為標(biāo)準的37℃和5％CO2(如果是拯救溫度敏感型病毒，可在加入新鮮培養(yǎng)液后將細胞在合適的較低溫度下培養(yǎng)2日)的培養(yǎng)箱中再培育細胞1天。然后收集轉(zhuǎn)染的細胞用于噬斑擴展步驟。將轉(zhuǎn)染細胞刮到培養(yǎng)液中，或轉(zhuǎn)移到含有50％匯合的Vero細胞(或選擇的其它允許細胞)單層的10厘米培養(yǎng)板或T25瓶中。37℃(或合適的溫度下)培育共培養(yǎng)細胞4到6小時，然后替換培養(yǎng)液。當(dāng)轉(zhuǎn)染細胞含有DNA合成抑制劑時，在該階段替換培養(yǎng)液特別重要。噬斑擴展步驟中，不需要抑制共培養(yǎng)中的細胞生長。噬斑擴展步驟開始大約4到5天后，可見噬斑，可收集細胞，來產(chǎn)生被拯救病毒的凍融裂解原種。
基因拯救實驗。上文方案導(dǎo)致具有拯救陽性指標(biāo)的孔數(shù)的持續(xù)增加。見下文表5。重組病毒在Vero細胞上第一次傳代后，用正(+)或負(-)評估實驗。陽性孔的噬斑數(shù)范圍是1到50。過夜轉(zhuǎn)染和隨后24小時培養(yǎng)中，當(dāng)使用MVA/T7-GK16時，所有實驗在培養(yǎng)液中含有20微克/ml AraC。對于第9日的實驗，用10mM羥基脲替代了araC DNA合成抑制劑。
表5
下文提供了在本文中引入的參考文獻表。
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權(quán)利要求
1．一種產(chǎn)生重組單鏈負義病毒目病毒的方法，其特征在于，該方法包含(a)在至少一個介質(zhì)中的宿主細胞中，進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物中包含在能充分允許載體共表達和產(chǎn)生重組病毒條件下的宿主細胞中；(ⅰ)一個含有分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體，該核酸分子中含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ⅱ)至少一個表達載體，該表達載體含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種以上分離的核酸分子；(b)在能充分增加重組病毒挽救的條件下，加熱轉(zhuǎn)染的拯救組合物至有效熱休克溫度。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括收集所述重組病毒。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效熱休克溫度是37℃以上。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效熱休克溫度范圍從37℃到大約50℃。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效熱休克溫度范圍從38℃到大約49℃。
6．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效熱休克溫度范圍從39℃到大約48℃。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效熱休克溫度范圍從41℃到大約47℃。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在有效熱休克溫度下約5分鐘到約300分鐘。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在有效熱休克溫度下約15分鐘到約240分鐘。
10．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在有效熱休克溫度下約15分鐘到約200分鐘。
11．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)后將轉(zhuǎn)染的拯救組合物轉(zhuǎn)移到至少一層Vero細胞上。
12．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Vero細胞層是單層。
13．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈負義病毒目的RNA病毒是人、?；蛐∈蟛《?。
14．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離的核酸分子是一個以上基因組或反基因組源的嵌合體。
15．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離的核酸分子編碼減毒病毒或所述病毒的感染性形式。
16．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離的核酸分子編碼所述病毒的感染性形式。
17．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離的核酸分子編碼減毒病毒。
18．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子編碼感染性減毒病毒。
19．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是副粘病毒科的病毒。
20．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是彈狀病毒科的病毒。
21．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是纖絲病毒科的病毒。
22．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是選自MV、RSV、PIV和BPV的病毒。
23．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是病毒MV。
24．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸編碼選自RSV病毒的RNA病毒基因組或反基因組，和衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白是N、P、L和M2。
25．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸編碼MV的基因組和反基因組，和衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白是N、P和L。
26．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸編碼PIV-3的基因組和反基因組，和衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白是NP、P和L。
27．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是原核細胞。
28．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是真核細胞。
29．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是脊椎動物細胞。
30．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是大腸桿菌。
31．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞衍生自人細胞。
32．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞衍生自人胚細胞。
33．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞衍生自人胚腎細胞。
34．一種權(quán)利要求1所述的方法制備的重組病毒。
35．一種組合物，其特征在于，該組合物包含(ⅰ)按權(quán)利要求1所述的方法制備的重組病毒，和(ⅱ)藥物學(xué)上可接受的載體。
36．一種產(chǎn)生重組單鏈負義病毒目病毒的方法，其特征在于，該方法包含a)在至少一個宿主細胞中，進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物中包含在能充分允許載體共表達和產(chǎn)生重組病毒條件下的宿主細胞中；(ⅰ)一個含有分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體，該核酸分子中含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ⅱ)至少一個表達載體，該表達載體含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種以上的分離的核酸分子；b)將轉(zhuǎn)染拯救組合物轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴展細胞上。
37．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述噬斑擴展細胞層是單層。
38．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，該方法還包含收集重組病毒。
39．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述噬斑擴展細胞至少約50％匯合。
40．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述噬斑擴展細胞至少約60％匯合。
41．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述噬斑擴展細胞至少約75％匯合。
42．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，將所述轉(zhuǎn)染細胞置于一個或多個噬斑擴展細胞容器中，從而使Vero細胞的表面積比產(chǎn)生轉(zhuǎn)染病毒時所用的表面積大。
43．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，噬斑擴展細胞是Vero細胞。
44．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄載體還包含T7聚合酶基因。
45．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述拯救組合物還包含未修飾或修飾的輔助病毒。
46．如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述輔助病毒提供用于轉(zhuǎn)錄編碼無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列的T7聚合酶基因，而所述拯救組合物還包含修飾的輔助病毒。
47．如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述T7基因在晚期啟動子或早/晚啟動子的調(diào)節(jié)性控制下。
48．如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述T7基因在早/晚啟動子的調(diào)控下。
49．如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染在DNA合成抑制劑的存在下進行。
50．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于轉(zhuǎn)染的宿主細胞是Vero細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生命名為單鏈負義RNA病毒目(Mononegaviral)的無節(jié)段、負義、單鏈RNA病毒的改良方法,包括關(guān)于產(chǎn)生減毒和/或傳染病毒的這些病毒,如麻疹病毒(MV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的方法的實施例。用于產(chǎn)生單鏈負義病毒目的重組病毒的一種方法包含(a)在至少一個宿主細胞中,進行拯救組合物的轉(zhuǎn)染,該組合物中包含在能充分允許載體共表達和產(chǎn)生重組病毒條件下的宿主細胞中;(i)一個含有分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體,該核酸分子中含有編碼單鏈負義病毒目的無節(jié)段、負義單鏈RNA病毒基因組或反基因組的多核苷酸序列,和(ii)至少一個表達載體,該表達載體含有編碼衣殼包裝、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種以上的分離的核酸分子;(b)在能充分增加重組病毒挽救的條件下,加熱轉(zhuǎn)染的拯救組合物至有效熱休克溫度;和可任選的,(c)收集得到的重組病毒。
文檔編號C12N15/09GK1303426SQ99806717
公開日2001年7月11日 申請日期1999年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月3日
發(fā)明者C·L·帕克斯, M·S·西迪, S·A·烏登, G·R·科瓦奇 申請人:美國氰胺公司