專利名稱：用于表達(dá)黑腹果蠅的異染色質(zhì)1(hp1)的重組植物細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能提供具有活力的植物的重組工程的植物細(xì)胞，含有這種植物細(xì)胞的植物和起源于這些植物的種子。
為了提高農(nóng)場(chǎng)效率，以便提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和農(nóng)場(chǎng)的投資回報(bào)，人們一直在提高植物活力方面進(jìn)行努力。這已經(jīng)通過傳統(tǒng)的植物育種技術(shù)進(jìn)行，在該技術(shù)中，植物的兩個(gè)高度近交品系雜交育種，提供顯示具有明顯的雜交品種優(yōu)勢(shì)的F1子代。然而，這種優(yōu)勢(shì)通常只是F1子代的特征，所以如果要維持產(chǎn)量，農(nóng)民必須連續(xù)地從植物供應(yīng)商處購(gòu)買其它F1子代植物新原種。這種隱藏在雜交品種優(yōu)勢(shì)后的原因還不知道。
作為傳統(tǒng)植物育種的替代，基因工程已經(jīng)用于嘗試和提高植物產(chǎn)量，通過在各種農(nóng)作物植物中選擇性地工程化各種基因，以提高所述農(nóng)作物的整體產(chǎn)量。預(yù)計(jì)到2005年，這種基因工程植物的世界市場(chǎng)有望達(dá)到60億美元。但是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)應(yīng)用重組技術(shù)的主要障礙是轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄沉默。沉默的原因還不太清楚，但可能是由于植物染色質(zhì)的高度甲基化和局部濃縮。
高等真核生物的染色體是由常染色質(zhì)和異染色質(zhì)組成的。異染色質(zhì)與常染色質(zhì)的區(qū)別在于異染色質(zhì)在細(xì)胞循環(huán)的中期，復(fù)制后期仍然是濃縮的，富含于重復(fù)序列中，在許多基因中相對(duì)較少。
如果將通常位于常染色質(zhì)中的基因置于異染色質(zhì)附近，作為染色體重排的結(jié)果，該基因?qū)⒔?jīng)過細(xì)胞特異性沉默產(chǎn)生雜色表型。
因此，染色體的結(jié)構(gòu)中至少具有影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一部分。
所以經(jīng)研究，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)染色體的DNA高度甲基化和局部濃縮的部分有可能在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)中起作用。然而，我們的重大發(fā)現(xiàn)是通過試圖鑒定在轉(zhuǎn)基因沉默中發(fā)揮作用的部分的試劑，以能夠代代相傳的方式顯著地提高植物的活力。
我們的研究涉及果蠅多櫛狀體基因產(chǎn)物(Pc)和果蠅異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1(HP1)。這兩種蛋白質(zhì)具有幾乎相同的區(qū)域，稱為染色體組織修飾物的“色區(qū)”。這一區(qū)域在大多數(shù)原核生物中是高度保守的。而HP1是異染色質(zhì)蛋白質(zhì)，Pc是構(gòu)成維持同源異型基因的抑制狀態(tài)的復(fù)合物的一部分。
所以，我們的實(shí)驗(yàn)從在植物細(xì)胞中通過重組構(gòu)建體表達(dá)這些基因開始。該構(gòu)建體將色區(qū)與綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)連接，該蛋白質(zhì)是從生物發(fā)光海蜇Aequorea victoria分離的。GFP與HP1和Pc的色區(qū)是通過激酶識(shí)別序列連接的。


圖1顯示了HP1和Pc的氨基酸同源性，從這樣高度保守的位點(diǎn)可以看到存在相當(dāng)大的同源性。
但我們發(fā)現(xiàn)，盡管在這兩種蛋白質(zhì)之間存在同源性，利用HP1轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞的生長(zhǎng)比利用Pc轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞或沒有轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞好的多。實(shí)際我們發(fā)現(xiàn)利用HP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少顯示產(chǎn)量提高了10％。這種產(chǎn)量的提高與通常在典型的育種技術(shù)中產(chǎn)生的傳統(tǒng)的雜交品種優(yōu)勢(shì)相關(guān)聯(lián)的增產(chǎn)是相同的。
另外，表達(dá)HP1色區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因能夠保護(hù)植物承受環(huán)境壓力。
在120或150毫摩爾NaCl時(shí)，與不表達(dá)HP1色區(qū)的植物相比，表達(dá)HP1色區(qū)的植物的生物量產(chǎn)量提高了1.5～2倍。這表明HP1色區(qū)的存在是能夠使植物細(xì)胞抵抗升高的鹽濃度的影響。
通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)鎘對(duì)秧苗生長(zhǎng)的影響。它的合理性源于許多植物茂盛的環(huán)境不是由于重金屬水平的升高，如銅、鉛和鎘。如果HP1轉(zhuǎn)基因可以保護(hù)植物抵抗重金屬的有害影響，那么，這些環(huán)境對(duì)于那些在土壤中不能茂盛生長(zhǎng)的植物種類就變得易于生長(zhǎng)。
通過對(duì)CdSO4的影響進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)以確立是否在秧苗中HP1色區(qū)的表達(dá)具有保護(hù)特性。與不表達(dá)HP1轉(zhuǎn)基因的對(duì)照秧苗進(jìn)行比較，在培養(yǎng)基中含有50微摩爾CdSO4，可使生物量產(chǎn)量提高1.7～4.0倍。
這表明HP1轉(zhuǎn)基因具有保護(hù)特性并能夠使秧苗在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中能夠耐受CdSO4水平的升高。
從這一信息可以看到，本發(fā)明的目的是提供展示植物產(chǎn)量明顯提高的植物細(xì)胞，包括這種細(xì)胞的植物和來自這種植物的種子，理想地，植物的這種特性可以在各代中轉(zhuǎn)移。
所以，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種植物細(xì)胞，含有表達(dá)形式的基因或其一部分，至少編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)、基因或其一部分，具有與上面的基因大于60％同源性。
從圖1可以看到，盡管HP1和Pc非常相似，它們有約18個(gè)氨基酸不同，卻表現(xiàn)出約60％的同源性(即27/45)的可變性。由于兩種蛋白質(zhì)的功能在植物產(chǎn)量方面的影響是如此不同，因此產(chǎn)生的變化是明顯的，在兩種蛋白質(zhì)之間的至少一個(gè)區(qū)別是植物生長(zhǎng)方面具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。所以，雖然兩種蛋白質(zhì)具有27個(gè)相同的氨基酸和5個(gè)來自同一基團(tuán)的氨基酸，這一相似性不足以使兩種蛋白質(zhì)都具有需要的促進(jìn)生長(zhǎng)特性。所以，只有與HP1相同或與其具有大于60％，優(yōu)選70％的同源性，更理想地大于70％的同源性的蛋白質(zhì)才可以用于本發(fā)明，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生有利的影響。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述基因起源于果蠅屬。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了含有的基因或其一部分的構(gòu)建體，至少編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)，基因或其一部分含有與其具有60％以上的同源性，與核靶區(qū)偶聯(lián)，從而保證所述的HP1基因輸入靶細(xì)胞的核。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了適于利用本發(fā)明的構(gòu)建體產(chǎn)生植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蜉d體，該載體或質(zhì)粒包括本發(fā)明的構(gòu)建體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有本發(fā)明的至少一個(gè)植物細(xì)胞的植物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了從含有本發(fā)明的至少一個(gè)植物細(xì)胞的植物中得到的種子。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于提高選定植物的植物產(chǎn)量的方法，包括利用試劑轉(zhuǎn)化來自所述的選定植物的植物細(xì)胞，所述試劑包括基因或其一部分，至少編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)，基因或其一部分，與上面的基因具有60％以上的同源性，和在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供相應(yīng)植物的生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的這一方面的優(yōu)選實(shí)施例中，所述基因或其部分進(jìn)一步與核靶區(qū)偶聯(lián)，以保證該基因或其一部分輸入靶細(xì)胞的核。
雖然本發(fā)明對(duì)于HP1的色區(qū)已經(jīng)在本發(fā)明中敘述了，但是利用整個(gè)HP1基因，或其選定的部分，如所述的部分含有色區(qū)進(jìn)行同樣的實(shí)踐也是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
現(xiàn)在，通過參考下面的圖、表和方法對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行敘述。其中圖1表示異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的DNA序列結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，并且序列603-738代表了色區(qū)。圖1B表示果蠅多櫛狀體蛋白質(zhì)和異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
圖2表示本文所述的方法中使用的蛋白質(zhì)融合構(gòu)建體的設(shè)計(jì)。
圖3表示在靶細(xì)胞的核中的融合蛋白質(zhì)的定位。
圖4A表示與廣泛類型的SR1比較，表達(dá)系855/3的提高的活力。
圖4B表示與弱表達(dá)系873/2-3比較，強(qiáng)表達(dá)系855/3-4的提高的活力。
圖5表示在鹽脅迫條件下改良的生長(zhǎng)。
圖6表示表達(dá)或不表達(dá)編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的轉(zhuǎn)基因的各種品系的生長(zhǎng)改良了。
圖7表示用于將多櫛狀體和異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞的載體。
表1顯示在150毫摩爾NaCl，1×Ms培養(yǎng)基(A)或120毫摩爾NaCl，0.5×Ms培養(yǎng)基(B)時(shí)，表達(dá)HP1轉(zhuǎn)基因的幼苗的提高的生物量產(chǎn)量；EXP＝表達(dá)植物，NONEXP＝非表達(dá)HP1轉(zhuǎn)基因植物。
表2顯示在0.5×Ms培養(yǎng)基，50微摩爾CdSO4中培養(yǎng)的表達(dá)HP1轉(zhuǎn)基因的秧苗(EXP)和非表達(dá)秧苗(NONEXP)的幼苗的提高的生物量產(chǎn)量。
材料和方法原生質(zhì)體分離.將生長(zhǎng)在LS培養(yǎng)基上的Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1的無(wú)菌莖培養(yǎng)物(Maliga等人，1973)用于原生質(zhì)體分離。用于原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基是M3，一種K3培養(yǎng)基(Nagy和Maliga 1976)，根據(jù)Kao和Michayluk(1975)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了維生素，有機(jī)酸，蔗糖和糖醇和不含維生素的酪蛋白氨基酸。如Shillito等人(1983)所述，將沒有中脈的半片狀葉子浸泡在含有0.4摩爾的蔗糖的M3培養(yǎng)基中，切成薄片。將2克葉子材料在30毫升酶溶液(在M3培養(yǎng)基，0.4摩爾蔗糖中1.3％細(xì)胞酶“Onozuka R-10”(Serva)，Heidelberg，F(xiàn)RG)，0.55％Mazerozyme R-10(Serva))在暗中室溫下溫育20～22小時(shí)。在1小時(shí)或適中的攪拌之后，通過100微米網(wǎng)狀過濾器過濾消化物。在100g離心10分鐘漂動(dòng)原生質(zhì)體，利用滲透劑(0.16摩爾CaCl2，0.5％w/v2(n-嗎啉)-ethanesul-苯酚(MES)，250毫摩爾甘露醇，pH5.6)洗滌兩次。
制備DNA.在圖7中顯示了用于轉(zhuǎn)移多櫛狀體和異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的載體。該載體參考35shgfp。明顯地顯示了限制位點(diǎn)。載體是基于來自含有細(xì)菌的復(fù)制原點(diǎn)的pBR322和用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的amp抗性基因的EcoRl-Sall片斷。植物可選擇標(biāo)記是HPT盒(Cologne，德國(guó)，Max-Planck育種研究所，David Wing和CzabaConcz博士贈(zèng)送)，該基因盒含有胭脂堿合成酶啟動(dòng)子，潮霉素抗性基因和基因4多聚腺苷酸化區(qū)。在35S啟動(dòng)子和終止子之間插入了GFP構(gòu)建體。
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化.采用Hein等人(1983)的融合方法進(jìn)行DNA吸收。利用滲透劑洗滌約250,000個(gè)原生質(zhì)體，再懸浮在最后體積為120微升的滲透劑中。加入溶解于20微升無(wú)菌水中的10～30微克DNA。慢慢加入140微升PEG溶液(0.5％N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷二磺酸(Hepes)，25％PEG6000，0.45摩爾甘露醇，0.1摩爾Ca(NO3)2，pH9.5)。在20分鐘后，逐滴加入5毫升洗滌液(0.5％Hepes，0.29摩爾Ca(NO3)2，0.45摩爾甘露醇，pH9)。在10～15分鐘后，沉淀細(xì)胞，并再懸浮于2毫升M3(0.4摩爾蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升細(xì)胞分裂素)。
培養(yǎng)和選擇處理的原生質(zhì)體.利用Shillito等人(1983)的珠型技術(shù)培養(yǎng)原生質(zhì)體，將該技術(shù)修改如下在轉(zhuǎn)化后1星期，將3毫升原生質(zhì)體溶液與3毫升含有1％Seaplaque LMT瓊脂糖(MarineColloids，Rockland，USA)的M3(0.3摩爾蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升細(xì)胞分裂素)在5厘米的培養(yǎng)皿中混合。在將瓊脂糖小珠轉(zhuǎn)移到10厘米的培養(yǎng)皿后，加入含有90毫克/升的硫酸卡那霉素的5毫升M3(0.3摩爾蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升細(xì)胞分裂素)，用于選擇卡那霉素抗性的愈傷組織。每3～4天變換介質(zhì)，每次降低蔗糖含量50毫摩爾。在3～4周后，將集落轉(zhuǎn)移到固體M3培養(yǎng)基(3％蔗糖，1毫克/升NAA，0.2％細(xì)胞分裂素，100毫克/升硫酸卡那霉素)上。為了確定愈傷組織非選擇性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的頻率，挑選大小為2毫米直徑的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到含有100毫克/升卡那霉素的固體選擇培養(yǎng)基上。
植株再生.在固體M3培養(yǎng)基(3％蔗糖，0.5毫克/升苯甲基腺嘌呤(BAP)，0.1毫克/升NAA，100毫克/升硫酸卡那霉素(personalcommunication P.Stabel))上培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)莖。為了使根發(fā)育，將莖轉(zhuǎn)移到固體LS培養(yǎng)基Linsmaier和Skoog(1965)(1％蔗糖，100毫克/升卡那霉素)上。
在含有NaCl或CdSO4時(shí)HP1/GFP轉(zhuǎn)基因秧苗和對(duì)照秧苗生長(zhǎng)幼苗來源于HP1轉(zhuǎn)基因系與SP1野生型的雜交，并生長(zhǎng)在含有150毫摩爾NaCl的MS培養(yǎng)基上或含有120毫摩爾的NaCl的0.5×MS培養(yǎng)基上。在相應(yīng)的缺乏NaCl的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?。如圖5中指出，在播種后11天，19天，和24天，定期檢測(cè)幼苗生長(zhǎng)。
為了評(píng)估CdSO4對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響，在含有50毫摩爾CdSO4的0.5×MS上使轉(zhuǎn)基因和對(duì)照幼苗發(fā)芽。
在每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束時(shí)，以干重評(píng)估生物量產(chǎn)量。
結(jié)果現(xiàn)在參考附圖，首先是圖2，顯示了融合構(gòu)建體的特性，該構(gòu)建體已經(jīng)用于如上所述的方法中。簡(jiǎn)要地說，在待測(cè)試的蛋白質(zhì)中，異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1或多櫛狀體的色區(qū)與核靶區(qū)連接，從而保證了將融合構(gòu)建體靶擊到植物細(xì)胞的核，同時(shí)與綠熒光蛋白質(zhì)連接，保證在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可見到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。
利用聚焦顯微鏡技術(shù)，通過GFP蛋白質(zhì)可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞的定位。特別在圖3中可以看到，HP1/GFP融合蛋白質(zhì)定位于植物細(xì)胞的核中。
使轉(zhuǎn)化體自花授粉，在溫室中使種子萌發(fā)，5周后將轉(zhuǎn)化植物與野生型植物進(jìn)行比較，其中轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞含有融合構(gòu)建體。
在圖4A中可以看到，表達(dá)系855/3比野生型SR1生長(zhǎng)更好。
圖4B中顯示的是我們已經(jīng)命名的強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞系855/3與弱表達(dá)細(xì)胞系873/2-3的比較?？梢钥吹綇?qiáng)表達(dá)細(xì)胞系比弱表達(dá)細(xì)胞系生長(zhǎng)更好。更具體地說，可以看到兩個(gè)細(xì)胞系均顯示了比野生型提高的活力。
在圖5中，我們顯示了野生型和轉(zhuǎn)化細(xì)胞在各種脅迫條件下特別是鹽脅迫條件下生長(zhǎng)的能力的各種測(cè)試實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以，如本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于農(nóng)業(yè)，在這些脅迫條件下生存的能力顯然是重要的。
鹽脅迫和沙漠化是農(nóng)業(yè)上土壤應(yīng)用的主要限制，事實(shí)上，每年有二千一百萬(wàn)公頃的農(nóng)業(yè)土壤由于沙漠化沒有任何經(jīng)濟(jì)回報(bào)。
圖5顯示的結(jié)果代表了三個(gè)取樣時(shí)間，最早是播種后11天，然后是播種后19天，最后是播種后24天。在最早的取樣時(shí)間，可以看到?jīng)]有受到鹽脅迫的野生型細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和只含有GFP蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈L(zhǎng)一樣良好。但是，當(dāng)與150毫摩爾氯化鈉接觸11天時(shí)，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞系855/3-4顯示了展示生長(zhǎng)的信號(hào)。
在第二個(gè)取樣時(shí)間，在播種后19天，再次可以看到野生型，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩忌L(zhǎng)同樣良好。但是，當(dāng)與150毫摩爾氯化鈉接觸時(shí)，生長(zhǎng)明顯不同，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的生長(zhǎng)比野生型或轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰黠@增強(qiáng)。
在第三個(gè)取樣時(shí)間，播種24天后，再次在沒有選擇壓力時(shí)，野生型，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩忌L(zhǎng)良好。但是，當(dāng)與150毫摩爾氯化鈉接觸時(shí)，在三個(gè)組中生長(zhǎng)明顯不同，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的生長(zhǎng)明顯比其它兩組好。
表1代表了對(duì)應(yīng)于升高的NaCl濃度的相對(duì)生物量產(chǎn)量的定量分析。在各種生長(zhǎng)條件下，120毫摩爾或150毫摩爾NaCl時(shí)分析轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系855/3-4。表1顯示的數(shù)據(jù)來源于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)條件下的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。很明顯的是，當(dāng)與在相同的鹽濃度下生長(zhǎng)的對(duì)照幼苗比較時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物獲得的生物量產(chǎn)量增加了1.7～2.1倍。
為了評(píng)估鎘對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響，將HP1轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系855/3-6在含有50毫摩爾CdSO4的0.5×MS中培養(yǎng)。在生長(zhǎng)××××天后收集植株，以干重評(píng)估生物量產(chǎn)量。表2顯示了在CdSO4中HP1的保護(hù)特性。那些表達(dá)HP1/GFP融合蛋白的幼苗當(dāng)與非表達(dá)對(duì)照幼苗比較時(shí)顯示提高1.7～4倍，表明在存在鎘時(shí)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)具有保護(hù)特性。
該資料表明轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有發(fā)育上的優(yōu)點(diǎn)，該優(yōu)點(diǎn)在萌發(fā)早期顯示出來并且使細(xì)胞系能夠耐受鹽脅迫條件。
我們將細(xì)胞系的改善的生長(zhǎng)和發(fā)育歸功于異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的轉(zhuǎn)化基因或其一部分的表達(dá)。圖6中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為對(duì)此進(jìn)行測(cè)試。在圖6中，顯示了三個(gè)都含有異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的不同轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的生長(zhǎng)。在各個(gè)細(xì)胞系中，那些表達(dá)HP1的細(xì)胞在所有鹽脅迫條件的情況下，與那些不表達(dá)該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞比較顯示生長(zhǎng)提高。最低的數(shù)據(jù)，873/1-15表示對(duì)照，它代表了只利用GFP蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
圖6顯示的數(shù)據(jù)明顯地將HP1的色區(qū)的表達(dá)與提高的細(xì)胞活力關(guān)聯(lián)。
總之，上述數(shù)據(jù)明顯地表明，至少含有HP1色區(qū)的植物細(xì)胞顯示符合需要的生長(zhǎng)特性，所以，將所述的蛋白質(zhì)工程化進(jìn)入植物細(xì)胞可以開發(fā)得到良好的效果。
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Nagy JL，Maliga P(1976)從Nicotiana silvestris的葉肉原生質(zhì)體誘導(dǎo)愈傷組織和再生植物，Z Pflanzen-physiol78453-455。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱利茲大學(xué)(B)街道木屋街(C)城市利茲(D)郡名約克郡(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)LS2 9JT(ii)發(fā)明名稱用于表達(dá)黑腹果蠅的異染色質(zhì)1(HP1)的重組植物細(xì)胞(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)媒體類型軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release #1.0，#1.30版(歐洲專利局)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度899堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假定無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)原始資料(A)組織黑腹果蠅(vii)直接資料(B)克隆35SHGFP(ix)特點(diǎn)(A)名稱/要點(diǎn)CDS(B)定位603..738(xi)序列描述SEQ ID NO1AATTCCCATG GAGTCAAAGA TTCAAATAGA GGACCTAACA GAACTCGCCG TAAAGACTGG 60CGAACAGTTC ATACAGAGTC TCTTACGACT CAATGACAAG AAGAAAATCT TCGTCAACAT120GGTGGAGCAC GACACGCTTG TCTACTCCAA AAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA180AAGGGCAATT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCCGCA AACCTCCTCG GATTCCATTG240CCCAGCTATC TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT CCTACAAATG300CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA GTGGTCCCAA360AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA GACGTTCCAA CCACGTCTTC420AAAGCAAGTG GATTGATGTG ATATCTCCAC TGACGTAAGG GATGACGCAC TATCCCACTA480TCCTTCGCAA GACCCTTCCT CTATATAAGG AAGTTCATTT CATTTGGAGA GGACAGGGTA540CCCGGGGATC CAAGCTTACA ATGGCTCCCA AGAAGAAGAG AAAGGTATCT AGAATGATGG600AG TAC GCC GTG GAA AAG ATC ATC GAC AGG CGG GTG CGC AAG GGA AAG 647Tyr Ala Val Glu Lys Ile Ile Asp Arg Arg Val Arg Lys Gly Lys1 5 10 15GTG GAG TAC TAT CTG AAA TGG AAG GGC TAT CCC GAA ACT GAG AAC ACG 695Val Glu Tyr Tyr Leu Lys Trp Lys Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Asn Thr20 25 30TGG GAG CCG GAG AAC AAT CTC GAC TGC CAG GAT CTT ATC CAG C738Trp Glu Pro Glu Asn Asn Leu Asp Cys Gln Asp Leu Ile Gln35 40 45AGACGCGTCG TGCATCTGTT ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCACTGGA GTTGTCCCAA798TTCTTGTTGA ATTAGATGGT GATGTTAATG GGCACAAATT TTCTGTCAGT GGAGAGGGTG858AAGGTGATGC AACATACGGA AAACTTACCC TTAAATTTAT T899(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Tyr Ala Ala Glu Lys Ile Ile Gln Lys Arg Val Lys Lys Gly Val1 5 10 15Val Glu Tyr Arg Val Lys Trp Lys Gly Trp Asn Gln Arg Tyr Asn20 25 30Thr Trp Glu Pro Glu Val Asn Ile Leu Asp Arg Arg --- Leu --- ---35 40 45(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Tyr Ala Val Glu Lys Ile Ile Asp Arg Arg Val Arg Lys Gly Lys Val1 5 10 15Glu Tyr Tyr Leu Iys Trp Lys Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Asn Thr Trp20 25 30Glu Pro Glu Asn Asn --- Leu Asp Cys Gln Cys Leu Ile Gln35 40 4權(quán)利要求
1.含有圖1A中表示的分離核苷酸分子或其一部分的轉(zhuǎn)錄活化/可激活形式的植物細(xì)胞，該核苷酸編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)，基因或其一部分含有與上面的核苷酸具有60％以上的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述的異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)起源于果蠅屬。
3.含有核酸分子的構(gòu)建體，核酸分子含有翻譯時(shí)與核定位區(qū)融合的異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)，從而可以將所述的色區(qū)靶擊植物細(xì)胞的核。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的構(gòu)建體的表達(dá)載體，用于進(jìn)行植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，采取含有可選擇標(biāo)記形式，使其具有對(duì)藥物/試劑的抗性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的一個(gè)植物細(xì)胞的植物。
7.至少含有一個(gè)植物細(xì)胞的植物，該植物細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求3～5的表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的植物中得到的種子。
8.含有圖1A表示的分離核苷酸分子或其一部分的轉(zhuǎn)錄活化/可活化形式的種子，該核苷酸分子編碼異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)，基因或其一部分具有與上面的核苷酸分子60％以上的同源性。
9.用于提高選定植物的植物產(chǎn)量的方法，包括i)根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；ii)選擇利用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，利用對(duì)應(yīng)于所述載體中提供的所述標(biāo)記的藥物；iii)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從而維持和繁殖利用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物；和可選擇地iv)將所述的轉(zhuǎn)基因植物自花授粉或雜交用于生產(chǎn)種子。
全文摘要
含有理想地起源于果蠅屬的異染色質(zhì)蛋白質(zhì)1的色區(qū)的植株或植物細(xì)胞,其中所述的區(qū)域使所述的植株或細(xì)胞具有可選擇的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1230992SQ9719805
公開日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1997年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月20日
發(fā)明者彼得·邁耶 申請(qǐng)人:利茲大學(xué)