專利名稱：新型葡激酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程的溶栓藥物及其生產(chǎn)方法，特別涉及一種新型葡激酶及其生產(chǎn)方法。
葡激酶能與纖維蛋白溶酶原結(jié)合形成復(fù)合物，使其活化為纖維蛋白酶，并特異性地降解纖維蛋白，使血栓溶解，從而使其成為一類新的有發(fā)展前景的溶栓藥物。目前，已有的葡激酶的基因是日本的學(xué)者Sako等從金黃色葡萄球菌的Sφ-c噬菌體中分離得到的(T.Sako et al. Cloning and Expression of theStaphylokinase Gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coliMol Gen Gene(1983)190271.)。從噬菌體中分離基因，需要將溶源性菌株培養(yǎng)至裂解狀態(tài)，進(jìn)行噬菌體的分離，再從噬菌體中分離所需要的基因片段，步驟較多，操作較復(fù)雜，并且只限于這一種葡激酶的基因來源，還不能滿足對葡激酶的溶栓機(jī)理和臨床應(yīng)用進(jìn)行全面、深入研究的需要。
本發(fā)明的目的在于尋找含有葡激酶基因的新的來源，簡化操作步驟，提高效率，并獲得新型結(jié)構(gòu)的葡激酶。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以含葡激酶基因的金黃色葡萄球菌溶源性菌株的染色體DNA為模板，設(shè)計合適的引物序列，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，從而獲得編碼新型葡激酶的DNA序列，該DNA編碼序列與現(xiàn)有技術(shù)所得到的葡激酶DNA編碼序列比較，第109位的核苷酸發(fā)生了變異，本發(fā)明實施例所涉及的DNA編碼序列的第109位的核苷酸變異為鳥苷酸；通過基因工程的方法，進(jìn)行重組新型葡激酶DNA序列表達(dá)載體的構(gòu)建；重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到工程菌株；工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化、氨基酸序列的分析及生物活性的測定，所得到的新型葡激酶的氨基酸序列與現(xiàn)有技術(shù)所得到的葡激酶的氨基酸序列比較，第37位的氨基酸發(fā)生了變異，本發(fā)明實施例所涉及的新型葡激酶的氨基酸序列的第37位氨基酸變異為甘氨酸。
由于本發(fā)明通過PCR技術(shù)擴(kuò)增金黃色葡萄球菌溶源性菌株染色體DNA中的新型葡激酶的基因片段，比現(xiàn)有技術(shù)操作步驟簡單，提高了重組基因產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，產(chǎn)物表達(dá)水平和生物活性均高于文獻(xiàn)報導(dǎo)，這為葡激酶溶栓機(jī)理和臨床應(yīng)用的深入研究提供了新的物質(zhì)來源。


圖1為本發(fā)明新型葡激酶的DNA編碼序列。
圖2為本發(fā)明新型葡激酶的氨基酸序列。
以下為本發(fā)明的實施例。
一、含有新型葡激酶基因的金黃色葡萄球菌溶源性菌株染色體DNA的提取將金黃色葡萄球菌FRI610A溶原菌(由本院雷祚榮教授提供)接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)，4℃離心收集菌體，用TE洗滌菌體后再以TE懸浮菌體，加入ProteinaseK混勻后，加入10％的SDS，37℃培養(yǎng)1小時，然后加入等體積的酚，顛倒混勻一分鐘，離心，取上相，再用酚和酚/氯仿各抽提一次，加入1/10體積的3M NaAc，2倍體積的無水乙醇，置-20℃2小時，4℃離心，沉淀DNA，將沉淀的DNA用75％的乙醇洗滌，最后將沉淀溶于無菌雙蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 二、PCR擴(kuò)增葡激酶基因1.引物的設(shè)計上游引物GGAATTCAAATGTCAAGTTCATTCGACAAAGGA下游引物CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAACAAC在兩引物的5′端分別引入Eco RI和Bam HI的內(nèi)切酶識別位點。以步驟一所得到的染色體DNA為模板，加入適量的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的條件為94℃1分鐘→50℃1分鐘→71℃1分鐘，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)的72℃延伸5分鐘。反應(yīng)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果表明，在大小與葡激酶基因相符的位置上，有十分特異的DNA條帶，將PCR反應(yīng)物純化后，溶于無菌雙蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 三、PCR反應(yīng)物的DNA序列分析用Eco RI和Bam HI消化載體pUC18，電泳回收載體；再以Eco RI和Bam HI消化步驟二所得到的葡激酶基因片段，電泳回收消化的基因片段。將回收的載體和基因片段按比例混合，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至EcoliJM101受體菌內(nèi)，經(jīng)篩選得到重組克隆，大量抽提重組克隆的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA編碼序列的分析，結(jié)果見圖1。
四、目的基因的克隆表達(dá)將所得到的葡激酶基因用內(nèi)切酶Eco RI和Bam HI進(jìn)行消化，與用同樣的內(nèi)切酶消化的載體pBV220進(jìn)行混合，加入T4DNA連接酶，14℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EcoliHB101中，挑取轉(zhuǎn)化子接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，以Eco RI和Bam HI雙酶切質(zhì)粒，經(jīng)篩選，獲得陽性重組子，將重組子接種于M9CA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后，進(jìn)行42℃誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，在分子量大小與葡激酶相符的位置上，有一條較深的帶，其表達(dá)水平為表達(dá)量占菌體總蛋白的70％。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后，以鏈激酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，進(jìn)行溶圈法生物活性的測定，比活性為3×106U/mg，說明本發(fā)明所得到的新型葡激酶具有潛在的溶解血栓的藥物用途。純化產(chǎn)物經(jīng)氨基酸序列分析，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種編碼新型葡激酶的DNA序列，其特征在于該DNA序列與來源于金黃色葡萄球菌的Sφ-C噬菌體DNA的葡激酶DNA序列相比，第109位的腺苷酸發(fā)生了變異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼新型葡激酶的DNA序列，其特征在于該DNA序列的第109位腺苷酸變異為鳥苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼新型葡激酶的DNA序列，其特征在于該DNA序列來源于溶源性金黃色葡萄球菌的染色體DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼新型葡激酶的DNA序列，其特征在于該DNA序列來源于溶源性金黃色葡萄球菌FRI610A的染色體DNA。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體含有權(quán)利要求1、2、3或4所述的編碼新型葡激酶的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體的載體為質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于質(zhì)粒為pBV220。
8.一種重組細(xì)胞，其特征在于該重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞被權(quán)利要求5、6或7所述的重組表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞，其特征在于宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組細(xì)胞，其特征在于宿主細(xì)胞為大腸桿菌
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組細(xì)胞，其特征在于宿主細(xì)胞為大腸桿菌HB101。
12.一種編碼新型葡激酶的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列由權(quán)利要求1、2、3或4所述的DNA序列所編碼。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的新型葡激酶的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列與來源于金黃色葡萄球菌的Sφ-C噬菌體DNA的葡激酶DNA序列所編碼的氨基酸序列相比，第36位的精氨酸發(fā)生了變異。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的新型葡激酶的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列的第36位氨基酸為甘氨酸。
15.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求12、13或14所述新型葡激酶的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)提取含有如權(quán)利要求1、2、3或4所述的新型葡激酶DNA序列的染色體DNA；(2)以步驟(1)所得到的新型葡激酶DNA序列為模板的PCR擴(kuò)增；(3)如權(quán)利要求5、6或7所述表達(dá)載體的構(gòu)建；(4)如權(quán)利要求8、9、10或11所述的重組細(xì)胞的構(gòu)建；(5)步驟(4)所獲得的重組細(xì)胞的培養(yǎng)表達(dá)；(6)步驟(5)所獲得的表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；(7)步驟(6)所獲得的純化產(chǎn)物的氨基酸序列的分析及生物活性的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型葡激酶,該葡激酶的基因分離于溶源性金黃色葡萄球菌的染色體,與現(xiàn)有的分離于金黃色葡萄球菌SΦ－C噬菌體DNA葡激酶的基因相比,其DNA編碼序列的第109位的腺苷酸變異為鳥苷酸,由此導(dǎo)致了氨基酸序列的第37位氨基酸由精氨酸變異為甘氨酸。通過基因工程技術(shù)手段,該新型葡激酶在宿主菌中獲得了高效表達(dá),經(jīng)純化獲得的產(chǎn)物的生物活性為3×10
文檔編號C12N15/70GK1196391SQ9710392
公開日1998年10月21日 申請日期1997年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月16日
發(fā)明者鄒民吉, 王嘉璽 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所