專利名稱：生物學活性多肽的輸送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體內(nèi)輸送生物學活性多肽。特別是涉及使用非侵染性細菌，通常是革蘭氏陽性菌例如乳球菌，在體內(nèi)特別是粘膜處提供生物學活性多肽。一個方面，本發(fā)明涉及提供一種佐劑效應，借助該效應得以提高針對某種抗原的免疫反應。本發(fā)明還提供這些應用所需的核酸構(gòu)建體及宿主生物體。
只有有限數(shù)目的佐劑被批準用于人疫苗中(鑒于大多數(shù)活性佐劑如弗氏完全佐劑的毒性或病原性)。在過去20多年里發(fā)現(xiàn)了許多參予B細胞和T細胞增殖、分化及活化的多肽。這使人們?nèi)パ芯坑眠@些因子(細胞因子)來加強對疫苗的反應，并向著所需途徑引導對特定疫苗之免疫反應的可能性。由于最近免疫學的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了細胞介導的和抗體介導的免疫反應在很大程度上是一種相互排他反應，所以對這一研究的需要愈加突出。不管是抗體生成還是效應T細胞或巨噬細胞被激活都是由給定的抗原、病原體或疫苗引發(fā)的細胞因子的特殊排列決定的。其中最重要的是參予對特定抗原或侵染性病原體反應的不同類型輔助T細胞TH1或TH2的功能活性。
因為抗病原因子的保護性免疫通常是因抗體生成(在細胞外病原體、可溶性毒素或死亡的、瀕死的或生產(chǎn)性細胞釋放到組織液的細胞內(nèi)病原體)或細胞介導的反應而產(chǎn)生的，將針對疫苗的免疫反應導向抗體生成或T細胞及巨噬細胞活化原則上是十分有利的。為了使疫苗接種的保護性效應持續(xù)盡可能長的時間，能夠增加免疫反應的幅度、時間和記憶組分也是很重要的。
為此，許多研究人員都將其注意力放在了利用信號蛋白之細胞因子網(wǎng)的一個或多個成員作為疫苗佐劑的可能性上。在考慮到輔助T細胞丟失—并因而其細胞因子釋放損失—可能與患有某些類型的遺傳性或后天獲得性免疫缺陷癥的個體不能對特定疫苗發(fā)生反應有關(guān)時，這種方法可能更為重要。
雖然對將細胞因子用于這些目的付諸了很大關(guān)注，但利用細胞因子作為佐劑的成功報導卻很有限。在用適用于疫苗的方法施用佐劑細胞因子時遇到了很大困難。這種困難可從使用IL-2作為佐劑進行的研究工作中得以解釋。
雖然一般認為IL-2的基本來源是T輔助1細胞，但據(jù)信其主要活性包括參予多方面的免疫反應，例如T細胞增殖、其他細胞因子的合成、B細胞生長及免疫球蛋白合成，所以IL-2用作可能的佐劑引起了特別的關(guān)注。因此IL-2是一種首先描述為T細胞生長因子的T細胞衍生的細胞因子。現(xiàn)已知道其可刺激T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞及少突膠質(zhì)細胞的生長與分化。總地說來，許多研究者都報導了IL-2的佐劑活性，發(fā)現(xiàn)其佐劑活性依賴于多次注射使用細胞因子或?qū)⑵鋼饺氲街|(zhì)體或油性乳劑中。為了免除這一需要，其他一些研究者則在重組細菌和病毒載體中共表達了IL-2和疫苗抗原，或者以基因工程方法制備了IL-2抗原融合蛋白質(zhì)；據(jù)稱后者顯著地提高了融合蛋白抗原成員的免疫原性。
疫苗的其他希望有的特征包括要求盡可能安全、在施用最小劑量之后可有效地發(fā)揮作用，并適于通過粘膜表面(即口服、鼻內(nèi)或陰道內(nèi))給藥以不必進行皮下注射，以及除全身性免疫反應外還可激活局部的粘膜免疫反應。由于活的、減毒的病原體能夠連續(xù)增殖，因而已針對使用病毒和細菌的重組疫苗株(例如痘病毒，或沙門菌和結(jié)核桿菌)作為外源抗原之輸送劑進行許多研究。
我們以前已建立了在非病原性、非定居的、無侵染性的食品級乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中表達異源抗原的系統(tǒng)(參見英國專利GB-2278358B)。我們以前的研究表明，當體外培養(yǎng)時，乳酸乳球菌能夠產(chǎn)生并分泌有生物學活性的鼠IL-2(Steidler等.，Applied andEnvironmental Microbiology，April 1995，Vol.66，No.4，pp.1627-1629)。但由于乳酸乳球菌是非侵染性的，即其不是共生菌，而且正常情況下也不定居在動物的粘膜表面上，所以這種能成功地應用于需要在體內(nèi)生成佐劑細胞因子的疫苗接種中不是顯而易見的。我們以前已證明(GB 2278358B)，當積累在乳酸乳球菌胞漿內(nèi)時，異源性抗原可以是全抗原性的(由此推測細胞被吞噬細胞消化而在體內(nèi)漏出所致)。
經(jīng)操作適當?shù)幕蛟覀円烟峁┝撕怂針?gòu)建體(即人工操縱子—協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄多基因單位)用于在乳酸乳球菌中共表達抗原多肽(其中以破傷風毒素片段C[TTFC]為例)和生物學活性細胞因子多肽(其中以白介素2和白介素6為例)。
其他研究者的實驗表明，細胞因子IL-6具有在體內(nèi)和體外加強鼠抗原特異性抗體反應的能力，我們已能夠制備在乳酸乳球菌中表達IL-6的表達單位。IL-6是由淋巴樣和非淋巴樣細胞分泌的多功能性細胞因子，已知其具有在宿主防御中起關(guān)鍵性作用的多效活性。根據(jù)靶細胞的不同，IL-6可發(fā)揮生長誘導、生長抑制及分化誘導等方面的活性。這些活性包括T細胞和巨噬細胞的分化和/或激活，促進B細胞的生長(例如可見體外促進B細胞腫瘤細胞系的生長)、B細胞的終末分化(免疫球蛋白分泌)，以及發(fā)揮激發(fā)肝急性期蛋白質(zhì)反應的全身性作用。為粘膜免疫目的，最重要的是已顯示IL-6可誘導IgA定型B細胞中以高比例分泌IgA。
為了舉例說明本發(fā)明，分別在組成型表達載體(pTREX1，也稱為pEX1)中構(gòu)建用于共表達IL-2和Il-6的操縱子，從而可由具有前述活性的乳球菌啟動子元件(所謂P1)的作用來控制TTFC基因和白介素基因的轉(zhuǎn)錄。制備這種構(gòu)建體，以致在翻譯從人工操縱子轉(zhuǎn)錄得到的mRNA后，即可在細胞內(nèi)積聚TTFC抗原。
在將這些細菌制劑經(jīng)鼻內(nèi)施用于小鼠時，經(jīng)基因工程化改造而表達白介素2或白介素6的細菌即可比只表達TTFC的構(gòu)建體引導產(chǎn)生10倍以上的抗TTFC抗體。因此，在此實驗系統(tǒng)中這些白介素都具有顯著的佐劑活性。
根據(jù)乳酸乳球菌運送外源性抗原的能力或其產(chǎn)生IL-2的能力還不能看出它是體內(nèi)運送細胞因子的適當載體，用以提供足夠的有活性的細胞因子以產(chǎn)生佐劑效應。乳酸乳球菌是非侵染性的和非定居的，這就意味著當使用這些細菌，例如通過粘膜表面向免疫系統(tǒng)輸送抗原時，它們很可能由于M(或微褶)細胞(其從相鄰于粘膜淋巴組織的粘膜分泌內(nèi)容物汲取樣品)的吞噬作用而進入淋巴組織。微顆粒抗原(如摻入多聚L-丙交酯微顆粒中的破傷風類毒素)以這種方式被動地進入淋巴組織，而李斯特氏菌、沙門氏菌及志賀氏菌等病原菌(或減毒的疫苗)則除了通過M細胞得以進入外，還可通過主動刺激其攝入粘膜上皮細胞而侵染細胞和組織。因前已發(fā)現(xiàn)細胞因子作為佐劑的活性需要多次注射或緩釋輸送(Heath and Playfair(1992)Vaccine 7427-434)，而且因為細胞因子只在巨噬細胞內(nèi)才免受蛋白水解消化，并且乳酸乳球菌則仍保持完整或存活，故不能預期表達細胞因子的乳酸乳球菌可表現(xiàn)出如本文所證明的顯著的佐劑活性。如果理解到細菌顆粒的死亡和溶解將有利于抗原釋放，但阻止很短時間產(chǎn)生細胞因子，則也許能夠正確認識這一點。盡管如此，我們的發(fā)現(xiàn)表明，由乳酸乳球菌表達IL-2或IL-6確實具有顯著的佐劑效應。既使經(jīng)粘膜途徑以外的胃腸道外途徑施用表達菌，也將同樣適用。
因為乳酸乳球菌是非侵染性的—其確實不是共生菌并且其營養(yǎng)也不依賴于在體內(nèi)不大可能得到的氨基酸和肽，所以證明分泌細胞因子的乳酸乳球菌菌株能夠增加抗體產(chǎn)生這一點是令人驚奇的。因為這些結(jié)果首次證明，乳酸乳球菌的重組菌株可用于在體內(nèi)合成并傳送生物學活性分子。特別令人感興趣的是，這些結(jié)果證明了提高粘膜及全身性免疫反應的可行性，因為已顯示IL-6是一種能夠在IgA定型細胞中誘導高比例IgA分泌的細胞因子。
乳酸乳球菌能夠在粘膜上使其生物學活性維持足夠長的時間，以傳送生物學活性劑量的兩種不同的重組細胞因子之一，并因而提高針對異源抗原的免疫反應這一發(fā)現(xiàn)證明，對佐劑活性以外的目的傳送多肽存有廣泛的適用性。
乳酸乳球菌產(chǎn)生并分泌多肽的能力證明，有可能利用這些細菌在體內(nèi)產(chǎn)生并傳送已知在微摩爾、毫微摩爾和微微摩爾濃度水平即有活性的多肽。由于這些多肽的精確使用劑量，并且對同時導入細菌細胞這一要求在獸醫(yī)應用方面考慮較少，所以這種傳送重組多肽的方法在獸醫(yī)學應用中將是特別有價值的。但既使在人類醫(yī)學內(nèi)，細胞因子輸出可能被限制在無害細菌細胞的附著部位，并且在免疫反應的最早期可在接近抗原處被利用，這一事實可有利于其在需要生物學活性多肽局部化以避免全身性毒性付作用的環(huán)境中的使用，例如利用其佐劑活性。
因此，本發(fā)明提供(i)傳送一種或多種生物學活性多肽的方法，其包括給予治療對象表達所說的一種或多種多肽的非侵染性或非致病性細菌；(ii)傳送一種或多種抗原的方法，其包括給予治療對象表達所說一種或多種抗原的非侵染性或非致病性細菌；以及(iii)傳送一種或多種抗原和/或一種或多種生物學活性多肽的方法，其包括給予治療對象表達所說的一種或多種抗原及所說的一種或多種異源生物學活性多肽的非侵染性或非致病性細菌。
生物學活性多肽可以是與細菌同源的，或者是異源的，衍生于真核或原核細胞，或衍生于它們的病毒。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了表達(i)一種或多種異源生物學活性多肽和(ii)一種或多種抗原的非侵染性或非致病性細菌。
“生物學活性”是指完成生物學功能的能力，并且當指多肽時還意味著該多肽是采取與其天然構(gòu)型相同或十分相似的穩(wěn)定構(gòu)型(“拆迭形式”)。當正確拆迭或基本上正確拆迭，形成適當拆迭的單位，例如α螺旋、β片層、區(qū)域、二硫橋等時，多肽便應具有完成其天然功能的能力。一般說來，多肽分子中的功能單位是某某區(qū)域。
無論是否引發(fā)免疫反應，而僅僅是被抗體或其他受體結(jié)合，這種能力是被動的，并且不構(gòu)成“生物學活性”。任何抗原都具有被抗體結(jié)合的能力，但不一定是有生物學活性的。
“異源”多肽是細菌天然沒有的多肽，即在自然界或在將編碼該多肽的核酸導入細菌或其祖代之前，沒有被該細菌表達的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的細菌一般是革蘭氏陽性的，并且原則上可以是任何無害的細菌，例如無害李斯特氏菌(Listeria innocua)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)或乳球菌(Lactococcus)。乳球菌，特別是乳酸乳球菌代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。這樣的細菌是非定居的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解到，本發(fā)明的方法可用于傳送某個范圍的生物學活性多肽。適當?shù)亩嚯目砂軌蛟诰植炕蛉戆l(fā)揮功能的多肽，例如是能夠發(fā)揮內(nèi)分泌活性以影響局部或全身代謝的多肽，和/或生物學活性多肽是能夠調(diào)節(jié)免疫造血系統(tǒng)細胞活性的多肽，和/或一種或多種生物學活性多肽是能夠影響體內(nèi)各種正?；蛸樕毎婊钚?、生長和分化的，或影響對損傷及感染之急性期炎癥反應的免疫調(diào)節(jié)或誘導作用的多肽，和/或一種或多種生物學活性多肽是能夠提高或誘導細胞和組織對于由作用于其靶細胞受體的趨化因子介導的感染的抗性，或促進上皮細胞增殖或傷口愈合的多肽，和/或一種或多種生物學活性多肽是調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞表達或產(chǎn)生某些物質(zhì)的多肽。
這樣的多肽的特定實例包括胰島素、生長激素、催乳素、降鈣素、黃體生成素、甲狀旁腺素、促生長素抑制素、甲狀腺刺激素、血管活性腸肽、采取反平行4α螺旋束狀結(jié)構(gòu)的1類結(jié)構(gòu)細胞因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSF、CNTF、GH、PRL或IFNα/β；常常與細胞表面相關(guān)的因子，形成對稱的均三聚體且亞單位呈現(xiàn)某些病毒衣殼蛋白質(zhì)樣β膠輥構(gòu)型的2類結(jié)構(gòu)細胞因子，例如TNF家族的細胞因子，如TNFα、TNFβ、CD40、CD27或FAS配體，IL-1家族的細胞因子、成纖維細胞生長因子家族、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β和神經(jīng)生長因子；包括短鏈α/β分子的，作為大的跨膜前體分子產(chǎn)生的，各分子至少含有一個在細胞外區(qū)域中之EGF區(qū)的3類結(jié)構(gòu)細胞因子，如表皮生長因子家族的細胞因子，以在保守半胱氨酸殘基周圍聚集的氨基酸序列為特征的趨化因子(C-C或C-X-C趨化因子亞類)或胰島素相關(guān)趨化因子；呈現(xiàn)嵌合結(jié)構(gòu)的4類結(jié)構(gòu)細胞因子，如由不同的區(qū)域如EGF、免疫球蛋白樣區(qū)域和kringhe結(jié)構(gòu)區(qū)域組成的heregulins或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
另外，生物學活性多肽也可以是上述生物學活性多肽的受體或拮抗劑。
細菌從包含在菌體內(nèi)的核酸表達生物學活性多肽和抗原。核酸可包括一個或多個核酸構(gòu)建體，在構(gòu)建體中編碼生物學活性多肽的核酸和編碼抗原的核酸處于為在細菌中表達所需的適當調(diào)節(jié)序列的控制下。
可以選擇或構(gòu)建包括待導入細菌中的核酸的適當載體，根據(jù)需要所說的載體可包括適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列，其中包括啟動子序列、終止子片段、增強子序列、標志基因及其他序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒如噬菌體或噬菌粒。更詳細的描述可參見Sambrook等.，《分子克隆實驗室指南》，第二版(Molecular Cloninga Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。在Ausubel等人編著的《分子生物學中的簡便實驗方法》第二版(Short Probocols inMolecular Biology，2nd edition，John Wiley & Sons，1992)中詳細描述了有關(guān)核酸操作的技術(shù)和方法，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、DNA導入細胞和基因表達，及蛋白質(zhì)分析等。Sambrook等人和Ausubel等人的公開列為本文參考文獻。
在一優(yōu)選實施方案中，生物學活性多肽和抗原的編碼序列包含在操縱子中，即進行多順反子表達的核酸構(gòu)建體中。在操縱子中，從啟動子轉(zhuǎn)錄得到包含一個以上編碼序列的mRNA，其中每個都具有其自身適當定位的核糖體結(jié)合位點上游。因此，可從單一mRNA翻譯一個以上的多肽。使用操縱子能夠協(xié)調(diào)生物學活性多肽和抗原的表達。
在另一個實施方案中，生物學活性多肽和抗原的編碼序列是同一個核酸載體或不同的載體的一部分，并且各自處于不同啟動子的調(diào)節(jié)控制之下。啟動子可以是相同或不同的。
本發(fā)明的再一個方面提供包含生物學活性多肽編碼序列和抗原編碼序列的核酸構(gòu)建體，其中各個編碼序列都處于在非侵染性細菌(如前所述的，其中特別是非共生性和/或非定居性細菌，如乳球菌)中表達所需的啟動子的控制下，而不管其是否為操縱子。
本發(fā)明所使用的啟動子最好是可在細菌中組成性表達的。如使用組成型啟動子就可不必使用表達發(fā)生所需的誘導子或其他調(diào)節(jié)信號。啟動子最好在細菌宿主細胞仍存活的水平上指導表達，即即使細胞不能繼續(xù)生長，但仍保留某些代謝活性。這樣，表達就很可能是低水平的。例如當表達產(chǎn)物聚積在細胞內(nèi)時，這一表達水平可使表達產(chǎn)物聚積量少于細胞蛋白質(zhì)的10％，最好少于5％，例如3％。啟動子可以是與所使用的細菌同源的，即見于天然存在的細菌中的。例如在乳球菌中表達時可使用乳球菌啟動子。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌)的優(yōu)選啟動子是衍生于乳酸乳球菌染色體的“P1”(Wa-terfield N.R.；Le Page，R.W.F.；Wilson P.W.和Wells J.M.，Gene(待出版))，其序列如下所示GATTAAGTCA TCTTACCTCT TTTATTAGTT TTTTCTTATA ATCTAATGATAACATTTTTA TAATTAATCT ATAAACCATA TCCCTCTTTG GAATCAAAATTTATTATCTA CTCCTTTGTA GATATGTTAT AATACAAGTA TC核酸構(gòu)建體可包括分泌信號序列。在一優(yōu)選實施方案中，編碼生物學活性多肽的核酸可提供生物學活性多肽的分泌表達(將編碼信號序列的核酸偶聯(lián)到編碼多肽的核酸序列上)。可在保持生物體存活性的培養(yǎng)條件下，體外試驗攜帶核酸的細菌分泌多肽的能力。
適當?shù)姆置谛盘栃蛄邪ㄈ魏卧诟锾m氏陽性菌如芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌及乳桿菌中有活性的分泌信號序列。這樣的序列包括淀粉液化芽孢桿菌的α淀粉酶前導分泌序列或已知在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性宿主中有功能的某些葡萄球菌菌株分泌的葡萄球菌激酶的前導分泌序列(參見“Gene Expression Using Bacillus”，Rapoport(1990)Current Opinion in Biotechnology 121-27)，或許多其他芽孢桿菌酶或S層蛋白的前導序列(參見Harwood and Cutting，“Molecular Biologycal Methods for Bacillus”，pp.341-344，John Wi-ley & Co.，1990)。對于乳球菌來說，優(yōu)選的是稱為Usp45的蛋白質(zhì)的前導序列(SEQ ID NO2)ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT ATT TTA ATG TCT ACA GTGmet lys lys lys ile ile ser ala ile leu met ser thr valATA CTT TCT GCT GCA GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCTile leu ser ala ala ala pro ley ser gly val tyr ala但抗原最好聚積在細胞內(nèi)。如上文討論的，聚積水平應使細菌仍能存活，即保持某些代謝活性，并少于細胞蛋白質(zhì)的大約10％，最好少于細胞蛋白質(zhì)的約5％。
原則上抗原可以是能夠與免疫系統(tǒng)的受體例如抗體結(jié)合的任何蛋白質(zhì)。在一優(yōu)選實施方案中，抗原是毒素形式的細菌類毒素或其抗原性片段。為了與編碼序列中具有超過G/C的高A/T使用率(60％A/T)的乳球菌有好的表達相容性，抗原可以是編碼序列中富含A/T(具有比G/C高的A/T含量)的抗原。例如，抗原可以是得自梭狀芽孢桿菌或肺炎球菌或其他葡萄球菌菌種的類毒素(或其抗原性片段)。例如，梭狀芽孢桿菌編碼序列，常常如來自屬于Plas-modium屬的重要的人瘧原蟲基因一樣，具有＞70％的A/T堿基對含量。
為了用于提高對抗原即如本文所討論的抗原肽或多肽的免疫反應，生物學活性多肽最好有細胞因子活性。Callard和Gearing(1994)在“The Cytokine Facts Book”(Academic Press)一書中討論了細胞因子。優(yōu)選的有細胞因子活性的多肽是白介素，包括白介素2(IL-2)和白介素6(IL-6)。許多細胞因子都含有二硫橋鍵，并且都是由天然產(chǎn)生這些因子的細胞分泌的。細菌細胞胞漿的還原性質(zhì)可望阻止二硫橋鍵的形成。還不很明確天然分泌的，特別是天然含有二硫橋鍵的多肽，當留在細菌細胞內(nèi)時是否是有生物學活性的。
因此，在一個實施方案中，生物學活性多肽是從天然產(chǎn)生它們的細胞中分泌的。
按照本發(fā)明，使用細胞因子提高對抗原的免疫反應，對于低免疫原性抗原是特別適宜的。此外，將免疫原施用于粘膜，一般可引發(fā)IgA反應。疫苗引發(fā)好的(保護水平)粘膜免疫反應的能力是一種理想的特征，因為現(xiàn)已知道sIgA抗體在防止粘膜遭受感染中起到十分重要的作用。例如，已顯示與霍亂桿菌結(jié)合的sIgA能夠防止小鼠的實驗性霍亂的發(fā)生。有效地中和HIV-1的sIgA可能在對抗這種病毒的感染中起到重要作用，因為病毒進入人體即可造成終生感染。因此還要努力尋找一種可靠的和長期持續(xù)的誘導粘膜sIgA反應的方法，因為絕大多數(shù)人類病毒和細菌病原體是在定居于粘膜表面后才開始感染的。
因此，本發(fā)明中可特別優(yōu)先利用那些得自有利增加IgA反應的低免疫原性的抗原，例如曼森氏裂體吸蟲的P28免疫原(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的細菌，須將核酸導入細菌宿主細胞內(nèi)。因此，本發(fā)明的再一個方面是提供包括將上文討論的核酸導入到非侵染性細菌內(nèi)的方法，所說的細菌較好是革蘭氏陽性菌，最好是非共生、非定居的細菌(例如乳球菌)?？衫萌魏我环N適用技術(shù)進行導入。就細菌細胞來說，適用技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化法、電穿孔及使用噬菌體轉(zhuǎn)化。
導入之后，例如可在適于基因表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以引起或充許從該核酸開始表達。在適于表達生物學活性肽的條件下培養(yǎng)細胞，并可利用抗原進一步證實細菌含有編碼核酸，并且能夠產(chǎn)生所編碼的材料。
另一個方面，本發(fā)明提供體內(nèi)運送生物學活性劑量的多肽的方法，該方法包括給個體施用包含表達外源生物學活性多肽的核酸的非侵染性細菌。如上文討論的，優(yōu)選的細菌包括乳球菌例如乳酸乳球菌，且優(yōu)選的給藥途徑可以是粘膜用藥。
雖然以前已顯示有可能在這些細菌中以生物學活性形式表達異源多肽，但這只是在有最佳化細菌存活率和生長的培養(yǎng)條件下于體外完成的。在體內(nèi)，例如在粘膜上，細菌是處于一個預期不會支持其生長或存活的環(huán)境中。因此令人驚奇的是，這些細菌能夠以足夠發(fā)揮多肽產(chǎn)生物學活性的量運送多肽，并產(chǎn)生可檢測的生物學效應。
在一優(yōu)選實施方案中，生物學活性多肽具有細胞因子活性并且細菌也可以表達某種抗原。特別是可以運送白介素如IL-2和IL-6。
利用本發(fā)明的方法和本文所述的非侵染性或非病原性細菌可提供使本領(lǐng)域技術(shù)人員操縱例如個體免疫反應的各種治療方法。因此，在其他一些方面本發(fā)明提供(i)調(diào)節(jié)細胞或組織的存活性、生長、分化、效應物功能或?qū)Ω腥镜拿舾行缘姆椒?，該方法包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(ii)增強抗腫瘤細胞或定居在粘膜表面或相鄰或遠距離組織上的感染的免疫反應的方法，其包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(iii)調(diào)整抗病原感染因子的免疫反應類型(抗體還是細胞介導的)的方法，其包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(iv)調(diào)制炎性或腫瘤細胞侵潤正常組織的方法，其包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(v)控制腫瘤細胞生長速率，侵入速率或存活性的方法，其包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(vi)誘導腫瘤細胞編程性細胞死亡的方法，其包括給個體施用如本文限定的非侵染性或非病原性細菌；(vii)下調(diào)免疫反應的方法，其包括給個體施用表達生物學活性多肽的非侵染性或非病原性細菌；以及(viii)治療變應性自身免疫或其他免疫調(diào)節(jié)異常性疾病狀態(tài)的方法，其包括給個體施用表達生物學活性多肽的非侵染性或非病原性細菌。
換句話說，當由一種細菌表達細胞因子和抗原時，本發(fā)明的一個方面是提供提高對抗原的免疫反應的方法，該方法包括給個體施用含有表達有細胞因子活性的多肽和抗原之核酸的非侵染性細菌。
就增強免疫反應如抗體反應來說，最好使免疫反應提高到足以保護個體繼后免受病原體中抗原攻擊的水平。例如，如果抗原是細菌類毒素或毒素片段，在按照本發(fā)明施用細菌后的抗體反應水平，可使個體如在受到產(chǎn)生該毒素的細菌感染后免于產(chǎn)生細菌毒素攻擊的病理后果。
在某些情況下，最好除全身反應外，還由于在粘膜上產(chǎn)生提高的免疫反應(即IgA反應)而優(yōu)選在粘膜表面施用細菌。
可將細菌加在營養(yǎng)培養(yǎng)基，即含有延遲(至少在體外)細菌代謝活性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中施用之。這樣的物質(zhì)可在細胞不生長的情況下維持其存活。這樣物質(zhì)可包括能源如葡萄糖、氨基酸等。
給予細菌的個體可以是人或動物，例如非人哺乳動物?？山?jīng)口、鼻、陰道或肛門等途徑常規(guī)給藥。在有些情況下粘膜給藥并不是優(yōu)選的，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他適當方式，如經(jīng)胃腸道外途徑(i/v、i/p、s/c、i/m)施用細菌。
在治療應用方面，即向個體體內(nèi)運送多肽的生物效應對該個體有利的情況下，最好施用“治療上有效的量”，這個量應足以對病人有利。這種益處可以是至少減輕至少一種癥狀。在預防應用方面，這個量可以是足以例如通過提高免疫反應來降低繼后病原攻擊對個體產(chǎn)生的有害影響。給藥的真正劑量、頻率和時間按排將取決于給藥目的，即根據(jù)攻擊的性質(zhì)和嚴重程度而尋求的生物學效應，并且是常規(guī)最佳化的要點。包括預防性疫苗接種在內(nèi)的治療處方，例如決定用藥劑量，則是一般從業(yè)者和其他臨床醫(yī)生的責任。
可以按照本發(fā)明單獨或與其他治療聯(lián)合，同時或相繼施用含有細菌的組合物。
本發(fā)明還提供含有如本文公開的細菌的藥物組合物。在一個實施方案中，這樣的藥物組合物最好是適于施用于粘膜的。
按照本發(fā)明使用的本發(fā)明藥物組合物除含有細菌外，還可含有醫(yī)藥上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他材料。這些材料應是無毒的，并且不干擾活性成分的效果。載體或其他材料的確切性質(zhì)可取決于給藥途徑。為了靜脈內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射，或在患部注射，可利用無熱原的并且有適當?shù)膒H、等滲性和穩(wěn)定性的胃腸道外可接受的含水溶液。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員能夠制備適當?shù)娜芤?。必要時其中可包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。如上所述，按照本發(fā)明施用的含有細菌的藥物可包含一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸等能源。
在另一個方面，本發(fā)明提供制造藥物的方法，其包括將所公開的細菌與適于施用于個體的載體配制在一起。在一個實施方案中，藥物適于施用于個體的粘膜。
本發(fā)明還提供表達異源生物學活性多肽并且還可能表達抗原的細菌作為藥物的應用，即用于以外科或治療法治療包括預防(疫苗接種)人或動物體的方法中。如上文公開的，細菌可以是革蘭氏陽性菌，最好是非共生的和/或非定居的，并且適當?shù)睦影ㄈ榍蚓?。該方法最好包括施用于個體的粘膜，例如用于提高個體的免疫反應。
本發(fā)明的再一個方面提供如所公開的細菌在制造施用于個體的組合物，即藥物組合物或藥物中的應用。最好是施用于個體的粘膜上并可提高個體體內(nèi)的免疫反應，如對細菌表達的抗原的免疫反應。
可從本公開中清楚地了解本發(fā)明各個方面的實施方案，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解到，可對本發(fā)明進行種種改動?？蛇M一步了解本發(fā)明的其他方面和實施方案。下文參照附圖描述按照本發(fā)明的實施方案獲得對抗原的保護水平免疫反應的非限制性實驗實例。


圖1顯示質(zhì)粒構(gòu)建的流程?？墒褂盟玫降馁|(zhì)粒pTTI2在生物體如乳酸乳球菌中表達TTFC和IL-2，并使用所得到的質(zhì)粒pTTI6表達TTFC和IL-6。
圖2a顯示載體pEX1(也稱為pTREX1)，其中可在多克隆位點(MCS)插入某種基因，例如包括抗原(如TTFC)和生物學活性多肽(如細胞因子IL-2和IL-6)之編碼序列的操縱子構(gòu)建體。
圖2b顯示pEX1(pTREX1)一個區(qū)域的放大圖解，其中顯示當插入到基因MCS(多克隆位點)時為基因(包括多(二)順反子編碼序列)表達而可操縱地定位的P1啟動子、SD序列(SD)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
圖3顯示用表達破傷風毒素片段C(TTFC)與鼠細胞因子IL-2或IL-6的重組乳酸乳球菌鼻內(nèi)接種的一組六只小鼠的TTFC特異性血清IgG滴度。
所有上文提到的文獻都列為本文參考文獻。
實施例1為了獲得TTFC和mIL2或mIL6的同時表達，我們選擇構(gòu)建驅(qū)動兩個順反子的操縱子。我們使用組成性表達的載體?？偟卣f來，我們試圖在順反子SD序列之前緊接一個XbaI位點，并在終止子密碼子之后緊接一個SpeI位點。以這種方式，可以很容易地交換多順反子，并以各種組合按所需排列安排之，因為XbaI和SpeI產(chǎn)生同樣的粘端。我們以前已借助T7啟動子—T7基因10核糖體結(jié)合位點—完成了mIL2和mIL6的表達，所以我們選擇使用存在于g10核糖體結(jié)合位點中的XbaI位點。就這種安排來說，我們知道SD序列是明確定位的。我們選擇將TTFC順反子放在白介素的前面。
質(zhì)粒的構(gòu)建圖1描繪了質(zhì)粒的構(gòu)建。對攜帶mIL2和mIL6的質(zhì)粒進行定點誘變，以得到緊接在終止密碼子之后的額外SpeI位點。使用含有USP45前導分泌序列和TTFC之融合體的質(zhì)粒作為模板對所需的各個TTFC序列進行PCR擴增。
對驅(qū)動細胞內(nèi)TTFC產(chǎn)生的操縱子來說，擴增作為平端SpeI/BamHI片段的基因并克隆到載體pTREX1中，用SphI切割，修成平端并再次用BamHI切割。所得質(zhì)粒稱為pT1TT。從該質(zhì)粒中分離3′末端150bp的SpeI TTFC片段并克隆到pL2MIL2A和pL2MIL6A的XbaI位點中。所得質(zhì)粒稱為p3TTIL2和p3TTIL6。我們使用存在于TTFC之3′末端的KpnI限制性位點重新構(gòu)建TTFC，并將p3TTIL2和p3TTIL6中的KpnI-SpeI片段與pTITT中的適當?shù)腒pnI-PvuII和SpeI-PvuII片段連接，從而得到所需的操縱子。所得到質(zhì)粒稱為pTT12和pTT16。
蛋白質(zhì)的表達用抗體檢測法檢測蛋白質(zhì)的表達。為此，將所研究的不同菌株的菌落點在硝酸纖維素膜上，放在含有適當抗體的GM17(difco)固體瓊脂板上。將平板保溫過夜并在含有2.5％脫脂奶粉的PBS中封閉。用兔抗TTFC或兔抗MIL2展現(xiàn)平板上的表達產(chǎn)物。實驗顯示所有含TTFC基因的構(gòu)建體中都有清晰的TTFC表達。另外就pT-TI2和pTTAI2來說，還檢測了IL2和TTFC的共表達。因為TTFC單位和mil6之間的接合與TTFC和mil2之間的接合完合相同，故可推測LL6同樣能與TTFC很好地共表達。
用于免疫接種的細胞的制備從新鮮的過夜培養(yǎng)物中培養(yǎng)用于免疫接種的細菌菌株，將其以1ml過夜培養(yǎng)物對15ml的比例稀釋到含有紅霉素(5μg/ml)的新鮮GM17培養(yǎng)基中，并于30℃培養(yǎng)。當600nm光密度為0.5至1.0時收獲細胞。在原培養(yǎng)物體積1/10的0.5％酪蛋白氨基酸、0.2M碳酸氫鈉、0.5％葡萄糖溶液中洗滌細胞，然后以原培養(yǎng)物體積的1/200體積重新懸浮之，并檢測細菌細胞濃度。然后將細胞稀釋到上述溶液中，以得到每次免疫接種的所需數(shù)目的細胞。
免疫接種經(jīng)吸入“Metofane”輕度麻醉小鼠，使用自動吸移管向每個鼻孔內(nèi)滴入加在0.5％酪蛋白水解物、0.2M碳酸氫鈉和0.5％葡萄糖的溶液中的10μl細菌懸液。密切觀察動物的呼吸困難情況，直到從麻醉狀態(tài)完全恢復為止。
結(jié)果結(jié)果如表1和圖4中所示。細菌能夠表達白介素2或白介素6，比只表達TTFC的細菌多引發(fā)10倍以上的抗TTFC抗體生成。
細菌毒素的一個規(guī)律是，抗體滴度一旦超過閥值，就達到了保護效果。見于接種含pEX-TTFC/IL-2和pEX-TTFC/IL-6細菌的小鼠的抗體滴度水平，遠遠超過繼后保護動物對抗破傷風毒素攻擊的閾值水平(見圖4，免疫接種后35天的滴度)。
實驗實例的總結(jié)分別在組成性表達載體(pTREX1)中構(gòu)建共表達抗原多肽(破傷風毒素片段C-TTFC)和生物學活性多肽(白介素2，白介素6)的人工操縱子。從而使TTFC基因和白介素基因的轉(zhuǎn)錄受到先前已限定活性的乳桿菌啟動子元件的控制。制備構(gòu)建體，以便在翻譯從人工操縱子轉(zhuǎn)錄的mRNA后，可在細胞內(nèi)積聚TTFC抗原。分泌信號序列被可操縱地在接到白介素上。當給小鼠鼻內(nèi)施用這些細菌的制劑時，經(jīng)工程改造而表達白介素2或白介素6的細菌，要比只表達TTFC的構(gòu)建體引發(fā)約10倍以上的抗TTFC抗體。因此，這些白介素在實驗系統(tǒng)中具有明顯的佐劑活性。
乳酸乳球菌是非共生細菌(與乳桿菌的相關(guān)菌種不同，后者定居在鳥類的嗉囊內(nèi)并存在于許多哺乳動物的腸道中)，并且其營養(yǎng)也取決于在體內(nèi)不可能得到的氨基酸和肽的供應，所以證明乳酸乳球菌的表達細胞因子的菌株仍能提高抗體生成這一事實是令人驚奇的。這些結(jié)果首次證明可使用非侵染性的、非定居的細菌如乳酸乳球菌的重組菌株體內(nèi)合成并運送生物學活性分子。
表1該表中，用“TT/9”表示以1×109個細菌的劑量用表達TTFC的細菌進行接種，“TT/8”表示1×108個細菌的劑量等?！癟T IL-2/9”和“TT IL-6/9”表示以1×109個細菌的劑量，分別用表達TTFC和IL-2，以及TTFC和IL-6的細菌進行接種，“TT IL-2/8”表示以1×108個細菌的劑量，以下類推。圖中給出小鼠個體的ELISA滴度。
表1免疫反應數(shù)據(jù)-第35天三次鼻內(nèi)免疫接種后采血測得的終點滴度數(shù)據(jù)TT/9 TT/8 TT/7 TT/610000 50 50 5011000 60 50 5010000 50 50 759000 50 50 504500 50 50 70600 110 55 250均值7516.761.7 50.8 90.8標準差 4089.224.0 2.0 78.8TT IL-2/9 TT IL-2/8 TT IL-2/7 TT IL-2/614000 50505030000 5050150100000505050100000105 150 50120000508050100000100 5050均值77333.0 67.5 71.7 66.7標準差43848.0 27.2 40.2 40.8TT IL-6/9 TT IL-6/8 TT IL-6/7 TT IL-6/680000 200 5050170000 300 5050190000 200 100 50100000 10000 505050000 750 505080000 260 400 50均值111670.0 1951.7116.7 50.0標準差55648.03948.3140.2 0.0對照組pEX1/9 pEX1/8pEX1/7pEX1/6初始75 7555756075 5075556050 5575755555 5055505575 5575505060 55705060均值65.0 56.7 67.5 59.2 56.7標準差11.4 0.9 1.0 12.4 4.權(quán)利要求
1.運送一種或多種生物學活性多肽的方法，其包括給個體施用表達所說的一種或多種多肽的非侵染性或非病原性細菌。
2.運送一種或多種抗原的方法，其包括給個體施用表達所說的一種或多種抗原的非侵染性或非病原性細菌。
3.運送一種或多種抗原和/或一種或多種生物學活性多肽的方法，其包括給個體施用表達所說的一種或多種抗原和所說的一種或多種異源生物學活性多肽的非侵染性或非病原性細菌。
4.如權(quán)利要求1或3中限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽對細菌來說是異源的。
5.如權(quán)利要求4中限定的方法，其中至少一種異源多肽衍生于真核細胞或其病毒。
6.如權(quán)利要求4中限定的方法，其中至少一種異源多肽衍生于原核細胞或其病毒，或衍生于與細菌同源的病毒。
7.如權(quán)利要求1至6中任何一項限定的方法，其中細菌是革蘭氏陽性細菌。
8.如權(quán)利要求7中限定的方法，其中革蘭氏陽性細菌是無害李斯特氏菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、格氏鏈球菌、乳球菌菌種或乳桿菌菌種。
9.如權(quán)利要求8中限定的方法，其中革蘭氏陽性細菌是乳酸乳球菌。
10.如權(quán)利要求7中限定的方法，其中細菌是革蘭氏陽性病原性細菌的減毒菌株。
11.如權(quán)利要求10限定的方法，其中細菌是單核細胞增生李斯特氏菌。
12.如權(quán)利要5至11中任何一項限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是能夠在局部或全身發(fā)揮功能的多肽，如能夠發(fā)揮影響局部或全身代謝之內(nèi)分泌活性的多肽。
13.如權(quán)利要求5至11中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是能夠調(diào)節(jié)免疫造血系統(tǒng)細胞的活性的多肽。
14.如權(quán)利要求5至11中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是能夠影響體內(nèi)各種正常或贅生細胞之存活性、生長及分化的，或影響免疫調(diào)節(jié)或誘導對損傷和感染的急性期炎性反應的生物學活性多肽。
15.如權(quán)利要求5至11中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是能夠提高或誘導細胞和組織對作用于靶細胞受體的趨化因子介導的感染之抗性的，或促進上皮細胞增殖或促進傷口愈合的生物學活性多肽。
16.如權(quán)利要求5至11中任何一項限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞對物質(zhì)的表達或生產(chǎn)。
17.如權(quán)利要求12至16中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是胰島素、生長激素、催乳素、降鈣素、黃體生成素、甲狀旁腺激素、促生長素抑制素、甲狀腺刺激激素或血管活性腸肽。
18.如權(quán)利要求12到16中任何一項限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是采取反平行4α螺旋束結(jié)構(gòu)的1類結(jié)構(gòu)細胞因子，如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL或IFNα/β。
19.如權(quán)利要求12至16中任何一項限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是常常與細胞表面相關(guān)聯(lián)的，形成對稱性均三聚體的，并且亞單位采取某些病毒表殼蛋白的β膠輥構(gòu)象的2類結(jié)構(gòu)細胞因子，如TNF家族的細胞因子，例如TNFα、TNFβ、CD40、CD27或FAS配體，IL-1家族的細胞因子、成纖維細胞生長因子家族、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β及神經(jīng)生長因子。
20.如權(quán)利要求12至16中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是3類結(jié)構(gòu)的包括短鏈α/β分子的細胞因子，其作為在細胞外區(qū)域中各自至少含有一個EGF區(qū)的大的跨膜前體分子產(chǎn)生的，例如表皮生長因子家族的細胞因子，以其在保守的半胱氨酸周圍聚集的氨基酸序列為特征的趨化因子(C-C或C-X-C趨化因子亞類)或胰島素相關(guān)的細胞因子。
21.如權(quán)利要求12至16中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是呈現(xiàn)嵌合結(jié)構(gòu)的4類結(jié)構(gòu)細胞因子，例如由不同的區(qū)域，如EGF、免疫球蛋白樣和kringle區(qū)域組成的hereg-ulin或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
22.如權(quán)利要求12至16中任何一項所限定的方法，其中一種或多種生物學活性多肽是如權(quán)利要求10至19中任何一項所限定的生物學活性多肽的受體或拮抗劑。
23.調(diào)節(jié)細胞或組織的存活性、生長、分化、效應或功能或感染敏感性的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌。
24.加強抗腫瘤或定居于粘膜或相鄰或遠距離組織的感染的免疫反應的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項中限定的非侵染性或非病原性細菌。
25.調(diào)整抗病原感染因子的免疫反應類型(抗體或細胞介導的)的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌。
26.調(diào)整正常組織受炎性或腫瘤組織侵潤的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌。
27.控制腫瘤細胞生長速率、侵入速率或存活性的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌。
28.誘導腫瘤細胞編程性死亡的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌。
29.如權(quán)利要求23至28中任何一項所限定的方法，其進一步用根據(jù)權(quán)利要求12至22的一個或多個特征修飾。
30.下調(diào)免疫反應的方法，其包括給個體施用表達生物學活性多肽的非侵染性或非病原性細菌。
31.治療變應性自身免疫或其他免疫功能失調(diào)性疾病狀態(tài)的方法，其包括給個體施用表達生物學活性多肽的非侵染性或非病原性細菌。
32.如權(quán)利要求30或權(quán)利要求31中所限定的方法，其進一步用權(quán)利要求7至22的任何一個或多個特征修飾。
33.含有如權(quán)利要求1至11的任何一項中所限定的非侵染性或非病原性細菌，可加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑、佐劑、載體等的藥物配制品。
34.如權(quán)利要求33中限定的藥物配制品，其為疫苗配制品。
35.如權(quán)利要求33或權(quán)利要求34中限定的藥物配制品，其進一步用權(quán)利要求12至22的任何一個或多個特征修飾。
36.生產(chǎn)如權(quán)利要求33至35中任何一項所限定的藥物配制品的方法，其包括將如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的一種或多種非侵染性或非病原細菌與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體相混合的步驟。
37.包括一種或多種生物學活性多肽的一個或多個編碼序列，及一種或多種抗原的一個或多個編碼序列的核酸，其中各編碼序列都在適于非侵染性或非病原性細胞中表達的啟動子控制下。
38.如權(quán)利要求37中限定的核酸，其進一步用權(quán)利要求7至22的一個或多個特征修飾。
39.如權(quán)利要求37或權(quán)利要求38中限定的核酸，其包括一個或多個核酸構(gòu)建體，其中編碼一種或多種生物學活性多肽的核酸和/或編碼一種或多種抗原的核酸處于適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制下。
40.如權(quán)利要求39中所限定的核酸，其中適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列選自啟動子序列、終止子序列、增強子序列和標志基團。
41.如權(quán)利要求39或權(quán)利要求40中限定的核酸，其中一個或多個核酸構(gòu)建體包含能夠產(chǎn)生多順反子RNA轉(zhuǎn)錄物的人工操縱子。
42.如權(quán)利要求37至41中任何一項所限定的核酸，其中啟動子是適用于乳酸乳球菌的乳球菌啟動子。
43.如權(quán)利要求37至42中任何一項所限定的核酸，其進一步包含分泌信號序列，處于一種或多種生物學活性多肽之編碼序列的上游。
44.如權(quán)利要求43中所限定的核酸，其中分泌信號序列是淀粉液化芽孢桿菌的α淀粉酶分泌前導序列、葡萄球菌激酶的前導分泌序列、其他芽孢桿菌酶或S層蛋白質(zhì)的前導序列，或乳球菌蛋白質(zhì)Usp45的前導序列。
45.如權(quán)利要求37至44中任何一項所限定的核酸，其中抗原能夠引發(fā)保護性免疫反應。
46.如權(quán)利要求37至44中任何一項所限定的核酸，其中抗原是在一種或多種共表達的如權(quán)利要求12至22中任何一項所限定的生物學活性多肽存在下加速、放大或延長保護性免疫反應的抗原。
47.如權(quán)利要求37至46中任何一項所限定的核酸用于轉(zhuǎn)化非侵染性或非病原性細菌，如乳酸乳球菌。
48.產(chǎn)生如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的細菌的方法，其包括將如權(quán)利要求37至46中任何一項所限定的核酸導入非侵染性或非病原性細菌宿主細胞的步驟。
49.表達(i)一種或多種異源生物學活性多肽和(ii)一種或多種抗原的非侵染性或非病原性細菌。
50.如權(quán)利要求49中限定的非侵染性或非病原性細菌，其進一步用權(quán)利要求7至22的一個或多個特征修飾。
51.如權(quán)利要求49或權(quán)利要求50中限定的非侵染性或非病原性細菌，其包含如權(quán)利要求37至46中任何一項所限定的核酸。
52.如權(quán)利要求49至51中任何一項所限定的非侵染性或非病原性細菌用于藥物中。
53.如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的，或包含如權(quán)利要求37至46中任何一項所限定的核酸的非侵染性或非病原性細菌用于制造運送一種或多種生物學活性多肽和/或一種或多種抗原的制劑。
54.如權(quán)利要求53中限定的應用，其進一步用權(quán)利要求23至32的任何一個或多個特征修飾。
全文摘要
輸送生物學活性多肽和/或抗原的方法,以及輸送工具和含有這種輸送工具的藥物配制品。
文檔編號C12N1/21GK1202934SQ9619848
公開日1998年12月23日 申請日期1996年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月20日
發(fā)明者L·斯泰德勒, E·里茂特, J·M·威爾斯, R·W·F·勒·佩吉 申請人:劍橋大學技術(shù)服務有限公司