專利名稱：薄膜中的化學(xué)、生化和生物學(xué)加工的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及薄膜中的化學(xué)、生化或生物學(xué)加工。它依賴于使用諸如光陷捕捉器之類的裝置，相對(duì)于薄膜移動(dòng)粒子。
背景技術(shù)：
光陷捕捉器是一種裝置，在此粒子可以在強(qiáng)聚焦光束(諸如激光束等)焦點(diǎn)附近陷獲一個(gè)粒子。通過(guò)與光強(qiáng)度和較強(qiáng)強(qiáng)度方向中的點(diǎn)數(shù)成正比的軸向梯度力，將粒子保持在該捕捉器中。一般來(lái)說(shuō)，大小為大約10μm至小于大約10nm的粒子可以進(jìn)行單束光陷捕捉。
美國(guó)專利4,893,886和5,079,169(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述了用來(lái)在液態(tài)細(xì)胞或薄膜中平移陷獲粒子的光陷捕捉器。這可以通過(guò)在激光束中陷獲粒子，然后相對(duì)于激光束平移細(xì)胞(’886專利的第3欄第31-34行)或相對(duì)于細(xì)胞平移激光束(’886專利的第4欄第18-20行，’169專利的第2欄第35-40行)來(lái)完成?！?86專利描述了用光陷捕捉器來(lái)操縱諸如病毒、酵母、細(xì)菌大腸桿菌、血細(xì)胞和細(xì)胞部分之類的生物學(xué)粒子(第4欄第45-49行)。’169專利描述了使用光陷捕捉器來(lái)操縱包括核酸片斷在內(nèi)的“聚合物單絲”(第1欄第1-10行)。
Buican等，1989，SPIE血細(xì)胞計(jì)數(shù)的新技術(shù)，1063190-197；Tashiro等，1993，光學(xué)工程32(11)2812-2817(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述了采用多激光束的光陷捕捉器。
這類采用這種技術(shù)的光陷捕捉器系統(tǒng)的市售實(shí)例包括CellRobotics，Inc.(Albuquerque，New Mexico)的Laser TweezerTM2000、德國(guó)S+L GmbH(Heidelberg)的小型質(zhì)子鑷子(Compact Photoic Tweezer)和德國(guó).P.A.L.M.GmbH(Wolfratshausen)的PALM激光顯微鏡系統(tǒng)。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)推薦實(shí)施方案中，光陷捕捉器用來(lái)將粒子平移通過(guò)光學(xué)平坦的表面上的薄膜涂層。該薄膜涂層最好是不均勻的，光陷捕捉器用來(lái)將粒子移動(dòng)通過(guò)薄膜涂層連續(xù)的不同區(qū)域，在該薄膜涂層上進(jìn)行化學(xué)、生化和/或生物學(xué)加工。按照本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)、生化和/或生物加工包括寡核苷酸的合成和測(cè)序、多肽的合成和測(cè)序、糖類的合成和測(cè)序、組合文庫(kù)的合成和篩選、常規(guī)(即Sanger或Maxam-Gilbert)DNA測(cè)序或單分子DNA測(cè)序。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)粒子移動(dòng)通過(guò)薄膜涂層時(shí)，留下反應(yīng)產(chǎn)物。最好，這些產(chǎn)物可以用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行鑒別。
附圖簡(jiǎn)述從以下本發(fā)明推薦實(shí)施方案的詳細(xì)描述，會(huì)更容易地看出本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1為常規(guī)光陷捕捉器的示意圖；圖2A-2H為用于實(shí)施本發(fā)明的光陷捕捉器的說(shuō)明性結(jié)構(gòu)的示意圖；圖3A-3C為用于實(shí)施本發(fā)明的薄膜涂層和試劑位置的示意圖；圖4A-4E為本發(fā)明推薦實(shí)施方案的示意圖；圖5為用于實(shí)施本發(fā)明的推薦熒光系統(tǒng)的示意圖。
本發(fā)明推薦實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明圖1由’169專利復(fù)制，描述了用于實(shí)施本發(fā)明類型的常規(guī)光陷捕捉器10。捕捉器包括一個(gè)修正熒光顯微鏡12，后者包括一個(gè)含有液態(tài)細(xì)胞的、進(jìn)行粒子操作的室14。該室固定于常規(guī)顯微鏡臺(tái)16上，后者可以在與顯微鏡軸垂直的平面中沿兩個(gè)直角方向移動(dòng)以及沿光學(xué)軸移動(dòng)。
由激光器22，通過(guò)一個(gè)高度會(huì)聚物鏡48在室14中聚焦的激光束形成光陷捕捉器。作為說(shuō)明，激光器為氬離子激光器、二極管激光器或NdYAC激光器。透鏡48的數(shù)值孔徑通常大于0.8，最好大于大約1.2或1.2以上。透鏡48最好為浸液型，透鏡48和室14覆蓋物之間的油滴大約與透鏡和覆蓋物的折射率匹配，以便減小表面上的光損失。
室14中光陷捕捉器的位置可以通過(guò)沿X或Y方向移動(dòng)平臺(tái)24來(lái)移動(dòng)。另一方法是，臺(tái)16可以相對(duì)于光陷捕捉器移動(dòng)。
圖1的儀器還包括一個(gè)象亮化視頻照相機(jī)60或其它電光成象裝置、諸如氬激光器或汞燈之類的熒光光源62和可見(jiàn)光光源66。
‘169專利中提出涉及該光陷捕捉器的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。’886專利的圖1中說(shuō)明了相似的這種捕捉器。
圖2A-2H中提出了可以用于實(shí)施本發(fā)明的幾種光陷捕捉器的幾何學(xué)。圖2A-2E中的每個(gè)圖都描述了一個(gè)物鏡130、一個(gè)光束132、一個(gè)基片134、一個(gè)液態(tài)薄膜136和陷獲粒子138。在圖2A和圖2B中，光束132由物鏡130通過(guò)基片134導(dǎo)向陷獲粒子138的薄膜。在這些圖中，匹配折射率的浸油140減少在其它情況下在物鏡和空氣之間的界面以及空氣和基片之間的界面上產(chǎn)生的光損失。圖2A描述了將薄膜涂在基片底面的情況，而圖2B描述了將薄膜涂在基片頂面的情況。正如明顯看出的，在圖2A和圖2B中，基片必須對(duì)光束透明。
在圖2C和圖2D中，光束由薄膜外表面入射到薄膜上。在這種情況下，不使用浸油，基片也無(wú)需對(duì)光束透明。然而，為了讓使用光陷捕捉器(諸如’169專利和’886專利的光陷捕捉器)的觀察者觀測(cè)薄膜，基片應(yīng)該對(duì)可見(jiàn)光透明。
圖2E與圖2A相似，但描述將薄膜加在兩個(gè)基片134、144中間的情況。
也可以采用多束光陷捕捉器實(shí)施本發(fā)明。三個(gè)這類的幾何學(xué)示于圖2F、2G和2H中。這些圖中的每個(gè)都描述了一個(gè)第一物鏡150、一個(gè)第一光束152、一個(gè)基片154、一個(gè)液態(tài)薄膜156、一個(gè)陷獲粒子158、一個(gè)第二物鏡160和一個(gè)第二光束162。這些元件中的每個(gè)都與圖2A-2E中的相應(yīng)元件相似。圖2F描述了將薄膜涂在基片底面的情況，而圖2G描述將薄膜涂在基片頂面的情況。圖2H描述了將薄膜加在兩個(gè)基片154和164之間的情況。在物鏡由薄膜起在基片另一面的情況下，可以可選地使用匹配折射率的浸油目標(biāo)。
基片最好很薄(例如標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡蓋玻片的通常厚度范圍130-250μm)并且是光學(xué)平坦的，以便允許使用高數(shù)值孔徑的物鏡，以形成光陷捕捉器。對(duì)于物鏡由薄膜起在基片對(duì)面的情況，該基片必須在陷獲波長(zhǎng)(例如在1064nm的紅外下)高度透明。對(duì)于熒光應(yīng)用，基片應(yīng)該或者在激發(fā)陷獲粒子中熒光的光波長(zhǎng)下、激發(fā)熒光的波長(zhǎng)下、或者在這兩個(gè)波長(zhǎng)下是透明的?；矐?yīng)該或者在主體(例如色心)或者在表面(即熒光沾染物質(zhì))上無(wú)熒光背景。推薦的材料是例如顯微鏡蓋玻片形式或變薄的HOYA T-4040石英晶片形式(Hoya Electronics Corporation，Woodcliff Lake，New Jersey)的石英玻璃或石英。
在實(shí)施本發(fā)明中，根據(jù)在薄膜中進(jìn)行化學(xué)、生化或生物學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，表面涂層可以或者為含水液態(tài)膜，或者為有機(jī)液態(tài)膜。酶促反應(yīng)通常在與酶相容的緩沖的含水薄膜中進(jìn)行，而諸如寡核苷酸合成之類的有機(jī)合成反應(yīng)在無(wú)水有機(jī)薄膜中進(jìn)行。薄膜的厚度通常大約與粒子的直徑相同，這通過(guò)光陷捕捉器來(lái)操作。該薄膜必須足夠厚，以允許粒子沿位于固態(tài)基片之下的表面轉(zhuǎn)移。液態(tài)膜可以加在兩個(gè)基片之間，或可以作為表面薄膜涂在單一的基片上，產(chǎn)生薄膜的游離界面。在后一種情況下，涂薄膜的基片可以形成能夠控制相對(duì)濕度或薄膜形成材料蒸汽壓“潮濕室”的一面，以便防止薄膜不需要的蒸發(fā)和控制薄膜厚度。形成捕捉器的光束可以由薄膜的游離面表面或由基片面入射到薄膜上。
可以單獨(dú)或組合利用幾種不同的方法，以在基片上產(chǎn)生不均勻的液態(tài)表面薄膜。在一個(gè)實(shí)施例中，光學(xué)上平坦的基片用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法(包括旋涂、手術(shù)刀或簡(jiǎn)單的潤(rùn)濕)中的任何一種涂上薄膜。然后用微量移液管，或者手工或者自動(dòng)將各種試劑加入預(yù)先涂上的薄膜中，在本領(lǐng)域中很好地建立了包括能夠輸送亞微升體積(諸如用于單細(xì)胞微注射的體積)的那些方法，或基于噴墨印刷技術(shù)的各種方法?；蛘撸ㄟ^(guò)將細(xì)針頭浸入試劑溶液中，然后將潤(rùn)濕溶液的針尖與薄膜接觸，將試劑轉(zhuǎn)移到薄膜上。根據(jù)沉積方法和試劑所需的特殊要求，試劑體積通常為顯微鏡下的大小，但可以覆蓋大至1mm2或更大的面積。各種試劑可以包含在溶劑試劑溶液中，以減小它們?cè)诒∧ぶ姓归_(kāi)。這類試劑包括粘度增加劑(諸如甘油或聚合物)或控制試劑在薄膜中溶混性或分配系數(shù)。不同的試劑例如作為小滴沉積在具有足夠空間分離和/或暫時(shí)分離的薄膜中，以便在完成必須反應(yīng)步驟所需的時(shí)間框期間防止不良的展開(kāi)和/或試劑的混合。
關(guān)于這里所用的薄膜上含試劑的“小滴”，由于盡管可以達(dá)到給定試劑濃度的可選實(shí)施方案不是唯一的方法，但很明顯小停留在薄膜上，因此該“小滴”應(yīng)該相信可與“給定試劑濃度”互換。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，諸如圖1的光陷捕捉器之類的光陷捕捉器用來(lái)陷獲不均勻液態(tài)薄膜涂層的一個(gè)區(qū)域中的粒子，將粒子移過(guò)液態(tài)薄膜涂層的連續(xù)不同區(qū)域，在此進(jìn)行化學(xué)、生化和/或生物加工。例如，參考液態(tài)薄膜涂層100的頂視3A，一系列小滴112、114、116、118可以沉積在薄膜涂層100中。每個(gè)小滴含有一個(gè)不同的化學(xué)試劑或生化試劑或不同的生物學(xué)試劑。使用光陷捕捉器，可以選擇小滴112中的粒子，然后將其連續(xù)通過(guò)薄膜涂層100移至小滴114、小滴116和小滴18，如箭頭120所示。在每個(gè)連續(xù)的小滴中，進(jìn)行一些化學(xué)、生化或生物加工，以便在小滴118中產(chǎn)生所需產(chǎn)物。
在固態(tài)基片中可以形成諸如勢(shì)阱102、104之類的不同特征，以便于試劑小滴的放置和分離，如圖3B和3C的側(cè)面圖中所描述的?？梢杂酶鞣N方法，包括平版印刷和蝕刻、沖壓或模塑或微機(jī)制，在基片中形成這類特征。這一預(yù)定型基片可以涂上上述薄膜，然后通過(guò)薄膜涂層、負(fù)載適當(dāng)試劑的各種樣品阱、微槽或微室或試劑室可以首先加樣，然后應(yīng)用薄膜涂層。試劑可以包括各種試劑，以增加它們的密度，使其高于薄膜涂層的試劑密度，使得試劑沉淀到基片中的凹處并轉(zhuǎn)移薄膜。這與電泳凝膠的槽通常加樣的方式相似。指示染料通常加入這類試劑中，以便更容易地目測(cè)加樣過(guò)程。這類染料如果使用，必須明顯與試劑和在試劑位置中發(fā)生的加工步驟相容。粒子可以用光陷捕捉器垂直移動(dòng)，將它引入試劑池，然后垂直取出，通過(guò)薄膜水平運(yùn)輸?shù)较噜彽脑噭┪恢?。如果要通過(guò)諸如圖3B的阱102或圖3C的阱104之類的含有預(yù)定型特征的基片進(jìn)行光陷捕捉，那些特征必須以這樣的方式設(shè)計(jì)和形成，使得它們不干擾陷獲束。例如要避免表面特征中突然的垂直變化。如果要從薄膜側(cè)面進(jìn)行光陷捕捉，那么這類約束是不大重要的，如圖3C所述。
有效地產(chǎn)生不均勻液態(tài)薄膜和/或不均勻基片表面化學(xué)的另一方法包括分子的自我裝配和納化學(xué)(nanochemistry)(1992)，Abbot等，Science 2571539；(1991)，Whitesides等，Science 2541312(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
在另一具體實(shí)施方案中，使用一個(gè)薄膜卷筒，它由一個(gè)上蓋板和一個(gè)下蓋板(例如由用于顯微鏡的高度平坦的玻璃或石英玻璃制成)組成，具有在兩個(gè)板之間含有的體積分配到大量反應(yīng)區(qū)的沉積線和結(jié)構(gòu)(由電鍍金或另一金屬、或象旋涂光刻膠一樣的聚合材料制成)。這些區(qū)域由用來(lái)限制任一區(qū)域的主體材料不擴(kuò)散另一區(qū)域的到小槽相連。
本發(fā)明在許多常規(guī)化學(xué)、生物和生化操作中是有用的，提供一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，以按比例將反應(yīng)縮小到亞微升水平，而沒(méi)有能夠以該水平操作的管道系統(tǒng)的困難和復(fù)雜性。
例如，寡核苷酸合成用來(lái)合成用作雜交探針和DNA測(cè)序引物的短的單鏈DNA分子。目前的方法由于合成規(guī)模的限制，通常產(chǎn)生大量過(guò)量的產(chǎn)物。諸如直接的DNA測(cè)序之類的應(yīng)用，目前受這類合成成本的限制。在本發(fā)明中，寡核苷酸合成可以在單一的市售珠粒粒子上進(jìn)行，該珠粒與所需順序的第一個(gè)核苷酸連接。連續(xù)核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)磷酰胺化物化學(xué)的連接可以容易地在該薄膜版本進(jìn)行。
具體地說(shuō)，一系列的小滴沉積在薄膜上，一個(gè)小滴含有粘附所需順序的第一個(gè)反應(yīng)核苷酸的珠粒，而其它小滴每個(gè)含有大量相同反應(yīng)性核苷酸，每個(gè)含有一種不同核苷酸。連接試劑、去封閉試劑、封端試劑或洗滌劑可以位于不同的小滴中。然后用光陷捕捉器從含有珠粒的小滴中選擇一個(gè)珠粒。將陷獲珠粒相對(duì)于薄膜移動(dòng)，然后將陷獲珠粒通過(guò)薄膜，移至一個(gè)小滴，后者含有下一個(gè)待連接到已粘附于珠粒的核苷酸上的核苷酸。該過(guò)程重復(fù)另外幾次，總是按照所需裝配核苷酸順序的順序，將陷獲珠粒和粘附的核苷酸移至下一個(gè)小滴。
合成完成時(shí)，寡核苷酸可以從其珠粒上切下，直接連接到也在一個(gè)珠粒上進(jìn)行的Sanger DNA測(cè)序法固相形式的薄膜型式中。然后將最終的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物釋放到毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(微制到相同的基片中)的樣品室。這一方法也可以應(yīng)用于編碼的組合文庫(kù)(Brenner & Lerner，ProcNatl.Acad.Sci.USA 895381-5383(1992)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)的寡核苷酸標(biāo)記的測(cè)序中。
同樣地，可以使用于多肽的Edmann測(cè)序化學(xué)適應(yīng)直接由一個(gè)珠粒測(cè)序的編碼格式。這類方法對(duì)于進(jìn)一步減小多許多天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)測(cè)序特別重要，對(duì)來(lái)自組合文庫(kù)的多肽標(biāo)記測(cè)序(Lam等，Nature 35482-84(1991)；Lam等，Bioorganic*Medicinal Chemistry Letters 3(3)419-424(1993)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)也是特別重要的。
多肽(Furka等，Int.J.Peptoids(Simon等，Proc Natl.Acad.Sci.USA899367-9371(1992)，Bartlett等，WO 91/19735)、大分子(Schrober等，BioTechniques 18(4)652-660(1995))和其它組合文庫(kù)(例如Ellman，美國(guó)專利5,288,514；Bunin和Ellman，J.Am.Chem.Soc.114L 10997-1-998(1992))的合成也可以適應(yīng)本發(fā)明的薄膜格式，所有文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。可以在固相支持體(通常為一個(gè)珠粒)上進(jìn)行的任何化學(xué)合成或生化合成或測(cè)序反應(yīng)都可以按比例縮小，以采用本發(fā)明在一個(gè)珠粒水平上進(jìn)行操作。
在反應(yīng)產(chǎn)物必須監(jiān)測(cè)(例如測(cè)定結(jié)合常數(shù))的那些情況下，Rigler的熒光相關(guān)分光鏡法可以用來(lái)分析薄膜中的亞微升樣品的含量(Eigen和Eigen和Rigler，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915740-5747，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
本發(fā)明也可用于生物學(xué)操作中，該操作包括涉及從帶動(dòng)不需要的物質(zhì)中分離所需物質(zhì)的步驟。作為說(shuō)明，這類生物學(xué)操作的實(shí)例是單克隆抗體的生產(chǎn)、噬菌體顯示多肽文庫(kù)的篩選和核酸的克隆。
對(duì)于單克隆抗體的生產(chǎn)，本發(fā)明可以容易地改造，以用來(lái)從產(chǎn)生不需要的單克隆抗體或不產(chǎn)生單克隆抗體的大量細(xì)胞背景中篩選產(chǎn)生所需單克隆抗體的單一細(xì)胞。單克隆抗體的產(chǎn)生涉及抗原的篩選，該抗原需要具有能夠與該抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體。這一抗原可能是一個(gè)蛋白質(zhì)、核酸、多糖或需要具有特異性地結(jié)合該物質(zhì)的單克隆抗體的任何其它物質(zhì)。在方便面的一個(gè)特別實(shí)施方案中，該抗原連接到在光陷捕捉器中適用于陷獲的一個(gè)粒子上。這一粒子可能是例如一個(gè)膠乳珠粒。
將本發(fā)明應(yīng)用于單克隆抗體的生產(chǎn)時(shí)，第一小滴112含有一種或多種連接適當(dāng)粒子的抗原。然后在光陷捕捉器中的光束中陷獲其中一個(gè)這些連接粒子的抗原，將其通過(guò)薄膜110移至第二小滴114。第二小滴114含有多種產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，其中一些細(xì)胞產(chǎn)生與該抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體。這類單克隆抗體可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生。參見(jiàn)例如Kohler和Milsteinm Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96頁(yè)(Alan R.Liss，Inc.1985)。
在第二小滴114中選擇條件，使得連接粒子的抗原與含有單克隆抗體(與連接到粒子的抗原特異性結(jié)合)的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞連接。然后用光陷捕捉器將連接粒子的抗原與結(jié)合的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞一起，通過(guò)薄膜110移至下一個(gè)小滴116，由此從不需要的細(xì)胞背景中分離所需的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞。然后從小滴116收集所需的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，將其置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，以將細(xì)胞復(fù)制成產(chǎn)生所需單克隆抗體的細(xì)胞系。
以相似的方法，可以用本發(fā)明來(lái)篩選噬菌體顯示多肽文庫(kù)，以便從表達(dá)不需要多肽的大量噬菌體背景中選擇顯示所需多肽的一個(gè)噬菌體、需要用于獲得與該配體結(jié)合的多肽一個(gè)配體蘭到一個(gè)粒子上。以第一小滴112的形式將一種或多種連接粒子的配體加到薄膜110上。用光陷捕捉器陷獲光束中的一個(gè)連接粒子的配體，將其通過(guò)薄膜110移至第二小滴14。第二小滴114含有一等份的噬菌體顯示多肽文庫(kù)。該文庫(kù)可以由多種眾所周知方法中的任一種制備。參見(jiàn)例如Smith，Science 2281315-1317(1985)；De la Cruz等，J.Biol.Chem.2634318-4322(1988)；Parmley和Smith，Gene 73305-318(1988)；Parmley和Smith，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218(1989)；Scott就Smith，Science 249386-390(1990)。
如果該等份噬菌體顯示多肽文庫(kù)含有的一個(gè)顯示出能夠特異性與配體結(jié)合的多肽，那么該噬菌體將與連接粒子的配體結(jié)合，與連接粒子的配體一起被攜帶。然后用光陷捕捉器將連接粒子的配體通過(guò)薄膜110移至下一個(gè)小滴116。從小滴116中，可以回收所需的噬菌體并讓其生長(zhǎng)在適當(dāng)?shù)募?xì)菌宿主中，用于分析和/或所需多肽的分離。
本發(fā)明也可以用來(lái)從收集的核酸片斷(諸如基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)等)純化所需的核酸片斷。例如當(dāng)制備基因組文庫(kù)時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)通常涉及以下步驟分離生物體總DNA，然后用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割該DNA。隨后的步驟允許由不需要的DNA片斷背景中識(shí)別和分離所需的DNA片斷。這里所述的光陷捕捉器可以用來(lái)簡(jiǎn)化或消除這些隨后的步驟。
關(guān)于常規(guī)操作，一個(gè)探針(特異性地與所需核酸片斷結(jié)合的核酸片斷)是必須的。將該探針連接到一個(gè)適用于在光陷捕捉器中陷獲的粒子上。然后將一個(gè)或多個(gè)連接粒子的探針加到薄膜110的第一小滴112中。然后用光陷捕捉器在光束中選擇其中一個(gè)連接粒子的探針，將該連接粒子的探針通過(guò)薄膜110移至第二小滴114中。第二小滴114含有一種降解生物體DNA的限制性內(nèi)切酶。選擇第二小滴114的條件，使得如果該探針能夠特異性地結(jié)合生物體DNA任一片斷，那么那么該探針與該片斷結(jié)合，由此形成連接粒子的探針和所需DNA片斷的復(fù)合物。然后用光陷捕捉器將該復(fù)合物通過(guò)薄膜110移至另一小滴116，在此，它可以按照所述方法進(jìn)行收集和操作。
本發(fā)明的一個(gè)推薦應(yīng)用是基于1次一個(gè)分子DNA測(cè)序。用一個(gè)光陷捕捉器，由含有大量這類珠粒和粘附鏈的薄膜涂層中的小滴選擇一個(gè)這種珠粒和粘附的DNA分子。通過(guò)相對(duì)于薄膜涂層移動(dòng)光陷捕捉器，然后將選擇的珠粒通過(guò)薄膜移至含有加工性核酸外切酶的小滴，在此一個(gè)核酸外切酶結(jié)合到該DNA分子的游離端。然后光陷捕捉器將珠粒、DNA分子和核酸外切酶移至薄膜涂層的一部分上，在此核酸外切酶被激活。結(jié)果，核酸外切酶開(kāi)始從DNA分子上，一次一個(gè)地切割一個(gè)核苷酸。然后光陷捕捉器將珠粒、分子和核酸外切酶拖過(guò)薄膜，同時(shí)核酸外切酶從DNA分子上切割一個(gè)核苷酸，將它們留在DNA分子移動(dòng)限定的途徑中。該DNA分子可以是單鏈或是雙鏈。
然后適當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng)再跟蹤DNA的途徑，以檢測(cè)和識(shí)別適當(dāng)順序中的核苷酸。這種系統(tǒng)的例證是一種脈沖激光器(它重復(fù)刺激單個(gè)核苷酸的熒光)和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(它檢測(cè)不同時(shí)間-分辯的與不同核苷酸有關(guān)的熒光光譜。
在圖4A-4E中更詳細(xì)地說(shuō)明了該應(yīng)用。為了說(shuō)明，小滴210和212大小上進(jìn)行了圖示發(fā)達(dá)放大，其厚度通常與薄膜厚度相似。
對(duì)于或者激發(fā)單一核苷酸的熒光和/或檢測(cè)單一核苷酸發(fā)射的熒光的那些單一核苷酸的識(shí)別方案，基片必須在分別用于天然核苷酸激發(fā)和/或檢測(cè)的UV(240-300nm)下和/或接近UV(300-450nm)下是透明的。對(duì)于該方法使用一種或多種熒光核苷酸類似物和/染料標(biāo)記的核苷酸的變化而言，該基片必須在相應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)區(qū)域是高度透明的。
為了將一個(gè)DNA分子平移穿過(guò)基片表面，必須在基片表面上提供最小厚度的含有薄膜。由于粘附到DNA的珠粒直徑可以為0.2-1.0μm，可比較厚度的薄膜是適當(dāng)?shù)?。液態(tài)膜可以簡(jiǎn)單至一個(gè)純的適用于核酸外切酶的含水緩沖液，或可以包括與核酸外切酶相容的各種試劑，以增加薄膜的粘度(例如甘油)。該薄膜也可以在包括聚合物或預(yù)聚物，或者游離在溶液中，或者共價(jià)連接到基片上(Hjerten，J.Chromatography 347191-198(1985)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。這類薄膜較高的粘度會(huì)降低適當(dāng)?shù)膯我缓塑账岬臄U(kuò)散(Pratt和Keller，J.Phys.chem 9710254-10255(1993)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。為了防止單一核苷酸presentaion期間表面薄膜蒸發(fā)，可以將薄膜按圖2E或2H夾在適當(dāng)分離的兩個(gè)基片之間。這可以防止將近場(chǎng)光學(xué)使用單一核苷酸的檢測(cè)，但可以與遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)相容。另一方法是，該薄膜可以具有一個(gè)游離表面，在此控制與薄膜接觸的氣相的相對(duì)濕度，以便防止蒸發(fā)和冷凝。這類具有游離表面的薄膜可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法(諸如旋涂)涂在基片上(Betzig和Chichester，Science 2621422-1425(1993)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
單一的大DNA分子用我的共同未決的美國(guó)專利08/376,761；Perkins等，Science 264819-822(1994a)，Science 264822-825(1994b)，Science 26883-87(1995)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)或中描述的各種方法本領(lǐng)域已知的方法，連接到珠粒上。
導(dǎo)入粘附到珠粒的DNA樣品的最簡(jiǎn)單的方法是使用倒顯微鏡構(gòu)型，其物鏡用于透明基片下面的陷捕捉器，該薄膜在基片上表面上，如圖2B所示。如圖4A所示，含有連接到珠粒222的DNA220的微升或亞微升小滴210沉積到基片234上的薄膜上。從物鏡230在光束232中目測(cè)選擇一個(gè)用于陷獲的珠粒+DNA分子238。如圖4B所示，然后將該單一的珠粒+DNA分子平移出該小滴，對(duì)底物和物鏡進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)而通過(guò)薄膜。其它未選擇的珠粒和DNA保持在該小滴位置上。相似的方法可以改變用于圖3A-3H的其它幾何學(xué)。
如圖4B所示，將一個(gè)含有適當(dāng)濃度核酸外切酶224的第二微升或亞微升小滴212立刻置于薄膜上，與含有珠粒和DNA的小滴210相鄰。如圖4C所示，將選擇的單一珠粒+DNA復(fù)合物通過(guò)該第二小滴平移，讓加工性核酸外切酶單一分子224與DNA的游離端結(jié)合。如圖4D所示，然后將該珠粒+DNA+核酸外切酶復(fù)合物通過(guò)薄膜，平移穿過(guò)表面，在此進(jìn)行核酸外切酶酶切。如圖4E所示，當(dāng)珠粒-DNA-核酸外切酶移過(guò)薄膜時(shí)，這產(chǎn)生留在薄膜236中的核苷酸270的順序。
需要小滴的高度不大于薄膜的高度。例如，在移過(guò)實(shí)施方案中，小滴的該度等于波美度高度。
單一珠粒+DNA+核酸外切酶復(fù)合物可以按不攪亂單個(gè)切割的核苷酸痕跡的任何方式，通過(guò)薄膜移穿過(guò)基片表面。例如，該途徑可以在圓片形狀的基片表面上限定一個(gè)與留聲機(jī)的溝槽圖案相似同心螺旋或與我的’761申請(qǐng)的圖13中描述的光柵掃描相似的往返圖案。最簡(jiǎn)單的是，該復(fù)合物可以單向平移通過(guò)薄膜，限定一個(gè)簡(jiǎn)單的線性路徑。關(guān)于含有聚合物的那些薄膜，單個(gè)DNA復(fù)合物reptate通過(guò)聚合物基質(zhì)(即DNA分子的核酸外切酶結(jié)合端將嚴(yán)格按照DNA珠粒結(jié)合端的運(yùn)動(dòng)限定的路徑)Perkins等，1994a supra。
需要最大限度地減小單個(gè)切割的核苷酸通過(guò)該表面的二維擴(kuò)散，以便提供可能隔開(kāi)切割的核苷酸的小室，而不攪亂核苷酸適當(dāng)連續(xù)的順序(Pratt和Keller，supra)。多種方法可以用來(lái)減小擴(kuò)散。其中一個(gè)最簡(jiǎn)單的方法是增加上面概述的液態(tài)表面膜的粘度和通過(guò)調(diào)節(jié)核酸外切酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(即改變溫度)和單個(gè)DNA分子平移通過(guò)該薄膜的速率，控制適當(dāng)單個(gè)核苷酸的間隔。此外，可以在薄膜表面上，通過(guò)用光致攪亂聚合物、但不光致漂白適當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核苷酸的第二聚焦激光束，按照路徑將聚合物膜到DNA后含有單個(gè)核苷酸的痕跡中。適當(dāng)?shù)倪x擇聚合物，如果將攪亂時(shí)間調(diào)至足夠長(zhǎng)，以允許延伸的DNA通過(guò)第一個(gè)，可以用紅外陷獲束進(jìn)行光致交聯(lián)。也可以將基片表面化學(xué)改性，以便提供非常高的結(jié)合單磷酸核苷酸的能力，例如通過(guò)與帶負(fù)電荷的磷酸根的靜電作用(Matheja和Degens，“磷酸鹽的結(jié)果分子生物學(xué)”，F(xiàn)orschritte Der Evolutionsforxchung，Band V，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1971，第180頁(yè)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)?？梢允褂猛ǔＳ脕?lái)結(jié)合核苷酸單磷酸的陰離子交換劑。另一方法是，可以將特異性與不同核苷酸單磷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)或有機(jī)和無(wú)機(jī)絡(luò)合劑(Kyogoku，Lord和Rich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57250-257(1967)；Kyogoku，Lord和Rich，Nature 21869-72(1968)；Kim和Rich，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 60402-408(1968)；Terron和Moreno，Inorganica Chimica Acta 56L57-L59(1981)，這些通過(guò)引用結(jié)合到本文中)結(jié)合到基片表面，作為適當(dāng)?shù)膯魏塑账岬挠行У南莴@器?？梢岳没献晕已b配的單層來(lái)提供這種核苷酸結(jié)合能力。這類自我裝配單層的定向性質(zhì)也將用來(lái)使結(jié)合的核苷酸定向，以便于探測(cè)。
通過(guò)將基片冷卻至低溫溫度(大約77°K)，以便由陷獲分離的單個(gè)核苷酸的薄膜形成一個(gè)剛性的嗪水性玻璃基質(zhì)，進(jìn)一步降低釋放的單個(gè)核苷酸的擴(kuò)散。在我的共同未決’761申請(qǐng)中發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的相接。低溫和高度內(nèi)聚的基質(zhì)還用來(lái)大大增強(qiáng)核苷酸熒光的光致穩(wěn)定性和量子場(chǎng)，以便于它們隨后的探測(cè)和鑒別。冷卻薄膜的儀器包括與Grober等，Rev.Sci.Instrum.65626-631(1994)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)的儀器相似的設(shè)計(jì)或諸如CF2102型顯微鏡低溫恒溫器(Oxford Instruments，Concord，Massachustts)的市售儀器。在圖4E中，用低溫恒溫器280將薄膜冷卻至低溫溫度。
如果各個(gè)切割的核苷酸足夠分離，那么正如我的共同未決’761申請(qǐng)中以及最近在Tellinghuisen等，Anal.Chem.66(1)64-72(1994)和Nie等，Science 2661018-1021(1994)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)詳細(xì)描述的，用常規(guī)衍射限光學(xué)在該表面可探測(cè)到它們。如果可以將核苷固定化酸，以便防止攪亂它們甚至以較接近的間隔的適當(dāng)連續(xù)順序，那么可以使用近場(chǎng)掃描陷獲顯微鏡。然而在后一種情況下，核苷酸必須定位在薄膜表面上，使得掃描探頭尖端可以達(dá)到大約3倍探頭孔徑的直徑內(nèi)。這可能需要薄膜的某些部分或全部蒸發(fā)或升華。較大的距離應(yīng)用遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)條件。表面上使用近場(chǎng)光學(xué)的單分子熒光光譜學(xué)的最近實(shí)例包括Betzig和Chichester，supra；Ambrose等，Phys.Rev.Lett.72(1)160-163 (1994a)；Trautman等，Nature 36940-42(1994)；Xie和Dunn，Science 265361-364 (1994)；以及Ambrose等，Science 265364-367(1994b)(這些通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
在圖4E中描述的熒光光譜學(xué)系統(tǒng)包括激光器系統(tǒng)300、探測(cè)器350和計(jì)算機(jī)400。在圖5中提出該系統(tǒng)進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，該圖取自我的’761申請(qǐng)的圖9。簡(jiǎn)單地講，該系統(tǒng)是一個(gè)時(shí)間分辨單質(zhì)子計(jì)數(shù)系統(tǒng)，其中激光束305反復(fù)地激發(fā)每個(gè)核苷酸270產(chǎn)生熒光，而探測(cè)器350測(cè)定單熒光質(zhì)子在每個(gè)激光脈沖后的到達(dá)時(shí)間的延遲。通過(guò)這一步對(duì)每個(gè)待探測(cè)核苷酸進(jìn)行多次，可以累積單熒光質(zhì)子事件的大量統(tǒng)計(jì)學(xué)樣品，由此可以測(cè)定每個(gè)核苷酸的熒光半衰期。然后由計(jì)算機(jī)400將該半衰期的測(cè)量值與預(yù)先測(cè)定的已知核苷酸的半衰期進(jìn)行比較，以定位最佳匹配，并由此識(shí)別該核苷酸。
激光束305由相干輻射源(最好為鎖模激光器310)產(chǎn)生。在一個(gè)推薦實(shí)施方案中，激光器310包括一個(gè)氬離子抽運(yùn)的鎖模Ti藍(lán)寶石激光器，將其輸出增至三倍，以提供240-300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以81.5MHz的鎖模速率提供可調(diào)飛秒脈沖或微微秒脈沖。適當(dāng)?shù)臍彐i模Ti藍(lán)寶石激光器為分別由Spectra-Physics的市售2080-15型和3960型。適用于由Ti藍(lán)寶石激光器產(chǎn)生第二諧波輸出和第三諧波輸出的裝置為可得自INRAD(Northvale，New Jersey)的5-050型頻率三倍頻器。
在將熒光核苷酸類似物、染料標(biāo)記核苷酸或坦然核苷酸、熒光核苷酸類似物和/或染料標(biāo)記核苷酸的各種組合物加入待測(cè)序DNA的本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明顯看出，激光激發(fā)源需要由supra所述分激發(fā)源進(jìn)行修改以提供所用的各種類型核苷酸的最適激發(fā)波長(zhǎng)。與天然核苷酸不同，熒光核苷酸類似物和染料標(biāo)記核苷酸通常在UV附近或可見(jiàn)光范圍內(nèi)具有激發(fā)最大值。一般來(lái)說(shuō)，這類波長(zhǎng)比較深的UV更容易用可利用的激光技術(shù)產(chǎn)生。在最復(fù)雜的情況下，可能需要四個(gè)離散激光源來(lái)提供四個(gè)不同類型核苷酸的最適激發(fā)。
通過(guò)在探測(cè)器350中使用高速掃描攝影機(jī)，記錄每個(gè)單獨(dú)的核苷酸的全時(shí)間分辯發(fā)射光譜。這種布置提供熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間和波長(zhǎng)的3-D恒值線。在核苷酸270受激光束305輻照時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)337，表示發(fā)動(dòng)激光脈沖。作為說(shuō)明，通過(guò)將射束分離器315插入激光束307的通路中，以便分離出輔助激光束307，產(chǎn)生信號(hào)337。激光束307入射到一個(gè)固定光電二極管320上，后者產(chǎn)生一個(gè)供給鑒頻器322的輸出信號(hào)。設(shè)定鑒頻器322產(chǎn)生一個(gè)輸出信號(hào)，表示僅僅當(dāng)入射到光電二極管320的光電子數(shù)超過(guò)一定閾值時(shí)，由激光器310產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)脈沖，由此消除假探測(cè)。
來(lái)自核苷酸的熒光發(fā)射330由高數(shù)值孔徑的透鏡345收集，進(jìn)行空間濾波和分光濾光，指導(dǎo)通過(guò)光柵攝譜儀370或其它色散成分(諸如一個(gè)棱鏡或一個(gè)單色儀)，聚焦到光陰極375上。棱鏡370將入射的質(zhì)子色散，沿x軸按照它們的波長(zhǎng)使質(zhì)子通路偏移。用這類方法排除核苷酸熒光發(fā)射帶之外的波長(zhǎng)。
信號(hào)337用來(lái)使激光器的鎖模頻率與正弦電壓發(fā)生器380同步，以觸發(fā)穿過(guò)正交電極對(duì)的高壓掃描，其中一個(gè)電極對(duì)作為電極382A和382B示于圖5中，而另一電極對(duì)在其直角位置。另一方法是，掃描頻率使得在連續(xù)激光脈沖之間只進(jìn)行一個(gè)掃描。但單個(gè)熒光質(zhì)子入射光陰極375時(shí)，發(fā)射的單個(gè)質(zhì)子-電子在streak tube內(nèi)的高度真空中，由提取柵極377加速，并經(jīng)歷一個(gè)獨(dú)特的電場(chǎng)，后者為單個(gè)質(zhì)子在激光脈沖后發(fā)射時(shí)間的函數(shù)。結(jié)果，單個(gè)質(zhì)子-電子在沿y軸與其發(fā)射時(shí)間成正比的點(diǎn)入射微通道板385。因此，入射到微通道板385上的光電子的空間坐標(biāo)表示每個(gè)探測(cè)質(zhì)子的延遲時(shí)間和波長(zhǎng)。這些坐標(biāo)由數(shù)字轉(zhuǎn)換器數(shù)字化，并提供給計(jì)算機(jī)400。
只要核苷酸保持在激發(fā)區(qū)內(nèi)，那么核苷酸通過(guò)重復(fù)的激發(fā)和發(fā)射循環(huán)。對(duì)于每個(gè)探測(cè)的熒光質(zhì)子，探測(cè)時(shí)間轉(zhuǎn)換為沿x軸的空間坐標(biāo)，而波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換為沿y軸的空間坐標(biāo)。這些空間坐標(biāo)由數(shù)字轉(zhuǎn)換器390數(shù)字化，并提供給計(jì)算機(jī)400。結(jié)果，大量的探測(cè)發(fā)展出一個(gè)條帶圖，它記錄輻射后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔內(nèi)和適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)下探測(cè)的質(zhì)子數(shù)。四種核苷酸中的每種，其條帶圖具有其特征。
因此，為了鑒別每個(gè)核苷酸，將每個(gè)探測(cè)核苷酸產(chǎn)生的條帶圖與預(yù)先記錄的參考條帶圖進(jìn)行比較。為此，預(yù)先記錄的參考條帶圖貯存在計(jì)算機(jī)400中，當(dāng)產(chǎn)生一個(gè)探測(cè)核苷酸的每個(gè)條帶圖時(shí)，計(jì)算機(jī)400可以將其與貯存的條帶圖比較。
作為說(shuō)明，攝譜儀370為Chromex 250i-FX，高速掃描攝影機(jī)為Hamamatsu Photonics of Bridgewater(New Jersey)供應(yīng)的C1587型。數(shù)字轉(zhuǎn)換器為CCD攝影機(jī)，而計(jì)算機(jī)為Macintosh Quadra 840 A/V。
在’761申請(qǐng)的圖9的討論中，提出了圖5儀器進(jìn)一步的細(xì)節(jié)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
正如將從上述說(shuō)明中明顯看出的，我的發(fā)明可以以多種方式實(shí)施?？梢允褂貌煌愋偷墓庀莶蹲狡?，可以用不同方法產(chǎn)生光陷捕捉器和基片之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，也可以按照多種不同的運(yùn)動(dòng)圖案。是否基片運(yùn)動(dòng)而捕捉器保持不動(dòng)或捕捉器運(yùn)動(dòng)和基片保持不動(dòng)沒(méi)有差別。盡管本發(fā)明以單個(gè)光陷捕捉器的角度進(jìn)行描述，但可以用多位光陷捕捉器達(dá)到更大的通過(guò)量。
多位掃描激光捕捉器(Miswa等，Macromolecules 26282-286(1993)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)可以用來(lái)平行平移多個(gè)單分子絡(luò)合物，以增加樣品的通過(guò)量。這種陷由獲計(jì)算機(jī)控制的單聚焦激光束以一定的速度和圖案通過(guò)目的平面來(lái)形成。如果連續(xù)掃描之間的時(shí)間足夠短，那么可以同時(shí)陷獲幾個(gè)粒子。如果每個(gè)連續(xù)的掃描圖案稍微不同，那么這些粒子可以獨(dú)立地運(yùn)動(dòng)?？梢缘玫竭@類多位光陷捕捉器的上手型式(例如多束質(zhì)子鑷子III，S+L Heidelberg，Heidelberg，德國(guó))。在這些多陷獲構(gòu)型中的相鄰擴(kuò)展的DNA分子必須足夠分離，以便防止擴(kuò)散攪亂來(lái)自兩股線中的任一股的釋放核苷酸。其它方法可以用來(lái)將粒子從一個(gè)小滴通過(guò)薄膜轉(zhuǎn)移到另一小滴。例如，通過(guò)采用磁性粒子或具有由諸如鐵等吸附于磁鐵的材料制成的核心的粒子，可以用磁場(chǎng)代替光陷捕捉器將粒子通過(guò)薄膜移動(dòng)。
在結(jié)合圖4A-4E描述的本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供一些操作參數(shù)，以供每個(gè)天然核苷酸的探測(cè)和鑒別之用。大家會(huì)認(rèn)識(shí)到有許多可選擇的實(shí)施方案由于各種原因(例如增加測(cè)序速率或簡(jiǎn)化儀器)，可能達(dá)到它們的理想條件。然而，可以實(shí)施圖4A-4E實(shí)施方案的仍允許可行測(cè)序的多種變化。
一般來(lái)說(shuō)，在有三類核苷酸可以用于圖4A-4E實(shí)施方案的實(shí)施。天然核苷酸是推薦型式，它提供唯一的機(jī)會(huì)進(jìn)行直接的基因組測(cè)序，并進(jìn)一步消除可能的錯(cuò)誤源，消除將非天然核苷酸加上合成測(cè)序模板所涉及的時(shí)間和費(fèi)用。第二類核苷酸為熒光核苷酸類似物，而第三類涉及通過(guò)Jett等研究的接頭(美國(guó)專利4,962,037)共價(jià)連接到核苷酸的熒光發(fā)色團(tuán)。必須認(rèn)識(shí)到，在后兩種情況下，必須首先用能夠摻入核苷酸類似物或染料標(biāo)記核苷酸的適當(dāng)?shù)木酆厦负铣纱郎y(cè)序DNA的拷貝。此外，必須使用可以切割這類含核苷酸類似物或染料標(biāo)記核苷酸的合成模板的核酸外切酶。
除只利用天然核苷酸、核苷酸類似物或染料標(biāo)記核苷酸的方法外，還有四種采用這些核苷酸組合物的一般可能性天然核苷酸加核苷酸類似物、天然核苷酸加染料標(biāo)記核苷酸、核苷酸類似物加染料標(biāo)記核苷酸和天然核苷酸加核苷酸類似物加染料標(biāo)記核苷酸。在這四類中的每一類中，所有可能的組合物都是可以的(例如3個(gè)天然加1個(gè)類似物，2個(gè)天然的加2個(gè)類似物，1個(gè)天然的加3個(gè)類似物等)。將各類核苷酸混合的能力克服了試圖僅摻入染料標(biāo)記核苷酸的技術(shù)人員遇到的許多困難(1992 Harding和Keller，Trends in Biotechnology 1055-57，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
多通測(cè)序提供了其它可能性，其中通過(guò)將同一鏈測(cè)序多次，得出該順序。在每個(gè)單獨(dú)的通過(guò)中，通過(guò)改變儀器的操作參數(shù)和/或通過(guò)采用可探測(cè)核苷酸的不同組合物，獲得關(guān)于異狀或多種核苷酸的資料。通過(guò)組合來(lái)自這種多次通過(guò)的資料，獲得最后的順序。通過(guò)包括互補(bǔ)DNA鏈的順序，進(jìn)一步增強(qiáng)和擴(kuò)展該方法。多通測(cè)序所需的精確的組合物取決于(a)該核苷酸是否可以由其它三種核苷酸中進(jìn)行唯一性鑒別，(b)該核苷酸是否可以作為或者嘌呤或者嘧啶鑒別，(c)該核苷酸是否可以作為核苷酸探測(cè)，或(d)該核苷酸根部不能探測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明顯看出，有這些條件的多種組合用于探測(cè)和鑒別，這允許用本發(fā)明進(jìn)行測(cè)序。下面提供幾個(gè)一般的實(shí)例用于說(shuō)明，但它們不意味著限制可能組合的范圍。
例如，如果可以鑒別每個(gè)核苷酸互補(bǔ)對(duì)中的一個(gè)，而它們的互補(bǔ)物(例如G和T)可以作為核苷酸探測(cè)，但不能鑒別，那么如下所述兩個(gè)互補(bǔ)鏈的測(cè)序?qū)⑻峁┳銐虻馁Y料，以重建全順序。這與這些核苷酸是否為天然的、類似物、染料標(biāo)記的或它們的任何組合物無(wú)關(guān)。
5’-ACGTTCAG-3’3’-TGCAAGTC-5’5’-ACXXXCAX-3’3’-XXCAAXXC-5’在只有一個(gè)核苷酸可以鑒別而其它三種可以作為核苷酸探測(cè)時(shí)，將需要至少三個(gè)、最好是四個(gè)種單獨(dú)的順序進(jìn)行組合，以重建最后的順序。通過(guò)調(diào)整含核苷酸基質(zhì)71的操作參數(shù)和/或探測(cè)站90的操作參數(shù)和/或通過(guò)將不同可鑒別核苷酸摻入用于每個(gè)單獨(dú)通過(guò)的DNA模板的拷貝中，可以完成在每次單獨(dú)的通過(guò)中鑒別不同核苷酸。
甚至當(dāng)一種或多種核苷酸不能探測(cè)時(shí)，如果所用核酸外切酶的切割速率足夠一致，那么可以進(jìn)行測(cè)序。隨著單個(gè)核苷酸的均勻產(chǎn)生，可以預(yù)測(cè)激發(fā)區(qū)100中下一個(gè)核苷酸的到達(dá)時(shí)間。因此，不能探測(cè)的核苷酸將作為順序中的缺口出現(xiàn)。然后，或者如果與不能探測(cè)的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸本身可探測(cè)并可鑒別，那么通過(guò)互補(bǔ)鏈的測(cè)序可以填上這類缺口，或者如果不能探測(cè)的核苷酸在隨后的通過(guò)中，可以用supra所示的任何方法制成可探測(cè)和可鑒別的，可以填上這類缺口。
很明顯，可以進(jìn)行上文提出的本發(fā)明的多種修改和變化，而不違反方便面的精神和范圍。上述具體實(shí)施方案僅僅通過(guò)實(shí)例給出，本發(fā)明僅僅受所附的權(quán)利要求書(shū)條款所限制。權(quán)利要求書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)“DNA”或“脫氧核糖核酸”除非另外陳述，應(yīng)該作為集體解釋，包括含天然核苷酸的DNA、含一種或多種修飾核苷酸(例如含有一個(gè)化學(xué)修飾或酶促修飾堿基、糖和/或磷酸的染料標(biāo)記核苷酸)、含一種或多種核苷酸類似物的DNA和上述組合物。權(quán)利要求書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”除非另外陳述，應(yīng)該作為集體解釋，包括天然核苷酸、核苷酸類似物、修飾核苷酸(例如含有一個(gè)化學(xué)修飾或酶促修飾堿基、糖和/或磷酸的染料標(biāo)記核苷酸)、和上述的組合物。
權(quán)利要求
1.進(jìn)行化學(xué)、生化或生物學(xué)反應(yīng)的方法，包括以下步驟至少在含有不同化學(xué)、生化或生物學(xué)試劑的第一區(qū)和第二區(qū)提供一層液態(tài)膜，在第一區(qū)提供至少一個(gè)粒子，在第一區(qū)形成一個(gè)光陷捕捉器，陷獲單個(gè)目的化學(xué)、生化或生物學(xué)粒子，使用光陷捕捉器將陷獲粒子通過(guò)液態(tài)膜移至第二區(qū)，在此該粒子與第二區(qū)的試劑相互作用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將陷獲粒子通過(guò)薄膜移至使用該粒子的位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中液態(tài)膜至少與光陷捕捉器中陷獲的粒子一樣厚。
4.權(quán)利要求1的方法，其中陷獲粒子的大小小于大約10μm。
5.權(quán)利要求1的方法，其中陷獲粒子為直徑小于大約1μm的珠粒。
6.用于寡核苷酸合成的權(quán)利要求1的方法，其中第一區(qū)含有多個(gè)連接第一個(gè)反應(yīng)性核苷酸的珠粒，在液態(tài)薄膜上提供多個(gè)附加區(qū)，每個(gè)區(qū)含有一種類型的反應(yīng)性核苷酸、或偶聯(lián)劑、或去封閉劑、或封端劑、或洗滌劑，而陷獲粒子以所需的順序，從一個(gè)附加區(qū)移至另一個(gè)附加區(qū)，以合成所需的寡核苷酸。
7.用于篩選的權(quán)利要求1的方法，其中來(lái)自第一區(qū)的粒子用來(lái)從第二區(qū)的多個(gè)不同分子中選擇具有特殊特征的分子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)區(qū)為一個(gè)小滴。
9.在一個(gè)表面上進(jìn)行化學(xué)、生化或生物學(xué)反應(yīng)的方法，包括以下步驟至少提供含有不同化學(xué)、生化或生物學(xué)試劑的第一離散區(qū)和第二離散區(qū)，提供一個(gè)與至少所述第一離散區(qū)和所述第二離散區(qū)互連的液態(tài)薄膜，在至少所述第一離散區(qū)中提供一個(gè)第一粒子，將第一粒子通過(guò)液態(tài)膜移至第二區(qū)，在此第一粒子與第二區(qū)的試劑相互作用。
10.權(quán)利要求9的方法，其中第一粒子從第二區(qū)移至使用第一粒子的液態(tài)薄膜區(qū)域。
11.權(quán)利要求9的方法，其中液態(tài)膜至少與第一粒子一樣厚。
12.用于寡核苷酸合成的權(quán)利要求9的方法，其中第一區(qū)含有多個(gè)各自連接第一個(gè)反應(yīng)性核苷酸的珠粒，提供多個(gè)由液態(tài)薄膜互連的附加區(qū)，每個(gè)區(qū)含有一種類型的核苷酸、或偶聯(lián)劑、或封端劑、或去封閉劑、或洗滌劑，而陷獲粒子以所需的順序，從一個(gè)附加區(qū)移至另一個(gè)附加區(qū)，以合成所需的寡核苷酸。
13.用于篩選的權(quán)利要求9的方法，其中第一粒子用來(lái)從第二區(qū)的多個(gè)不同分子中選擇具有特殊特征的分子。
14.權(quán)利要求9的方法，其中至少一個(gè)區(qū)為薄膜中的一個(gè)小滴。
15.形成單個(gè)核苷酸通路的方法，包括使單個(gè)DNA分子連接在其一端的單個(gè)珠粒，通過(guò)液態(tài)薄膜在固態(tài)基片表面上移動(dòng)，而連接到DNA分子上的加工性核酸外切酶從DNA分子上連續(xù)切割單個(gè)核苷酸，其中固態(tài)基片的表面與單個(gè)核苷酸連接，由此在所述表面上以它們切割的連續(xù)順序形成單個(gè)核苷酸的通路。
16.權(quán)利要求15的方法，其中用一個(gè)光陷捕捉器移動(dòng)該珠粒。
17.權(quán)利要求15的方法，其中液態(tài)薄膜至少與該珠粒一樣厚。
18.權(quán)利要求15的方法，其中該珠粒的大小小于大約10μm。
19.權(quán)利要求15的方法，其中該珠粒的直徑小于大約1μm。
全文摘要
使用一個(gè)光陷捕捉器將一個(gè)粒子通過(guò)光學(xué)平坦的表面上的薄膜涂層平移。該薄膜涂層最好為不均勻的,該光陷捕捉器用來(lái)將粒子通過(guò)薄膜涂層連續(xù)的不同區(qū)平移,在此進(jìn)行不同的化學(xué)、生化和/或生物學(xué)加工。可以按照本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的化學(xué)、生化和/或生物學(xué)加工的實(shí)例包括:寡核苷酸的合成和測(cè)序、多肽的合成和測(cè)序、糖類的合成和測(cè)序、組合文庫(kù)的合成和篩選、常規(guī)(即Sanger或Maxam－Gilbert)DNA測(cè)序或單分子DNA測(cè)序。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,當(dāng)粒子通過(guò)薄膜涂層移動(dòng)時(shí),留下反應(yīng)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物最好用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1192745SQ96196054
公開(kāi)日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1996年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月5日
發(fā)明者K·M·厄爾默 申請(qǐng)人:西克有限公司