專利名稱：需氧微生物發(fā)酵過(guò)程控制菌體代謝節(jié)律的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種需氧微生物的培養(yǎng)方法，這個(gè)方法是把發(fā)酵罐內(nèi)的Fed-Batch過(guò)程看作一個(gè)時(shí)空混沌體系，在線控制其中的非線性變量，使生物活體的酶促生化反應(yīng)在節(jié)律狀態(tài)下完成。
在生化工業(yè)里典型的菌體培養(yǎng)程序是先在一個(gè)種子發(fā)酵罐中(體積大約2M3)進(jìn)行種子培育，種子培養(yǎng)基輸送到種子罐中煮沸消毒后，把經(jīng)過(guò)無(wú)菌培養(yǎng)過(guò)的微生物細(xì)胞(菌株)接進(jìn)罐讓它生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間(大約16小時(shí))當(dāng)細(xì)胞數(shù)目表明微生物是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)就被輸送到主發(fā)酵設(shè)備開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)和獲取產(chǎn)物，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于監(jiān)測(cè)和控制都是針對(duì)主發(fā)酵設(shè)備里的發(fā)酵生化過(guò)程。
主發(fā)酵過(guò)程一般分為三個(gè)階段，發(fā)酵前期是長(zhǎng)菌階段，發(fā)酵中期和后期是產(chǎn)物積累和排泄階段也就是菌體的代謝過(guò)程。在需氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，及時(shí)準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)溫度、pH、通風(fēng)量和流加氮源，碳源，可以控制菌體繁殖、底物消耗速率，提高產(chǎn)物形成速率。迄今為止大多數(shù)發(fā)酵工業(yè)仍采用每幾個(gè)小時(shí)從發(fā)酵罐內(nèi)取出樣品，離線進(jìn)行生化分析，測(cè)定菌體濃度、碳源濃度和產(chǎn)物濃度，以便采取相應(yīng)操作進(jìn)行過(guò)程控制。
歐洲專利EP0661380A2“需氧微生物培養(yǎng)的方法和設(shè)備”所介紹的現(xiàn)有技術(shù)包括方法和設(shè)備，其方法是開(kāi)發(fā)一種在線測(cè)量發(fā)酵液里的菌體濃度、碳源濃度和產(chǎn)物濃度以及氨離子濃度的方法，根據(jù)這些測(cè)量值去計(jì)算流加速率。定量控制發(fā)酵液的碳源濃度和氨離子濃度，使需氧微生物在Fed-Batch培養(yǎng)過(guò)程中保持微生物菌的適當(dāng)生長(zhǎng)。實(shí)施這個(gè)方法的設(shè)備包括一臺(tái)近紅外分光光度計(jì)和與此儀器相接的計(jì)算機(jī)以及與計(jì)算機(jī)相接的控制部件包括溫度、pH、流加碳源、罐壓和通風(fēng)。計(jì)算機(jī)及其控制部件組成一個(gè)在線系統(tǒng)。每10分鐘自動(dòng)取一次發(fā)酵液，由近紅外分光光度計(jì)進(jìn)行在線分析。在線分析的方法是根據(jù)校正曲線所提供的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算碳源濃度＝32.36+0.900×1295.2×(F-1019.0×F-165.7×F+848.3×F)谷氨酸濃度＝-4.064+1.079×(-383.2×F+1233.0×F+122.9×F-998.5×F)菌體濃度＝-1.570+0.321×(-100.1×F+71.18×F+53.83×F氨離子濃度＝-2.817+0.856×(-846.5×F+878.6×F-15.8×F)根據(jù)在線分析的結(jié)果確定流加碳源速率1.當(dāng)分析結(jié)果＞SV+0.2流加速率＝0.8×C源消耗速率2.SV+0.2≥分析結(jié)果＞SV+0.1 流加速率＝0.9×C3.分析結(jié)果＝SV 流加速率＝1×C4.SV-0.1＞分析結(jié)果≥SV-0.2 流加速率＝1.1×C5.SV-0.2＞分析結(jié)果 流加速率＝1.2×C近紅外分光光度計(jì)的分析結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)按照上述方法計(jì)算流加速率，其中SV表示每10分鐘大致耗掉多少碳源(這是人為確定的設(shè)定值)，碳源消耗速率C是指十分鐘前與十分鐘時(shí)的碳濃度差與時(shí)間之比，五種流加速率由計(jì)算機(jī)確定一種，通過(guò)控制器進(jìn)行流加。
根據(jù)上述公式計(jì)算的菌體濃度用來(lái)確定菌體生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)行溫度控制初始溫度 第一次升溫第二次升溫31.5℃當(dāng)菌體濃度≥5.6g/l當(dāng)菌體濃度≥8.0g/l36℃ 39℃現(xiàn)有技術(shù)對(duì)pH、罐壓和通氣量基本保持在一定值，不進(jìn)行調(diào)節(jié)。
現(xiàn)有技術(shù)有以下不足之處1.現(xiàn)有技術(shù)提出的培養(yǎng)方法僅僅是用計(jì)算機(jī)代替人工取樣和輸送到近紅外分光光度計(jì)進(jìn)行分析計(jì)算，在測(cè)量發(fā)酵液里的菌體濃度和其它濃度的方法方面并沒(méi)有先進(jìn)新技術(shù)。實(shí)際上國(guó)內(nèi)早已采用遠(yuǎn)紅外分光光度計(jì)721測(cè)定菌體濃度和碳源濃度而用酶膜傳感技術(shù)測(cè)定產(chǎn)物濃度，這些都是經(jīng)典的方法。
2.現(xiàn)有技術(shù)提出的在線檢測(cè)方法是一種靜態(tài)線性系統(tǒng)定量方法，把樣品在各種波長(zhǎng)的光照下的吸收率按照經(jīng)驗(yàn)公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算菌體濃度，碳源濃度和產(chǎn)物濃度。事實(shí)上，微生物的培養(yǎng)過(guò)程表現(xiàn)出隨機(jī)而非線性的行為，常常不是一堆經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠框住的，譬如用現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)的菌體濃度所反映的是包括死的菌體在內(nèi)的菌體個(gè)數(shù)，不能反映菌體的真實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育情況，所以這種經(jīng)典的估算方法只能作為參考。
3.現(xiàn)有技術(shù)忽略了需氧微生物培養(yǎng)的最重要條件之一是氧的供給，事實(shí)上菌體的需氧情況是隨著菌的繁殖和代謝的不同階段而不同的?，F(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為pH、罐壓和通風(fēng)量基本維持在一定值而沒(méi)有通過(guò)監(jiān)測(cè)的菌體濃度改變pH和通氣量，說(shuō)明現(xiàn)有技術(shù)的方法不合理。
4.現(xiàn)有技術(shù)提出的培養(yǎng)方法的重點(diǎn)是根據(jù)在線檢測(cè)的碳源濃度，估算碳源消耗速率，去確定碳源的流加速率。這里存在二種誤差一是近紅外分光光度計(jì)對(duì)不同碳源原材料的透光率不同產(chǎn)生的測(cè)量誤差；二是碳源消耗速率計(jì)算的累計(jì)誤差，因?yàn)樘荚吹南乃俾适怯卯?dāng)前測(cè)定的碳濃度減去前次測(cè)定的碳濃度除以時(shí)間，所以一次計(jì)算的流加速率不準(zhǔn)確，將會(huì)造成后10分鐘流加速率不準(zhǔn)確，以后每10分鐘依次類推，積累誤差，直接影響流加碳源的正確性。
5.在現(xiàn)有專利中用近紅外分光光度計(jì)在線檢測(cè)氨離子的目的是為了流加氮源，而現(xiàn)有專利又用pH電極檢測(cè)pH值其目的也是為了流加氮源，這二者以何種檢測(cè)為流加氮源的依據(jù)，因二種測(cè)試沒(méi)有關(guān)聯(lián)，而且氨離子濃度與氨基之間也沒(méi)有關(guān)聯(lián)，所以控制氨離子濃度沒(méi)有新的實(shí)用意義。
本發(fā)明提出一套新的培養(yǎng)方法，是激勵(lì)微生物菌對(duì)碳、氮、氧的攝取，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活力，最終提高產(chǎn)量的方法。本發(fā)明方法的重要特征是在通氣培養(yǎng)過(guò)程中，控制微生物在培養(yǎng)液里的pH和排氣中的二氧化碳，使它們呈現(xiàn)反相節(jié)律狀態(tài)。所謂節(jié)律狀態(tài)，就是具有一定周期和強(qiáng)弱幅度變化的脈動(dòng)或振蕩行為。反相節(jié)律狀態(tài)是指CO2和pH的變化周期相同，但是當(dāng)CO2上升時(shí)，pH下降，而CO2下降時(shí)，pH上升。CO2達(dá)到高峰時(shí)，pH恰處在低谷，如圖1所示。產(chǎn)生代謝節(jié)律的方法是用計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)CO2和pH，并由計(jì)算機(jī)運(yùn)行控制算法以實(shí)現(xiàn)各項(xiàng)操作的協(xié)同作用。本發(fā)明方法的技術(shù)路線如下1.根據(jù)菌體在培養(yǎng)過(guò)程中的不同階段確定CO2和pH的振蕩幅度(設(shè)定值)，當(dāng)CO2達(dá)不到設(shè)定值時(shí)，改變溫度、降低風(fēng)量、補(bǔ)充生物素等，使CO2上升；當(dāng)CO2達(dá)到設(shè)定值時(shí)，提高風(fēng)量、流加氮源、流加碳源等，使CO2在設(shè)定值以下周期性變化。
2.根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中各階段的pH調(diào)節(jié)范圍，用流加氮源來(lái)控制振蕩周期。培養(yǎng)過(guò)程中的各種操作，包括改變溫度、pH、供氧量和流加氮源、碳源等，都是用階躍或開(kāi)/關(guān)方式來(lái)完成。
在這樣一種培養(yǎng)方法中，每隔1分鐘檢測(cè)一次CO2和pH，并且用實(shí)時(shí)顯示的圖形表現(xiàn)它們的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)判斷氮源和碳源的消耗狀況及時(shí)定量補(bǔ)給。與現(xiàn)有技術(shù)的根本不同是本發(fā)明方法對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)的優(yōu)化控制，因?yàn)殡S時(shí)可以根據(jù)CO2和pH的圖形軌跡調(diào)整操作設(shè)定值，因此培養(yǎng)過(guò)程中各種操作均能夠被定量化，使復(fù)雜的工藝能夠被簡(jiǎn)化，背景材料中現(xiàn)有技術(shù)的所有不足之處均可避免。
本發(fā)明提出的需氧微生物培養(yǎng)方法中涉及的控制代謝節(jié)律的具體做法是建立4組控制回路，如圖2所示，其中以pH和CO2的關(guān)系為核心，通過(guò)多變量控制器把它們與流加氮源、改變通風(fēng)量、流加生物素、流加碳源結(jié)合起來(lái)進(jìn)行協(xié)同控制。這四組回路，分別介紹如下控制回路(1)流加氮源作為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器給定pH設(shè)定值，控制氮源流加。
控制回路(2)改變通風(fēng)量作為過(guò)程的輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器給定CO2的設(shè)定值，控制風(fēng)量。
控制回路(3)流加生物素為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器控制生物素的流加量，或者改變CO2設(shè)定值。
控制回路(4)流加碳源為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器調(diào)節(jié)碳源的間歇流加量，并調(diào)節(jié)CO2的振蕩幅度設(shè)定值。
上述四組控制回路中，回路(1)的輸入必須采用開(kāi)/關(guān)閥自動(dòng)執(zhí)行，其余回路(2)～(4)可以自動(dòng)也可以人工操作(通常控制回路(2)用人工操作)。
多變量控制器是貯存在計(jì)算機(jī)微處理器里的程序模塊，用來(lái)順序執(zhí)行預(yù)定的控制算法。在本發(fā)明方法中多變量控制器的控制算法包括以下二方面內(nèi)容1.振蕩周期的設(shè)定振蕩周期的大小與pH的調(diào)節(jié)度成正比。調(diào)節(jié)度大，振蕩周期大；調(diào)節(jié)度小，振蕩周期小。
pH控制范圍＝pH設(shè)定值±pH調(diào)節(jié)度pH調(diào)節(jié)度＝pH調(diào)節(jié)率％×(pH上量程-pH下量程)振蕩周期＝n×pH調(diào)節(jié)度 式中n＝每單位pH值下降所需的時(shí)間2.振蕩幅度的調(diào)節(jié)振蕩幅度的調(diào)節(jié)采用人工智能邏輯判斷算法，例如發(fā)酵前期約0～6小時(shí)之間，提高通氣量使CO2達(dá)到最大值；發(fā)酵中期約6～24小時(shí)之間再次提高通氣量，同時(shí)流加氮源使CO2控制在中等大小量，發(fā)酵中期主要用提高通氣量和補(bǔ)充生物素來(lái)調(diào)節(jié)CO2幅度。在此期間大約從16小時(shí)開(kāi)始參考離線分析的底物濃度確定流加碳源，保持CO2的振幅。在發(fā)酵后期約24小時(shí)～30小時(shí)以降低通氣量控制CO2在一定值。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程CO2的振幅控制在大、中、小三種值。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提出的方法，所用的裝置和裝置里各組成部分如圖3所示，需氧發(fā)酵過(guò)程代謝節(jié)律控制裝置的結(jié)構(gòu)包括傳感器與儀表、控制箱、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、驅(qū)動(dòng)和執(zhí)行機(jī)構(gòu)四部分。
1.傳感器與儀表用來(lái)在線檢測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)液里的溫度，pH和排氣CO2。
2.控制箱由多種接口卡組成，用來(lái)聯(lián)接儀表與計(jì)算機(jī)，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和產(chǎn)生控制信號(hào)。
3.計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用來(lái)進(jìn)行監(jiān)督控制，執(zhí)行多變量控制算法，對(duì)過(guò)程進(jìn)行智能化決策，其中包括圖形顯示和報(bào)警，數(shù)據(jù)貯存和圖形數(shù)據(jù)的輸入/輸出。
4.驅(qū)動(dòng)和執(zhí)行機(jī)構(gòu)，用來(lái)完成最優(yōu)節(jié)律控制下的各項(xiàng)操作。上述裝置的四個(gè)組成部分主要完成檢測(cè)、過(guò)程監(jiān)督和決策、控制三種功能。各部件內(nèi)部的連接和詳細(xì)作用介紹如下1.檢測(cè)本發(fā)明主要的檢測(cè)量是溫度、pH和CO2，其中溫度和pH的傳感器分別安裝在發(fā)酵罐罐體上，插到罐內(nèi)培養(yǎng)基里，傳感器輸出信號(hào)經(jīng)過(guò)變送器輸送到控制箱內(nèi)的信號(hào)調(diào)理電路，CO2的檢測(cè)是從發(fā)酵罐通氣口引出的管道經(jīng)過(guò)干燥器和過(guò)濾器輸入CO2測(cè)示儀，測(cè)出的電信號(hào)輸入控制箱內(nèi)的信號(hào)調(diào)理電路。
2.過(guò)程監(jiān)督和決策這些功能由控制箱和計(jì)算機(jī)來(lái)完成。
(1)控制箱由電源卡、通信卡、信號(hào)調(diào)理卡和模數(shù)、數(shù)模轉(zhuǎn)換、數(shù)入/數(shù)出卡組成，各卡的作用如下電源卡用來(lái)提供±12、±15V直流穩(wěn)壓電源。通信卡是計(jì)算機(jī)母線在控制箱內(nèi)的擴(kuò)展，使計(jì)算機(jī)與控制箱聯(lián)接，傳送控制信號(hào)和接收從控制箱來(lái)的信號(hào)。信號(hào)調(diào)理卡接收來(lái)自于檢測(cè)儀表的信號(hào)后，經(jīng)過(guò)隔離、放大、阻抗匹配，輸送給模/數(shù)轉(zhuǎn)換卡，由計(jì)算機(jī)完成數(shù)據(jù)采集。
(2)計(jì)算機(jī)包括微處理計(jì)算器、批報(bào)數(shù)據(jù)及圖形輸出打印機(jī)、顯示器、存儲(chǔ)器四個(gè)主要部件，各部件的作用如下微處理計(jì)算器一方面進(jìn)行過(guò)程監(jiān)測(cè)和報(bào)警，把控制箱輸送過(guò)來(lái)的數(shù)據(jù)采集信號(hào)用圖形顯示在顯示屏幕上，便于操作人員監(jiān)視培養(yǎng)過(guò)程，當(dāng)培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)異常時(shí)自動(dòng)用聲光提示，便于人工干預(yù)，消除異常；另一方面依靠微處理器自動(dòng)執(zhí)行控制算法(如前面提到的人工智能邏輯判斷算法)，確定各控制回路的設(shè)定值，同時(shí)發(fā)出操作指令通過(guò)控制箱的數(shù)入/數(shù)出卡去驅(qū)動(dòng)執(zhí)行機(jī)構(gòu)。批報(bào)及圖形輸出打印機(jī)用來(lái)輸出每批培養(yǎng)的中間或最終技術(shù)資料。顯示器用來(lái)顯示所有圖形和數(shù)據(jù)。存儲(chǔ)器用來(lái)貯存技術(shù)資料檔案。
3.控制發(fā)酵過(guò)程的控制是由計(jì)算機(jī)和控制箱通過(guò)驅(qū)動(dòng)器和執(zhí)行機(jī)構(gòu)來(lái)完成的，主要的功能部件包括驅(qū)動(dòng)電路和執(zhí)行機(jī)構(gòu)。其中驅(qū)動(dòng)電路接受來(lái)自于控制箱的控制信號(hào)，用繼電器驅(qū)動(dòng)執(zhí)行機(jī)構(gòu)。執(zhí)行機(jī)構(gòu)包括流加氮源和流加碳源的二組計(jì)量器和閥門，閥門直接安裝在發(fā)酵罐頂?shù)妮斔涂谏?，?jì)量器安裝在管道里用來(lái)定量流加量。
本發(fā)明提出的控制菌體代謝節(jié)律的方法不受微生物菌種類不同的限制，適合于任何需氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程。用于生產(chǎn)各種氨基酸，核酸和古龍酸例如用在生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)T6-13菌或F9114菌同樣有效，同樣具有激勵(lì)菌體生長(zhǎng)和代謝活力，促進(jìn)菌體排泄功能的作用。無(wú)論是分批發(fā)酵工藝(一次投料產(chǎn)出)或是補(bǔ)料—分批發(fā)酵工藝(Fed-Batch)過(guò)程，本方法同樣能夠獲得提高產(chǎn)率和縮短周期的效果。本方法籍助于計(jì)算機(jī)顯示微生物呼吸和消耗氮源的動(dòng)態(tài)軌跡，直接進(jìn)行自動(dòng)相關(guān)控制，對(duì)離線取樣分析的菌體濃度、碳源濃度、產(chǎn)物濃度的依賴性比任何其他培養(yǎng)方法小得多，另外本發(fā)明所使用的發(fā)酵罐可以是任意規(guī)格和任何形狀，例如各種噸位的攪拌式發(fā)酵罐或是氣升式發(fā)酵罐。還有，對(duì)于所用氮源的種類沒(méi)有任何限制，例如可以是尿素、氣氨或液氨。這些都說(shuō)明本發(fā)明方法特別適合于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵過(guò)程。


圖1.CO2與pH之間的非線性對(duì)應(yīng)關(guān)系圖2.以CO2與pH為主回路的節(jié)律控制方法粗框3.需氧發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置的結(jié)構(gòu)總框4.在谷氨酸生產(chǎn)150M3發(fā)酵罐上的應(yīng)用實(shí)例1.和實(shí)例2.圖5.應(yīng)用實(shí)例1.和實(shí)例2.的非線性控制實(shí)時(shí)圖形圖6.應(yīng)用實(shí)例1.和實(shí)例2.的發(fā)酵狀態(tài)離線分析結(jié)果圖7.未采用本實(shí)用新型和節(jié)律控制方法的150M3發(fā)酵罐的設(shè)備比較例圖8.比較例的在線控制圖形圖9.比較例的發(fā)酵狀態(tài)離線分析結(jié)果應(yīng)用實(shí)例用控制菌體代謝節(jié)律方法發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的工業(yè)現(xiàn)場(chǎng)裝備配套示意圖如圖4所示1.實(shí)例一工業(yè)谷氨酸發(fā)酵，150噸規(guī)模微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.07％

1.1～1.2％硫酸鎂0.06～0.07％玉米漿0.43％糖 蜜0.04％氯化鉀0.1％控制條件溫度 三級(jí) 35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級(jí)提風(fēng) 700→1100→1500→1800三級(jí)降風(fēng) →1600→1500→1300pH設(shè)定7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度 150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件 殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期30小時(shí)流加糖量3.53％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開(kāi)始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測(cè)量為溫度、pH、CO2，離線檢測(cè)信號(hào)為菌體濃度，殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛取９?jié)律的設(shè)定發(fā)酵前期 發(fā)酵中期 發(fā)酵后期振蕩周期(分鐘) 7.5 7.5 7.5
振蕩幅度(CO2％) 8～13 6～80～6控制回路(1)CO2與pH的回路設(shè)定值pH CO2定時(shí)(小時(shí))7.4 8％＜CO2＜13％0＜t＜127.2 8％＜CO2＜10％12＜t＜247.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜287.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜306.9 30＜t＜32控制回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時(shí))CO2含量定時(shí)(小時(shí))700 CO2＝0 t＝01100 CO2＞4％ t＜81500 4％＜CO2＜12％ t＜81800 CO2≥12％t＜81600 9％≤CO2＜12％ t＞241500 5％＜CO2＜19％ t＞241300 2％CO2＜5％ t＞24控制回路(3)本批發(fā)酵未加生物素，因?yàn)殡x線分析的菌體濁度6小時(shí)已經(jīng)達(dá)到凈增＞0.6g/l。同時(shí)CO2限幅達(dá)到12％，說(shuō)明菌體數(shù)和發(fā)育情況良好，不用再加生物素?？刂苹芈?4)流加糖控制 殘?zhí)呛?CO2含量24.4％糖液 5.5噸 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％(計(jì)量罐輸出量) 4噸S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％3噸S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％本批發(fā)酵產(chǎn)酸率10％，轉(zhuǎn)化率60.8％，發(fā)酵周期30小時(shí)控制節(jié)律如圖5(上)所示，谷氨酸發(fā)酵過(guò)程的三種離線狀態(tài)分析結(jié)果如圖6(上)所示。2.實(shí)例二工業(yè)谷氨酸發(fā)酵，150噸規(guī)模微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.2％

1.1～1.2％硫酸鎂 0.06～0.07％玉米漿 0.45％糖 蜜 0.042％氯化鉀 0.1％控制條件溫度 三級(jí) 35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級(jí)提風(fēng) 700→1100→1500→1800三級(jí)降風(fēng) →1600→1500→1300pH設(shè)定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度 150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件 殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期 32小時(shí)流加糖量 3.1％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開(kāi)始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測(cè)量為溫度、pH、CO2，離線檢測(cè)信號(hào)為菌體濃度，殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛?。?jié)律設(shè)定值發(fā)酵前期 發(fā)酵中期 發(fā)酵后期振蕩周期(分鐘) 15 1510.5振蕩幅度(CO2％) 8～13 6～8 0～6控制回路(1)CO2與pH的回路設(shè)定值pH CO2定時(shí)(小時(shí))7.4 8％＜CO2＜13％ 0＜t＜127.2 8％＜CO2＜10％ 12＜t＜247.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜287.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜306.9 30＜t＜32控制回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時(shí))CO2含量 定時(shí)(小時(shí))700 CO2＝0 t＝01100 CO2＞4％ t＜81500 4％＜CO2＜12％ t＜81800 CO2≥12％ t＜81600 9％≤CO2＜12％ t＞241500 5％＜CO2＜19％ t＞241300 2％CO2＜5％t＞24控制回路(3)本批發(fā)酵未加生物素，因?yàn)殡x線分析的菌體濁度6小時(shí)已經(jīng)達(dá)到凈增＞0.6kg/l。同時(shí)CO2限幅達(dá)到12％，說(shuō)明菌體數(shù)和發(fā)育情況良好，不用再加生物素?？刂苹芈?4)流加糖控制殘?zhí)呛緾O2含量
24.4％糖液 5.5噸 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％(計(jì)量罐輸出量) 4噸S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％3噸S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)酸率9.21％，轉(zhuǎn)化率58％，發(fā)酵周期32小時(shí)。控制節(jié)律如圖5(下)所示，狀態(tài)分析結(jié)果如圖6(下)所示。實(shí)例2比實(shí)例1的周期長(zhǎng)了2個(gè)小時(shí)，產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率相應(yīng)點(diǎn)都低一些，說(shuō)明該菌株的代謝控制周期小一些較合適。3.比較例工業(yè)谷氨酸，150噸(未采用節(jié)律控制方法的150噸攪拌罐)的裝備情況如圖7所示微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.07％

1.1～1.2％硫酸鎂 0.06～0.07％玉米漿 0.43％糖 蜜 0.04％氯化鉀 0.1％控制條件溫度 三級(jí)35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級(jí)提風(fēng)700→1100→1500→1800三級(jí)降風(fēng)→1600→1500→1300
pH設(shè)定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期30小時(shí)流加糖量3.53％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開(kāi)始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測(cè)量為溫度、pH、CO2，離線檢測(cè)信號(hào)為菌體濃度、殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛取；芈?1)根據(jù)pH值，用人工調(diào)液氨+氣氨pH 定時(shí)(小時(shí))7.3 0＜t＜67.2 6＜t＜167.1 16＜t＜247.0 24＜t＜286.9 28＜t＜32回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時(shí)) CO2含量定時(shí)(小時(shí))700CO2＝0t＝01100CO2＞4％ t＜815004％＜CO2＜12％t＜81800CO2≥12％ t＜816009％≤CO2＜12％t＞2415005％＜CO2＜19％t＞2413002％CO2＜5％ t＞24回路(3) 本批發(fā)酵未流加生物素。
回路(4)流加糖控制殘?zhí)呛緾O2含量24.4％糖液5.5噸 S≤3.6％5％＜CO2＜8％(計(jì)量罐輸出量)3.4噸 S≤2.6％5％＜CO2＜8％2～3噸 S≤1.6％5％＜CO2＜8％本例所有各種條件與例1.例2.相仿，所不同的是沒(méi)有進(jìn)行代謝振蕩節(jié)律控制，而是根據(jù)CO2的變化趨勢(shì)調(diào)節(jié)生物素、流加糖和流加液氨的速率控制pH在適當(dāng)值，其在線控制的圖形如8所示。發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。
產(chǎn)酸率8.6％，轉(zhuǎn)化率57％，周期32小時(shí)。經(jīng)濟(jì)效益采用微生物代謝節(jié)律控制進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程可以獲得以下效益1.提高單位體積發(fā)酵罐的發(fā)酵強(qiáng)度0.1～0.2；2.使產(chǎn)酸率相對(duì)提高5～10％，轉(zhuǎn)化率相對(duì)提高5％；3.可縮短發(fā)酵周期，節(jié)約原材料和節(jié)約電、水、能量折合為平均每批次降低成本8％以上。
權(quán)利要求
1.一種需氧微生物培養(yǎng)方法其特征在于在微生物發(fā)酵過(guò)程中在線控制微生物菌體的代謝規(guī)律，使其處于節(jié)律狀態(tài)。
2.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中微生物培養(yǎng)過(guò)程的所有人工或自動(dòng)操作均采用階躍或開(kāi)/關(guān)方式進(jìn)行以使菌體的代謝處于一定周期和幅值的振蕩狀態(tài)。
3.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中自動(dòng)操作采用計(jì)算機(jī)控制。
4.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中自動(dòng)操作系統(tǒng)是由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、傳感器和儀表、驅(qū)動(dòng)和執(zhí)行機(jī)構(gòu)四部分組成的自動(dòng)監(jiān)控系統(tǒng)。
5.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體代謝節(jié)律的控制方法是將CO2和PH關(guān)聯(lián)，建立時(shí)變非線性相關(guān)回路。
6.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，以控制PH和CO2為核心建立如下四組控制回路控制回路(1)流加氮源作為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器給定pH設(shè)定值，控制氮源流加?？刂苹芈?2)改變通風(fēng)量作為過(guò)程的輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器給定CO3的設(shè)定值，控制風(fēng)量?？刂苹芈?3)流加生物素為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器控制生物素的流加量，或者改變CO2設(shè)定值?？刂苹芈?4)流加碳源為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過(guò)多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器調(diào)節(jié)碳源的間歇流加量，并調(diào)節(jié)CO2的振蕩幅度設(shè)定值。
7.按照權(quán)利要求6所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中多變量控制器的輸入包括調(diào)整通氣量、流加生物素、流加碳源和流加氮源；多變量控制器的輸出是CO2。
8.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法使用紅外分析儀檢測(cè)CO2濃度。
9.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法使用pH電極及變送器檢測(cè)發(fā)酵液的PH值。
10.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中代謝節(jié)律監(jiān)控規(guī)則是通過(guò)實(shí)時(shí)圖形顯示的代謝軌跡而決定的。
11.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中流加氮源的方式是由計(jì)算機(jī)控制電磁閥的通/斷。
12.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體的代謝振蕩幅值是通過(guò)改變通氣量、流加生物素、流加碳源和流加氮源，調(diào)整CO2的濃度。
13.按照權(quán)利要求12所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體的代謝振蕩周期如下確定pH控制范圍＝pH設(shè)定值±pH調(diào)節(jié)度pH調(diào)節(jié)度＝pH調(diào)節(jié)率％×(pH上量程-pH下量程)振蕩周期＝n×pH調(diào)節(jié)度 式中n為使單位pH值下降所需的單位時(shí)間。
14.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為氨基酸。
15.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為核酸。
16.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為古龍酸。
17.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵罐包括各種體積規(guī)模的氣升式發(fā)酵罐和攪拌式發(fā)酵罐。
18.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中的發(fā)酵可以是分批發(fā)酵或補(bǔ)料—分批發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提出一種需氧微生物發(fā)酵過(guò)程控制菌體代謝節(jié)律的培養(yǎng)方法,這個(gè)方法是把發(fā)酵過(guò)程中反映菌體代謝狀態(tài)的2個(gè)非線性時(shí)變生化變量(CO
文檔編號(hào)C12P1/00GK1177007SQ9611982
公開(kāi)日1998年3月25日 申請(qǐng)日期1996年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月19日
發(fā)明者錢梓文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所