專利名稱：一種用基因工程方法培育的抗黃瓜花葉病毒病甜椒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的植物基因工程學(xué)科。
現(xiàn)有技術(shù)(與本發(fā)明最接近的技術(shù))本項(xiàng)目采用的技術(shù)是植物基因工程育種技術(shù)，是一個新興的高科技學(xué)科；以往的經(jīng)典生物學(xué)技術(shù)和經(jīng)典的農(nóng)作物育種技術(shù)無法在同一水平上與之比較、培育抗病毒植物的基因工程方法目前有幾種本項(xiàng)目采用的是已為國際承認(rèn)的有效的方法，即利用病毒的外殼旦白的基因轉(zhuǎn)入植物以防止病毒傳染的方法。
植物的病毒危害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上損失最大的病害之一，到目前為止還沒有很有效的方法來防治，通常采用的是用農(nóng)藥來殺死、控制傳染病毒的昆蟲，保護(hù)植物免受病毒侵染。這種方法的缺點(diǎn)是不但化學(xué)藥品的價(jià)格較高，而且往往造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。另一種方法是組織脫毒法，用于無性繁殖的一些植物，取這類植物的莖尖、芽點(diǎn)等病毒尚未入侵到的組織，通過組培的方法，育出大量的無毒苗，用于田間生產(chǎn)。目前在馬鈴薯、草莓等生產(chǎn)上已經(jīng)應(yīng)用。這個方法的缺點(diǎn)是，組培脫毒育苗不但成本高，工作量大，而且由于病毒的田間再侵染，能維持無毒的有效期不長，兩三年后產(chǎn)量又會嚴(yán)重下降。還有一種防病毒的方法叫交叉保護(hù)(cross protection)法，當(dāng)把一種病毒的弱株接種到植物上，同種的強(qiáng)病毒再侵染這些植物時(shí)，表現(xiàn)出植株受到保護(hù)的現(xiàn)象，此時(shí)強(qiáng)病毒的侵染能力和致病能力都大大降低。我國從70年代開始，主要將此法用于防止蕃茄上的病毒病，80年代在抗木瓜環(huán)斑病毒上也曾使用此法。這個經(jīng)典的、利用病毒的交叉保護(hù)特點(diǎn)建立的方法也存在著一些問題。首先，需要找到一株弱病毒，找到一株適用的這樣的病毒，往往需要幾年時(shí)間；其次，雖然選用的是弱病毒，但仍能在一定程度上降低此種作物的產(chǎn)量；再者，弱病毒株只能與和它相類似的病毒有交叉免疫作用，而對相距較大的病毒種類沒有什么作用，有時(shí)甚至還能和這些不相關(guān)的病毒相互影響，加重病害，使作物遭到更大的損失。加之工作量大，成本高，此法比較難以廣泛使用。下面介紹如何利用植物基因工程方法解決病毒防治，現(xiàn)有5種方法。
第一種方法是向植物轉(zhuǎn)入病毒的外殼蛋白基因。1986年，在美國通過植物基因工程成功地獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。他們首次地將煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)移到了煙草和番茄的細(xì)胞里去，并培育成株。在這種番茄和煙草的葉片里都測到了煙草花葉病毒的外殼蛋白，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)用煙草花葉病毒侵染這些植物時(shí)，這些植株能在一定程度上有抵抗作用。TMV外殼蛋白基因在細(xì)胞中的存在，能抑制TMV在寄主細(xì)胞中的復(fù)制，并能阻止或降低TMV在植株體內(nèi)的傳遞。1986年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在溫室里得到的，后經(jīng)美國濃業(yè)部批準(zhǔn)，這種轉(zhuǎn)基因番茄已在美國的幾個不同的地區(qū)，進(jìn)行了大田實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，它們在大田里的表現(xiàn)和在溫室里的表現(xiàn)一致。大田實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)說明有TMV外殼蛋白的番茄，在接種TMV后，只有5％左右的植株得病，而對照植株的發(fā)病率是99％。在產(chǎn)量上與無病株相比，含TMV外殼蛋白的番茄幾乎不減產(chǎn)，而對照組的產(chǎn)量損失達(dá)26—35％。從此提供了一條通過植物基因工程來抗病毒的十分誘人的途徑。繼抗煙草花病毒的外殼蛋白基因工程成功之后，現(xiàn)在已經(jīng)完成的還有黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、苜?；ㄈ~病毒(AIMV)和最近即將報(bào)導(dǎo)的大豆花葉病毒(SMV)等的外殼蛋白基因工作。應(yīng)該說，使用轉(zhuǎn)病毒的外殼蛋白基因方法培育出來的抗病毒植物比較安全。因?yàn)橥鈿さ鞍妆旧聿]有毒性，我們平日吃的番茄和馬鈴薯里就有這些病毒，只是到目前為止我們還沒有足夠的證據(jù)證明這個方法能夠解決所有種類的病毒危害。也許這種辦法有一定的限度，但是直到目前為止我們還未曾發(fā)現(xiàn)它有什么副作用。另一個問題是，如果某種病毒的外殼蛋白能夠裝配蟲傳的它種病毒的RNA的話，也許會發(fā)生危險(xiǎn)。但是，直到目前為止并沒有提出任何有這種危險(xiǎn)存在的跡象和實(shí)際根據(jù)。
第二種方法是通過病毒的衛(wèi)星RNA的植物基因工程來防治病毒。不少種類的病毒有衛(wèi)星RNA。黃瓜花葉病毒(CMV)的衛(wèi)星RNA是用于植物基因工程方面最早獲得成功的一個例子抗黃瓜花葉病毒的工程植株(轉(zhuǎn)基因植物)。但是人們普遍地認(rèn)為，因?yàn)椴《镜男l(wèi)星RNA存在著不能徹底地抑制它的互補(bǔ)病毒的復(fù)制，本身具有很高的突變率，以及與它種病毒互補(bǔ)后會加強(qiáng)被補(bǔ)病毒的危害等幾個問題，如果在生產(chǎn)上使用會有一定的潛在危險(xiǎn)。因此，目前這方面的研究存在著一些困難，需要設(shè)計(jì)一些新的實(shí)驗(yàn)。如對衛(wèi)星RNA的cDNA搞些點(diǎn)突變，作些改造，也許能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用。
第三種方法是利用病毒的反義RNA。這個方法最早用在動物病毒上，具體的作法是將病毒的基因組反向地結(jié)合在啟動子后，這樣就能在轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞里編碼出反義基因。當(dāng)外源的病毒RNA侵染進(jìn)入植物細(xì)胞之后，和這些細(xì)胞里編碼出來的反義RNA形成互補(bǔ)，構(gòu)成雙鏈的RNA，使得病毒無法復(fù)制，減輕了病毒的危害。利用植物基因工程的技術(shù)，已經(jīng)成功地將植物的一些病毒基因組反過來接在植物的啟動子后面，轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞里去，出現(xiàn)了能抵抗這些病毒侵染的結(jié)果。但是，這個方法也還有一些缺點(diǎn)，主要問題是需要比較大量的反義RNA才能徹底抵抗外源病毒的入侵。它的產(chǎn)量起碼還要提高50倍，而目前的植物啟動子都還達(dá)不到這個水平。所以，這個方法可以抵抗不太嚴(yán)重的病毒侵染；當(dāng)入侵病毒的數(shù)量大時(shí)，它所起的作用就很小了。
第四個方法是利用植物自己編碼的抗病基因。有些植物在受病毒侵染時(shí)，表現(xiàn)出一定的抵抗能力，最明顯的例子是有的番茄品種能抗煙草花葉病毒。育種家們有許多帶抗原的材料。我們可以通過克隆這類抗原基因，得到抗某種病毒的轉(zhuǎn)基因植物。這方面的工作的困難在于分離到能被利用的基因。但是如果這種方法成功，這種轉(zhuǎn)基因植物的危險(xiǎn)性應(yīng)該最小。
第五，利用病毒上的其他基因。前面說到過的是利用病毒中的一個外殼蛋白基因。在病毒基因組中除了外殼蛋白基因外，還有其他一些基因，其中有轉(zhuǎn)移基因、復(fù)制酶基因等等，我們有可能用改造基因組的辦法得到抗病毒的基因。這個辦法目前尚處于探索階段。
在上述5種方法中，比較成功的還是前三種，在國外都已達(dá)到得到轉(zhuǎn)基因植物的階段，有的甚至已經(jīng)進(jìn)入大田實(shí)驗(yàn)。我國已經(jīng)開展這方面的工作，并且已得到了不少成果。針對一些國內(nèi)廣泛流行嚴(yán)重危害的作物病毒，我們實(shí)驗(yàn)室開展了它們的外殼蛋白基因分離和轉(zhuǎn)化的工作。現(xiàn)已成功地分離并合成了編碼煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒和另外幾種常見的作物病毒的外殼蛋白基因，并對這些基因作了序列等方面的分析；同時(shí)還得到了其中一些病毒外殼蛋白基因?qū)ξ覈F(xiàn)生產(chǎn)用的煙草、番茄優(yōu)良品種的基因轉(zhuǎn)化植物。全世界每年由植物病毒危害造成的作物減產(chǎn)，至少以10％計(jì)。我們這么大的農(nóng)業(yè)國家，其損失難以計(jì)數(shù)。植物基因工程這一方面的工作對農(nóng)業(yè)增產(chǎn)會有立竿見影的好處，我國需要大力開展這方面的工作。
發(fā)明的目的1、甜椒是在世界范圍內(nèi)廣泛種植，并為各國人民喜愛和接受的一種通用蔬菜，它常年使用，和普遍出現(xiàn)在各種擋次的餐桌上，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
我國的甜椒栽培品種到目前為止除僅有少數(shù)幾個略耐CMV的品種之外，幾乎全都不抗CMV。而CMV在我國不分地域全都產(chǎn)生嚴(yán)重危害，輕者減產(chǎn)30％以上。重則絕產(chǎn)，幼株染病則很難成活。
本發(fā)明即針對以上問題而設(shè)計(jì)，提供了一種抗CMV的甜椒種子，經(jīng)田間試驗(yàn)，在對照組99％染重病的情況下，只有2％染病而且病勢輕微，證明解決了CMV感染這一問題。
2、甜椒一直是在組培再生產(chǎn)方面尚有一定困難的植物，特別是基因轉(zhuǎn)化后的再生問題，國際幾個知名實(shí)驗(yàn)室若干年來，長期未能克服不易組培產(chǎn)生轉(zhuǎn)化再生株的問題，這個問題直接阻礙著甜椒的轉(zhuǎn)基因育種工作，針對這一問題本發(fā)明提供了一種獲得轉(zhuǎn)基因組培苗并提高甜椒組培苗再生能力的方法。
發(fā)明的內(nèi)容及方案a.分離出流行于我國的CMV病毒，并克隆了編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因，并作了全序列測定及比較。
b.找到了一種提高甜椒組培苗出苗率的方法。
c.培育出了抗CMV的基因工程植株并進(jìn)行了田間試驗(yàn)。
發(fā)明的具體內(nèi)容a.從我國山東大田的發(fā)病煙草葉片中分離出流行于我的CMV病毒。
b.克隆編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因。
c.通過對DNA全序列的測定和比較，確定所分離的CMV屬CMV—D亞組。
d.將此基因，利用土壤農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法，分別轉(zhuǎn)入苗齡為10—15天的甜椒子葉、真葉、下胚軸等外植體。
e.誘導(dǎo)出芽，及使芽伸長的培養(yǎng)基見說明書。
g.以MS＋I(xiàn)AA0.5mg/l＋蔗糖30％的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，形成甜椒與小植株。
f.誘芽培養(yǎng)基中含卡那霉素對獲得外源目的基因的再生芽進(jìn)行篩選。
h.在轉(zhuǎn)化后的再生小植株中檢測到CMV外殼蛋白基因。
i.將組培所得植株移入溫室，盆栽，經(jīng)接CMV病毒檢測抗CMV。
j.子二代大田種植，遺傳性狀穩(wěn)定，抗性表現(xiàn)良好。
優(yōu)點(diǎn)及效果1、甜椒對CMV的感染十分敏感并普遍缺乏抗性，本發(fā)明可選用任一品質(zhì)優(yōu)良的甜椒品種，將本發(fā)明所克隆的CMV—CP基因轉(zhuǎn)入，以提高它們對CMV的抗性，從而提高了它們的產(chǎn)量，使之成為一個帶有新的抗病遺傳基因的甜椒品系。
2、由于增加了抗CMV能力和進(jìn)一步的組培單系選育，由基因工程技術(shù)所育得的新品系在產(chǎn)量和品質(zhì)方面都優(yōu)于原始材料。
3、田間試驗(yàn)，在對照組99％染重病的情況下，基因工程植株只有2％染病，且病勢輕微。
4、本項(xiàng)目中對甜椒的組培進(jìn)行了大量的研究和試驗(yàn)，找到了最佳培養(yǎng)基配方，使不宜組培的甜椒苗誘導(dǎo)率達(dá)100％。
實(shí)施例一、黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因的cDNA克隆和全序列測定及比較近年來，植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展為培育抗病毒植物提供了一條新的途徑。Powell等人將編碼煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白的基因加上植物基因啟動子，并導(dǎo)入煙草細(xì)胞中使之表達(dá)，首次獲得了可以抵抗TMV的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄。隨后，人們用類似的方法分別獲得了可以抗黃瓜花葉病毒(CMV)、苜蓿花葉病毒、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的煙草、番茄、馬鈴薯等，成為目前培育抗病毒植物的一條很重要的途徑。
CMV是一種在世界上分布很廣的植物正鏈RNA病毒，可以侵染單子葉和雙子葉植物的85科365屬中的775種植物，由于缺乏合適的育種抗原材料，而且其傳播媒介—蚜蟲又難于控制，對蔬菜、煙草、香蕉等作物造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。CMV的RNA基因組中含有四種組分(RNA1-4)，屬于Q株系的RNA1—4的核苷酸序列都已被確定。編碼外殼蛋白的基因分別在RNA4(1.0kb)和RNA3(2.2kb)之中。我們從山東大田的發(fā)病煙草中分離出流行于我國的CMV病毒，并克隆了編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因。通過對DNA全序列的測定及比較，發(fā)現(xiàn)我們所分離的CMV屬于CMV—D所在的亞組，利用轉(zhuǎn)基因植物來表達(dá)這一基因以達(dá)到抗黃瓜花葉病毒的工作正在進(jìn)行。
材料與方法cDNA合成試劑盒、DNA序列分析試劑盒均購自Promega公司。α-32P-dNTP為Amersham產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶等生化制劑購自華美公司。
1、病毒及其RNA的提取從山東大田的發(fā)病煙葉中，以改進(jìn)的Peden等人的方法提取病毒，即用聚乙二醇6000沉淀植物組織抽提液，經(jīng)差速離心、超速離心和蔗糖密度梯度離心(10—40％)后，得到提純的病毒，將病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA。
2、cDNA合成和克隆人工合成一段含24個核苷酸的DNA序列作為引物，5′—TGGTCTCCTTATG GAGAACCTGTG—3′。該引物由北京大學(xué)生物系生命中心ABI DNA合成儀合成，可以與CMV RNA 1—4的3′端互補(bǔ)。cDNA的合成是以CMV的總RNA為模板，用Gubler和Hoffman報(bào)道的方法進(jìn)行的。
雙鏈cDNA用T4 DNA聚合酶進(jìn)行末端補(bǔ)平，將質(zhì)粒Bluescript用EcoRV切開作為載體，用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化菌經(jīng)篩選后，挑出其中的白色菌落進(jìn)行分析。
3、篩選和鑒定重組質(zhì)料根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CMV外殼蛋白基因中有一個EcoRI位點(diǎn)，其它RNA序列中沒有。故用EcoRI酶切的方法篩選重組質(zhì)粒。
4、DNA序列分析將全長的cDNA克隆用多種限制性內(nèi)切酶切開，并亞克隆在Bluescript載體上，以雙脫氧核昔酸鏈終止法，直接用雙鏈DNA測定其cDNA序列。即先將超螺旋的質(zhì)粒DNA在0.2mol/LNaOH中變性5min，再以0.4倍體積的5mol/L NH4Ac中和，乙醇沉淀，變性的質(zhì)粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法測定DNA序列。
結(jié)果1、cDNA的合成在合成cDNA的第一鏈和第二鏈時(shí)，都加入了α-32P-dATP。經(jīng)堿性膠電泳后，得到放射自顯影的X光片。最長的cDNA片段可達(dá)3kb。而CMV RNA基因組在1.0—3.4kp范圍內(nèi)，所以從合成的cDNA中有希望獲得外殼蛋白基因的完整序列。
cDNA合成電泳照片，a.λDNA/HindIII；b.cDNA第一鏈；c.cDNA第二鏈；d.T4 DNA聚和酶補(bǔ)成平末端的cDNA。圖1為質(zhì)粒pHC210插入片段的部分限制性內(nèi)切酶圖譜及亞克隆片段A質(zhì)粒pHC210中載體多位點(diǎn)接口的部分酶切位點(diǎn)和插入片段的部分酶切圖譜。cDNA插入位點(diǎn)為EcoRV；B.為進(jìn)行插入片段全長的DNA序列分析所做的亞克隆片段，自上而下為HindIII-HindIII片段、SaII-SaII片段、EcoRI-EcoRI片段、SaII-EcoRI片段。圖2為質(zhì)粒pHC210插入片段全長的DNA序列及由序列推出的氨基酸序列與CMV—D相應(yīng)序列的比較自上而下為pHC210插入片段的氨基酸序列、pHC210插入片段的DNA序列，CMV—D相應(yīng)片段的DNA序列(與第二行的核苷酸相同者標(biāo)以“+”，不同者則列出相應(yīng)的核苷酸)、CMV—D外殼蛋白的按基酸序列(與第一行相同者標(biāo)以“*”，不同者則列出)。
2、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定cDNA經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，得到900多個白色菌落，經(jīng)小鏈提取質(zhì)粒，EcoRI酶切分析后，得到21個陽性克隆，插入片段在0.5—2.0kp之間，對其中的一個質(zhì)粒pH210的插入片段進(jìn)行了部分DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與發(fā)表的CMVD株系的外殼蛋白基因序列吻合良好。
3、pHC210質(zhì)粒插入片段的完整序列分析及與其它株系間外殼蛋白基因同源性的比較經(jīng)酶切測定，pHC210質(zhì)粒的插入片段約有1kb，為了測定其完整序列，先分析了這段DNA的物理圖譜并進(jìn)而做了不同酶切片段的亞克隆。這段DNA的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)是SaII(0.1kb)，EcoRI(0.35kb)，HindIII(0.36kb)，XhoI(0.63kb)，SaII(0.6kb)，其中EcoRI(0.35kb)和SaII(0.66kb)是CMV—D的相應(yīng)序列中所沒有的，其它位點(diǎn)和CMV—D一致。DNA序列分析的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。
通過對pHC210質(zhì)粒插入片段的四種亞克隆的DNA序列分析，得到了該質(zhì)粒完整插入片段的序列(見圖2)。經(jīng)與CMV—D的外殼蛋白基因比較，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒中含有完整的CMV外殼蛋白基因。該片段全長1008bp，5′端非編碼區(qū)53bp，3′端具有完整的301bp的非編碼區(qū)，外殼蛋白基因編碼區(qū)654bp。這段1008bp的序列與CMV—D的相應(yīng)序列相比，同源率為92.6％，其中基因編碼區(qū)的同源率為93.9％。與CMV—Q的相應(yīng)序列相比，同源序列占73.1％，基因編碼區(qū)的同源序列占77.1％。由這段序列推知該基因編碼的蛋白含218個氨基酸殘基，分子量為24060。與CMV—D外殼蛋白所含氨基酸殘基數(shù)相等，分子量也很接近(后者分子量為24100)。序列同源率為96.3％。CMV—Q外殼蛋白含有較多的氨基酸殘基(236個)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％。
近年來的研究結(jié)果表明，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和核酸序列同源性的比較可以將CMV的絕大部分株系分為兩個亞組。CMV—Q、CMV—R、CMV—S等屬于一個亞組，CMV—D、CMV—C、CMV—Ma等屬于另一個亞組。上述cDNA序列同源性比較表明，流行于我國的這種CMV株系應(yīng)屬于CMV—D所在的亞組。
二、甜椒的離體再生和基因轉(zhuǎn)化1、材料和方法分別以甜椒的子葉、真葉、下胚軸為材料在培養(yǎng)基MS＋6mg/L BA＋0.5mg/L IAA＋3％蔗糖和MS＋6mg/L BA＋3％蔗糖上誘導(dǎo)出芽，繼而通過芽伸長，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS＋0.5mg/L IAA＋3％蔗糖，誘導(dǎo)其生根，形成甜椒小植株。
甜椒基因轉(zhuǎn)化通過土壤農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法，分別用含GUS基因和CMV外殼蛋白基因的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化苗齡為10—15天的甜椒子葉，用含kanamycin的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選、培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)化的子葉發(fā)黃死去，轉(zhuǎn)化的子葉分化出新芽和根。在抗性芽中檢測到GUS基因的穩(wěn)定表達(dá)，在轉(zhuǎn)化后的再生小植株中檢測到CMV外殼蛋白基因整合到植物基因組中。
植物材料甜椒品種選用市售品種。
種子消毒方法清水浸泡半小時(shí)，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘，再用無菌水漂洗3—4次。
消毒后的種子置于1/2MS固體培養(yǎng)基上，于25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成無菌苗，分別取5天，15天，30天苗齡的子葉，10天苗齡的下胚軸，30天苗齡的真葉為外植體進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化。
植物的組織培養(yǎng)在超凈工作臺內(nèi)將外植體取出接種于培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基為MS＋3％蔗糖。在此基礎(chǔ)上分別加不同種類及濃度的激素，以誘發(fā)不同的外植體器官的發(fā)生。試驗(yàn)的培養(yǎng)基見表<1>。
細(xì)菌菌株和質(zhì)粒供試菌種R1000PBI帶有GUS和NPT—II基因，屬雙元載體系統(tǒng)。
A32帶有CMV外殼蛋白基因和NPT—II基因，屬共整和載體系統(tǒng)。其中黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因是從我實(shí)驗(yàn)室在山東大田發(fā)病煙草中分離出的病毒中克隆的。
在平板上挑單菌落，R1000PBI置于液體LB＋50mg/Lkana培養(yǎng)基中，A32置于液體LB＋50mg/L kana＋50mg/L spc培養(yǎng)基中，于27℃搖床上培養(yǎng)20—25小時(shí)。至細(xì)菌處于對數(shù)生長期時(shí)，3000rpm離心10分鐘，棄上清。菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮并稀釋5—10倍，至OD600值＝0.1-0.2。稀釋好的菌液用于轉(zhuǎn)化。
哺育細(xì)胞使用生長迅速的胡蘿卜懸浮細(xì)胞系。由本實(shí)驗(yàn)室提供。
基因轉(zhuǎn)化步驟在超凈工作臺內(nèi)剪下外植體，其中子葉、真葉完整地連葉柄剪下，下胚軸要注意去除生長點(diǎn)。將剪好的外植體放入稀釋好的菌液中浸泡2—3分鐘。用無菌濾紙吸干表面菌液。
用無抗生素的MS固體培養(yǎng)基倒入直徑為12CM的培養(yǎng)皿中，待其冷卻，在其上鋪少許胡蘿卜細(xì)胞，放上一層無菌濾紙，將吸干菌液的外植體置其上，培養(yǎng)皿封上Parafilm后置于暗箱中3—4天，進(jìn)行培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化。
將轉(zhuǎn)化后的外植體轉(zhuǎn)入含不同激素條件的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中加入100mg/L kana，500mg/L card，進(jìn)行篩選與誘導(dǎo)，直至再生抗性芽及植株的產(chǎn)生。取其中的葉片和愈傷組織用于檢測。
檢測GUS檢測，大腸桿菌GUS基因編碼一個β—葡萄糖醛酸苷酶，該酶可以分解β—葡萄糖醛酸苷類化合物，若以4—甲基傘形酮?！?D葡萄糖醛酸苷為底物，可以生成帶有熒光的4—甲基傘形酮。這個產(chǎn)物可以在激發(fā)興365nm，發(fā)射光455nm波長下檢測到。
試劑1.反應(yīng)緩沖液50mM NaPO4(PH＝7.0)1mM EDTA0.1％Triton-10010mMβ-meroaptoethanol2.底物緩沖液1mM4-methylumbelliferyL-β-Dglucusonide
(MUG)用反應(yīng)緩沖液配制。
3.終止緩沖液0.2N NaCO3步驟1.植物材料收集后，用液氮破碎，加100μl冷反應(yīng)緩沖液，離心2分鐘；2.取60μl樣品，加60μl底物緩沖液，留一半作對照；3.另一半37℃保溫過夜；4.加2.0μlNa2Co3；5.測熒光，激發(fā)光365nm，發(fā)射光445nm，10nM4-甲基傘形酮為標(biāo)準(zhǔn)。
蛋白測定取20μl步驟1所得上清楚，測OD280、OD260，同時(shí)用考馬斯亮蘭法較正。
比較生成4—甲基傘形酮隨時(shí)間變化的斜率，計(jì)算空白與樣品間的差異。
PCR檢測提取植物DNA步驟采用CTAB方法，過程如下1、取植物葉片，液氮碾磨，放入Eppendoff管中；2、加入500μl 160℃預(yù)熱數(shù)分鐘的2×CTAB提取緩沖液(0.2％β-球基乙醇，2％CTAB，1.4N Nacl，0.1M Tris.Cl PH8.0，0.02M EDTA)置60℃水浴45分鐘；3、加等體積24∶1氯仿∶異戊醇，溫和晃動數(shù)次，5000rpm離心5分鐘；4、上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，用24∶1氯仿∶異戊醇再抽提一次，條件同上；5、加2/3體積的異丙醇，-20℃沉淀30分鐘；6、10000rpm離心2分鐘，棄去上清；7、重懸于100μlTE(PH8.0)中，加1/10體積2M NaOAc和2.5體積無水乙醇沉淀；8、10000rpm離心2分鐘，棄去上清；9、70％乙醇洗滌兩次；10、常溫下風(fēng)干，DNA沉淀重懸于TE中；11、電泳，檢驗(yàn)植物總DNA含量。
反應(yīng)體系使用無菌的0.5ml硅化離心管按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加樣和操作反應(yīng)物 加樣順序 體積 終濃度10X緩沖液 1 5μl 1X緩沖液4XdNTPMix 2 5μl 200μM/per dNTPPrimerl 3 2μl 50pmol/per reactionPrimer2 4 2μl 50pmol/per reaction模板DNA 5 2.5μ 0.5μg/per reactionTag DNA酶 6 3U 2.5-3U/per reactionDMSD 6 2.5μl -加無菌去離子水至100μlCMV外殼蛋白基因兩端引物的結(jié)構(gòu)Primer15′＞ATG GAC AAA TCT GAA＜3′Primer25′＞TCA AAC TGG GAG TCA＜3′實(shí)驗(yàn)操作程序?qū)⑽醇覶ag DNA polymerase的反應(yīng)管中的樣品混勻，反應(yīng)管放入95℃水浴中反應(yīng)10分鐘。取出反應(yīng)管，在臺式離心管上快速離心，使冷凝于管蓋的液滴沉下，然后，加入Tag DNA Poly merase，混勻并離心，最后加上50→80μl石蠟油，于72℃反應(yīng)2分鐘，即可循環(huán)循環(huán)參數(shù)93℃變性反應(yīng)30秒55℃退火反應(yīng)90秒72℃延伸反應(yīng)150秒經(jīng)過30→36個循環(huán)后，在進(jìn)行到最后一個循環(huán)時(shí)，72℃延伸反應(yīng)增加5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，使之冷卻到室溫后放于4℃保存，并進(jìn)一步分析，使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳。
甜椒的組織培養(yǎng)甜椒子葉在培養(yǎng)基MS＋BA6mg/L＋3％蔗糖上培養(yǎng)兩周后，在子葉上切口處誘導(dǎo)出綠色小芽，每個外植體10—20個，芽長至1—1.5cm后不再長大，此時(shí)將其轉(zhuǎn)入MS＋1mg/LGA3＋2mg/LZT，2-3周后葉片展開，并有莖的伸長，但伸長率很低。共得到4株伸長的芽，將其轉(zhuǎn)入MS＋0.5mg/LI AA＋3％蔗糖的生根培養(yǎng)基上生根，得到再生小植株。該植株正在繼續(xù)培養(yǎng)，以便移入土壤。
在甜椒的離體再生培養(yǎng)過程中，考查了激素、苗齡、位置效應(yīng)對于分化的影響。
①激素條件考查了離體再生的不同階段中的最佳激素條件。由表(1)的結(jié)果，確定了以子葉為外植體的培養(yǎng)過程中，MS＋6mg/LBA＋0.5mg/LIAA為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS＋1mg/LGA3＋2mg/LZT為伸長培養(yǎng)基，MS＋0.5IAA為生根培養(yǎng)基。所以下一步的基因轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)抗性植株過程中均使用這幾種激素條件。
②苗齡子葉外植體的生理年齡是影響器官再生的因素之一，在本實(shí)驗(yàn)中，比較了5天，12天，30天苗齡的子葉分化的情況(見表2)。結(jié)果表明12天苗齡的子葉分化能力最強(qiáng)，30天苗齡的子葉誘導(dǎo)出芽時(shí)間長，分化能力有所降低，芽伸長也較難；5天苗齡的子葉只能誘導(dǎo)出胚性愈傷和少數(shù)芽點(diǎn)。
③位置效應(yīng)在甜椒再生過程中，位置效應(yīng)也是一個重要的影響因素。在這方面，F(xiàn)ari，M和Czako，M曾于1981年報(bào)道下胚軸的分化情況，即基部的下胚軸分化出根，上端胚段分化出芽。我將子葉橫切為二，置于培養(yǎng)基MS＋6mg/LBA＋0.5mg/LIAA上。發(fā)現(xiàn)上半部分幾乎無分化能力，而帶有葉柄的基部子葉分化頻率為100％。而且兩端切口處呈現(xiàn)不同分化趨勢從基部分化出根，從端部分化出芽。這個效應(yīng)對以后的芽伸長及再生有較大影響。
三、甜椒的基因轉(zhuǎn)化的觀察結(jié)果
1.GUS基因轉(zhuǎn)化結(jié)果R1000PBI菌種轉(zhuǎn)化甜椒葉片在含Kanamycin的培養(yǎng)基上生長的抗性芽上生長的抗性芽以及對照在轉(zhuǎn)入含Kanamycin培養(yǎng)基一周后死去。
取在含Kanamycin培養(yǎng)基上長出的抗性芽進(jìn)行MUG熒光檢測(見表3)，由表3中數(shù)據(jù)可知轉(zhuǎn)化樣品MU含量為對照樣品MU含量的8倍，表明轉(zhuǎn)化樣品有GUS基因活性。
2.黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化結(jié)果土壤農(nóng)桿菌A32含有一個35s啟動子引導(dǎo)的CMV外殼蛋白的基因，該基因大約600bp，不存在于正常植物中，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明轉(zhuǎn)化植物在600bp有一特征條帶。而在未轉(zhuǎn)化對照植株中看不到這一條帶。表明我們已經(jīng)將CMV外殼蛋白基因整合到甜椒染色體中。
四、甜椒的離體再生株的獲得以苗齡10—16天的子葉為外植體，經(jīng)過芽誘導(dǎo)、芽伸長、根誘導(dǎo)、移入土壤四個步驟的離體培養(yǎng)，已獲得能正常開花結(jié)實(shí)的再生植株。所用培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同種類不同濃度的植物激素。最適的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋4－6mg/L BA＋0.5mg/L IAA，芽誘導(dǎo)率可達(dá)100％。誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)入MS＋2mg/L zeatin或2mg/L BA＋1－2mg/L GA的培養(yǎng)基上，可使芽伸長，伸長率為35％左右。已伸長的芽在生根培養(yǎng)基MS或MS＋0.1－0.5mg/L NAA上生根后，轉(zhuǎn)入土壤成為正常植株。
一般認(rèn)為甜椒是一種較難進(jìn)行遺傳操作的蔬菜作物。自從1978年，Gunay和Rao首次報(bào)道從C.annuum的3個品種中成功地再生芽以來，國外曾陸續(xù)有一些有關(guān)C.annuum組織培養(yǎng)的報(bào)道。但這些報(bào)道中，有的再生周期較長，有的只停留在芽誘導(dǎo)階段，沒有詳細(xì)涉及芽的伸長及再生完整植株。本發(fā)明首次利用我國甜椒栽培品種的子葉進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功地獲得再生植株，并已正常開花結(jié)實(shí)。同時(shí)進(jìn)行甜椒的抗病毒基因轉(zhuǎn)化。
表1不同激素配比對甜椒外植體的誘導(dǎo)作用外植體 6—BA IAA NAA ZT 出芽 生根 愈傷12天子葉2 - --+++ - +12天子葉4 - --++++- -12天子葉6 - --++++- -12天子葉8 - --+++ - +12天子葉2 0.5 --+++ + ++12天子葉6 0.5 --+++++ -12天子葉- 0.5 --- +++++12天子葉- - 0.5 2- ++++++說明出芽(根、愈傷)率++++＞80％ +++60-80％ ++40-60％ +20-40％激素濃度單位mg/l表2苗齡 接種外植體數(shù) 分化外植體數(shù) 每外植體出芽數(shù) 最長芽 出芽率5天20 2 4 0.4 10％12天 20 20151.3 100％30天 20 126 0.8 57％表3甜椒GUS熒光檢測結(jié)果未轉(zhuǎn)化對照芽轉(zhuǎn)化芽保溫前熒光值0.079 0.071保溫后熒光值0.692 1.503蛋白量(OD值)0.381 0.142MU生成量(nM/mg蛋白) 29.4240.7


圖1質(zhì)粒pHC210插入片段的部分限制性內(nèi)切酶圖譜及亞克隆片段A質(zhì)粒pHC210中載體多位點(diǎn)接口的部分酶切位點(diǎn)和插入片段的部分酶切圖譜，cDNA插入位點(diǎn)為EcoRV。
B.為進(jìn)行插入片段全長的DNA序列分析所做的亞克隆片段，自上而下為HindIII-HindIII片段、SaII-SaII片段、EcoRI-EcoRI片段、SaII-EcoRI片段。
圖2質(zhì)粒pHC210插入片段全長的DNA序列及由序列推出的氨基酸序列與CMV—D相應(yīng)序列的比較自上而下為pHC210插入片段的氨基酸序列、pHC210插入片段的DNA序列，CMV—D相應(yīng)片段的DNA序列(與第二行的核苷酸相同者標(biāo)以“+”，不同者則列出相應(yīng)的核苷酸)、CMV—D外殼蛋白的按基酸序列(與第一行相同者標(biāo)以“*”，不同者則列出)。
權(quán)利要求
1.一種用基因工程方法培育的抗黃瓜花葉病毒病甜椒，其特征在于所述方法包括黃瓜花葉病外殼蛋白基因的cDNA克隆和全序列測定和比較；甜椒的離體再生和基因轉(zhuǎn)化；甜椒的離體再生株的獲得；1)黃瓜花葉病外殼蛋白基因的cDNA克隆和全序列測定和比較a.材料與方法cDNA合成試劑盒、DNA序列分析試劑盒均購自Promega公司，α-32P-dNTP為Amersham產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶等生化制劑購自華美公司；病毒及其RNA的提取從山東大田的發(fā)病煙葉中，以改進(jìn)的Peden等人的方法提取病毒，即用聚乙二醇6000沉淀植物組織抽提液，經(jīng)差速離心、超速離心和蔗糖密度梯度離心(10—40％)后，得到提純的病毒。將病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA；cDNA合成和克隆人工合成一段含24個核苷酸的DNA序列作為引物5′—TGGTCTCCTTATG GA GAACCTGTG—3′，該引物由北京大學(xué)生物系生命中心ABI DNA合成儀合成，可以與CMV RNA 1—4的3′端互補(bǔ)，cDNA的合成是以CMV的總RNA為模板，用Gubler和Hoffman報(bào)道的方法進(jìn)行的；雙鏈cDNA用T4 DNA聚合酶進(jìn)行末端補(bǔ)平，將質(zhì)粒Bluescript用EcoRV切開作為載體，用T4 DN A連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化菌經(jīng)篩選后，挑出其中的白色菌落進(jìn)行分析；篩選和鑒定重組質(zhì)粒CMV外殼蛋白基因中有一個EcoRI位點(diǎn)，其它RNA序列中沒有，故用EcoRI酶切的方法篩選重組質(zhì)粒；DNA序列分析將全長的cDNA克隆用多種限制性內(nèi)切酶切開，并亞克隆在Bluescript載體上，以雙脫氧核苷酸鏈終止法，直接用雙鏈DNA測定其cDNA序列，即先將超螺旋的質(zhì)粒DNA在0.2mol/L NaOH中變性5min，再以0.4倍體積的5mol/L NH4Ac中和，乙醇沉淀，變性的質(zhì)粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法測定DNA序列；b.結(jié)果cDNA的合成在合成cDNA的第一鏈和第二鏈時(shí)，都加入了α-32P-dATP，經(jīng)堿性膠電泳后，得到放射自顯影的X光片，最長的cDNA片段可達(dá)3kb，而CMV RNA基因組在1.0—3.4kb范圍內(nèi)，從合成的cDNA中獲得外殼蛋白基因的完整序列；重組質(zhì)粒的篩選和鑒定結(jié)果如下cDNA經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，得到900多個白色菌落，經(jīng)小鏈提取質(zhì)粒，EcoRI酶切分析后，得到21個陽性克隆，插入片段在0.5—2.0kb之間，對其中的一個質(zhì)粒pH210的插入片段進(jìn)行了部分DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與發(fā)表的CMVD株系的外殼蛋白基因序列吻合良好；pHC210質(zhì)粒插入片段的完整序列分析及與其它株系間外殼蛋白基因同源性的比較結(jié)果如下經(jīng)酶切測定，pHC210質(zhì)粒的插入片段約有1kb，為了測定其完整序列，分析了這段DNA的物理圖譜并進(jìn)而做了不同酶切片段的亞克隆，這段DNA的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)是SaII(0.1kb)，EcoRI(0.35kb)，HindIII(0.36kb)，XhoI(0.63kb)，SaII(0.66kb)，其中EcoRI(0.35kb)和SaII(0.66kb)是CMV—D的相應(yīng)序列中所沒有的，其它位點(diǎn)和CMV—D一致，DNA序列分析的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)；通過對pHC210質(zhì)粒插入片段的四種亞克隆的DNA序列分析，得到了該質(zhì)粒完整插片段的序列，經(jīng)與CMV—D的外殼蛋白基因比較，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒中含有完整的CMV外殼蛋白基因，該片段全長1008bp，5′端非編碼區(qū)53bp，3′端具有完整的301bp的非編碼區(qū)，外殼蛋白基因編碼區(qū)654bp，這段1008bp序列與CMV—D的相應(yīng)序列相比，同源率為92.6％，其中基因編碼區(qū)的同源率為93.9％，與CMV—Q的相應(yīng)序列相比，同源序列占73.1％，基因編碼區(qū)的同源序列占77.1％，由這段序列推知該基因編碼的蛋白含218個氨基酸殘基，分子量為24060，與CMV—D外殼蛋白所含氨基酸殘基數(shù)相等，分子量也很接近(后者分子量為24100)，序列同源率為96.3％，CMV—Q外殼蛋白含有較多的氨基酸殘基(236個)，相比之下，二者的同源氨基酸序列占71.5％；根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和核酸序列同源性的比較可以將CMV的絕大部分株系分為兩個亞組，CMV—Q、CMV—R、CMV—S等屬于一個亞組，CMV—D、CMV—C、CMV—Ma等屬于另一個亞組，上述cDN A序列同源性比較表明，流行于我國的這種CMV株系應(yīng)屬于CMV—D所在的亞組；2)甜椒的離體再生和基因轉(zhuǎn)化植物材料種子消毒方法清水浸泡半小時(shí)，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘，再用無菌水漂洗3—4次；消毒后的種子置于1/2MS固體培養(yǎng)基上，于25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成無菌苗，分別取5天，15天，30天苗齡的子葉，10天苗齡的下胚軸，30天苗齡的真葉為外植體進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化；植物的組織培養(yǎng)在超凈工作臺內(nèi)將外植體取出接種于培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基為MS＋3％蔗糖。在此基礎(chǔ)上分別加不同種類及濃度的激素，以誘發(fā)不同的外植體器官的發(fā)生；細(xì)菌菌株和質(zhì)粒供試菌種R1000PBI帶有GUS和NPT—II基因，屬雙元載體系統(tǒng)；A32帶有CMV外殼蛋白基因和NPT—II基因，屬共整和載體系統(tǒng)，其中黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因是從我實(shí)驗(yàn)室在山東大田發(fā)病煙草中分離出的病毒中克隆的；在平板上挑單菌落，R1000PBI置于液體LB＋50mg/lkana培養(yǎng)基中，A32置于液體LB＋50mg/lk ana＋50mg/lspc培養(yǎng)基中，于27℃搖床上培養(yǎng)20—25小時(shí)，至細(xì)菌處于對數(shù)生長期時(shí)，3000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮并稀釋5—10倍，至(OD600值＝0.1—0.2)，稀釋好的菌液用于轉(zhuǎn)化；哺育細(xì)胞使用生長迅速的胡蘿卜懸浮細(xì)胞系；基因轉(zhuǎn)化步驟采用葉盤法，在超凈工作臺內(nèi)剪下外植體，其中子葉、真葉完整地連葉柄剪下，下胚軸要注去除生長點(diǎn)，將剪好的外植體放入稀釋好的菌液中浸泡2—3分鐘，用無菌濾紙吸下表面菌液；用無抗生素的MS固體培養(yǎng)基倒入直徑為12CM的培養(yǎng)血白，待冷卻，在其上鋪少許胡蘿卜細(xì)胞，放上一層無菌濾紙，將吸菌液的外植體置其上，培養(yǎng)血封上Parafilm后置于暗箱中3—4天，進(jìn)行培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化；將轉(zhuǎn)化后的外植體轉(zhuǎn)入含不同激素條件的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中加入100mg/l kana500mg/l card，進(jìn)行篩選與誘導(dǎo)，直至再生抗性芽及植株的產(chǎn)生，取其中的葉片和愈傷組織用于檢測；GUS檢測大腸桿菌GUS基因編碼一個β—葡萄糖醛酸苷酶，該酶可以分解β—葡萄糖醛酸苷類化合物，若以4—甲基傘形酮酰-β-D—葡萄糖醛酸苷為底物，可以生成帶有熒光的4—甲基傘形酮，這個產(chǎn)物可以在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm波長下檢測到；反應(yīng)緩沖液50mM NaPO4(PH＝7.0)1mM EDTA0.1％Triton-10010mMβ-meroaptoethanol底物緩沖液1mM4-methylumbelliferyL-β-Dglucusonide(MUG)用反應(yīng)緩沖液配制終止緩沖液0.2N NaCO3步驟植物材料收集后，用液氮破碎，加100μl冷反應(yīng)緩沖液，離心2分鐘；取60μl樣品，加60μl底物緩沖液，留一半作對照；另一半37℃保溫過夜；加2.0μlNa2Co3；測熒光，激發(fā)光365nm，發(fā)射光445nm，10nM4-甲基傘形酮為標(biāo)準(zhǔn)；蛋白測定取20μl步驟1所得上清楚，測OD280、OD260，同時(shí)用考馬斯亮蘭法較正；比較生成4—甲基傘形酮隨時(shí)間變化的斜率，計(jì)算空白與樣品間的差異；PCR檢測提取植物DNA步驟，采用CTAB方法，過程如下取植物葉片，液氮碾磨，放入Eppendoff管中；加入500μl160℃預(yù)熱數(shù)分鐘的2×CTAB提取緩沖液(0.2％β-球基乙醇，2％CTAB，1.4N Nacl，0.1M Tris.Cl PH8.0，0.02M EDTA)置60℃水浴45分鐘；加等體積24∶1氯仿∶異戊醇，溫和晃動數(shù)次，5000rpm離心5分鐘；上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，用24∶1氯仿∶異戊醇再抽提一次，條件同上；加2/3體積的異丙醇，-20℃沉淀30分鐘；10000rpm離心2分鐘，棄去上清；重懸于100μlTE(PH8.0)中，加1/10體積2M NaOAc和2.5體積無水乙醇沉淀；10000rpm離心2分鐘，棄去上清；70％乙醇洗滌兩次；常溫下風(fēng)干，DNA沉淀重懸于TE中；電泳，檢驗(yàn)植物總DNA含量；反應(yīng)體系使用無菌的0.5ml硅化離心管按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加樣和操作反應(yīng)物 加樣順序 體積 終濃度10X緩沖液 1 5μl 1X緩沖液4XdNTPMix 2 5μl 200μM/per dNTPPrimerl3 2μl 50pmol/per reactionPrimer24 2μl 50pmol/per reaction模板DNA5 2.5μ 0.5μg/per reactionTag DNA酶 6 3U 2.5-3U/per reactionDMSD 6 2.5μl -加無菌去離子水至100μlCMV外殼蛋白基因兩端引物的結(jié)構(gòu)Primer15′＞ATG GAC AAA TCT GAA＜3′Primer25′＞TCA AAC TGG GAG TCA＜3′實(shí)驗(yàn)操作程序?qū)⑽醇覶ag DNA polymerase的反應(yīng)管中的樣品混勻，反應(yīng)管放入95℃水浴中反應(yīng)10分鐘。取出反應(yīng)管，在臺式離心管上快速離心，使冷凝于管蓋的液滴沉下，然后，加入Tag DNA Poly merase，混勻并離心，最后加上50→80μl石蠟油，于72℃反應(yīng)2分鐘，即可循環(huán)循環(huán)參數(shù)93℃變性反應(yīng)30秒55℃退火反應(yīng)90秒72℃延伸反應(yīng)150秒經(jīng)過30→36個循環(huán)后，在進(jìn)行到最后一個循環(huán)時(shí)，72℃延伸反應(yīng)增加5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，使之冷卻到室溫后放于4℃保存，并進(jìn)一步分析，使用0 8％瓊脂糖凝膠電泳；b.甜椒的組織培養(yǎng)篩選獲得抗CMV再生植株用1、2、3號的甜椒苗的子葉在培養(yǎng)基MS＋6mg/LBA＋3％蔗糖上培養(yǎng)兩周后，在子葉上切口處誘導(dǎo)出綠色小芽，每個外植體10—20個，芽長至1-1.5cm后不再長大，此時(shí)將其轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中，2-3周后葉片展開，并有莖的伸長；共得到4株伸長的芽，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上生根，得到再生小植株，該植株正在繼續(xù)培養(yǎng)，以便移入土壤；在甜椒的離體再生培養(yǎng)過程中，考查了激素、苗齡、位置效應(yīng)對于分化的影響，在以子葉為外植體的培養(yǎng)過程中，MS＋6mg/LBA＋0.5mg/LIAA為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS＋1mg/LGA3＋2mg/LZT伸長培養(yǎng)基，MS＋0.5IAA為生根培養(yǎng)基；苗齡子葉外植體的生理年齡是影響器官再生的因素之一，在本實(shí)驗(yàn)中，比較了5天，12天，30天苗齡的子葉分化的情況(見表2)，結(jié)果表明12天苗齡的子葉分化能力最強(qiáng)，30天苗齡的子葉誘導(dǎo)出芽時(shí)間長，分化能力有所降低，芽伸長也較難；5天苗齡的子葉只能誘導(dǎo)出胚性愈傷和少數(shù)芽點(diǎn)；位置效應(yīng)在甜椒再生過程中，位置效應(yīng)也是一個重要的影響因素，在這方面，F(xiàn)ari，M和Czako，M曾于1981年報(bào)道下胚軸的分化情況，即基部的下胚軸分化出根，上端胚段分化出芽，我將子葉橫切為二，置于培養(yǎng)基MS＋6mg/LBA＋0.5mg/LIAA上，發(fā)現(xiàn)上半部分幾乎無分化能力，而帶有葉柄的基部子葉分化頻率為100％，而且兩端切口處呈現(xiàn)不同分化趨勢從基部分化出根，從端部分化出芽。這個效應(yīng)對以后的芽伸長及再生有較大影響；3)甜椒的離體再生株的獲得以苗齡10—16天的子葉為外植體，經(jīng)過芽誘導(dǎo)、芽伸長、根誘導(dǎo)、移入土壤四個步驟的離體培養(yǎng)，已獲得能正常開花結(jié)實(shí)的再生植株，所用培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同種類不同濃度的植物激素，最適的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，芽誘導(dǎo)率可達(dá)100％，誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基上，可使芽伸長，伸長率為35％左右，已伸長的芽在生根培養(yǎng)基MS或MS＋0.1－0.5mg/LNAA上生根后，轉(zhuǎn)入土壤成為正常植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求11)所述，其特征是對PHC210質(zhì)粒插入片段的四種亞克隆的DNA序列分析，得到了該質(zhì)粒完整插片段的序列如下Met Asp Lys Ser Glu 5AGAGAGTCTGTGTTGTGTTTTCTCTTTTGTGTCGTAGATACTTGAGTCGAGTC ATG GAC AAA TCT GAA 68+++T++A++++C+++++++++++++++++++++++++ + ++++++++++++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * *Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg Arg Pro Arg Ala Gly Ser Arg Ser Ala 24TCA ACG AGT GCT GGT CGC AAC CGT CGA CGT CGT CCG CCT GCT GGT TCG CGC TCC GCT 125+++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CG+ +++ +++ +++ +++ ++C* * * * * * * * * * * * * Arg * * * * *Ser Ser Ser Ala Asp Ala Asn Phe Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn 43TCC TCC TCC GCG GAT GCC AAC TTT AGA GTG TTG TCG CAG CAA CTT TCG CGA CTT AAT 182C++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++G +++ +++ +++ +++ +++Pro * * * * * * * * * * * * * * * * * *Lys Thr Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly Ser Glu 62AAG ACG TTG GCA GCT GGT CGT CCT ACC ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA GGG AGT GAA 239+++ +++ ++A +++ +++ +++ +++ ++A ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Arg Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys Pro Pro Lys Ile Asp 81CGC TGT AAA CCT GGG TAC AGG TTC ACA TCT ATC ACC CTG AAG CCA CCG AAA ATA GAC 296+++ +++ +G+ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ ++A +++ +++ ++A +++ +++ +++* * Arg * * * * * * * * * * * * * * * *Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Pro Asp Ser Val Thr Glu Phe Asp 100CGG GGG TCT TAT TAT GGT AAA AGG TTG TTA TTA CCT GAT TCA GTC ACG GAA TTC GAT 353++T +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ C++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T +AT +++* * * * * * * * * * * * * * * * Asp Tyr *Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln Ile Arg Val Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser 119AAG AAG CTT GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT AAT CCT TTG CCG AAA TTT GAT TGT 410+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * *Thr Val Trp Val Thr Val Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Thr Ala 138ACG GTG TGG CTG ACA GTC CGT AAA GTT CCT GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTC ACC GCC 467+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++T G++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * Ala *Ile Ser Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala 157ATC TCT GCT ATG TTT GCG GAC GGA CCC TGA CCG GTA CTG GTT TAT CAG TAT GCT GCA 524+++ +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++* * * * * * * * * * * * ** * * * * *Ser Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp 176TCC GGA GTC CAA GCC AAC AAT AAG TTG TTG TAT GAT CTT TCG GCG ATG CCC GCT GAT 581++T +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++ C++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp Val Leu Glu 195ATT GGC GAC ATG CGA AAG TAC GCC GTA CTC GTG TAT TCA AAA GAC GAT GTC CTC GAG 638++A ++T +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +CG +++ +++* * * * * * * * * * * * * * * * Ala * *Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gln Arg Ile Pro Thr Ser Gly 214ACG GAT GAG CTA GTA CTT CAT GTC GAC ATA GAG CAC CAA CGC ATT CCC ACA TCT GGG 695+++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ ++T +++ ++C +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++A* * * * * * * * * * * * * * * * * * *Val Leu Pro Val --- 218GTG CTC CCA GTT TGA ATCCGTGTTTCCCAGAACCCTCCCTCGAGTTTTCTGAGGCCGGAGCTGAGTTGGC 765+C+ +++ +++ ++G +++ T++++++++ +++++++++++++++++GA+C+ +++T++T+++++++++++++++Ala * * * *AGTTCTCCTATAAACTGTCTGAAGTCACTAAACGCTTTGTGGTGAACGGGTTGTCCATCCAGCTTACGGCTAAAA 840++++++++++C+++++++++++++++++++++++T+++AC+++++++++++++++++++++++++++++++++++TGGTCAGTCGTGGAGAAATCCACGCCAGTAGACTTACAAGTCTCTGAGGCGCCTTTGAAACCATCTCCTAGGTTT 915++++++++++++++++++++++++++++++++T++++++A+++++++++++++++++++++++++++++++++++CTTCGGAAGGACTTCGGTCCGTGTAGTTCTACCACAAGATGCTAGTTTCAGGGTACGGGTGGTGCTC TC TG 986++++++++++++++++++++++++++C++++++++++CG+++++++++++++++++++++++CC+C+CA+TTTC+T GGGAGCTCCATAAGGAGACCA 1008+G+++GC+++++A++++++++++
3.根據(jù)權(quán)利要求12)中所述甜椒的組織培養(yǎng)篩選獲得抗CMV再生植株，其特征在于伸長培養(yǎng)基配方為MS＋1mg/1GA3＋2mg/LZT；生根培養(yǎng)基配方為MS＋0.5mg/LIAA＋3％蔗糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求13)中所述甜椒的離體再生株的獲得，其特征在于最適合的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS＋4－6mg/LBA＋0.5mg/LIAA；芽伸長培養(yǎng)基是MS＋2mg/L zeatin或2mg/LBA＋1－2mg/LGA。
全文摘要
通過土壤膿桿菌侵染的方法，將基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入甜椒的子葉、真葉、下胚軸，用含GUS基因和CMV外殼蛋白基因的土壤膿桿菌轉(zhuǎn)化苗齡為10-15天的子葉，用含Kanamycin的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選、培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子葉分化出新芽和新根。在抗性芽中檢測到GUS基因的穩(wěn)定表達(dá)，在轉(zhuǎn)化后的再生小植株中檢測到CMV外殼蛋白基因整合到植物基因組中；將所得甜椒植株轉(zhuǎn)入大田，得到轉(zhuǎn)基因抗CMV甜椒支系。
文檔編號C12N15/31GK1120586SQ9510280
公開日1996年4月17日 申請日期1995年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月29日
發(fā)明者陳章良 申請人:北京大學(xué)