專利名稱：重組p53腺病毒方法和組合物的制作方法
發(fā)明的背景本發(fā)明總地涉及重組技術(shù)領(lǐng)域。在某些方面，涉及簡化而有效的產(chǎn)生重組腺病毒的方法。在其他方面，提供包括p53腺病毒構(gòu)建體的新組合物及其制備方法，包括恢復(fù)p53功能及抑制有異常p53之細(xì)胞生長的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述目前治療腫瘤的方法，包括放射治療、外科治療和化學(xué)藥物治療均只有有限的效果。在美國每年僅死于肺癌的就有14萬人以上。近年，按年令組調(diào)查的婦女肺癌死亡率己超過了乳腺癌死亡率。雖然實(shí)施戒煙計(jì)劃后已減少了吸煙的風(fēng)行，但預(yù)計(jì)進(jìn)入21世紀(jì)肺癌死亡率仍將居高不下。合理的開發(fā)肺癌的新療法探取決于在分子水平上對肺癌生物學(xué)的了解。
現(xiàn)已證實(shí)，各種不同的腫瘤至少部分是由于導(dǎo)致一種或多種基因的過表達(dá)、或異?；蛲蛔兓虮磉_(dá)的遺傳異常引起的。例如，在許多情況下，已知“癌基因”的表達(dá)將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生?！鞍┗颉笔菑倪z傳上改變了的基因，其突變的表達(dá)產(chǎn)物以某種方式破壞正常細(xì)胞的功能或調(diào)控(Spandidos et al.，1989)。
已發(fā)現(xiàn)迄今研究的大多數(shù)癌基因都是突變而成為被“活化的”，所說的突變常常是發(fā)生在正常細(xì)胞基因即“原癌基因”之編碼區(qū)中的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致被表達(dá)之蛋白質(zhì)產(chǎn)物中的氨基酸取代。這種改變了的表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)有參于惡性生長過強(qiáng)的異常生物學(xué)功能(Travali et al.，1990)。可用各種手段，例如化學(xué)誘變或電離幅射引起根本性突變。現(xiàn)已鑒定了包括ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、iun和abl在內(nèi)的許多癌基因和癌基因家族，并在不同程度上確定了它們的性質(zhì)(Travali et al.，1990；Bishop，1987)。
在正常細(xì)胞生長期間，認(rèn)為生長促進(jìn)性原癌基因受到生長約束性腫瘤抑制基因的抗衡。有幾種因素可使這兩種力量失衡，導(dǎo)致腫瘤生成狀態(tài)。其中一種因素是腫瘤抑制基因的突變(Weinbery，1991)。
一種重要的腫瘤抑制基因是編碼細(xì)胞蛋白質(zhì)p53的基因，所說的p53是分子量53KD的控制細(xì)胞增殖的核內(nèi)磷蛋白。引起定位于染色體17p上應(yīng)該基因及某位基因丟失的突變是在人類惡性腫瘤中鑒定的最常見的改變。p53蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中是高度保守的，并且可在大多數(shù)正常組織中表達(dá)。已證明野生型53參于控制細(xì)胞周期(Mercer，1992)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Fields et al.，1990，和Mietz et al.，1992)、DNA復(fù)制(Wilcoch and Lane，1991和Bargonetti et al.，1991)及誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡(Yonish-Rouach et al.，1991和Shaw et al.，1992)。
各種突變p53等位基因是已知的，其中單個堿基取代導(dǎo)致具有相當(dāng)不同之生長調(diào)節(jié)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生(Hollstein et al.，1991)。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)p53基因是常見的人腫瘤中最常發(fā)生突變的基因(Hollstein et al.，1991；Weinberg，1991)，并且與那些同吸煙有關(guān)的腫瘤有著特殊的聯(lián)系(Hollstein et al.，1991；Zalcut-Houri et al.，1985)。也已報(bào)導(dǎo)p53在乳腺癌中的過表達(dá)(Casey et al.，1991)。
對腫瘤進(jìn)行基因治療的一個最具挑戰(zhàn)性的方面涉及利用腫瘤抑制基因，如p53。已報(bào)導(dǎo)了將野生型p53轉(zhuǎn)染到某些類型的乳腺和肺腫瘤細(xì)胞中可恢復(fù)細(xì)胞系中的生長抑制性控制(Casey etal.，1991；Takahasi et al.，1992)。雖然DNA轉(zhuǎn)染并不是將DNA導(dǎo)入病人細(xì)胞中的可行手段，但這些結(jié)果可以證明，如果能建立一種輸送p53基因的改良方法，則向帶有突變之p53基因的腫瘤細(xì)胞提供野生型p53可能是一種有效的治療方法。
近年已研究并開發(fā)了可應(yīng)用于腫瘤抑制之基因治療的基因釋放系統(tǒng)。鑒于病毒在感染真實(shí)活細(xì)胞(即一種病毒遺傳材料本身被轉(zhuǎn)移的過程)中的效力，所以對基于病毒的基因轉(zhuǎn)移載體特別感興趣。在這方面，例如在產(chǎn)生用于輸送各種基因的工程化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已取得了某些進(jìn)展。然而，與使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療相聯(lián)系的主要問題是因?yàn)樗鼈兊母腥拘砸Q于靶細(xì)胞上逆轉(zhuǎn)錄病基受體的可利用性、它們難于濃縮和純化、以及它們只能有效地整合到復(fù)制細(xì)胞中。
最近已提出將腺病毒載體系統(tǒng)用于某些基因轉(zhuǎn)移方法，但目前用于制備重組腺病毒的方法卻有幾方面的缺陷。這些方法依賴于磷酸鈣介導(dǎo)的向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體和腺病毒質(zhì)粒，以及其后對被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行噬斑檢測。這些類型的轉(zhuǎn)染步驟和檢測法效率低，而且一般只造成低水平的病毒增殖。
因此，仍需要開發(fā)將腫瘤抑制基因如p53導(dǎo)入作為恢復(fù)生長抑制之工具的細(xì)胞內(nèi)的新方法。不必進(jìn)行磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染及瓊脂糖鋪板以檢測噬斑的生產(chǎn)重組腺病毒的方法也將是有利的。
發(fā)明的概要本發(fā)明通過提供生產(chǎn)重組腺病毒如p53腺病毒的有效方法，以及恢復(fù)p53對帶有異常p53之細(xì)胞的功能的有效手段來解決前述的和其他一些問題。公開了含重組腺病毒載體和病毒顆粒的組合物，以及使用這樣的組合物促成有異常p53功能之細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞中野生型p53表達(dá)的方法。還公開了使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染然后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)及轉(zhuǎn)好進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析以增殖重組腺病毒的簡化方法。
此外，利用該新的產(chǎn)生并增殖重組腺病毒的方法，預(yù)計(jì)也可將其他基因摻入列病毒顆?；蚪M中。這些基因可包括腫瘤抑制基因如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(rb)基因、反義癌基因即抗C-myc和抗K-ras，以及用于腫瘤基因治療的其他生長控制相關(guān)基因。
本發(fā)明人已證明了本發(fā)明方法在控制轉(zhuǎn)移瘤生長中的顯著作用。已顯示Ad5CMV-p53重組腺病毒可顯著地降低被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率。該病毒抑制了病毒感染之H358細(xì)胞的致瘤性。當(dāng)在氣管內(nèi)接種H226Br細(xì)胞后病毒在氣管內(nèi)侵染時，其可阻止同位肺癌生長。抑制致癌性還提示，即使暫時表達(dá)高水平p53蛋白質(zhì)，也可足以誘導(dǎo)殺腫瘤效應(yīng)。
在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將野生型p53基因?qū)氚屑?xì)胞(例如包括惡性細(xì)胞類型在內(nèi)的推測有突變或異常p53基因的靶細(xì)胞)內(nèi)的載體構(gòu)建體。這些實(shí)施方案包括制備其中p53基因被置于否動子控制下的基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄單元，且所說的單元被插入重組腺病毒內(nèi)的腺病毒載體中?；谙率鰩讉€理由，本發(fā)明作為一個整體是令人驚奇并有其優(yōu)點(diǎn)的。首先，以前認(rèn)為由于p53病毒是有毒性的，所以不能進(jìn)入包裝細(xì)胞例如用于制備腺病毒的細(xì)胞內(nèi)增殖；第二，腺病毒的E1B與p53結(jié)合并因此而干擾其功能；第三，一旦增殖后即發(fā)現(xiàn)p53腺病毒可在抑制各種腫瘤細(xì)胞生長中發(fā)揮意想不到的效果；最后，肺癌細(xì)胞的致癌性是通過用Ad5CMV-p53處理而不是通過控制病毒而受到抑制的，表明新的p53蛋白質(zhì)輸送和制備具有意想不到的治療效力。
因此本發(fā)明涉及腺病毒載體構(gòu)建體，其包括使用腺病毒來攜帶腫瘤抑制基因如p53、反義致癌基因和其他用于人類腫瘤治療的相關(guān)基因。在一個實(shí)施方案中，包括了重組腺病毒病毒顆?；驌饺脒@種載體的顆粒，及其藥學(xué)配制品，所說的載體包含其中有編碼野生型p53之表達(dá)區(qū)的重組插入段，借助該表達(dá)區(qū)載體能夠在人轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中表達(dá)p53。載體中的p53表達(dá)區(qū)可包括基因組序列，但為了簡便起見，一般較好利用p53 cDNA序列，因?yàn)檫@些序列容易獲得并且更易于操作。載體的重組插入序列一般還包括啟動子區(qū)和聚腺苷酸化信號如SV40或魚精蛋白基因聚腺苷酸化信號。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，懸欲使p53表達(dá)區(qū)處于強(qiáng)結(jié)構(gòu)啟動子如CMV啟動子、病毒LTR、RSV或SV40啟動子、或與以高水平在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)之基因相關(guān)聯(lián)的啟動子如延伸因子-1或肌動蛋白啟動子的控制之下。目前，最優(yōu)選的啟動子是巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子。
可以按照本發(fā)明的簡化方法，將p53編碼序列插入缺乏E1B的病毒基因組中，從而將p53基因或cDNA導(dǎo)入重組腺病毒。但優(yōu)選的腺病毒是復(fù)制缺陷病毒，其中復(fù)制和/或包裝所必需的病毒基因已從腺病毒載體構(gòu)建體中被刪除，從而得以在其位置上導(dǎo)入p53表達(dá)區(qū)域。除E1B外的任何基因，不管其為復(fù)制所必要(如E1A，E2和E4)或不必要的(如E3)均可被刪除并用p53取代之。
特別優(yōu)選的是如

圖1的基因組結(jié)構(gòu)舉例顯示的，其中腺病毒的F1A和E1B區(qū)域已被刪除并在它們的位置中導(dǎo)入了p53表達(dá)區(qū)的載體和病毒顆粒。
制備復(fù)制缺陷型腺病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如包括Ghosh-Choudhury和Graham(1987)、McGrory等人(1988)、及Ghezman等人(1982)所描述的方法(這些文獻(xiàn)均摻入本文作為參考文獻(xiàn))。各種已知的細(xì)胞系只要它們補(bǔ)償任何可能存在的復(fù)制缺陷，均可用于制備重組腺病毒。優(yōu)選的細(xì)胞系是人293細(xì)胞系，但也可以使用容許復(fù)制，即在優(yōu)選情況下可表達(dá)E1A和E1B的任何其他細(xì)胞系。此外，為了得到病毒原種貯存液，也可以在塑料平皿上或懸浮液培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞。
本發(fā)明不只限于缺少E1的病毒和單單表達(dá)E1的細(xì)胞。實(shí)際上，只要p53載體沒有E1B，本發(fā)明可以利用其他病毒和宿主細(xì)胞的互補(bǔ)組合。可以使用缺少功能性E2的病毒和表達(dá)E2的細(xì)胞，也可以使用缺少功能性E4和表達(dá)E4的細(xì)胞等。如果刪除并取代不是復(fù)制所必需的基因，例如，E3基因，則不必由宿主細(xì)胞特異性地補(bǔ)償這一缺陷。
除了要求腺病毒載體和病毒顆粒沒有E1B外，根據(jù)它們的性質(zhì)對于成功地實(shí)踐本發(fā)明并不是關(guān)鍵的。腺病毒可以是42個不同的已知血清型或亞類A-F中的任何一個。為了得到用于本發(fā)明方法的條件復(fù)制缺陷型腺病毒載體，優(yōu)選亞類C的5型腺病毒作為起始材料。這是因?yàn)?型腺病毒是人類腺病毒，關(guān)于該病毒亞型的許多生物化學(xué)和遺傳學(xué)信息都是已知的，并且歷史上在利用腺病毒作載體的大多數(shù)構(gòu)建工作都是使用該亞型。
本發(fā)明的進(jìn)一步相關(guān)方面涉及新的p53 DNA片段、或表達(dá)載體，以及摻入了按照本發(fā)明制備的腺病毒p53載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的DNA片段在轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向上一般包括巨細(xì)胞病毒IE啟動子、野生型人p53的結(jié)構(gòu)基因、及SV40早期聚腺苷酸化信號。含有重組腺病毒的宿主細(xì)胞一般是真核或哺乳動物宿主細(xì)胞，如293細(xì)胞，或者可以是已用本發(fā)明的腺病毒感染的p53基因有缺陷的細(xì)胞。
其他實(shí)施方案涉及含有分散于藥學(xué)下可接受的溶液或緩沖液中的，編碼野生型p53之重組腺病毒的藥物組合物。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的溶液包括用磷酸鹽、乳酸鹽。Tris等緩沖的中性鹽溶液。當(dāng)然，可以純化腺病毒以使之基本上沒有不需要的污染物，如缺損干擾腺病毒顆?；騼?nèi)毒素及其他熱原，以使之不在接受該載體構(gòu)建體的動物的或病人體內(nèi)引起任何不適宜的反應(yīng)。純化載體的優(yōu)選手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化銫梯度離心法。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及為野生型p53有缺陷的細(xì)胞提供p53功能，或恢復(fù)野生型p53蛋白質(zhì)功能的方法。為此目的，可使攜帶p53突變的細(xì)胞與一定量的可在細(xì)胞內(nèi)有效地表達(dá)野生型p53的本發(fā)明的重組腺病毒接觸?？赏ㄟ^給體內(nèi)隱藏有p53缺陷性細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞的動物或人投用生理上有效量的含腺病毒的藥物組合物來達(dá)到這一目的。因此，本發(fā)明還包括治療人腫瘤如乳腺和肺癌的有效方法。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，使用表達(dá)p53的腺病毒預(yù)防腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤生長。在一個實(shí)施方案中使用表達(dá)p53的重組腺病毒抑制具有p53基因突變之細(xì)胞的不受控制的生長。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)p53的腺病毒抑制H358細(xì)胞的致瘤性和生長，但可使用作為p53功能之指示物的其他細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，使用氣管內(nèi)滴入的表達(dá)p53的病毒抑制同位肺腫瘤生長。Ad5CMV-p53病毒在裸鼠試驗(yàn)中產(chǎn)生了令人鼓舞的結(jié)果。病毒抑制了病毒感染之H358細(xì)胞-正常產(chǎn)生明顯腫瘤團(tuán)塊之細(xì)胞的致瘤性。當(dāng)在氣管內(nèi)接種H226Br細(xì)胞證實(shí)Ad5CMV-p53對肺癌細(xì)胞的體外作用后，氣管內(nèi)滴入病毒時，病毒也抑制同位肺癌細(xì)胞生長。通過用Ad5 CMV-p53而不是對照病毒Ad5/RSV/GL2處理抑制肺癌細(xì)胞的致癌性，表明p53蛋白質(zhì)具有治療效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解到，輸送病毒的其他方法也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
雖然通過使用p53構(gòu)建體恢復(fù)正常細(xì)胞功能和用于腫瘤治療舉例說明了本發(fā)明的各個方面，但認(rèn)為本發(fā)明一般可適用于期望通過使用重組腺病毒實(shí)現(xiàn)在靶或宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)腫瘤抑制蛋白質(zhì)的任何情況。例如，在腫瘤治療程式方面，除了p53取代外本發(fā)明人意欲涉及的特定例子是導(dǎo)入成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(rb)、反義癌基因(C-myc或C-ras)、及其他用于人腫瘤治療的相關(guān)基因。
應(yīng)指出的是，因?yàn)樗玫南俨《据d體是復(fù)制有缺陷的，所以不能在最終被感染的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。因此，在某些病人需要連續(xù)治療的情況下，如在治療開始時，可能有必要在一定時間如6個月或一年后再次導(dǎo)入病毒。
本發(fā)明的腺病毒載體還具有除與基因治療直接相關(guān)聯(lián)的實(shí)施方案以外的其他實(shí)用性。例如其他應(yīng)用可包括對各種p53基因進(jìn)行體外分析和誘變研究，以及重組生產(chǎn)用于例如制備抗體及其他實(shí)施方案的蛋白案質(zhì)。在與人基因治療相關(guān)的，包括所有涉及進(jìn)一步限定p53之分子活性相關(guān)的實(shí)施方案以外的實(shí)施方案中，也可以利用其他相關(guān)病毒向細(xì)胞輸送p53。那些屬于皰疹病毒家族的病毒，如單純皰疹病毒(HSV)、E-β病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)將是適用的。
本發(fā)明的一個不同的方面涉及生產(chǎn)任何一種類的重組腺病毒的簡化方法，該方法沒有使用效率差的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和繁索噬斑檢測法。為了按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)重組腺病毒，一般可用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法將腺病毒質(zhì)粒和表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，然后分析培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，了解其是否存在借以指示同源重組和病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。正是由于第一步驟轉(zhuǎn)染效率的提高才使相繼的和有利的CPE步驟成為可能。
用于脂質(zhì)體介導(dǎo)之轉(zhuǎn)染的優(yōu)選組分是可從市場上購得的DOTAP(N-〔2，3-二癸氧基〕-丙基)-N，N，N-三甲基-硫酸二甲銨)。CPE是一種可以使用相差顯微鏡直接觀察的現(xiàn)象。CPE描述腺病毒細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)特征，其開始是減少溶胞感染的細(xì)胞，最后是形成溶胞噬斑。這種方法的一個獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)是在保溫10至14天后很容易檢測到病毒增殖。這是對至少需要14天，通常長達(dá)21天，甚至經(jīng)常長達(dá)幾周才能得出結(jié)果的磷酸鋁介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法和繼后之噬斑檢測法的一個明顯改進(jìn)。
在某些實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的方法，并聯(lián)合使用有復(fù)制缺陷的腺病毒質(zhì)粒連同補(bǔ)償這種缺陷的宿主細(xì)胞，例如合用缺少E1的質(zhì)粒和293細(xì)胞。在本發(fā)明的工作實(shí)施例中使用了缺少功能性E1A和E1B并摻入p53表達(dá)區(qū)域的腺病毒質(zhì)粒，但任何表達(dá)區(qū)域均可以這種方式摻入重組腺病毒中?？梢愿鶕?jù)需要改變實(shí)際使用方法學(xué)；但其包括在某些情況下優(yōu)選使用MEM培養(yǎng)基。
這些新方法可以與PCR分析合用以進(jìn)一步證實(shí)正確重組之病毒的存在。PCR是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如參見美國專利No.4,683,195(該文獻(xiàn)列入本文作為參照)。為了與本發(fā)明結(jié)合使用PCR，可從表現(xiàn)有細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞上清中得到DNA，并使用兩對引物-一對表達(dá)載體特異性DNA引物和一對腺病毒基因組特異性DNA引物，以PCR方法分析DNA。按照定義，載體或插入序列特異性DNA是這樣的基因片段，它是編碼多肽或最終預(yù)期將被表達(dá)的RNA之DNA的一部分，如用作為mRNA的p53DNA表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生所說明的。腺病毒基因組特異性DNA可以是在被監(jiān)測的增殖階段被表達(dá)之基因組的一部分。
附圖的簡要描述下述附圖構(gòu)成本說明書的一部分并用于進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。參考一個或多個附圖并結(jié)合對本文所給出的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述將會更好地理解本發(fā)明。
圖1顯示得到重組p53腺病毒的流程。將p53表達(dá)盒插入pXCJL。1品xbaI和ClaI位點(diǎn)之間。將p53表達(dá)載體(pEC53)和重組質(zhì)粒pJM1F共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞維持于培養(yǎng)基中直到發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)。使用經(jīng)蛋白酶K處理和苯酚提取CPE上清液而從中制得的DNA模板，對DNA進(jìn)行PCR分析以鑒定新產(chǎn)生的p53重組腺病毒(Ad5CMV-p53)。
圖2A顯示用于對Ad5CMV-p53基因組DNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的酶切圖。Ad5CMV-p53基因組DNA的酶切圖給出p53表達(dá)盒、PCR行物和限制性位點(diǎn)的定位?；蚪M大小約為35.4kb，被分成100個酶切圖單元(1m.u.＝0.35kb)。p53表達(dá)盒置換Ad5基因組的E1區(qū)(1.3-9.2m.u.)。引物1位于人CMV大IE基因啟動子的第一內(nèi)含子下游。引物2位于SV40早期聚腺苷酸化信號中。而引物在離開p53 cDNA插入段而末端的15-20的處，用于限定1.40kb PCR產(chǎn)物。引物3和4分別定位于Ad5基因組的1/m.u.和13.4m.u.處，其限定0.86kb病毒基因組特異性PCR產(chǎn)物。
圖2B顯示PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析結(jié)果。每個反應(yīng)中使用限定1.4kb(p53)和0.86kb(Ad5)DNA片段的兩對引物。用于各反應(yīng)的DNA模板是pEC53質(zhì)粒(泳道1)、Ad5/RSV/GL2DNA(泳道2)、無DNA(泳道3)，和Ad5CMV-p53 DNA(泳道4)。標(biāo)記(M)的泳道相當(dāng)于分子量標(biāo)志。
圖2C顯示Ad5CMV-p53 DNA的限制性酶切圖。分別不用酶消化(U)和用限制性酶Hind IV(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)及ClaI(C)消化CsCl梯度純化的Ad5-CMV-p53 DNA樣品，并在1％瓊脂糖凝膠上分析。標(biāo)記(M)的泳道是分子量標(biāo)志。
圖3A、3B、3C和3D顯示重組腺病素對293細(xì)胞之細(xì)胞病變效應(yīng)的觀察。圖3A、3B、3C和3D顯示293細(xì)胞的一系列相差顯微鏡影象(X400)。圖3A為轉(zhuǎn)染前的鏡檢觀察；圖3B為轉(zhuǎn)染后第12天的陰性對照；圖3C顯示轉(zhuǎn)染后第12天發(fā)生CFE；圖3D顯示轉(zhuǎn)染后14天時完成CPE。
圖4A、4B、4C和4D顯示用重組腺病毒感染之細(xì)胞的免疫組織學(xué)特征。圖4A、4B、4C和4D顯示H358細(xì)胞的一系列免疫組織學(xué)影象。觀察Ad5CMV-p53在H358細(xì)胞中的感染性。用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以50pFU/細(xì)胞的劑量感染H358細(xì)胞24小時。用單獨(dú)的培養(yǎng)基作為模擬感染。用免疫染色法分析被感染的細(xì)胞。圖4A顯示用抗p53抗體探查的模擬感染。圖4B顯示用Ad5/RSV/GL2對照病毒感染的并用抗p53抗體探查的細(xì)胞。圖4C顯示用無關(guān)抗體(MOPC-21)探查的Ad5CMV-p53感染的細(xì)胞。圖4D顯示用抗p53抗體探查的Ad5 CMV-p53感染的細(xì)胞。使用的抗p53抗體是Pab 1801，并使用抗生物素蛋白-生物素方法進(jìn)行染色。
圖5A顯示用于比較H358細(xì)胞中外源p53相對表達(dá)水平的考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠。感染后24和72小時制備以30PFU/細(xì)胞的劑量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染的H358細(xì)胞樣品。對SDS-PAGE分析進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色，以顯示所負(fù)載的蛋白質(zhì)樣品的相對量。泳道1和4含有Ad5/RSV/GL2感染的細(xì)胞樣品。泳道2和3含有感染后24小時收集的用兩份個別Ad5 CMV-p53儲備物感染的細(xì)胞樣品。泳道5和6是感染后72小時收集的Ad5 CMV-p53感染的細(xì)胞樣品。泳道7是感染后72小時的模擬感染的H358樣品。泳道M顯示以KDa表示的預(yù)染色的分子量標(biāo)志物(GIBCO-BRL)。
圖5B顯示對如圖5A所示SDS-PAGE分析的同一泳道固化凝膠的Western印跡分析結(jié)果。使用抗p53抗體以Western印跡法分析p53的相對表達(dá)水平。使用的第一抗體是抗p53蛋白質(zhì)(Pab 1801，Oncogene Seience Inc.)和β-肌動蛋白(AmershamInc.)的單克隆抗體。MRP結(jié)合的第二抗體和ECL顯影劑購自Amershem Inc.。用Western印跡法檢查病毒感染的H358細(xì)胞。圖5B的Western印跡與圖5A顯示者有相等的布局和次序。
圖6是用Western印跡法檢測的p53表達(dá)的時間過程。以10PFU/細(xì)胞的濃度用Ad5 CMV-p53感染多個平皿的H358細(xì)胞。感染后在所指出的時間點(diǎn)制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。同時用抗p53和抗肌動蛋白抗體進(jìn)行Western印跡探查。標(biāo)記“C”的泳道代表陰性對照。直方圖代表用光密度計(jì)測得的p53的相對密度。
圖7A顯示病毒感染的細(xì)胞系H358的人肺癌細(xì)胞的生長曲線。以每平皿(60mm)105個細(xì)胞，每個細(xì)胞系6平皿接種細(xì)胞。24小時后，以10m.o.i(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞)的病毒劑量用Ad5在CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后每天計(jì)數(shù)細(xì)胞共計(jì)數(shù)6天。生長曲線代表得自4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)。
圖7B顯示病毒感染的細(xì)胞系H322之人肺癌細(xì)胞的生長曲線。以每平皿(60mm)105個細(xì)胞和每個細(xì)胞系6平皿接種細(xì)胞。24小時后，以10m.o.j(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞)用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后計(jì)數(shù)細(xì)胞6天。生長曲線代表得自4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)。
圖7C顯示病毒感染的細(xì)胞系H460的人肺癌細(xì)胞的生長曲線。以每平皿(60mm)105個細(xì)胞和每個細(xì)胞系6平皿接種細(xì)胞。24小時后，以10m.o.i(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞數(shù))的病毒劑量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后計(jì)數(shù)細(xì)胞6天。生長曲線代表是自4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)。
圖8顯示在同位腫瘤模型中試驗(yàn)Ad5 CMV-p53的流程。流程中總結(jié)了處理接種H226 Br細(xì)胞和病毒之裸鼠的劑量和程序。
圖9A、9B、9C和9D顯示得自經(jīng)處理的小鼠和對照小鼠的肺和橫隔片段的樣品。圖9A、9B、9C和9D是同一個圖的4個部分。6周預(yù)處理結(jié)束時殺死小鼠。切除肺和橫膈組織用于估計(jì)腫瘤生成情況。圖9A是正常裸鼠橫隔塊的樣品；圖9B是載體(PB5)處理之小鼠的橫隔塊樣品；圖9C是Ad5 CMV-p53處理之小鼠的橫隔塊樣品；圖9D是Ad5/RSV/GL2處理之小鼠的橫隔塊樣品。箭以指示腫瘤塊。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述A.肺癌發(fā)展的分子行為本發(fā)明人所進(jìn)行的研究已鑒定了導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)分子行為。這樣使得發(fā)明人能夠建立恢復(fù)某些正常蛋白質(zhì)功能從而得以在體內(nèi)抑制惡變表型的新方法。
最常見的肺癌組織學(xué)改變(80％)分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)這一類，并包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞未分化癌。目前關(guān)于肺癌分子生物學(xué)的資料來自對不太常見的小細(xì)胞肺癌(SCLC)的研究。可以根據(jù)細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌特征區(qū)分SCLC和NSCLC；SCLC對化學(xué)治療及應(yīng)性很好；但治療后會很快復(fù)發(fā)。NSSLC也可作為致癌因子誘導(dǎo)的上皮癌的模型。本研究中建立的研究方法和手段也可應(yīng)用于其他類型的上皮癌。
已積累的大量證據(jù)表明惡性轉(zhuǎn)變過程是由遺傳范式介導(dǎo)的。在腫瘤細(xì)胞中檢測到的主要損傷發(fā)生在顯性癌基因和腫瘤抑制基因中。顯性癌基因在一類參予臨界正常細(xì)胞功能(包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄)的稱為原癌基因的基因中有所改變。賦予轉(zhuǎn)變能力的顯性癌基因中的基本修飾包括點(diǎn)突變、轉(zhuǎn)位、重排和擴(kuò)增。腫瘤抑制基因似乎通過突變、缺失或其聯(lián)合作用而發(fā)生功能的純合丟失，以發(fā)生轉(zhuǎn)變。某些腫瘤抑制基因可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而在控制增殖中發(fā)揮作用。修飾顯性癌基因和腫瘤抑制基因的表達(dá)很可能影響那些體現(xiàn)惡性表型之細(xì)胞的某些特征。
盡管對參于癌基因介導(dǎo)之轉(zhuǎn)變的機(jī)制不斷有新的了解，但在發(fā)展針對特異性靶癌基因和其產(chǎn)物的治療方案方面卻進(jìn)展不大。在這個領(lǐng)域中的研究工作最初是集中在顯性癌基因上，因?yàn)檫@些癌基因是要首先定性的。DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移研究表明在從惡性人腫瘤轉(zhuǎn)移DNA后正常細(xì)胞才獲得惡性表型。B.p53和腫瘤中的p53突變目前p53被認(rèn)定為腫瘤抑制基因(Montenarh，1992)。已發(fā)現(xiàn)在許多用化學(xué)致癌、紫外照射，以及包括SV40在內(nèi)的幾種病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中有高水平的p53。在許多種人腫瘤中p53基因是突變尖活的常見的靶，并且有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為其為常見人腫瘤中最常見的突變基因(Mercer，1992)。該基因在50％以上的人NSCLC(Hollestein et al.，1991)和許多其他腫瘤中發(fā)生了突變。
p53基因編碼可以與宿主蛋白質(zhì)如大丁抗原及E1B形成復(fù)合物的375氨基酸磷蛋白。該蛋白質(zhì)可見于正常組織和細(xì)胞中，但其濃度比在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤組織中小得多。令人感興趣的是，野生型p53在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分裂中似乎是很重要的。已顯示在某些情況下在人腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)野生型p53是抗增殖的。因此p53可作為細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Weinberg，1991)并可直接抑制不受控制的細(xì)胞生長或間接激活抑制這種生長的基因。因此沒有或失活野生型p53可造成轉(zhuǎn)化。但有些研究工作表明突變體p53的存在對于充分表達(dá)有轉(zhuǎn)化可能的基因是不可缺少的。
雖然野生型p53被認(rèn)定為許多細(xì)胞類型中的起關(guān)鍵作用的重要生長調(diào)節(jié)因子，但其遺傳學(xué)和生物化學(xué)特征似乎也有著一定作用。錯義突變是p53基因中常見的并且對于癌基因的轉(zhuǎn)化能力是必不可少的。由點(diǎn)突變促成的單一基因改變可產(chǎn)生致癌p53。但與其他癌基因不同，已知p53點(diǎn)突變發(fā)生于至少30個不同的密碼子處，然而常常產(chǎn)述一些細(xì)胞表型中移動而又沒有降低雜合性的顯性等位基因。另外，其中許多顯性失活等位基因似乎是生物體中容許的并可在種系中傳遞下去。各種突變等位基因似乎是從極小機(jī)能障礙到強(qiáng)烈外顯的，顯性失活等位基因排布的(Weinberg，1991)。
Casey和其同事已報(bào)導(dǎo)將編碼野生型p53的DNA轉(zhuǎn)染到兩個人乳腺癌細(xì)胞系中可恢復(fù)這類細(xì)胞中的生長抑制控制(Casey，etal.，1991)。將野生型而不是突變的p53轉(zhuǎn)染到人肺癌細(xì)胞系中也已證明了相似的作用(Takahasi et al.，1992)。P53相對于突變基因似乎是顯性的并且將用突變基因針對將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時的增殖進(jìn)行選擇。正常表達(dá)轉(zhuǎn)染的p53并不影響含內(nèi)源p53之細(xì)胞的生長。因此，可由正常細(xì)胞容納這樣的構(gòu)建體而沒有不良作用。
因此用野生型p53處理p53相關(guān)腫瘤可能減少惡性細(xì)胞的數(shù)目。然而，因?yàn)椴荒芾肈NA轉(zhuǎn)染方法將DNA導(dǎo)入病人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞中，所以上述這些研究還沒有達(dá)到這一目的。
C.基因治療技術(shù)迄今已提出了幾種基因治療的實(shí)驗(yàn)方法，但每種方法都有其特定的缺點(diǎn)(Mulligan，1993)。如上文所述，已有幾種基本轉(zhuǎn)染方法，其中例如通過物理或化學(xué)方法加大細(xì)胞膜通透性以將含有感興趣基因的DNA非生物學(xué)地導(dǎo)入細(xì)胞中。當(dāng)然，這種方法只限于能暫時從體內(nèi)除去的并能耐受這種處理的細(xì)胞毒性的細(xì)胞，即淋巴細(xì)胞?？梢允褂门c某些脂質(zhì)和兩親性肽形成的脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)結(jié)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但基因整合的效率仍很低，一般每1,000到100,000個細(xì)胞才有一個發(fā)生整合，并且已轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)常常限于幾天(增殖細(xì)胞)或幾周(非增殖細(xì)胞)。因此DNA轉(zhuǎn)染顯然不是一種腫瘤治療的適宜方法。
第二種方法是利用病毒攜帶其自身的遺傳材料連同它們一起進(jìn)入細(xì)胞的天然能力。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒能夠標(biāo)其基因整合到宿主基因組中，轉(zhuǎn)移大量外來遺傳材料、感染廣譜品系和細(xì)胞類型并可被包裝到特定細(xì)胞系內(nèi)，所以其有希望作為基因運(yùn)輸載體。但也有三方面的主要問題妨礙在實(shí)際中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。第一，逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染性取決于靶細(xì)胞表面上病毒受體的可利用性。第二，逆轉(zhuǎn)錄病毒只有效地整合到復(fù)制中的細(xì)胞內(nèi)。最后，逆轉(zhuǎn)錄病毒難于濃縮和純化。
D.用于基因治療的腺病毒構(gòu)建體人腺病毒是其基因組大小約36kb的雙股DNA腫瘤病毒(Tooza，1981)。作為真核基因表達(dá)的模型系統(tǒng)，已對腺病毒進(jìn)行了廣泛的研究并充分鑒定了其性質(zhì)，使之成為開發(fā)腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的有吸引力的系統(tǒng)。該組病毒很容易生長和操作，并且在體外和體內(nèi)表現(xiàn)有很寬的宿主范圍。在溶胞感染的細(xì)胞中，腺病毒能夠切斷宿主蛋白質(zhì)合成途徑，引導(dǎo)細(xì)胞機(jī)構(gòu)合成大量的病毒蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生大量病毒。
基因組的E1區(qū)域包括E1A和E1B及少數(shù)細(xì)胞基因，其中E1A和E1B編碼負(fù)責(zé)病毒基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。包括E2A和E2B在內(nèi)的E2的表達(dá)得以合成病毒復(fù)制功能蛋白質(zhì)，如DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶及引發(fā)復(fù)制的末端蛋白質(zhì)。E3基因產(chǎn)物防止由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和腫瘤壞死因子引起的細(xì)胞溶解作用并且似乎對病毒增殖有著重要作用。與E4蛋白質(zhì)相關(guān)的功能包括DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)及宿主細(xì)胞關(guān)閉。晚期基因產(chǎn)物包括大部分病毒顆粒衣殼蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)只在從主要晚期啟動子開始的單一初級轉(zhuǎn)錄本發(fā)生大部分加工后被表達(dá)。在感染的晚期，主要晚期啟動子(MLP)表現(xiàn)出高的效率(Stratford-Perricaudet andPerricaudet，1991a)。
由于只有一小部分病毒基因組似乎需要為順式(Tooza，1981)，腺病毒衍生的載體當(dāng)與細(xì)胞系如293細(xì)胞聯(lián)用時對于大DNA片段的取代具有極大的潛力。為了提供反式的病毒必需蛋白質(zhì)已建立了Ad-5轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系(Graham，et al.，1977)。因此本發(fā)明者推論腺病毒的特點(diǎn)使之成為用于導(dǎo)向體內(nèi)癌細(xì)胞的良好候選者。
使用腺病毒系統(tǒng)向細(xì)胞遞送外來蛋白質(zhì)的特殊優(yōu)點(diǎn)包括(i)能夠由外來DNA取代相對大的病毒DNA片段；(ii)重組腺病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(iii)給人投用腺病毒的安全性；(iv)腺病毒感染與腫瘤或癌沒有任何已知的聯(lián)系；(v)能夠得到高滴度重組病毒；以及(vi)腺病毒有高感染力。
腺病毒載體不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的其他優(yōu)點(diǎn)包括較高的基因表達(dá)水平。另外，與逆轉(zhuǎn)錄序列不同，腺病毒復(fù)制不依賴于宿主基因復(fù)制。因?yàn)镋1區(qū)中的腺病毒轉(zhuǎn)化基因可以很容易地被刪除并且仍提供有效的表達(dá)載體，所以一般認(rèn)為由腺病毒載體造成的致癌危險(xiǎn)是可以忽略的(Grunhaus & Horwitz，1992)。
一般說來，腺病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是基于重組的工程化腺病毒，通過刪除其基因組的一部分如E1而使其成為復(fù)制非感受的，并且仍保留其對感染的感受性。當(dāng)對腺病毒基因組進(jìn)行附加刪除時，可以表達(dá)相對大的外來蛋白質(zhì)。例如，E1和E3區(qū)缺失的腺病毒能夠攜帶長達(dá)10kb的外來DNA并可在293細(xì)胞中生長至高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaccelet，1991a)。已有人報(bào)導(dǎo)在腺病毒感染后可令人驚奇地持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)移基因。
作為介導(dǎo)基因向真核細(xì)胞內(nèi)或整個動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移的手段，近年已廣泛研究了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。例如，在治療患有罕見的隱性遺傳疾病鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)缺陷癥的小鼠中，發(fā)現(xiàn)可利用腺病毒構(gòu)建體提供正常OTC酶。但不幸的是，在17例中只有4例達(dá)到OTC的正常表達(dá)水平(Stratford-Perricaudetet al.，1991b)。因此，大多數(shù)小鼠的缺陷只得到部分糾正，并且沒有導(dǎo)致生理或表型改變。因此這些結(jié)果對于在腫瘤治療中使用腺病毒載體沒有多少促進(jìn)。
使用腺病毒將囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的基因轉(zhuǎn)移到cotton大鼠肺上皮細(xì)胞中的嘗試也獲得了部分成功，但尚沒有可能估計(jì)被轉(zhuǎn)移的基因在動物上皮細(xì)胞中的生物學(xué)活性(Rosenfeld et al.，1992)。另外，這些研究證明了CFTR蛋白質(zhì)在肺導(dǎo)氣管細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，但沒有顯示出生理學(xué)效應(yīng)。在1991年的Science中，Rosenfeld等人發(fā)表了關(guān)于α1抗胰蛋白酶蛋白質(zhì)的肺表達(dá)但仍未顯示有生理學(xué)效應(yīng)的文章。事實(shí)上，他們估計(jì)其所觀察到的表達(dá)水平只是為在人肺中產(chǎn)生保護(hù)作用所需水平的約2％，即遠(yuǎn)低于發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)所必需的水平。
已通過門脈內(nèi)注射將人α1抗胰蛋白酶的基因?qū)胝４笫蟮母蝺?nèi)，在其中表達(dá)并導(dǎo)致被導(dǎo)入之人蛋白質(zhì)向這些大鼠血漿中的分泌(Jaffe et al.，1992)。但令人失望的是，所獲得的表達(dá)水平不足以發(fā)揮治療價值。
這些結(jié)果未證明腺病毒能夠指導(dǎo)在重組細(xì)胞中表達(dá)足夠的蛋白質(zhì)以達(dá)到生理學(xué)相關(guān)效應(yīng)，因此沒有提示可將腺病毒系統(tǒng)用于與腫瘤治療相關(guān)的方面。再者，在本發(fā)明之前，一般認(rèn)為p53是有毒性的，所以不能被摻入到包裝細(xì)胞如那些用于制備腺病毒的細(xì)胞中。因?yàn)橄倭龆镜腅1B結(jié)合p53，所以認(rèn)為這是不能聯(lián)合使用腺病毒和p53的另一個原因。
E.p53-腺病毒構(gòu)建體和腫瘤抑制本發(fā)明提供了用新的和更有效的腫瘤抑制載體進(jìn)行腫瘤基因臺療的方法。該重組病毒利用了腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，例如高滴度、寬靶宿主范圍、有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)及不在靶細(xì)胞中整合等。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，制得在人巨細(xì)胞病毒啟動子控制下表達(dá)野生型p53(A5CMV-p53)的復(fù)制缺陷性的、不依賴輔助病毒的腺病毒。
當(dāng)要求在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，常常提供來自病毒的對表達(dá)載體的控制功能。例如，常用的啟動子是衍生于多瘤病毒、腺病毒2和猴病毒40(SV40)的啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子是特別適用的，因?yàn)槎幘勺鳛橐埠蠸V40病毒復(fù)制原點(diǎn)的片段很容易地從該病毒中得到。也可以使用較小或較大的SV40片段，所提供的片段中包括了從HindIII位點(diǎn)向前延伸到位于病毒復(fù)制原點(diǎn)中之Bg1I位點(diǎn)的約250bp序列。另外，還有可能并常常期望利用正常情況下與所包括的基因序列聯(lián)系的啟動子或控制序列，所提供的這些控制序列是與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相匹配的。
可以構(gòu)建載體使之包括外源的，例如得有SV40或其他病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)來源的復(fù)制原點(diǎn)，或者可以由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供復(fù)制原點(diǎn)。如果載體被整合到宿主細(xì)胞染色體中，則后者常常是足夠的。
圖1中圖解顯示了優(yōu)選的p53腺病毒的設(shè)計(jì)和增殖。與此相聯(lián)系的，已建立了增殖和鑒定重組腺病毒的改良方法(詳見下文)。鑒定后，如圖2中所示，用PCR分析方法從結(jié)構(gòu)上證實(shí)p53重組腺病毒。分離并證實(shí)其結(jié)構(gòu)后，用p53腺病毒感染具有純合p53基因缺失的人肺癌細(xì)胞系H358。Western印跡顯示以高水平表達(dá)了外源p53蛋白質(zhì)(圖4和圖5)并在感染后3天達(dá)到峰值水平(圖6)。
還顯示在p53點(diǎn)突變細(xì)胞系H322中因外源p53的表達(dá)而使突變p53受到下調(diào)。使用具有與Ad5 CMV-p53相似結(jié)構(gòu)的病毒顆粒(Ad5/RSV/GL2)作為實(shí)驗(yàn)對照。該病毒顆粒含有由存在于病毒顆粒之表達(dá)盆中的Rous肉瘤病毒LTR啟動子驅(qū)動的熒光素酶cDNA。在用病毒顆粒Ad5/RSV/GL2感染的細(xì)胞中既沒檢測到p53表達(dá)也沒檢測到肌動蛋白表達(dá)的改變。與未被感染或被對照病毒顆粒感染的細(xì)胞相反，被Ad5 CMV-p53感染的H358細(xì)胞的生長受到很大抑制(圖7A)。H322細(xì)胞的生長也受到p53病毒顆粒的很大抑制(圖7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460細(xì)胞的生長則只受到較小的影響(圖7C)。
Ad5 SMV-p53介導(dǎo)對肺癌細(xì)胞體外生長的強(qiáng)抑制作用。當(dāng)以低于1PFU/細(xì)胞的MOI用Ad5 CMV-p53感染細(xì)胞時生長抑制作用并不十分明顯，而以高于100PFU/細(xì)胞的MOI感染時，即使用對照病毒Ad5/RSV/GL2感染也可觀察到細(xì)胞毒性。在我們的研究中，用于生長速率研究的最適劑量為10-50PFU/細(xì)胞。在此劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞生長抑制作用歸因于被表達(dá)的p53蛋白質(zhì)。
在裸鼠中進(jìn)行的試驗(yàn)證明Ad5 CMV-p53處理之H358細(xì)胞的致癌性受到很大程度的抑制。在正向人肺癌小鼠模型中，在病毒處理前3天氣管內(nèi)接種有p53點(diǎn)突變的致瘤性H226Br細(xì)胞。氣管內(nèi)滴入Ad5 CMV-p53可防止該模型系統(tǒng)中的腫瘤形成，提示經(jīng)修飾的腺病毒是介導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的有效載體，并且Ad5 CMV-p53病毒可進(jìn)一步開發(fā)成用于腫瘤基因治療的治療劑。
如經(jīng)Western印跡分析證明的，Ad5 CMV-p53介導(dǎo)了p53基因在人肺癌細(xì)胞中的高水平表達(dá)。在H460細(xì)胞中外源p53蛋白質(zhì)比內(nèi)源野生型p53豐富約14倍，在H358細(xì)胞中則比β-肌動蛋白內(nèi)部對照豐富2至4倍。高水平表達(dá)可解是由于(1)高效率基因轉(zhuǎn)移，(2)強(qiáng)CMV啟動子驅(qū)動p53 cDNA表達(dá)，和(3)腺病毒E1增強(qiáng)子增強(qiáng)p53 cDNA轉(zhuǎn)錄。在H358細(xì)胞中p53表達(dá)期間長達(dá)感染后的15天以上。但在感染后5天表達(dá)迅速降低。對得自被感染H358細(xì)胞之DNA樣品的PCR分析顯示病毒DNA水平隨蛋白質(zhì)水平降低而降低，表明在腫瘤細(xì)胞體外連續(xù)生長期間有病毒DNA的丟失。
p53表達(dá)降低也可能是由于控制p53表達(dá)之CMV啟動子的細(xì)胞衰減所致，因?yàn)橐郧霸鴪?bào)導(dǎo)了宿主細(xì)胞介導(dǎo)的CMV啟動子切斷現(xiàn)象(Dai et al.，1992)。腺病毒載體是非整合性基因轉(zhuǎn)移載體并因此基因表達(dá)時間長短取決于包括宿主細(xì)胞、被轉(zhuǎn)移的基因及相關(guān)啟動子等多種因素。Crystal及其同事的研究顯示，感染后6周可在Cotton大鼠上皮細(xì)胞中檢測到囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白基因的低水平表達(dá)(Rosenfeld et al.，1992)。Perricaudet的實(shí)驗(yàn)室證明，在mdx小鼠肌肉中小肌營養(yǎng)不良蛋白基因的小量表達(dá)持續(xù)到感染后的3個月以上。本研究中觀察到的短期高水平表達(dá)野生型p53蛋白質(zhì)可能有益于降低在體內(nèi)用Ad5 CMV-p53處理后對正常細(xì)胞產(chǎn)生的可能的負(fù)作用。
本文公開的研究工作表明p53重組腺病毒具有腫瘤抑制性質(zhì)，所說的抑制作用似乎是通過恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中的p53蛋白質(zhì)功能而產(chǎn)生的。這些結(jié)果支持使用Ad5 CMV-p53病毒顆粒作為腫瘤治療的治療劑。
F.增殖和鑒定重組腺病毒的改良方法重組腺病毒作為新的基因輸送系統(tǒng)，在基因治療和疫苗開發(fā)中可能具有許多潛在應(yīng)用價值。因此重組腺病毒的增殖是重要的分子生物學(xué)工具。增殖重組腺病毒的已有方法是使用磷酸鈣沉淀法介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，然后對被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行噬斑檢測。需要改善與該方法相關(guān)的轉(zhuǎn)染效率，并且可進(jìn)一步簡化操作步驟。
在本發(fā)明之前，增殖重組腺病毒的常規(guī)方法是利用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。這種方法包括使細(xì)胞在磷酸鈣中與載體或質(zhì)粒DNA接觸幾小時，然后在15％甘油中進(jìn)行短時(如1分鐘)震盛處理。這種方法的明顯缺點(diǎn)在于只導(dǎo)致低水平的DNA摻入細(xì)胞中，即其為一種效率很低的轉(zhuǎn)染手段。也可以根據(jù)噬斑的出現(xiàn)正常指示病毒增殖，所說的噬斑看起來為環(huán)繞著被溶解細(xì)胞的表明由病毒增殖引起之細(xì)胞溶解的清晰的圓形區(qū)域。
本發(fā)明人已建立了一種顯著地改善了轉(zhuǎn)化效率并且簡化了選擇程序的新的腺病毒生產(chǎn)方法。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染例如DOTAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染與觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)結(jié)合，將導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的改善和檢測手段的快速和簡化。在該新的方法中，利用脂質(zhì)體DOTAP介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法將表達(dá)載體和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到293細(xì)胞中。然后不是用0.5％瓊脂糖覆蓋被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行噬斑檢測，而是將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞持續(xù)維持在MEM培養(yǎng)基中以觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。
在使用該新的方法進(jìn)行的兩項(xiàng)研究中，24孔平板的2個孔和5個60mm平皿中的3個平皿分別于共轉(zhuǎn)染后的10和12天產(chǎn)生了CPE。相反，使用磷酸鈣沉淀法，在每次實(shí)驗(yàn)中均沒有從一式三份的20個60mm平皿的共轉(zhuǎn)染中得到重組病毒。在Hep G2和HeLa細(xì)胞系中使用CAT檢測，發(fā)現(xiàn)DOTAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生比磷酸鈣轉(zhuǎn)染法高5倍的CAT活性。
共轉(zhuǎn)染后除掉瓊脂糖覆蓋層也簡化了這一方法。在研究的終點(diǎn)，通過直接觀察CPE而不是鑒定噬斑從而使方法更加簡便和清楚，其中所說的簽定噬斑方法通常很不清楚而且難于在保溫10-14天后確定噬斑。圖3顯示有CPE之細(xì)胞培養(yǎng)物與沒有CPE之細(xì)胞培養(yǎng)物的比較結(jié)果。
本發(fā)明人還發(fā)展了使用PCR確定腺病毒滴度的快速方法。對得自有CPE之細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的DNA樣品進(jìn)行直接PCR分析的使用兩對引物，一對擴(kuò)增插入段特異性序列，另一對擴(kuò)增病毒基因組特異性序列。發(fā)明人證明可用PCR技術(shù)檢測釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中的腺病毒，從而允許使用少至50μL的上清液制備DNA模板。
例如可在瓊脂糖凝膠上分析PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物來確定經(jīng)PCR擴(kuò)增而鑒定的插入段特異性和病毒基因組特異性DNA序列?？膳c適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)準(zhǔn)品標(biāo)濾物進(jìn)行比較，以鑒定相當(dāng)于插入段特異性DNA和病毒基因組特異性DNA及行物的帶。
當(dāng)利用PCR擴(kuò)增插入段特異性和病毒基因組特異性基因產(chǎn)物時，可首先制備對將被擴(kuò)增的序列特異的引物。使用而對引物實(shí)現(xiàn)有效的選擇性擴(kuò)增一對擴(kuò)增插入段特異性產(chǎn)物的限定部分，另一對限定病毒基因組特異性產(chǎn)物的小片段。只作為實(shí)例，已構(gòu)建了含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和SV40早期聚腺苷酸化信號的D53的表達(dá)盒。第一引物組將包括位于人CMV主要1E基因啟動子之第一內(nèi)含子下游的引物，第一引物組的其他行物則將位于SV40早期聚腺苷酸化信號中。實(shí)際上，這兩對引物均離開cDNA插入段，即作為舉例說明的p53約15至20個堿基對。
應(yīng)選擇一限定的PCR產(chǎn)物，例如1.40kb p53DNA。例如第二組行物可位于Ad5基因組的11M.U T 13.4M.U.處，以限定0.86kb病毒基因組特異性PCR產(chǎn)物。
引物選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢詷?gòu)建用于擴(kuò)增有已知堿基對序列之DNA序列的已選擇部分的引物。引物與DNA雜交并作為合成基因之一部分的起始位點(diǎn)。設(shè)計(jì)在反向雙鏈上不同位點(diǎn)結(jié)合的核苷酸引物，從而限定作為將被擴(kuò)增之部分的介入序列。被利用作為引物的核酸分子一般將包括與預(yù)期擴(kuò)增之DNA片段互補(bǔ)的至少10個堿基對的序列。選擇10堿基對作為通常的引物大小下限，如小于10堿基對可能不產(chǎn)生有效的雜交并可能存在穩(wěn)定化問題。較好使用15-20堿基對的引物，本發(fā)明的優(yōu)選方案中所利用的如圖1所示的引物對大小為19或20個堿基對。
G.患者和治療程序發(fā)明人提議向患有p53相關(guān)聯(lián)腫瘤，如不可切除之阻塞性支氣管內(nèi)腫瘤的患者的肺腫瘤細(xì)胞內(nèi)區(qū)域性輸送腺病毒-p53基因構(gòu)建體將是一種輸送治療上有效的基因以對抗臨床疾病的很有效的方法。該方法是對目前使用的腫瘤治療法的重大改進(jìn)方法，其依賴于試圖殺死或消除最后的腫瘤細(xì)胞。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞休眠是一種已證實(shí)的現(xiàn)象，所以這就使得有效殺傷幾乎成為不可能。
預(yù)計(jì)NSCLC細(xì)胞攝入腺病毒構(gòu)建體將減低這些細(xì)胞的增殖速率。這就增加了受影響之肺仍繼續(xù)擴(kuò)展的時間，防止支氣管內(nèi)腫瘤再生長并延長患者的存活期。
對于那些患有不可切除之復(fù)發(fā)性支氣管內(nèi)腫瘤并部分或完全阻塞了通氣道，沒有或不能接受外部光束放射治療的患者，可考慮使用這種方法。對于這種狀態(tài)患者，已有療法常常只是起短期緩解作用。即使進(jìn)行外部光束放射治療，大多數(shù)患者也都有復(fù)發(fā)。有可能插入短距離放射治療插管并給予額外的放射治療。接受這種治療的患者平均存活期為6個月。沒有進(jìn)行短距離放射治療的病人也應(yīng)符合進(jìn)行基因治療條件?？梢杂眉す饣蚧铙w解剖鉗從通氣道中除去腫瘤。這可以與注射腺病毒構(gòu)建體結(jié)合進(jìn)行，以便減少必須注射之病毒的量。如果腫瘤惡化，則不解給接受其他緩解治療的患者使用病毒構(gòu)建體。
下列實(shí)施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解到，實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人在實(shí)踐本發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)的改進(jìn)技術(shù)，因此可看作是實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選方式。但從本公開的觀點(diǎn)看，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解到，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍前提下，對所公開的特定實(shí)施方案進(jìn)行許多改變而仍可獲得相同或相似的結(jié)果。
實(shí)施例1p53表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例描述p53表達(dá)載體的構(gòu)建。按所指出的方法構(gòu)建該載體并用于取代腺病毒株Ad5基因組的E1區(qū)域(1.3-9.2m.u.)，以構(gòu)建實(shí)施例2中所述的腺病毒病毒顆粒。
將如圖1中所示的，含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(Boshart，et al.，1985)、p53 cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信號的p53表達(dá)盒插入pXCJL1(由Frank L. Graham博士(McMaster University，Canada)提供)的XbaI和ClaI位點(diǎn)之間。
該基因組大小約35.4kb，被分成100個酶切圖單位(1m.u.＝0.35kb)。用p53表達(dá)盒取代Ad5基因組的E1區(qū)(1.3-9.2m.u.)。
引物1具有序列5’-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3’(SEQ ID NO1)并定位于人CMV主要IE基因啟動子(Boshart，et al.，1985)的第一內(nèi)含子下游。引物2具有序列5’-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3’(SEQ ID NO2)并定位于SV40早期聚腺苷酸化信號中。兩引物均在兩末端離開p53cDNA插入段15-20bp，以限定1.40kb PCR產(chǎn)物。引物3具有序列5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3’(SEQ ID NO3)，引物4具有序列5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’(SEQ ID NO4)，且兩引物分別定位于Ad5基因組的11m.u.和13.4m.u.處，借以限定0.86kb病毒基因組特異性PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例2重組p53腺病毒的產(chǎn)生和增殖本實(shí)施例描述一種適于產(chǎn)生表達(dá)p53的p53的輔助病毒作依賴性重組腺病毒的方法。用于產(chǎn)生重組腺病毒的分子策略是基于這樣的事實(shí)，即由于腺病毒的包裝限制，所以pJM1F不能以具本身形成病毒。因此，p53表達(dá)載體質(zhì)粒和被轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)pJM1F之間的同源重組產(chǎn)生只能夠包裝在表達(dá)必要腺病毒蛋白質(zhì)之細(xì)胞中的活病毒。
本實(shí)施例的方法利用293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以增殖在E1或E3區(qū)域包含異源DNA表達(dá)盒之取代的病毒。該方法需要將NDA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染效率在很大程度上決定病毒增殖的效率。在本發(fā)明之前，用于將DNA轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中的方法通常是磷酸鈣/DNA共沉淀法(Graham and van der Eb，1973)。但這種方法及噬斑檢測法相對比較難以完成并且一般所達(dá)到的病毒增殖效率較低。本實(shí)施例作為舉例說明，當(dāng)根據(jù)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)鑒定被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時，表明使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法顯著改善了被感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果和繼后的鑒定效率。
將293細(xì)胞系維持在添加10％熱滅活馬血清的Dulbecco氏改進(jìn)的極限基本培養(yǎng)基中。按照制造商推薦的程序(BoehringerMannheim Biochemcalc，1992)，以DOTAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)法將用于同源重組的p53表達(dá)載體和質(zhì)粒pJM1F(McGrory，et al.，1988)共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。圖1中圖解顯示了這一方法。
轉(zhuǎn)染前24小時將293細(xì)胞(35代，60％匯合)接種在60mm平皿或24孔平板上。用30μl DOTAP、2μg p53表達(dá)載體、和3μg質(zhì)粒pJM1F轉(zhuǎn)染各小孔中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后每2-3天給細(xì)胞提供MEM培養(yǎng)基直到發(fā)生CPE。
實(shí)施例3進(jìn)一步證實(shí)重組腺病毒的同一性本實(shí)施例舉例說明用新的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法進(jìn)一步證實(shí)共轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系后所得重組腺病毒的同一性。
從試驗(yàn)平板中收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的等分樣品(50至370μl)，于56℃用蛋白酶K(50μg/ml，含0.5％SOS和20mMEDTA)處理/小時，用苯-酚氯仿提取，并用乙瓊沉淀核酸。將DNA沉淀物重新懸浮在20μldM2O中并用作PCR擴(kuò)增的模板。圖1和SEQ ID NOS1、2、3和4分別圖示了PCR行物及其序列的相對位置。cDNA插入段特異性引物限定1.4kb PCR產(chǎn)物，病毒基因組特異性引物限定0.86kb PCR產(chǎn)物。在含有4mMMgCl2、50mM KCl、0.1％Triton X-100、200μM各種dNTP、10mM Tris-HCl(pH9.0)、2μM各種引物和1.0單位Taq聚合酶(Promega)的50μl總反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)以94℃，0.5分鐘、56℃，0.5分鐘、和72℃、1分鐘進(jìn)行30次循環(huán)。
為了簡化鑒定新增殖之重組病毒的方法，建立了對得自細(xì)胞培養(yǎng)物上清的DNA樣品的直接PCR檢測法。用蛋白酶K處理有CPE之細(xì)胞培養(yǎng)基上清的等分樣品(50或370μl)并用苯酚/氯仿提取。乙醇沉淀后，使用兩對擴(kuò)增插入段特異性和病毒基因組特性序列的引物以PCR技術(shù)分析DNA樣品。圖1中顯示了PCR引物靶及其序列。引物1、2、3和4分別由SEQ ID NOs1、2、3和4表示。
結(jié)果可見，從表達(dá)載體(陽性對照)和陽性細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA樣品(分別是圖2B所示的泳道1和4)擴(kuò)增了1.4kb插入段和0.86kb病毒基因組片段。只從Ad5/RSV/GL2病毒的DNA樣品(陰性對照，泳道2)擴(kuò)增了0.86kb片段。使用未經(jīng)處理的陽性細(xì)胞培養(yǎng)基上清(泳道3)進(jìn)行的PCR反應(yīng)中未出現(xiàn)擴(kuò)增的帶。
這些結(jié)果表明，使用少至50μL的細(xì)胞培養(yǎng)基上清制備DNA模板，以PCR方法可以檢測出釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中的腺病毒。這些結(jié)果將得以發(fā)展使用這一技術(shù)確定腺病毒滴度的定量檢測方法，而傳統(tǒng)上這一檢測是以噬斑檢測法完成的。
對CsCl梯度純化的病毒DNA進(jìn)行雙脫氧DNA測序分析，以進(jìn)一步證實(shí)Ad5 CMV-p53病毒中p53 cDNA野生型序列的存在。以相似方法產(chǎn)生的對照病毒Ad5/RSV/GL2具有與Ad5 CMV-p53相似的結(jié)構(gòu)，但在其表達(dá)盒中使用了Rous肉瘤病毒啟動子和熒光素酶cDNA。攜帶E.col；β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的重組腺病毒(Ad5 CMV-Lac Z)也具有與Ad5 CMV-p53相似的結(jié)構(gòu)，并由Dr.Frank L. Graham提供。
病毒種子培養(yǎng)物、滴度和感染。按照Graham和Prevec(1991)的方法，以噬斑純化法得到Ad5 CMV-p53、Ad5/RSV/GL2和Ad5 CMV-Lac Z病毒的個別克隆。在293細(xì)胞中增殖單一病毒克隆。收集顯示有完全細(xì)胞病毒效應(yīng)之293細(xì)胞的培養(yǎng)基并以1000×g離心10分鐘。等分全并的上清并于-20℃儲存用作病毒種子儲備物。以噬斑檢測法確定病毒滴度(Graham and Prevec，1991)。向細(xì)胞單層上加入病毒溶液(每個60mm平皿0.5ml)并在室溫下保溫30分鐘(每隔5分鐘簡單攪動一次)的感染細(xì)胞系。然后加入培養(yǎng)基并將被感染的細(xì)胞放回37℃保溫箱。
還在H226Br、H322、H460、HeLa、HepG2、LM2、和Vero等多種細(xì)胞系中使用Ad5 CMV-LacZ估計(jì)重組腺病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。使用X-gal染色，在用Ad5 CMV-LacZ以30PFU/細(xì)胞的MOI感染后，所有細(xì)胞系均著染97-100％藍(lán)色。
實(shí)施例4在人肺癌細(xì)胞中Ad5 CMV-p53指導(dǎo)的p53基因表達(dá)本實(shí)施例描述使用重組p53腺病毒感染有純合p53基因缺失的人肺腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示這些細(xì)胞的生長和突變p53的表達(dá)均受到抑制，表明Ad5 CMV-p53病毒顆?？梢杂米骺刂妻D(zhuǎn)移細(xì)胞的有用治療劑。
對用3.8％福爾馬林固定并用3％H2O2(在甲醇中)處理5分鐘的被感染之細(xì)胞單層進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。使用Vectastain剛ite試劑盒(Vector，Burlingame，CA)完成免疫組織化學(xué)分析。使用的第一抗體是抗p53抗體PAb 1801(Oncogene Science，Manhasset，NY)，并使用MOPC-21(Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)作為陰性對照。第二抗體是抗生物素蛋白標(biāo)記的抗小鼠IgG(Vector)。使用生物素化的辣根過氧化物酶ABC復(fù)合試劑檢測抗原-抗體復(fù)合物。最后用Harris蘇木精(Sigma)復(fù)染并用Cytoseal 60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)固定細(xì)胞。
對被感染的細(xì)胞系進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，以檢驗(yàn)由Ad5CMV-p53病毒的CMV啟動子驅(qū)動之p53表達(dá)的原位表達(dá)。如經(jīng)免疫組織化學(xué)分析所測得的，當(dāng)30-50噬斑形成單位(PEU)/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)用Ad5 CMV-p53感染具有p53之純合缺失的H358細(xì)胞系時，該細(xì)胞系中p53基因轉(zhuǎn)移效率為97-100％(圖4)。
使用攜帶由人CMV IE啟動子轉(zhuǎn)錄的LacZ基因的病毒Ad5CMV-LacZ進(jìn)一步證實(shí)重組腺病毒的高轉(zhuǎn)移效率。以30-50PFU/細(xì)胞的MOI感染細(xì)胞，經(jīng)X-gal染色顯示包括HeLa、HepG2、LM2和人NSCLC腫瘤細(xì)胞系在內(nèi)的所有被檢細(xì)胞均有97-100％呈現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性的陽性反應(yīng)。這些結(jié)果表明腺病毒載體是向人腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的有效載體。
用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗細(xì)胞后，在含SDS-PAGE樣品緩沖液的平皿(每個60mm平皿0.5ml)中溶解單層細(xì)胞并對制得的細(xì)胞溶解物進(jìn)行Western印跡分析。為進(jìn)行SDS-PAGE分析，泳道內(nèi)所加細(xì)胞溶解物相當(dāng)于5×104個細(xì)胞(10-15ml)。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到HybondTM-ECL膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上。用加于PBS中的0.5％乳粉封閉膜并用第一抗體小鼠抗人p53單克隆抗體pAb 1801和小鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗體(Amersham)探查，洗滌并用第二抗體辣根過氧化物酶結(jié)合的免抗小鼠IgG(PierceChemical Co.，Rockford，IL)探查。按照Amersham的增強(qiáng)化學(xué)熒光法使膜顯色。用光密度計(jì)(Molecular Dynamic Inc.，Sunnyvale，CA)檢測所表達(dá)的外源p53的相對量。
Western印跡顯示以高水平表達(dá)了外源p53蛋白質(zhì)(圖5A，泳道2、3和5、6)。感染后第3天蛋白質(zhì)量達(dá)到峰值(圖6，插入片段，0.5天至3天)。作為對照，構(gòu)建與實(shí)施例1的重組Ad5 CMV-p53有核似結(jié)構(gòu)的病毒顆粒。該病毒顆粒含有由病毒顆粒的表達(dá)盒中的Rous肉瘤病毒LTR啟動子驅(qū)動的蟲熒光素酶cDNA。在用病毒顆粒Ad5/RSV/GL2感染的細(xì)胞中沒有檢測到p53表達(dá)，也沒有檢測到肌動蛋白表達(dá)的改變。
使用重組p53腺病毒感染三個人肺NSCLC細(xì)胞系具有p53基因純合缺失的細(xì)胞系H358、在密碼子248(G至T)處有p53基因之點(diǎn)突變的細(xì)胞系H322，和具有野生型p53基因的細(xì)胞系H460。在60mm培養(yǎng)皿中接種H322和H460(1×105)或H358(2×105)后檢測人NSCLC細(xì)胞的生長速率，并于接種后24小時感染病毒。以10PFU/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)用病毒感染細(xì)胞。使用培養(yǎng)基進(jìn)行模擬感染作為對照。感染后第1-6天每天計(jì)數(shù)作不同處理的各細(xì)胞系的一式三份培養(yǎng)物。
與未經(jīng)感染的細(xì)胞或用對照病毒顆粒感染的細(xì)胞相反，用Ad5 CMV-p53感染的H358細(xì)胞的生長受到明顯抑制(圖7A)。H322細(xì)胞的生長也受到p53病毒顆粒的很大抑制(圖7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460細(xì)胞的生長則只受到較小程度的影響(圖7C)。Ad5 CMV-P53病毒感染的H358細(xì)胞的生長受到79％的抑制，而未經(jīng)感染或用對照病毒感染的細(xì)胞則沒有受到抑制。具有p53點(diǎn)突變的細(xì)胞系H322的生長受到Ad5 CMV-p53的抑制達(dá)72％，而含有野生型p53的細(xì)胞系H460的生長則只受到較小影響(28％抑制率)。
結(jié)果表明p53重組腺病毒具有腫瘤抑制性質(zhì)，其通過恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中的p53蛋白質(zhì)功能發(fā)揮作用。
實(shí)施例5Ad5 CMV-p53用于處理p53缺陷細(xì)胞本實(shí)施例涉及使用重組p53腺病毒恢復(fù)對腫瘤細(xì)胞的體外生長抑制，從而用于抑制細(xì)胞的惡性或轉(zhuǎn)移生長。其描述本發(fā)明通過腺病毒介導(dǎo)的基因療法以預(yù)期某些方式用于腫瘤治療。
以10PFU/細(xì)胞的MOI用Ad5 CMV-p53和Ad5/RSV/GL2感染H358細(xì)胞。用培養(yǎng)基處理等量的細(xì)胞以作為模擬感染。感染后24小時，收獲經(jīng)過處理的細(xì)胞并用PBS洗兩次。對于每種處理，均以0.1ml體積給每只裸鼠(Harlan Co.，Houston，TX)皮下注射3×106個細(xì)胞。每種處理使用5只小鼠。注射前照射(300cGy，60Co)小鼠，并在注射后每周檢查一次。6周結(jié)束時估計(jì)腫瘤形成情況并計(jì)算腫瘤體積，其中俘定腫瘤有平均直徑的球形，求其模斷面直徑之乘積平方根算出腫瘤體積。
為了確定Ad5 CMV-p53介導(dǎo)的對致癌性的抑制效果，給裸鼠皮下注射H358細(xì)胞(人NSCLC型細(xì)胞)以誘發(fā)腫瘤生長。每只小鼠接受一次已以10PFU/細(xì)胞的劑量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染24小時的細(xì)胞注射。以單獨(dú)用培養(yǎng)基處理的H358細(xì)胞作為模擬感染對照。如從表I中看出的，在注射后14天只經(jīng)模擬感染或?qū)φ詹《靖腥镜募?xì)胞誘發(fā)了第一個可觸及的腫瘤。
表I 在裸鼠體內(nèi)Ad5 CMV-p53對H358之致瘤性的影響a
a每只小鼠皮下注射2×106個經(jīng)處理的H358細(xì)胞。
6周期間結(jié)束時測腫瘤大小。
如表I中所示，接受Ad5 CMV-p53處理之細(xì)胞的小鼠并沒有顯現(xiàn)腫瘤。6周結(jié)束時腫瘤直徑為4-10mm。該項(xiàng)研究以每組5只小鼠開始；在Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2組中有一只小鼠沒有完成研究。較早死亡可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境感染所致。
實(shí)施例6Ad5 CMV-p53用于治療肺癌本實(shí)施例涉及使用重組p53腺病毒恢復(fù)對腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制作用，并因而用于治療動物腫瘤。描述本發(fā)明通過腺病毒介導(dǎo)的基因療法預(yù)期以某些方式用于治療腫瘤。
進(jìn)一步使用同位人肺癌小鼠模型來估計(jì)Ad5 CMV-p53在抑制致癌性中的效率。因?yàn)镠358和H322細(xì)胞在該模型中不產(chǎn)生腫瘤，所以使用H266Br細(xì)胞系。該細(xì)胞系在小鼠體內(nèi)增殖成鱗狀上皮細(xì)胞肺癌并從肺轉(zhuǎn)移到腦。H266Br在p53基因的外顯子F，密碼子254處有點(diǎn)突變(ATC變成GTC)并且在小鼠體內(nèi)是致癌性的。
以前曾描述過在同位人肺癌小鼠模型中的試驗(yàn)方法(Georges，et al.，1993)。簡單地說，通過支氣管內(nèi)滴注給經(jīng)過照射(300 cGY，60Co)的裸鼠接種H226Br。每只小鼠接受體積為0.1ml(在PBS中)的2×106個細(xì)胞。接種后3天，每天一次經(jīng)支氣管內(nèi)滴注用0.1ml病毒或載體(PBS)處理每組10只小鼠，其處理2天。所用的病毒劑量為每只小鼠5×107Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2。6周時間結(jié)束時殺死小鼠。切除肺和橫膈組織估計(jì)腫瘤形成情況并測量腫瘤大小。對腫瘤塊的切片進(jìn)行組織學(xué)分析以進(jìn)一步證實(shí)腫瘤。
經(jīng)支氣管內(nèi)滴注給經(jīng)過照射的裸鼠接種2×106個H226Br細(xì)胞/小鼠。接種后3天，經(jīng)支氣管內(nèi)滴注用0.1ml Ad5/RSV/GL2或載體(PBS)處理每只小鼠(每組8-10只)，每天一次共兩天。所使用的病毒劑量為5×107PFU/小鼠。6周結(jié)束時切除動物肺和橫膈組織以估計(jì)腫瘤生成情況并測量腫瘤大小。圖7中顯示方法的流程，圖8中則證明有代表性的切除樣品。經(jīng)組織學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)所檢測的腫瘤。表II中總結(jié)了腫瘤檢測的數(shù)據(jù)
表II. 在同位人肺癌小鼠模型中Ad5 CMV-p53對H226Br之致瘤性的影響a
用2×106個H226Br細(xì)胞/小鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴注接種小鼠，接種后第3天，連續(xù)兩天每天給小鼠支氣管內(nèi)滴注載體或病毒(5×107/小鼠，0.1ml體積)。6周時間結(jié)束時估計(jì)小鼠體內(nèi)腫瘤生成情況。
b經(jīng)雙向方差分析與接受載體(PBS)或?qū)φ詹《窘M的動物相比p＜0.05。
只有25％經(jīng)Ad5 CMV-p53處理的小鼠生成腫瘤，而載體或Ad5/RSV/GL2對照組則有70-80％的被處理小鼠生成腫瘤。Ad5 CMV-p53組的平均腫瘤大小明顯小于對照組。這些結(jié)果表明Ad5 CMV-p53可以阻止H226Br在同位人肺癌小鼠模型中形成腫瘤。
實(shí)施例7Ad5 CMV-p53用于治療程式當(dāng)然，如本文實(shí)施例5和6中所述，動物模型中的應(yīng)用可作為臨床前試驗(yàn)的一部分。因此，可以試驗(yàn)已確定有進(jìn)行腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移治療臨床指征的病人體內(nèi)是否存在抗腺病毒抗體。如果存在抗體并且病人有對藥理學(xué)或天然物質(zhì)發(fā)生過敏反應(yīng)的歷史，將指示可以在密切臨床觀察下給予應(yīng)用103至106試驗(yàn)劑量的重組腺病毒。
為了使用Ad5 CMV-p53治療腫瘤，應(yīng)制備在適當(dāng)啟動子/增強(qiáng)子元件如CMV啟動子控制下表達(dá)p53的重組腺病毒，并按照符合藥物與食品管理局(FDA)規(guī)定的生產(chǎn)人用藥品的方法純化之。這些方法包括但不只限于氯化銫密度梯度離心，然后測試效率和純度。
認(rèn)為有兩種基本方法是適于p53腺病毒治療的方法，一是直接或局部給藥和一種是全身性給藥。本方法適于治療各種已知與p53突變相關(guān)的不同的腫瘤。就全身給藥來說，已顯示簡單地靜脈內(nèi)注射腺病毒足可導(dǎo)致遠(yuǎn)離注射部位之組織的病毒感染(Stratford-Perricaudet et al.，199b)，并因此而適于治療所有p53相關(guān)腫瘤。可以將病毒加在藥理學(xué)上可接受的溶液中通過靜脈內(nèi)途徑，或經(jīng)長時間輸送投用于病人。一般說來，所投用的有效數(shù)量的功能性病毒顆粒將在1×1010至5×1012范圍內(nèi)。
另外，具體就肺癌來說，必要時可以更直接地物理注入重組腺病毒，以相似方式經(jīng)支氣管內(nèi)投用囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(Rosenfeld et al.，1992)。這樣可以將重組p53腺病毒輸送到更接近靶細(xì)胞的部位。
更詳細(xì)地說，可以沿著下列路線發(fā)展優(yōu)選的治療方法。首對病人進(jìn)行氣管鏡檢查以了解阻塞程度。應(yīng)通過氣管鏡盡可能多地切除大體腫瘤。最好在局部或全身麻醉下對病人進(jìn)行氣管鏡檢查。將一個StifcorTM跨氣管抽吸針(21g)通過氣管鏡的活檢通道。然后以小體積如大約10ml或更小些的體積在殘留腫瘤部位注射p53腺病毒。
因?yàn)樗玫南俨《驹谌魏吻闆r下都是復(fù)制況無能的，所以病毒本身對治療對象的健康沒有不良影響。但治療期間病人至少應(yīng)在醫(yī)院里留院觀察48小時以監(jiān)視其總性和遲發(fā)性不良反應(yīng)。過去已注意到使用重組缺陷腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的安全問題(Rosenfeld et al.，1992；faffe et al.，1992)，但應(yīng)適當(dāng)?shù)乇O(jiān)測腺病毒的使用劑量以進(jìn)一步盡可能地減少不期望的副作用。
當(dāng)提出存在反應(yīng)不足或存在毒性時，應(yīng)該考慮多個不同的標(biāo)準(zhǔn)。為了幫助確定毒性的存在，在療程開始前應(yīng)攝影測量腫瘤的大小。將測量最長直徑和其垂直徑長度。以直徑的乘積記錄腫瘤大小。可根據(jù)這些數(shù)據(jù)計(jì)算出腫瘤再生長的速率。
測定從第一次觀察有腫瘤塊退化到出現(xiàn)進(jìn)行性病變?yōu)橹沟臅r間進(jìn)程。進(jìn)行性疾病定義為所測得之損傷的直徑乘積的總和增加≥25％。在確定進(jìn)行性病變之前病人必須已接受了至少兩個療程的治療。從進(jìn)入程序開始測病人的存活期。
追蹤檢查應(yīng)包括所有用于腫瘤治療的常規(guī)檢查，包括監(jiān)測臨床指征和進(jìn)行用于常規(guī)和分子生物學(xué)分析的活體組織檢查，在分子生物學(xué)分析中估測各種p53基因表達(dá)的特征。如此也將提供已攝入了被轉(zhuǎn)移之基因的細(xì)胞的數(shù)目及啟動子及體內(nèi)相對強(qiáng)度的信息。基于獲得的資料，可對治療方案進(jìn)行調(diào)整。這些調(diào)整可包括使用不同啟動子的腺病毒構(gòu)建體或所注射之pfu數(shù)目的改變以確保在沒有非生理性過表達(dá)重組基因的情況下感染更多的或所有的腫瘤細(xì)胞。
應(yīng)考慮到在體內(nèi)由腺病毒轉(zhuǎn)移之外源基因的表達(dá)可持續(xù)一個長的時期。治療上有效地長期表達(dá)由病毒轉(zhuǎn)移的外源基因必須基于每個具體病例來考慮和處理。標(biāo)志基因在其應(yīng)用中只限于估計(jì)基因表達(dá)的治療上相關(guān)的持續(xù)時間，因?yàn)闉榱司徑馊魏我阎z傳疾病所需的表達(dá)水平可能與為了完全治療其他疾病所需的水平有很大的差異。
雖然已借助優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的前提下對本文所述的組合物、方法及方法中的各步驟或各步驟的次序作出改動。及具體地說，顯然可以用某種化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的制劑取代本文描述的制劑并獲得相同或相似的結(jié)果。所有這些相似的取代或修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的，并視為屬于本發(fā)明待批權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍和概念之內(nèi)。所有權(quán)利要求的材料和方法均可重現(xiàn)并不必進(jìn)行過多的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。
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C.鏈況單鏈D.拓?fù)鋵W(xué)線性ii.分子類型iii.序列描述SEQ ID NO1GGCCCACCC CCTTGGCTTC(2)SEQ ID NO2信息i.序列特征A.長度20B.類型核酸C.鏈況單鏈D.拓?fù)鋵W(xué)線性ii.分子類型iii.序列描述SEQ ID NO2TTGTAACCAT TATAAGCTGC(2)SEQ ID NO3信息i.序列特征A.長度20B.類型核酸
C.鏈況單鏈D.拓?fù)鋵W(xué)線性ii.分子類型iii.序列描述SEQ ID NO3TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG(2)SEQ ID NO4信息i.序列特征A.長度20B.類型核酸C.鏈況單鏈D.拓?fù)鋵W(xué)線性ii.分子類型iii.序列描述SEQ ID NO4CATCTGAACT CAAAGCGTGG
權(quán)利要求
1.攜帶腺病毒載體構(gòu)建體的重組腺病毒，所說的載體包含編碼p53的表達(dá)區(qū)，其能移在人惡性細(xì)胞中表達(dá)p53。
2.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其中載體構(gòu)建體包含位于巨細(xì)胞病毒IE啟動子控制下的p53表達(dá)區(qū)。
3.權(quán)利要求2的重組腺病毒，其中載體構(gòu)建體包含p53表達(dá)區(qū)、巨細(xì)胞病毒IE啟動子及SV40早期聚腺苷酸化信號。
4.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其中從載體構(gòu)建體中刪除了腺病毒復(fù)制所必需的基因并在其位置上導(dǎo)入了p53表達(dá)區(qū)。
5.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其中腺病毒載體的E1A和E1B區(qū)被刪除并在其位置上導(dǎo)入了p53表達(dá)區(qū)。
6.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其具有圖1所示的基因組結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其分散于藥理學(xué)上可接受的配方中。
8.用依據(jù)權(quán)利要求1的重組腺病毒感染的重組宿主細(xì)胞。
9.恢復(fù)有野生型p53缺陷之細(xì)胞的野生型p53蛋白質(zhì)功能的方法，其包括使細(xì)胞與一定量可在細(xì)胞中有效表達(dá)野生型p53的權(quán)利要求1的重組腺病毒接觸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)胞是有p53基因突變的腫瘤細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞是人肺癌細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞是人乳腺癌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)胞位于哺乳動物體內(nèi)，并且腺病毒是以藥理學(xué)上可接受的形式給哺乳動物投用的。
14.產(chǎn)生重組腺病毒的方法，該方法包括通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將腺病毒質(zhì)粒和表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；并分析培養(yǎng)的宿主細(xì)胞是否有作為同源重組和病毒產(chǎn)生之指征的細(xì)胞病變效應(yīng)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染步驟是DOTAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
16.權(quán)利要求14的方法，其中腺病毒質(zhì)粒是有復(fù)制缺陷的腺病毒質(zhì)粒并且宿主細(xì)胞彌補(bǔ)這一缺陷。
17.權(quán)利要求16的方法，其中腺病毒質(zhì)粒缺少功能性E1A和E1B，并且宿主細(xì)胞是表達(dá)E1的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。
19.權(quán)利要求14的方法，其中宿主細(xì)胞是在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。
20.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括從表現(xiàn)有細(xì)胞病變效應(yīng)之細(xì)胞上清中得到DNA并使用表達(dá)載體特異性和腺病毒基因組特異性DNA探針經(jīng)PCR分析DNA，以證實(shí)重組腺病毒的存在。
21.權(quán)利要求14的方法，其中表達(dá)載體包含p53編碼DNA片段，該片段處于能夠指導(dǎo)人轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中p53表達(dá)的啟動子控制之下。
全文摘要
公開了利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染及直接觀察被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)以制備重組腺病毒的簡化而有效的方法。還公開了涉及新的p53腺病毒構(gòu)建體的組合物及制備方法，包括恢復(fù)有異常p53之細(xì)胞和動物體內(nèi)的p53功能及腫瘤抑制作用的方法。
文檔編號C12N5/10GK1136826SQ94194354
公開日1996年11月27日 申請日期1994年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月29日
發(fā)明者W·W·張, J·A·羅斯 申請人:德克薩斯州立大學(xué)董事會