專利名稱：網(wǎng)柱菌屬二肽氨肽酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更確切地說，本發(fā)明涉及從粘液霉菌盤狀網(wǎng)柱菌中分離得到的一種二肽氨肽酶，它可用于加工重組產(chǎn)生的生物化合物。
盤狀網(wǎng)柱菌是一種原始的真核微生物，通常被稱為粘液霉菌，或者更確切地稱為細胞粘液霉菌。這個名稱是從肉眼觀察到的該微生物的兩個極端狀態(tài)而來的。當活躍生長時，盤狀網(wǎng)柱菌生長為單細胞變形蟲。在這個階段它們沒有細胞壁，因此它們外表為一層薄膜(或者粘液)。在固體培養(yǎng)基并處于饑餓狀態(tài)下，各個獨立的細胞聚集形成一個集落。這個集落呈現(xiàn)一種多細胞生物體的特征，因為它以蛞蝓的方式移動，然后進行分化。它后面的細胞形成一個足，前面的細胞形成一個柄，而中間的細胞形成一個果實體。這個生物體天然是在泥土和糞肥的表面發(fā)現(xiàn)的。野生型變形蟲只通過攝取(吞噬)整個的細菌來獲得營養(yǎng)，因此它們有時被稱為是食肉的。盤狀網(wǎng)柱菌的無外來污染的突變體已被分離出來，它們能在無“食物”細菌的共培養(yǎng)下生長，所以能生長在可溶培養(yǎng)基中。本發(fā)明涉及從盤狀網(wǎng)柱菌中分離的二肽氨肽酶。
二肽氨肽酶(DAP)是水解氨基端倒數(shù)第二個肽鍵的酶，從肽的蛋白質(zhì)的未封閉的氨基端釋放二肽。目前有四類二肽氨肽酶(稱做DAP-Ⅰ，DAP-Ⅱ、DAP-Ⅲ和DAP-Ⅳ)，它們的區(qū)別在于其物理性質(zhì)及其催化裂解不同的多肽氨基端序列的速率的差異。DAP-Ⅰ是一種從蛋白質(zhì)和肽類未封閉的氨基末端催化釋放出許多二肽復合物的相對非特異性的DAP。如果出現(xiàn)的二肽是Ⅹ-Pro、Arg-Ⅹ或者Lys-Ⅹ(Ⅹ為任何一種氨基酸)，那么DAP-Ⅰ幾乎不顯示活性。DAP-Ⅱ?qū)Π被硕捻樞驗锳rg-Ⅹ或Lys-Ⅹ的優(yōu)先，其次為Ⅹ-Pro，而對其余大多數(shù)二肽復合物DAP-Ⅱ的裂解速率顯著降低。DAP-Ⅲ似乎對氨基端二肽順序為Arg-Arg和Lys-Lys的具有傾向性。DAP-Ⅳ對二肽順序為Ⅹ-Pro的顯示最高的水解活性。DAP酶，尤其是DAP-Ⅰ與DAP-Ⅳ在處理加工蛋白質(zhì)方面已顯示出其用途。本發(fā)明涉及盤狀網(wǎng)柱菌中的一種新DAP，它用于加工以偶數(shù)個氨基酸N-末端延伸的重組蛋白。
本發(fā)明涉及從細胞粘液霉菌-盤狀網(wǎng)柱菌中分離的一種新二肽氨肽酶。這個新的二肽氨肽酶-dDAP顯示出有些類似DAP-Ⅰ和DAP-Ⅲ兩者的活性，但在物理和其它的酶特征方面又與它們有顯著區(qū)別。本發(fā)明還涉及利用dDAP酶從重組產(chǎn)生的前體蛋白或前體多肽的N-末端移去二肽的方法。本發(fā)明的dDAP酶可用于從多肽的N-末端移去單個二肽，也可用于從前體多肽的N-末端順序移去一個以上的二肽。此外，本發(fā)明還涉及從盤狀網(wǎng)柱菌的培養(yǎng)物中分離純化此dDAP酶的方法。
就本發(fā)明目的而言，在本文說明書和權(quán)利要求書所用的下列術(shù)語及縮寫定義如下dDAP為一種從盤狀網(wǎng)柱菌中分離得到的二肽氨肽酶，用GFPNA作底物證明其最適pH為pH3.5，用超離心分析測得其他分子量約為225，000道爾頓，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳得知其單個亞基的分子量約為66，000道爾頓。
GFPNA為甘氨酰-苯丙氨酰-對硝基苯胺。
前體多肽為一種重組產(chǎn)生的多肽，它包括由從有意義的期望的多肽的氨基末端延伸的偶數(shù)個氨基酸。
加工后多肽為一種多肽，其中N-末端二肽或多個二肽已被移去，生成有意義的目的多肽。
RRBNA為精氨酰-精氨酰-β-萘胺本公開應用的所有氨基酸縮寫均被美國專利與商標局在37C.F.R.§1.822(b)(1990)中認可。
本發(fā)明是針對一種從細胞粘液霉菌盤狀網(wǎng)柱菌中分離出的一種二肽氨肽酶，dDAP。dDAP酶顯示出裂解未封閉氨基末端順序的傾向，而它們過去習慣上由DAP-Ⅰ和DAP-Ⅲ共同完成，即便如此，dDAP在物理及其它酶學特性上與這些酶存在明顯區(qū)別。dDAP以GFPNA為底物測得其最適pH約為pH3.5，天然dDAP分子量約為225，000道爾頓，而單個亞基的分子量約為66，000道爾頓。凝集素親合色譜表明dDAP很可能是一個糖蛋白。dDAP酶能從合成的底物GFPNA和RRBNA以及其它許多合成的和重組產(chǎn)生的多肽上移去二肽。
已知的DAP-Ⅰ酶已從多種動物及動物組織中分離得到。新酶dDAP是從盤狀網(wǎng)柱菌的培養(yǎng)物中分離得到的。DAP-Ⅰ酶需要鹵化物和還原劑才有活性。還原劑(如碘代乙酸鹽，它修飾半胱氨酸巰基)鈍化DAP-Ⅰ酶。DAP-Ⅰ在pH5-6之間有最理想的活性。與此相反，以GFPNA或RRBNA作底物，dDAP酶的最適pH約為3.5，而且在pH3.5條件下dDAP對蛋白質(zhì)和肽也具顯著活性，但它在pH＞6條件下無明顯活性。dDAP酶無需添加還原劑并且在半胱氨酸修飾物(如碘代醋酸鹽和連四硫酸鹽)的存在下仍具完全活性。dDAP與牛DAP-Ⅰ相似，因為它不能裂解N-末端封閉的肽，但是dDAP又與牛DAP-Ⅰ不同，它對N-末端具有氧化的甲硫氨酸底物仍具活性，而DAP-Ⅰ不能裂解在N-末端具有氧化的甲硫氨酸的底物。此外，與牛DAP-Ⅰ不同，dDAP酶能夠容易地裂解RRBNA底物。這種裂解包含裂解Arg-Arg二肽基的氨基末端底物的能力，與哺乳和微生物來源的DAP-Ⅲ酶活性很相似。雖然據(jù)報道DAP-Ⅲ酶在堿性范圍內(nèi)具有最適pH，而dDAP在酸性范圍具有最有效作用。據(jù)SDS-PAGE測定，dDAP亞基分子量約為66，000道爾頓，而哺乳動物DAP-Ⅰ的亞基分子量約為22，000道爾頓。
本發(fā)明的dDAP酶對于將前體多肽轉(zhuǎn)變?yōu)榧庸ず蠖嚯姆浅Ｓ杏?。例如，若目的多肽是人類生長激素，那么只需表達此激素的前體(在一實例中，Met-Asp-人類生長激素)，然后將此前體在dDAP的作用下釋放出二肽Met-Asp和加工后的目的多肽人生長激素。加工后的肽無需是“天然”的野生型多肽，因為通常希望產(chǎn)生類似物或中間體。加工前體多肽的方法也是本發(fā)明的一個部分?？杀籨DAP加工的其它前體多肽包括Met-Arg-人生長激素，Met-Tyr-胰島素原，Met-Arg-胰島素原，Met-Arg-胰島素原類似物(B28Lys，B29Pro)，Met-Arg-胰島素原類似物(B10Asp，des B28-30)和Met-Tyr-胰島素原類似物(B10 Asp，des B28-30)。胰島素類似物(B28 Lys，B29 Pro)公開在歐洲專利申請序號為90301224.3中，而胰島素類似物(B10 Asp，des B28-30)公開在歐洲專利申請序號為92305678.2中。此外，dDAP還可用于從前體多肽N-末端順序地移去一個以上的二肽。用牛DAP-Ⅰ加工Met-Arg-胰島素原及其類似物公開于美國專利申請5，126，249號中(1992年6月30日授予Becker等人)。所有這些教導均作為參考文獻并入本文中。
利用dDAP酶從前體蛋白質(zhì)移去二肽是有利的，因為dDAP最適pH約為3.5，這就允許反應在許多前體多肽可溶的酸性pH范圍內(nèi)進行。再者，在中性或更高pH條件下一些前體多肽的轉(zhuǎn)化會導致鏈間二硫聚合物或底物多聚體生成水平增加，而這伴隨著產(chǎn)物產(chǎn)量損失。這個現(xiàn)象叫作二硫化物混雜(scrambling)，尤其在使用牛DAP-Ⅰ時很麻煩，因為DAP-Ⅰ在反應混合物中需要還原試劑的存在，如β-巰基乙醇或半胱氨酸。而且在酸性pH范圍里甲硫氨的殘基的氧化發(fā)生率較低。此外，從盤狀網(wǎng)柱菌發(fā)酵培養(yǎng)物中分離的酶比從動物來源大批量生產(chǎn)的酶更經(jīng)濟，因為發(fā)酵技術(shù)允許較高濃度的產(chǎn)物存在以及酶的再生。避開動物來源的酶，主要考慮到大量高純原料的恒定來源。盤狀網(wǎng)柱菌Ax3(ATCC28368)的發(fā)酵，然后通過離心、陰離子交換色譜、巰水相互作用色譜、容積排阻色譜可得到高度純化的dDAP酶溶液，它可以貯存或立即用于加工前體多肽。從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離和純化dDAP也是本專利的一個部分。
將前體多肽轉(zhuǎn)變?yōu)榧庸ず蠖嚯?，可在一個較大的溫度范圍、pH范圍和時間階段內(nèi)完成。反應一般在使pH保持在約2.5-5.5的緩沖的水性介質(zhì)中進行。介質(zhì)的pH范圍優(yōu)選大約3.0-4.5，最好在約3.0-3.5，最適pH可能根據(jù)底物不同而有微小變動。例如，加工GFPNA和GRPNA的速率在pH約3.5時最快，而加工Met-Asp-hGH的速率在pH約3.0-3.5時較迅速。加工Arg-Arg-BNA的速率在pH約4.5時最快。熟練的技術(shù)人員會認識到任何特定反應的最適pH是由諸如所給的前體多肽和酶的穩(wěn)定性、溶解度等因素決定的。在某些情況下，可采用如尿素、十二烷基硫酸鈉、胍等增溶劑。
加工反應可在從僅幾秒鐘到幾天的時間范圍內(nèi)進行。優(yōu)選大約1分鐘到24小時，最優(yōu)選大約1小時到8小時。熟練的技術(shù)人員會認識到反應時間能容易地根據(jù)任意需要的前體多肽或加工后多肽所需的參數(shù)來調(diào)整。
加工反應的溫度還能根據(jù)所給底物進行調(diào)整。反應一般在大約15℃～45℃進行，優(yōu)選大約20℃-37℃，最優(yōu)選約25℃-37℃。再者，熟練的技術(shù)人員會容易的認識到反應的pH、溫度和時間參數(shù)會因需要的前體多肽和加工后多肽的需要而有所變動。
只要能夠保持所需要的pH范圍，可使用任何范圍的緩沖試劑。代表性的緩沖試劑實例是磷酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、甘氨酸等。緩沖試劑優(yōu)選為乙酸鈉、磷酸鈉和甘氨酸。
本發(fā)明中使用的前體多肽一般是通過重組DNA技術(shù)制備的。在制備中目的前體多肽的核苷酸編碼順序是利用這類合成的常規(guī)技術(shù)制備的。這些方法一般包括目的編碼序列片段和它的互補序列寡核苷酸編碼的制備。設(shè)計的寡核苷酸以提供編碼序列的一個片段與互補序列的兩個片段的重疊，反過來也是這樣。將寡核苷酸配對連結(jié)，最后得到目的基因順序。
此順序插入克隆載體，其位置在能表達產(chǎn)物的編碼區(qū)。一個合適的克隆載體至少包含表達控制順序的一個部分。
下列實施例用于舉例說明此發(fā)明。它們決不是對本發(fā)明的限制。
實施例1盤狀網(wǎng)柱菌的發(fā)酵盤狀網(wǎng)柱菌Ax3的凍干培養(yǎng)液是從注冊號為ATCC28368的馬里蘭州羅克維爾美國典型培養(yǎng)物收集中心獲得的，然后接種到幾種濃度的瓊脂培養(yǎng)皿上(1.2%Difco Bacto瓊脂)，其中包括用緩沖液處理的酵母提取蛋白胨培養(yǎng)基，組成為(克/升)Difco酵母提取物(7.15)，Difco Bacto胨(14.3)，Na2HPO4(0.51)和KH2PO4(0.49)，并加入單獨滅菌的葡萄糖(終濃度為10克/升)，再用NaOH或H2SO4調(diào)整至最終pH為6.5(+/-0.1)。相同的培養(yǎng)基(沒有瓊脂)用于體積小于一升的液體培養(yǎng)生長。瓊脂培養(yǎng)皿在21℃～24℃培養(yǎng)3-5天。從培養(yǎng)基上收獲孢子團，小心不要將與Ax3培養(yǎng)基一起凍干的“食物細菌”也取出來，然后將孢子團移入3ml緩沖液處理的酵母提取蛋白胨液體培養(yǎng)基中，并在21℃～24℃輕微振蕩培養(yǎng)。此后，盤狀網(wǎng)柱菌細胞通過連續(xù)地轉(zhuǎn)移到體積逐漸增大的用緩沖液處理的酵母提取蛋白胨液體培養(yǎng)基中增殖。連續(xù)的每步轉(zhuǎn)移都是在細胞濃度超過2×106/ml時并稀釋大約10-25倍。液體培養(yǎng)基總是在輕度搖動下在21℃～24℃培養(yǎng)。
攪動的發(fā)酵一般在一種相似的培養(yǎng)基中進行，即用濃度為2-14.3克/升的大豆蛋白胨(如植物蛋白胨或Marcor大豆蛋白胨)來代替起初的酵母提取蛋白胨培養(yǎng)基。通常從配有1到3個轉(zhuǎn)速為40-150轉(zhuǎn)的Rushon渦輪推進器、工作體積為10到2000升的發(fā)酵器中收獲。溫度控制在22±1℃，空氣流動控制在每體積液體培養(yǎng)基0.1到0.5體積空氣，排氣壓力保持在3-5p.s.i.。有些發(fā)酵pH用硫酸控制在6.4，有些通過變化的攪動和空氣流動將溶解氧控制在40-60%。在細胞的處理和發(fā)酵中小心減少切變，因為它們在生長過程中是沒有細胞壁的變形蟲。
通常，盤狀網(wǎng)柱菌Ax3的攪動培養(yǎng)液在12-36小時內(nèi)加倍增長。溶解氧逐漸減少(當不控制時)并在細胞密度停止增長后某一時間開始回升。最終細胞密度在3×106/ml到5×107/ml范圍內(nèi)，伴隨著氧的轉(zhuǎn)移明顯限制在較低的最大細胞密度的發(fā)酵過程中。
樣品不定時地取出并分析其細胞密度和GFPNA的活性(參見下文實施例3)。當高于約5×105/ml時，用Petroff-Hauser計數(shù)板來測定細胞密度。通常，在發(fā)酵過程中GFPNA水解活性逐漸增加。達到最大細胞密度后的2到4天可觀察到最大的dDAP活性。所有的液體培養(yǎng)基在4℃貯存或-20℃凍存，然后解凍并分析活性。發(fā)酵通過冷卻到10℃以下并用連續(xù)流動離心機去掉細胞獲得產(chǎn)品。
實施例2dDAP的制備A.細胞的去除和濃縮從盤狀網(wǎng)柱菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基中對dDAP的最初純化包括細胞去除和濃縮步驟。細胞的去除是在Western States離心機上用連續(xù)流動離心完成的。無細胞培養(yǎng)基通過用能去除50，000分子量以下物質(zhì)的膜進行切向流動超濾，被濃縮約20倍。保留物從超濾室中排出，用50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH7)沖洗超濾室以回收殘留的dDAP。保留物與洗下的樣品合并形成最終濃縮物。在進一步處理前，合并液可在-20℃冷凍保存幾個月。
B.澄清冷凍的最終濃縮物在室溫解凍約12小時。一旦解凍，在第一次柱色譜步驟前，最終濃縮物要進行澄清。澄清操作由離心和隨后的5微米濾膜過濾完成。將澄清的最終濃縮物調(diào)節(jié)pH至7.0，在等待離子交換色譜時可于4～10℃下保存不超過12小時。
C.離子交換色譜法dDAP純化過程的首次柱色譜法是陰離子交換色譜，用Pharmacia Q-瓊脂糖快流速樹脂(FFQ)。交換柱用50mM tris緩沖液(pH＝7)平衡。澄清的無細胞濃縮物按每升樹脂對應60升未濃縮的發(fā)酵培養(yǎng)液以線性流速為50cm/hr的速率上樣。結(jié)果每升樹脂可獲得60克蛋白(蛋白量以牛血清白蛋白作標準，通過Pierce BCA蛋白分析測定)。每升FFQ樹脂上樣的dDAP活性約為250單位。無細胞濃縮物電導率約為5mMHOS/cm。上樣完畢后，F(xiàn)FQ樹脂用三倍柱體積的平衡緩沖液沖洗。用10倍柱體積的0-1M NaCl，50mM Tris(Ph7)以流速為50cm/hr對樹脂進行線性梯度洗脫得到dDAP活性物，每組分為0.1柱體積。FFQ柱進一步用3倍柱體積的pH7.050mM Tris(內(nèi)含1.0M NaCl)進一步洗脫。流出物通過電導率和在280nm處的吸收進行監(jiān)測。各組分通過在pH3.5時其裂解GFpNA比色底物的能力來分析dDAP活性。將包含大約90%洗脫下的總dDAP活性物的各組分合并組成主流池。dDAP活性物以大約兩倍柱體積的單峰被洗脫下來。主流池用10%(V/V)的HCl酸化到pH3.5。FFQ經(jīng)酸化的主流池在4℃最多貯存兩天。
D.疏水相互作用色譜法FFQ酸化的主流池再用疏水相互作用色譜法(HIC)純化。用藥用苯基瓊脂糖凝膠(Pharmacia Phenyl Sepharose)快流速樹脂，柱體積為陰離子交換柱的三分之一。每升樹脂上樣約650單位活性物。每升樹脂的蛋白上樣量是4克(在280nm，一個吸收單位等于1mg/ml蛋白)。每升加入140克硫酸銨制備FFQ主流液上到HIC柱。所上樣調(diào)節(jié)到pH3.5，最終電導率約為90mMHOS/cm。HIC柱用PH3.5，50mM檸檬酸鹽平衡，其中每升至少含有140g硫酸銨。以40cm/hr的線流速上料，該樹脂至少用三倍柱體積的平衡緩沖液沖洗。dDAP活性物用10倍于柱體積的含140g/L到0g/L硫酸銨、pH3.5的50mM檸檬酸鹽溶液以40cm/hr的速率進行線性梯度洗脫。柱子進一步用至少三倍柱體積的50mM檸檬酸鹽(pH3.5)溶液洗脫。每組分為0.1倍柱體積，流出液用電導率和280nm處的吸收來監(jiān)測。流分的dDAP活性通過它們在pH3.5時裂解GFPNA的能力來測定。將包含大約90%洗脫下的總dDAP活性物各組分合并組成主流池。洗脫的為單峰的dDAP活性物約為柱體積的2倍。主流池用10%(V/V)HCl或10%(W/V)NaOH調(diào)節(jié)至pH3.5。在后面的處理過程前，HIC主流池在4℃保存不超過一天。
E.體積排阻色譜法HIC主流池進一步用S-200瓊脂糖凝膠體積排阻色譜法(SEC)處理。所用柱的體積為HIC柱的兩倍，柱床高78cm。通過可去除10，000道爾頓分子量的膜在超濾單元中濃縮HIC主流物，制備用于SEC柱的HIC主流物。HIC主流物濃縮到SEC柱體積的2.5%，并把超濾室內(nèi)的保留物排出，用等于2.5%SEC柱體積、pH3.5的50mM檸檬酸鹽緩沖液沖洗超濾室。保留物與沖洗液合并，形成最終濃縮物，用10%(V/V)HCl或10%(W/V)NaOH調(diào)節(jié)pH至3.5。最終濃縮物的電導率約為30mM HOS/cm。SEC柱用50mM乙酸、20mM氯化鈉(pH3.5)平衡，其電導率約為2mMHOS/cm。最終濃縮物以15cm/hr的線性流速上到SEC柱中，dDAP活性物用一倍柱體積的平衡緩沖液洗脫下來，每組分是柱體積的0.02倍。洗脫物用電導率和在280nm處的吸收來監(jiān)測，通過其在pH3.5時裂解GFPNA的能力來測定組分中dDAP活性。將包含大約90%洗脫的總dDAP活性物和組分合并組成主流池。dDAP活性物以單峰形式洗脫下來，約為柱體積的0.08倍。SEC主流池可以在4℃保存幾個月。
用陰離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法及體積排阻色譜法的組合來進行dDAP純化，得到的物質(zhì)在SDS-PAGE上以一條主帶遷移。此帶在凝膠上遷移的位置相當于標準牛血清白蛋白分子量(66 KD)。蛋白用ISS普魯蘭(Pro-blue)染色。遷移圖譜不受樣品制備過程中含不含0.1M DTT(100℃加熱五分鐘)的影響。DAP-Ⅰ(來源于牛)亞基分子量用SDS-PAGE測得約為22，000道爾頓。
實施例3dDAP的活性A.轉(zhuǎn)化反應1.GF-PNA的裂解dDAP的活性通常是通過跟蹤生色底物Gly-Phe-對硝基苯胺(GF-PNA)的裂解來監(jiān)測的。典型的檢測是在1.0ml調(diào)節(jié)到pH3.5的4mM GFPNA溶液中把酶稀釋11倍進行的。GF二肽裂解速率在37℃通過測定405nm處吸收值的增加來檢測。
在這些條件下，每單位活性引起每分鐘0.90oD值變化。假定405nm處游離PNA的消光系數(shù)為9.9mM-1cm-1，可以估計出單位/ml值。
以GFPNA做底物，用碘乙酰胺、連四硫酸鉀以及已知的抑制DAP-Ⅰ活性的巰基修飾試劑作抑制劑，將它們對dDAP的抑制與對牛DAP-Ⅰ的抑制相對照。dDAP或牛脾DAP-Ⅰ的樣品在100mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液中配成pH7的抑制劑終濃度為0，0.5，5.0或50mM體系中，室溫孵育15分鐘。孵育液然后用pH3.5的4mM GFPNA稀釋21倍。通過測定37℃時在405nm處吸收值的增加來監(jiān)測裂解速率。當反應體系含5mM碘代乙酰胺時，牛DAP-Ⅰ裂解GFPNA的速率降低大于90%，而含5mM連四硫酸鉀抑制95%。沒有跡象表明，dDAP明顯受實驗中所用任何濃度的碘代乙酰胺和連四硫酸鉀抑制。
dDAP裂解GFPNA的最適pH是在由0.5三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽和檸檬酸鹽組成的緩沖液中，用10%HCl或10%NaOH將pH調(diào)節(jié)至3-8的幾個不同pH緩沖液中測得的。dDAP酶在含100mM半胱胺和10mM 10mM NaCl的緩沖液中稀釋20倍，牛DAP-Ⅰ在同樣緩沖液中稀釋200倍。GFPNA底物(4mM)溶于2%DMF中。在一微滴定平板上，將0.025ml各種pH值的三羥甲基氨基甲烷/磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液與0.1ml稀釋的酶和0.1ml底物溶液混合，30分鐘內(nèi)，在平板閱讀器上于410nm處測定吸收值增加的速率。結(jié)果表明，dDAP裂解DFPNA的最適pH在3.5到4.0之間。
2.Gly-Arg-pNA的裂解在pH為5的50mM乙酸、50mM甘氨酸緩沖液中配制4mM Gly-Arg-pNA(GR-pNA)。用HCl或NaOH將pH調(diào)至5.1-2.3幾個不同的pH值。向180ml上述pH的底物緩沖液中加入5mldDAP(終濃度為49毫單位/ml)，在410nm處的吸收值增加速率用平板閱讀器監(jiān)測，并與反應液的pH相對照。與GF-PNA底物相似，GR-PNA底物在大約3.5有一最適pH值。在pH低于2.5或高于5時，此酶對該底物幾乎沒有活性。
3.Arg-Arg-β-萘酰胺(RR-BNA)的裂解將約0.25mM RR-BNA或0.25mM芐氧羰基-RR-BNA(Z-RR-BNA)溶于pH3.5的100mM乙酸中或溶于pH5.0的100mM檸檬酸鹽緩沖液中。向2ml底物中加入dDAP或牛DAP-Ⅰ(約每毫升溶液含15毫單位)，通過監(jiān)測340nm激發(fā)后410nm處的熒光增加來檢測裂解的速率。牛DAP-Ⅰ不能裂解任何一種底物，而dDAP出人意料地能有效裂解RR-BNA底物。dDAP不能裂解封閉氨基基團的Z-RR-BNA底物，這更證明了dDAP是一個DAP酶。采用含有50mM乙酸和50mM檸檬酸鹽的緩沖體系，通過監(jiān)測RR-BNA的裂解速率，探測出最適合RR-BNA裂解的pH值。使用HCl或NaOH得到各種pH，每種pH緩沖液取1.5ml與0.5ml1mM的RR-BNA貯存液混合得2.0ml(RR-BNA終濃度約0.25mM)，加入dDAP(約15mM/ml)，測定其裂解速率，在探測的整個范圍(pH3.5-5.7)，觀察到的裂解RR-BNA的最適pH約為4.5。這時該酶有顯著的活性。這一驚人結(jié)果提示dDAP具有DAP-Ⅲ的某些性質(zhì)。
熟練的技術(shù)人員會認識到，底物裂解的最適pH不僅依賴于酶，而且也與底物自身有關(guān)。也就是說，與被切下的二肽和指示基團自身的組成有關(guān)。例如，使用dDAP，Gly-Arg-pNA的最適pH大約是3.5，而Gly-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素(GR-AMC)裂解的最適pH約為5，提示報道的基團會影響裂解的性質(zhì)。
B.合成的八肽及十肽的轉(zhuǎn)化八肽Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu用pH3.5的50mM乙酸溶解，其濃度為4mM。此溶液用dDAP(10mM/ml)按1∶1稀釋，并在室溫孵育6小時，用含1%磷酸的7M尿素稀釋20倍，中止反應。中止后的樣品用高壓反相色譜法(HPLC)來分析。裂解產(chǎn)物與八肽、Met-Asp二肽及Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu六肽標準品比較。dDAP容易地從未封閉的八肽的氨基端切去Met-Asp二肽，但不易切下暴露出來的Phe-Pro二肽。
合成的十肽Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu用pH3.5的100mM甘氨酸配制成1.7mM的貯備液。向1.5ml貯備液中加入8ml6.4mM/ml的dDAP(用pH3.5的100mM甘氨酸配制)，每小時取5ml該反應液直接注入反相HPLC色譜系統(tǒng)檢測裂解產(chǎn)物，將Met-Arg和met-Try二肽以及Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu和Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu肽分別單獨注入做為對照。dDAP容易地從十肽上切下Met-Arg二肽，同樣容易地切下暴露出來的Met-Tyr二肽。這表明二肽能夠順次從氨基端被dDAP切下。
C.Met-Asp-人生長激素的轉(zhuǎn)化Met-Asp-人生長激素(Met-Asp-hGH)在大腸桿菌的胞漿中以不溶性蛋白生產(chǎn)出來。該不溶性蛋白被溶解，然后對折生成具有配對的二硫化物的Met-Asp-hGH，并用離子交換色譜法進行純化。這一制備過程中溶劑是可變換的，并被調(diào)節(jié)到pH3.5。將Met-Asp-hGH溫熱到37℃，測定其在280nm處的吸收。以每毫克Met-Asp-hGH6毫單位的量加入dDAP。轉(zhuǎn)化反應在37℃進行，攪拌大約4-6個小時。采用較少的酶、較低的溫度或較低的Met-Asp-hGH濃度，反應進程可被放慢而不會有損害。加入更多的酶、提高Met-Asp-hGH的濃度或升高反應溫度可使反應速率增加。轉(zhuǎn)化反應的進行由反相色譜來監(jiān)測。攪拌下，快速加入NaOH至pH8，并加入30%(V/V)乙腈，使轉(zhuǎn)化反應得以中止。dDAP處理后得到的人生長激素反應產(chǎn)物要經(jīng)受一組廣泛的分析步驟，包括肽圖譜、N末端序列分析、質(zhì)譜、氨基酸分析以及反相色譜(HPLC)。所有數(shù)據(jù)表明，由dDAP得到了可靠的人生長激素。
D.Met-Arg-人胰島素原的轉(zhuǎn)化Met-Arg-人胰島素原(Met-Arg-hPI)作為一種不溶蛋白在大腸桿菌胞漿中產(chǎn)生。此不溶蛋白溶解于7M尿素溶液中，由離子交換色譜法純化。Met-Art-hPI被硫解(sulfitolyzed)、溶劑交換并對折生成天然的二硫鍵配對物和天然的三級結(jié)構(gòu)，并進一步用反相色譜純化。用過氧化氫從met-Arg-hPI得到氧化的甲硫氨?；?Met(o)-Arg-hPI，隨后用反相色譜純化并冷凍干燥。
得到的Met-Arg-hPI為約24mg/ml(在pH3.5約20mM甘氨酸緩沖液中)，大約2.4mg此原料用0.1%毫單位的dDAP在pH3.5下孵育，反應可在室溫進行。定期地取出等份試樣并用10%磷酸稀釋。將稀釋液注入中性反相HPLC系統(tǒng)，檢測Met-Arg-hPI或Met(o)-Arg-hPI的消失以及隨后的hPI產(chǎn)物。另外，等份試樣被稀釋成合適的稀釋液，以便通過HPLC檢測二肽Met-Arg或Met(o)-Arg。大約60%的Met-Arg-hPI在8小時后轉(zhuǎn)變成hPI。在對于Met(o)-Arg-hPI的轉(zhuǎn)化實驗中出乎意料地看到了相似的結(jié)果，即產(chǎn)生了hPI，兩個底物的裂解速率相似。這一結(jié)果是令人吃驚的，因為牛DAP-Ⅰ似乎不能裂解hPI的Met(o)-Ⅹ-衍生物，其中Ⅹ為Arg、Phe和Tyr。反相色譜分析結(jié)果也表明以二肽met-Arg作對照，Met-Art二肽從Met-Arg-hPI中釋放出來。用met(o)-Arg-hPI作底物，在Met-Arg二肽區(qū)出現(xiàn)的一個峰，它可能是二肽Met(o)-Arg。dDAP裂解氧化的Met(o)-Ⅹ底物的能力比不能完成這一裂解的酶具有顯著的加工優(yōu)點。
E.Met-Arg-人胰島素原類似物的轉(zhuǎn)化dDAP酶也可用來有效地轉(zhuǎn)化折疊的Met-Arg-胰島素原類似物(B28Lys，B29Pro)及Met-Arg-胰島素原類似物(B10Asp，desB28-B30)。這些反應的進行同前述對Met-Arg-hPI轉(zhuǎn)化的解釋基本一致。
權(quán)利要求
1.從盤狀網(wǎng)柱菌中分離得到的一種dDAP酶。
2.從前體多肽中移去氨基端二肽的方法，所說的方法包括在適宜于dDAP作用的條件下，將前體多肽與dDAP接觸，以逐步移去前體多肽的氨基端二肽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中前體多肽選自人胰島素原前體、人生長激素前體和人胰島素原類似物前體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的前體多肽與所述的dDAP接觸大約1分鐘到24小時。
5.權(quán)利要求4的方法，其中將所述的前體多肽在約為pH2.5到pH5.5的溶液中與dDAP接觸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中將所述的前體多肽在pH約為3.5的溶液中與dDAP接觸。
7.權(quán)利要求3的方法，其中將所述的前體多肽在約15℃到45℃之間與dDAP接觸。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述的二肽的N-末端氨基酸是氧化的甲硫氨酸。
9.從盤狀網(wǎng)柱菌培養(yǎng)物中分離權(quán)利要求1的dDAP酶的方法，所述的方法包括a)從培養(yǎng)液體中獲得無細胞培養(yǎng)液;b)將所得的培養(yǎng)液經(jīng)過陰離子交換色譜;c)將b)步的洗脫液進行疏水相互作用色譜;d)將c)步洗脫液進行體積排阻色譜。
10.通過權(quán)利要求9所述方法純化的dDAP酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及從細胞粘液霉菌-盤狀網(wǎng)柱菌中分離得到一種新的二肽氨肽酶。這個新的DAP酶，即dDAP，具有類似DAP-I與DAP-III兩者的活性，但在物理及其它酶學特征上與這些酶有很明顯的區(qū)別。本發(fā)明還涉及利用dDAP酶從重組產(chǎn)生的前體蛋白及肽類的N-末端移去二肽的方法。此外，本發(fā)明還涉及從盤狀網(wǎng)柱菌中分離和純化dDAP酶的方法。
文檔編號C12N9/58GK1085253SQ9311845
公開日1994年4月13日 申請日期1993年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月1日
發(fā)明者P·R·阿特金森, M·D·希爾頓, P·K·蘭布伊 申請人:伊萊利利公司