專利名稱：生產(chǎn)色氨酸的微生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)色氨酸的微生物及其制備方法。
大家知道色氨酸代謝在目前所研究過的所有微生物中只以一個(gè)單一生物合成途徑進(jìn)行(Somerville，R.L.，Herrmann，K.M.，1983，氨基酸，生物合成和基因調(diào)控(Aminoacids，Biosynthesis and Genetic Regulation)，Addison-Wesley Publishing Company，USA301-322和351-378;Aida et al.，1986，氨基酸生產(chǎn)的生物學(xué)方法，工業(yè)微生物學(xué)進(jìn)展(Biotechnology of amino acid production，progress in industrial microbiology)Vol 24，Elsevier Science Publishers，Amsterdam188-206)。色氨酸代謝途徑以及與絲氨酸代謝的聯(lián)系和編碼主要酶的基因列在

圖1中。
已知的色氨酸生產(chǎn)方法是基于一個(gè)突變的trp E基因的表達(dá)之上的，該基因編碼有色氨酸不敏感的鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合成酶，以及在一個(gè)合適的可自動(dòng)復(fù)制的載體上的trp操縱子的其他基因的表達(dá)之上。由于這些基因的相對高拷貝數(shù)，trp基因的表達(dá)也多，對應(yīng)的色氨酸代謝中的每一種酶的量也增加了。這導(dǎo)致色氨酸的過多生產(chǎn)。
下面舉一些這種生產(chǎn)色氨酸方法的例子，有許多微生物用于這個(gè)過程，如大腸菌EP 0 293207，US4，371，614，桿菌US4，588，687棒狀桿菌(Corynebacterium)和短桿細(xì)菌(Brevibacterium)EP 0 338 474。在這個(gè)生產(chǎn)過程中，會(huì)存在不穩(wěn)定性、載體丟失或生產(chǎn)菌株生長速度放慢等問題。
EP-A-O 401 735(申請人Kyowa Hakko Kogyo Co.)描述了以含有重組質(zhì)粒的棒狀桿菌或短桿細(xì)菌來生產(chǎn)L-色氨酸的方法。在這些質(zhì)粒中含有合成DAHP合成酶，鄰氨基苯甲酸合成酶，吲哚-3-甘油-P合成酶，色氨酸合成酶和磷酸甘油脫氫酶的遺傳信息。使用了抗反饋鄰氨基苯甲酸合成酶的等位基因。
進(jìn)而我們也知道可通過給生產(chǎn)菌株引入許多Ser A，或Ser A，B，C野型基因?qū)е律彼岽x失調(diào)來增加色氨酸的生產(chǎn)。因此化學(xué)文摘CA111(1989)16 86 88q和CA111(1989)16 86 89r描述了在質(zhì)粒上引入色氨酸代謝的Ser A野型等位基因和全部野型基因(Ser A，Ser B和Ser C)的桿菌菌株能過剩表達(dá)它們來生產(chǎn)色氨酸。
在EP-0 149 539(申請人Stauffer Chemical Company)中揭示了通過在細(xì)胞中防止絲氨酸降解來提高色氨酸產(chǎn)量的方法。在這個(gè)專利申請中使用了破壞絲氨酸降解酶(絲氨酸脫氨酶，Serine deaminase，sda)的大腸桿菌K12突變體，同時(shí)還描述了用這類菌株來生產(chǎn)氨基酸。例Ⅷ中描述一個(gè)這種類型的菌株，從鄰氨基苯甲酸中大量生產(chǎn)色氨酸的方法和歐洲專利申請所提到的一種具有完整絲氨酸脫氨酶的菌株生產(chǎn)色氨酸相比，用于色氨酸產(chǎn)量提高的解釋是氨基酸前體儲(chǔ)量非常高的微生物中絲氨酸或絲氨酸生物合成能力限速色氨酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是提供能增加色氨酸產(chǎn)量的微生物和提供使這種微生物制備成為可能的一些方法。
本發(fā)明的目的可以通過微生物菌株來實(shí)現(xiàn)。這些菌株的特征在于具有一個(gè)失調(diào)的色氨酸代謝和一個(gè)至少由一個(gè)抗反饋Ser A等位基因而失調(diào)的絲氨酸代謝。
為了完成本發(fā)明，抗反饋Ser A等位基因位點(diǎn)意味著抗反饋Ser A基因的突變體，它編碼著一個(gè)與絲氨酸敏感性相關(guān)的磷酸甘油脫氫酶，該酶的活性要低于這個(gè)菌株相應(yīng)的野型磷酸甘油脫氫酶活性。
至少一個(gè)抗反饋Ser A等位點(diǎn)基因位點(diǎn)與失調(diào)色氨酸代謝的微生物的按本發(fā)明結(jié)合會(huì)導(dǎo)致色氨酸產(chǎn)量的增加。令人驚奇的是和不具有抗反饋Ser A等位基因位點(diǎn)的相同微生物在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)量經(jīng)比較，前者較后者高出2.6倍。
根據(jù)本發(fā)明，用本發(fā)明的菌株使色氨酸產(chǎn)量的提高是未曾預(yù)料到且令人驚奇的，因?yàn)榭狗答丼er A等位基因表明了一個(gè)只有在一個(gè)高細(xì)胞內(nèi)絲氨酸水平上的效應(yīng)(Tosa T，Pizer L.J.，1971，Journal of Bacteriology Vol.106972-982;Winicov J.，Pizer L.，J.，1974，Journal of Biological Chemistry Vol.249∶1348-1355)。可是，按本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)(例如EP-A-O 149 539)，具有失調(diào)色氨酸代謝的菌株有一個(gè)很低的絲氨酸水平。這就是為什么按本發(fā)明通過給色氨酸代謝失調(diào)菌株引入一個(gè)抗反饋Ser A等位基因沒能得到期望的色氨酸生產(chǎn)的提高。
由于在所有已知微生物中色氨酸代謝都是通過圖1所示的代謝途徑進(jìn)行的，按本發(fā)明用于菌株的技術(shù)，大家其中上都明確并且可以用于所有的微生物，所以本發(fā)明菌株可以從任何希望的微生物中制得。
適合的和優(yōu)選的用于本發(fā)明生產(chǎn)色氨酸的菌株是細(xì)菌，特別是革蘭氏陰性菌，如大腸菌是更適合和更優(yōu)選的。
本發(fā)明的菌株可通過部分或完全對目的色氨酸原養(yǎng)型起始菌株的色氨酸代謝調(diào)控進(jìn)行廢除而引入一個(gè)抗反饋Ser A等位基因來獲得。
本發(fā)明的菌株還可同樣地通過對具有修復(fù)的色氨酸代謝失調(diào)的色氨酸營養(yǎng)缺陷型的起始菌株回復(fù)其合成色氨酸能力再引入抗反饋Ser A等位基因來獲得。
菌株的色氨酸代謝失調(diào)可通過許多不同的本領(lǐng)域已有技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
色氨酸代謝失調(diào)的一種可能性是修飾鄰氨基苯甲酸合成酶，該酶催化所有微生物中色氨酸特異性的生物合成途徑中的第一步。它的活性受色氨酸的抑制，因此它依賴著色氨酸的量通過色氨酸生物合成途徑來調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的流動(dòng)，該酶由trp E基因編碼。
編碼鄰氨基苯甲酸合成酶的突變trp E基因與色氨酸敏感性有關(guān)，該敏感性要低于相應(yīng)的野型鄰氨基苯甲酸合成酶的敏感性，因此也被稱為抗反饋trp E等位基因，它可以通過誘導(dǎo)突變和繼而選出一株原養(yǎng)型色氨酸起始菌株而得到。為達(dá)到這一點(diǎn)，相關(guān)菌株應(yīng)進(jìn)行處理，誘其突變(Miller J.H.，1972，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，USA∶113-185)。
被處理過的菌株培養(yǎng)在一個(gè)營養(yǎng)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基至少含有一種色氨酸拮抗物，其量應(yīng)足以抑制該菌株的生長。合適的色氨酸拮抗物如4-甲基-色氨酸，5-甲基色氨酸，6-甲基色氨酸，鹵化色氨酸，吲唑氨丙酸(tryptazan)，吲哚和吲哚丙烯酸。
抗性克隆株應(yīng)對它們的鄰氨基苯甲酸合成酶的色氨酸敏感性進(jìn)行測定。鄰氨基苯甲酸合成酶的色氨酸敏感性可采用任何以色氨酸存在下測定酶活性的方法進(jìn)行檢測確定。例如，分支酸(chorismate)可以在一個(gè)適當(dāng)?shù)木彌_液中與谷氨酰胺反應(yīng)，在這個(gè)酶促反應(yīng)中，谷氨酰胺與色氨酸共同作用(Bauerle R.et al.，1987，Methods in Enzymology Vol.142∶366-386)。從檢測混合物中以動(dòng)力學(xué)方式移出整分，用高效液相色譜法分析確定每個(gè)單位時(shí)間反應(yīng)后產(chǎn)物鄰氨基苯甲酸的量。每個(gè)單位時(shí)間獲得的產(chǎn)物鄰氨基苯甲酸的量是鄰氨基苯甲酸合成酶活性的直接測定。為了測定待測鄰氨基苯甲酸合成酶的敏感性，該方法應(yīng)在色氨酸存在和不存在兩種情況下進(jìn)行。
用直接基因操縱獲得對色氨酸不敏感的trp E等位基因的可能性是相等的(Bauerle R.et al.，1987，Methods in Enzymology Vol.142∶366-386)。各種微生物均已有描述鄰氨基苯甲酸合成酶氨基酸序列上許多變化都將導(dǎo)致該酶對色氨酸敏感性的降低(例如沙門氏菌Caliguiri MG.，Bauerle R.，1991，J.of Biol.Chem.Vol.266∶8328-8335;fur brevibacterium，corynebacteriumMatsui K.et al.，1987，J.Bact.Vol.169∶5330-5332)。
有一些已知方法已使得在DNA片段上一個(gè)特定點(diǎn)誘導(dǎo)突變已成為可能。這類方法在下列公開出版物中特別加以描述Sakar G.，Sommerauer S.S.，1990，Bio Techniques 8∶404-407中描述了依賴聚合酶鏈反應(yīng)的定向點(diǎn)突變。
Ausubel F.M.et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，描述了依賴M13噬菌體的方法。
Smith M.，1985，Ann.Rev.Genet，19∶423-462，描述了其它方法。
含有野型trp E基因的DNA片段用早期描述的標(biāo)準(zhǔn)方法重組到一個(gè)載體上獲得重組DNA。使用上述提及的點(diǎn)定向突變法將導(dǎo)致DNA序列上一個(gè)或多個(gè)核苷酸被修飾，結(jié)果由該基因編碼的氨基酸序列便與一個(gè)對色氨酸不敏感的鄰氨基苯甲酸合成酶的氨基酸序列相對應(yīng)。該描述的技術(shù)可以被用于將一個(gè)或多個(gè)突變體引入任何目的trp E基因，這將導(dǎo)致編碼的鄰氨基苯甲酸合成酶有一個(gè)產(chǎn)生對色氨酸不敏感性的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明菌株的下列特性是希望得到的但不是絕對需要的一個(gè)缺損的色氨酸阻遏物蛋白質(zhì)(repressor protein)，一個(gè)缺損的trp操縱子表達(dá)的衰減控制和一個(gè)缺損的色氨酸酶，本發(fā)明菌株的這些特征可以最簡單地通過選擇一個(gè)已經(jīng)具有一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)特征的起始菌株而獲得。這種制備和選擇可通過下述提及的選擇方法組合后進(jìn)行。
色氨酸阻遏物蛋白質(zhì)(repressor protein)是色氨酸生物合成中的一個(gè)主要調(diào)節(jié)蛋白。這個(gè)蛋白質(zhì)和色氨酸一起作為阻遏物蛋白(aporepressor)阻遏trp操縱子基因的表達(dá)，該蛋白由trp R基因編碼?？蓮膶ι彼徂卓刮?如5-甲基色氨酸)有抗性的突變體中篩選出色氨酸阻遏物突變體。在J.Mol.Biol.44，1969，185-193或Genetics52，1965，1303-1316文獻(xiàn)中已有例子。
除了有由trp R編碼蛋白的控制外，trp操縱子還參與了衰減調(diào)控。在trp操縱子第一個(gè)基因前的DNA區(qū)段負(fù)責(zé)調(diào)控。該區(qū)段的突變體或缺失體可能導(dǎo)致調(diào)控失調(diào)。這類突變體可從對色氨酸拮抗物(如5-甲基色氨酸)有抗性的突變體中篩選出來。另一方面，這類突變體，特別是缺失體，可用點(diǎn)定向突變的方法在DNA的衰減區(qū)域內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)特異性誘導(dǎo)這種修飾而獲得。通過已敘述的點(diǎn)特異性突變技術(shù)很可能會(huì)把滅活的衰減子區(qū)重組到本發(fā)明菌株的染色體中以替換天然衰減子區(qū)域。
色氨酸酶(tnaA)催化色氨酸降解成吲哚，丙酮酸(pyruvate)和氨。理想的是這種酶在色氨酸生產(chǎn)菌株中是無活性的。缺失這種酶的菌株可以通過對菌株進(jìn)行突變處理，尋找到那些不再能利用色氨酸作為碳氮源的突變體而獲得。在文獻(xiàn)J.Bact.85，1965，680-685中給了一個(gè)詳細(xì)的例子，或同等可通用上述技術(shù)將導(dǎo)致滅活的點(diǎn)特異性突變體引入tnaA基因。
許多起始菌株的其它突變體很適宜導(dǎo)致色氨酸生產(chǎn)的進(jìn)一步提高。因此，不僅色氨酸生物合成途徑。而且一般的芳香族氨基酸生物合成途莽草酸途徑，(shikimic acid pathway)最好也是調(diào)控不敏感的。按照本發(fā)明，這就是為什么具有調(diào)控不敏感性的脫氫阿拉伯庚酮糖酸合成酶(dehydroarabinoheptulosonate synthase)和一個(gè)突變體或缺失體就能滅活酪氨酸抑制蛋白(tyrR)的菌株最好能作為起始菌株用于制備本發(fā)明的菌株。同樣對于苯丙氨酸和酪氨酸代謝被削弱的菌株也是最好的。這保證了前體分子分枝酸的流動(dòng)全部向色氨酸方向。這種類型的菌株在pheA或/和tyrA基因上突變成缺失。
許多菌株已知在色氨酸生物合成的一步或多步或莽草酸途徑失調(diào)從而大量生產(chǎn)色氨酸。例如，枯草桿菌Fermm BP-4，F(xiàn)erm P1483(DE3123001)，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC21427(US 3，849，251)，谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium glutamicum)ATCC 21842-21851(US3，594，279，US 3，849，251)，黃體微球菌(Micrococcu luteus)ATCC 21102(US 3，385，762)，大腸桿菌ATCC 31743(CA1182409)，這些菌株同樣地適合作為起始菌株制備本發(fā)明的生產(chǎn)菌株。依本發(fā)明它們都表明色氨酸生產(chǎn)菌株可以從很寬范圍的微生物群中得到。
除了要求菌株具有失調(diào)的色氨酸代謝以外，還要求用于制備本發(fā)明菌株的菌株至少有一個(gè)編碼磷酸甘油脫氫酶的基因，并且該酶的絲氨酸敏感性要低于對應(yīng)的野型菌株的磷酸甘油脫氫酶的活性。
磷酸甘油脫氫酶(PGD)由SerA基因編碼。已知野型SerA基因的序列(Tobey K.L.，Grant G.A.，1986，J.Bac.Vol，261，No.26∶1279-1283)。用一個(gè)質(zhì)粒載體大量表達(dá)該野型SerA基因產(chǎn)品也同樣為人所知(Schuller et al.，1989，J.Biol.Chem.Vol.264∶2645-2648)。
用經(jīng)典的遺傳方法制備抗反饋SerA等位基因已由Tosa T，Pizer L，T.，1971，J.Bac.Vol.106，No.3∶972-982描述。在該例中，可通過突變體對絲氨酸類以物絲氨酸hydroxamate的抗性來進(jìn)行篩選。這些突變體在該文獻(xiàn)中沒有加以詳細(xì)鑒定，突變對代謝的影響也未進(jìn)行研究。
抗反饋SerA等位基因也可通過對微生物進(jìn)行突變誘導(dǎo)來獲得。適合的誘變劑為紫外線(UV)和一些化子誘變劑，如甲基磺酸乙酯或N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(ethyl methanasulphonate or N-methyl -N′-nitro-N-nitrosoguanidine)。劑量和作用時(shí)間通過常規(guī)方法對選用的誘變劑進(jìn)行測定(Miller J.H.，1972，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory USA113-143)。
誘變劑處理的微生群然后對帶有編碼絲氨酸不敏感性磷酸甘油脫氫酶的Ser A基因的克隆株進(jìn)行篩選。例如，一個(gè)用誘變劑處理的群接種到含有足以抑制非抗性細(xì)菌生長量的絲氨酸hydroxamate固體生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)?？剐钥寺≈暝賹ζ溥M(jìn)行磷酸甘油脫氫酶的絲氨酸敏感性測定。該法由Tosa和Pfizer，1971，J.Bact，100，3∶972-982提供的例子中已作了描述。
編碼對絲氨酸不敏感的磷酸甘油脫氫酶的等位基因同樣可以由遺傳工程技術(shù)獲得。
介導(dǎo)絲氨酸調(diào)控的PGD區(qū)段位于該蛋白的C-末端區(qū)。這就是為什么在PGD蛋白C-末端25%區(qū)段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸更多地選擇插入，替換或缺失的原因。這個(gè)區(qū)段中優(yōu)選C-末端前50個(gè)氨基酸。這些作用導(dǎo)致PGD對絲氨酸的敏感性降低。
對于編碼這類PGDs的等位基因可通過修飾Ser A基因3′區(qū)，即編碼所述的PGD C-末端區(qū)來實(shí)現(xiàn)。為了做到這一點(diǎn)，未突變的Ser A基因由一個(gè)熟知本領(lǐng)域重組DNA技術(shù)的技術(shù)人員重組到一個(gè)克隆載體上。這種重組DNA過程包括限制性酶切，連接和轉(zhuǎn)化(Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.and Sambrook，J.，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual 1982，Cold Spring Harbor Laboratory)。在結(jié)構(gòu)基因3′端的特殊修飾可通過例如點(diǎn)定向突變技術(shù)而獲得。
適合在失調(diào)色氨酸代謝的微生物中表達(dá)對絲氨酸不敏感的PGDs的例子列在表1中，該表顯示了它們的C-末端氨基酸序列。除了顯示部分外，該酶蛋白序列與野型序列沒有區(qū)別。
下面的測定方法被用于檢測Ser A等位基因的產(chǎn)品以表明PGD活性和絲氨酸敏感性PGD活性是按McKitrick，J.C.和Lewis J.P.，1980，J.Bact.141∶235-245中介紹的方法檢測該酶的正反應(yīng)和逆反應(yīng)進(jìn)行測定的。在該例中酶活性不僅在沒有絲氨酸條件下測定，也在不同濃度的絲氨酸條件下進(jìn)行測定。所說的測定方法適合確定任何磷酸甘油脫氫酶的絲氨酸敏感性，這可同樣能使用其它方法測定PGD活性。
用于該酶絲氨酸敏感性的測定是Ki值，也就是說，抑制該酶50%活性時(shí)絲氨酸的濃度。許多抗反饋Ser A等位基因和野型Ser A基因(Ser A WT)的Ki值和C-末端氨基酸序列在表1中。
令人吃驚的是按本發(fā)明合適和優(yōu)選地制備生產(chǎn)菌株Ser A等位基因的Ki值在100μM和50mM絲氨酸濃度。
為在本發(fā)明菌株中表達(dá)PGD蛋白很可能使用任何重組載體，從而導(dǎo)致絲氨酸不敏感Ser A等位基因的表達(dá)。一個(gè)適合制備本發(fā)明菌株的重組載體至少要有一個(gè)具有編碼絲氨酸敏感性的并要比原野型敏感性低的PGD的Ser A基因和能在受體菌株中自動(dòng)復(fù)制的載體部分。
能夠在大腸桿菌中自動(dòng)復(fù)制的載體例子列在Pouwels P.H.，Enger-Valk B.E.，Brammar W.J.1985，Cloning Vectors，Elsevier.Amsterdam。這類載體包括
含有高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，如pBR322;pUC12，含有中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒，如pACYC 184，177，含有低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，如pSC 101，噬菌體載體，如M13，λ載體。
對大量細(xì)菌來說，都描述可比較的載體(例如EP 0401735的捧狀桿菌和短桿菌或CA 111(1989)168688q)。
合適和優(yōu)選的載體為具有中等到低拷貝數(shù)的載體;帶有p15A復(fù)制子的載體，如pAYC184(ATCC 37033)或pACYC 177(ATCC37031)為最為優(yōu)選。
對于其它細(xì)菌的大量載體在文獻(xiàn)中已作了描述(Pouwels et al.，1985，Cloning Vectors，Elsevier Science Publishers，Amsterdam)。
合適的重組載體可通過制備重組DNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中被詳細(xì)描述如，Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.and Sambrook J.，1982，Molerular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，USA or Ausubel F.M..et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，USA。
重組載體的制備是可能的，如，可先用限制性核酸內(nèi)切酶將受體菌DNA消化成片段，該受體菌在染色體或在重組載體上有一個(gè)編碼對絲氨酸不敏感PGD的Ser A等位基因。這些切斷的片段用常規(guī)方法，即用T4 DNA連接酶連接到用上述同樣限制酶消化的載體分子上。連接反應(yīng)后，混合物用已知方法，如氯化鈣休克或電穿孔(Calcium chlorideShock or electroporation)，轉(zhuǎn)化色氨酸代謝失調(diào)的受體菌。含有所需要的Ser A基因的載體可在受體菌中，如，可通過上述方法如抗生素抗性選擇或Ser A突變的互補(bǔ)而獲得。
獲得本發(fā)明菌株的另一個(gè)實(shí)施方案是將Ser A等位基因作為單拷貝整合到染色體中，這一方面可通過上述直接描述的用色氨酸失調(diào)的起始菌株進(jìn)行突變誘導(dǎo)和篩選策略得到，另一方面，也可能將現(xiàn)在已重組在載體上的Ser A等位基因整合到生產(chǎn)菌株的染色體上，這種類型的整合方法已為大家所熟知。下列出版的文獻(xiàn)中可找到這些技術(shù)的描寫λ噬菌體介導(dǎo)的整合Balakrishnan and Backmann，1988，Gene 67∶97-103;Simons R.W.et al.，1987，Gene 53∶85-89;
ren D-依賴的基因替換Shervell et al.，1987，J.Bact.141∶235-245;
其它方法Silhavy et al.，1988，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory。
本發(fā)明菌株的發(fā)酵揭示了含有抗反饋Ser A等位基因且其Ki值在100μM和50mM絲氨酸濃度范圍，并且色氨酸代謝失調(diào)，含有trp E等位基因且其Ki值在0.1mM和20mM色氨酸濃度范圍的菌株，提供最高的色氨酸產(chǎn)量這一結(jié)果是令人驚奇的。
下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。附圖中圖1為色氨酸代謝途徑以及與絲氨酸代謝的聯(lián)系和編碼主要酶的基因。
圖2顯示△trp L1突變體(第二類)的位置和突變體trpE0，trpE5，trpE6和trpE8(第一類)的位置。
圖3為野型serA的核酸序列。
圖4為重組載體pGC3。
圖5為重組后的質(zhì)粒pGH5。
圖6為質(zhì)粒pKB1321。
圖7為質(zhì)粒pKB1508。
圖8為質(zhì)粒pGH11。
圖9為質(zhì)粒pGH5/Ⅱ。
圖10為質(zhì)粒pGH11/Ⅱ。
圖11為質(zhì)粒pKB1508/Ⅱ。
圖12為質(zhì)粒pGH5/Ⅲ。
圖13為質(zhì)粒pGC3/Ⅰ。
實(shí)施例1篩選抗反饋trp E等位基因并整合這些基因至染色體中。
色氨酸的類同物5-甲基色氨酸被用于尋找抗反饋trp E等位基因。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基-胍(NG，N-Methyl-N′-nitro-N-nitroso-guanidine)被用作誘變劑。使用的起始菌株為大腸桿菌K12 YMC9 ATCC 33927。誘導(dǎo)突變的方法基于Miller的資料(Miller J.H.，1972，Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.∶125-129)。
培養(yǎng)在LB中處于對數(shù)生長期的約2×109個(gè)YMC9細(xì)胞與50μg/ml NG在4ml 0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)中37℃培養(yǎng)30分鐘。在進(jìn)一步用0.1M(pH7.0)磷酸鹽緩沖液洗2次后，0.1ml細(xì)胞在LB中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。接著，用0.9% NaCl將0.1ml細(xì)胞制成多種濃度(10-3，10-4和10-5)加到含有100μg/ml5-甲基色氨酸的最低營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上。除5-甲基色氨酸外，最低營養(yǎng)基還含有5g/L葡萄糖，5mg/L維生素B1，3g/L KH2PO4，12g/LK2HPO4，0.3g/L MgSO4×7H2O，0.1g/LNaCl，5g/L(NH4)2SO4，14.7mg/L CaCl2×2H2O，2mg/L FeSO4×7H2O，1g/L檸檬酸三鈉和15g/L瓊脂。在37℃24-48小時(shí)后，挑出5-甲基色氨酸抗性克隆，按上述方法重新接種到平板上。
對上述獲得的突變體菌株進(jìn)一步確定trp E基因產(chǎn)品對色氨酸的Ki值(Bauerle R.et al.，1987，Methods in Enzymology Vol.142∶366-386)。用這種方式將突變體分成兩類是可能的，第一類突變體有抗反饋鄰氨基苯甲酸合成酶，第二類突變體只有一些酶并使鄰氨基苯甲酸合成酶活性提高而Ki值不變等特征。
為了在分子水平進(jìn)行確定，各類突變體相關(guān)DNA區(qū)被克隆和測序，為此，染色體DNA在每一種情況下要進(jìn)行分離并用NheI和ClaI兩種酶雙切。分離出約5kb大小的片段連接到Nhe I/ClaI pBR322大小為4158 bp質(zhì)粒片段上。連接反應(yīng)后的混合物被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌KB 862(DSM7196)trp E菌株上。篩選出能夠在無色氨酸的最低營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長的克隆。這種互補(bǔ)質(zhì)粒含有一個(gè)5kb大小的NheI和ClaI片段。除有trp E和trp D外，這個(gè)5kb Nhe I/Cla I片段也含有來自trp E上游的DNA區(qū)(約0.8kb)和來自trp D下游的DNA區(qū)(約1kb)。表2顯示4個(gè)第一類突變體的氨基酸序列差異和Ki值。突變體的序列與野型序列上未注明的其它序列相同。
第二類突變體序列分析表明突變既存在于trp啟動(dòng)子的操縱子區(qū)，又存在于編碼trp前導(dǎo)肽的DNA區(qū)。被稱為△trpL1和△trpL2的突變體在編碼前導(dǎo)肽的DNA區(qū)分別有136 bp和110bp缺失區(qū)。在EMBL數(shù)據(jù)庫編號為AC V00372號下，在△trpL1突變體的缺失從核苷酸第33位至168位，在△trpL2突變體的缺失從第11位至120位。
為了獲得抗反饋trp E等位基因更強(qiáng)的表達(dá)，對兩類突變體進(jìn)行了聯(lián)合。第二類突變體△trpL1被用于此目的。圖2示△trpL1突變體(第二類)的位置和突變體trpE0，trpE5，trpE6和trpE8(第一類)的位置。
含有△trpL1突變體的1.6kb NruI片段從質(zhì)粒p△trpL(圖2)中分離出來，和對應(yīng)的野型質(zhì)粒pE0，pE5，pE6和pE8(圖2)的NruI片段交換，所獲得質(zhì)粒被分別稱為pIE0，pIE5，pIE6和pIE8，并用同源重組方式用于染色體整合。為此，從每一個(gè)所說質(zhì)粒中大小約為5kb的染色體NheI/ClaI片段按實(shí)施例2所述的從低融點(diǎn)瓊脂糖中分離出來，并以線性形式轉(zhuǎn)化到rec D PD106菌株[△trp LD102]中。使用的轉(zhuǎn)化方法是Cohen等的氯化鈣法(Cohen et al.，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69∶2110-2114)。菌株P(guān)D106于1993年9月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM93047，且已按布達(dá)佩斯條約，被保藏在德國微生物保藏中心(DSM)保藏號為DSM 7195，能夠在無色氨酸的最低營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長并對氨芐青霉素敏感，即無質(zhì)粒的菌株被篩選出來。編碼各種抗反饋trp E酶，并每一個(gè)都結(jié)合有△trpL1突變體的trp E等位基因由P1轉(zhuǎn)導(dǎo)從相關(guān)菌株被轉(zhuǎn)移到KB 862(Miller J.H.，1972，Experiments in Molecular Gentics.Cold Spring Harbor，N.Y.∶201-205)。菌株KB 862已于1993年9月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M93048，并按布達(dá)佩斯條約于1992年7月28日保藏于德國微生物保藏中心(DSM)，保藏號為DSM7196，篩選出在無色氨酸最低營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長的菌株。這些菌株被稱為PD103(trp EO)，KB862(trp E5)，SV164(trp E8)和SV 163(trp E6)。
實(shí)施例2制備編碼對絲氨酸不敏感的磷酸甘油脫氫酶的Ser A基因。
Ser A野型基因從大腸桿菌B株(ATCC23226)克隆到質(zhì)粒載體pUC 18上。
為了獲得該菌株的染色體DNA，先將其在37℃下Luria肉湯中培養(yǎng)過夜。然后離心(4000g)收集細(xì)菌體細(xì)胞，用Ausubel等(Ausubel et al.，1987，2.4.1-2.4.2，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associales)提供的方法裂解該細(xì)胞并純化DNA。用分光光度計(jì)在260nm波長處測定獲得的DNA量。產(chǎn)量約為600μg/100ml。
10μg染色體DNA用SphI限制性酶(Boehringer Mannheim GmbH)按制造商提供條件的進(jìn)行切割。大約3μg片段混合物連接到用上述同一酶SphI切割后的0.2μg能自動(dòng)復(fù)制的質(zhì)粒載體pUC18上(由Boehringer Mannheim GmbH提供)，使用的酶為T4連接酶(由Boehringer Mannheim GmbH提供)，反應(yīng)條件按制造商說明書。將連接后的混合物用于轉(zhuǎn)化Ser A突變體PC 1523(CGSC?！?411;)上(CGSC∶E.coli Genelic Slock Cenler，Deparlment of Biology 255 OML，Yale Universlty，Postbox 6666，New Haven，CT，USA)。使用的轉(zhuǎn)化方法是Cohen等的氯化鈣法(Cohen et al.，1972，Proc.Natl，Acad.Sci.USA69∶2110-2114)。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布在無絲氨酸的最低營養(yǎng)培養(yǎng)基平皿上。在無絲氨酸情況下能生長的克隆含有在SphI片段(約3.5kb大小)來自大腸桿菌的Ser A基因。野型Ser A基因的核酸序列列于圖3中，帶有Ser A基因的重組載體被稱為pGC3(圖4)。
Ser A等位基因Ser A5可通過用限制性內(nèi)切酶Sal I和Kpn I(由BoehringerMannheim GmbH提供)按制造商的資料切割質(zhì)粒pGC3即可獲得。獲得的片段用瓊脂糖電泳進(jìn)行分離，大小為2.0kb，含有完整Ser A基因并遠(yuǎn)離C-末端8個(gè)密碼子的Sal I-KpnI片段從膠中純化出來。為了做到這一點(diǎn)，在低融點(diǎn)瓊脂糖(由Boehringer Mannheim GmbH提供)進(jìn)行電泳以便僅通過融化瓊脂糖就可以收集出DNA。以此片段0.2μg與等摩爾量的HindⅢ/Sal Ⅰ切割的pUC18片段加上一段人工合成的雙股寡核苷酸在T4連接酶(由Boehringer Mannheim GmbH提供)的作用下進(jìn)行連接。這段寡核苷酸的序列為5' 3'C ATT CGC GCC CGT CTG CTG TAA TACTAGG TAA GCG CGG GCA GAC GAC ATT ATT CGA3' 5'這段寡核苷酸是Ser A基因C-末端最后8個(gè)密碼子中的7個(gè)，引入終止的三聯(lián)體TAA以代替第8個(gè)密碼子。由這個(gè)Ser A基因編碼的磷酸甘油脫氫酶因此由一個(gè)C-末端氨基酸截短了頂端，這個(gè)改變了的PGD氨基酸序列列在表1中(Ser A 5)。重組后的質(zhì)粒被稱為pGH5(圖5)，用連接混合物轉(zhuǎn)化Ser A突變體PC 1523。
Ser A等位基因Ser A 1508按下述方法制備，按制造商資料，質(zhì)粒pGC3用SphI/SalI(由Boehringer Mannheim GmbH提供)酶切，含有完整Ser A基因的3kb片段由凝膠電泳純化并連接到用SphI/SalI酶切的pUC18載體上，獲得的質(zhì)粒稱為pK1321(圖6)。
pKB1321用限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅱ(由Boehringer Mannheim GmbH提供)作用，反應(yīng)條件只允許部分酶切(每μg DNA中加入0.05U酶，消化10分鐘，其它反應(yīng)條件按說明書)。這個(gè)步驟尤其是產(chǎn)生在Ser A基因第1793位中由HindⅡ切開的片段。具有XbaⅠ切點(diǎn)的DNA接頭由連接反應(yīng)插入到這個(gè)位點(diǎn)上。DNA接點(diǎn)的序列如下5' 3'TGC TCT AGA GCAACG AGA TCT CGT3' 5'這種插入將導(dǎo)致PGD在這一點(diǎn)上帶有4個(gè)額外的氨基酸，它的序列列在表1。帶有插入段的質(zhì)粒稱為pKB 1508(圖7)，然后再轉(zhuǎn)化到Ser A突變體PC 1523中。
Ser A等位基因Ser A11是用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ酶(由Boehringer mannbeim GmbH提供)按制造商提供的反應(yīng)條件通過酶切pGH5質(zhì)粒得到的，并在低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后從消化混合物中純化出2.8kb大小的片段。這個(gè)片段含有來自pUC18的載體部分和來自Ser A 5的C-末端區(qū)。質(zhì)粒pKB1508也同樣用Sal Ⅰ/Kpn Ⅰ酶切，將大小為2.0kb的DNA片段從低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離出來。該片段含有帶插入突變體的Ser A等位基因Ser A 1508，但沒有C-末端的8個(gè)密碼子。將上述2個(gè)片段連接到一起，用于轉(zhuǎn)化Ser A突變體PC1523，獲得的重組質(zhì)粒被稱為pGH11(圖8)。這個(gè)編碼的磷酸甘油脫氫酶將SerA 1508的插入突變體Ser A5缺失突變體結(jié)合起來。在編碼的氨基酸序列中帶有突變體的區(qū)域展示在表1。
為了在生產(chǎn)菌株表達(dá)突變的Ser A等位基因，它們被克隆到載體pACYC 184(ATCC37033)上，這個(gè)載體為中等拷貝數(shù)。為做到這些，用Sal Ⅰ/Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒pGH5和質(zhì)粒pGH11，從低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離出每個(gè)質(zhì)粒消化后大小約為2kb并含有Ser A等位基因Ser A5和Ser A 11的DNA片段。這兩種片段在不同的反應(yīng)液中用來自大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(由Boehringer Mannheim GmbH提供)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行處理，其目的是將限制性內(nèi)切酶消化切割的凸出的5′端變成鈍端。為此，每個(gè)片段各1μg中加入含有5U Klenow酶，0.5mM dATP，dGTP，dTTP和dCTP的20μl反應(yīng)混合液，按制造商建議的緩沖液37℃反應(yīng)15分鐘。
每個(gè)鈍端的DNA片段再連接到用PvuⅡ酶切過的pACYC 184載體上，這個(gè)連接混合物被用于轉(zhuǎn)化Ser A突變體PC1523，這種增補(bǔ)后的質(zhì)粒分別被稱為pGH5/Ⅱ和pGH11/Ⅱ(圖9和圖10)。質(zhì)粒pKB1508用Sal Ⅰ/SphⅠ酶切。將含有Ser A等位基因Ser A 1508 3.0kb片段用凝膠電泳純化。這個(gè)片段按上述制備成鈍端，然后和PvuⅡ酶切的pACYC 184連接，連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌PC1523，這個(gè)被增補(bǔ)后的質(zhì)粒稱為pKB1508/Ⅱ(圖11)。
質(zhì)粒pGH5/Ⅱ(Ser A 5)，pGH11(SerA11)和pKB 1508 Ⅱ用于轉(zhuǎn)化PD103(trp E0)，KB862(trp E5)，SV 164(trp E8)和SV163(trp E6)。
實(shí)施例3用重組λ原噬菌體構(gòu)建一個(gè)染色體編碼的抗反饋的Ser A 5等位基因。
為了將Ser A 5等位基因整合到染色體λ吸附位點(diǎn)(att λ)，將該等位基因克隆到質(zhì)粒pRS551(Simons et al.，1987，Gene 53∶85-96)。為此，將含有Ser A 5的Hind Ⅲ/Sal Ⅰ片段(約2kb)從質(zhì)粒pGH5中分離出來。5′凸出端按產(chǎn)品說明書用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填滿，在將EcoR Ⅰ接頭連接后(Maniatis et al.，1982，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.∶396-397)，這個(gè)2kb片段連接到EcoRI酶切過的載體pRS551上。重組質(zhì)粒被篩選出來并稱為pRS5。
用λRS45噬菌體裂解在平皿上的含有pRS5 rec A+菌株(如YMC 9 ATCC 33927)，再用同源重組(Simons et al.，1987，Gene53∶85-96)將一個(gè)除λRS45噬菌體以外也含有重組Ser A5的λRS45衍生物的異源λ裂解物在體內(nèi)產(chǎn)生。
SerA PC1523菌株(CGSC＃5421)被用于篩選重組λRS45衍生物。為此，用異源λ裂解物(見上)感染PC1523，然后鋪于含有卡那霉素(25mg/L)的LB平板上。形成的溶源性的卡那霉素抗性克隆被檢查它們在無絲氨酸的最低營養(yǎng)平皿上的生長能力。篩選出絲氨酸-原養(yǎng)型的克隆并用于制備一株同源SerA5λ裂解物(采用紫外線誘導(dǎo)方法，Simons et al.，1987 Gene 53∶85-96)。
這種同源Ser A5λ裂解物用來感染色氨酸生產(chǎn)菌株SV164。獲得的SV164 attλSerA5菌株按實(shí)施例4所述進(jìn)行發(fā)酵，這種特殊培養(yǎng)基在這種情況下用25mg/L卡那霉素替代四環(huán)素作為篩選劑。
色氨酸的產(chǎn)量約為12.5g/L，和沒有SerA5的相同菌株產(chǎn)生3.5g/L相比高出許多。
實(shí)施例4
用棒狀桿菌進(jìn)行色氨酸生產(chǎn)質(zhì)粒pGH5用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和HindⅢ(由Boehringer Mannheim GmbH提供)酶切，大小為2kb含有SerA5基因的DNA片段從低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離出來。再用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(由Boehringer Mannheim GmbH提供)，將該片段制備成鈍端。用SmaI(由Boehringer Mannheim GmbH提供)酶切載體pWST1并連接到鈍端DNA片段。pWST1載體是能夠在大腸桿菌和棒狀桿菌中復(fù)制并能在這兩菌之間穿梭的載體，這個(gè)載體的棒狀桿菌復(fù)制子來自谷氨酸棒狀桿菌ATCC19223菌株。pWST1載體的制備在US-A4，965，197中已作了描述。該連接反應(yīng)后的混合物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌PC1523菌株。增補(bǔ)后的質(zhì)粒稱為pGH5/Ⅲ(圖12)。
pGH5/Ⅲ質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)色氨酸谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21851，轉(zhuǎn)化采用電穿孔技術(shù)進(jìn)行，該技術(shù)已由Wolf H.et al.，1989，App1.Microbiol.Biotechnol.30∶283-289描述。含有重組質(zhì)粒pGH5/Ⅲ的克隆可通過質(zhì)粒編碼的卡那霉素抗性在含有25mg/L卡那霉素瓊脂板上篩選出來。
用限制性內(nèi)切酶SphI和SalI酶切質(zhì)粒pGC3。含有野型Ser A等位基因的3kb DNA片段純化后，以上述的方法連接到pWST1載體上。獲得的載體pGC3/Ⅰ(圖13)用于轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21851。
在一個(gè)質(zhì)粒上含有Ser A等位基因1455的谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21581菌株按類同的方法制備。
發(fā)酵揭示在一個(gè)質(zhì)粒上含有Ser A5等位基因的菌株可獲得最高色氨酸產(chǎn)量。
實(shí)施例5各種質(zhì)粒編碼的Ser A等位基因?qū)Ω鞣Ntrp E菌株色氨酸生產(chǎn)的影響。
在10ml LB培養(yǎng)基(1%胰胨，0.5%酵母浸液，0.5% NaCl)中加入四環(huán)素使成15mg/l，再轉(zhuǎn)入100ml錐形瓶中，按表3列的各種色氨酸生產(chǎn)菌株按種入內(nèi)。30℃以150rpm旋轉(zhuǎn)振蕩8-9小時(shí)后，這種預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100ml SM1培養(yǎng)基。SM1培養(yǎng)基是由5g/L葡萄糖，3g/LKH2PO4，12g/L K2HPO4，0.1g/L(NH4)2SO4，0.3g/L MgSO4×7H2O，15mg/L CaCl2×2H2O，2mg/L FeSO4×7H2O，1g/L檸檬酸三鈉×2H2O，1ml/L微量元素溶液(參見下)，40mg/L L-苯丙氨酸，40mg/L L-酪氨酸，5mg/L維生素B1和15mg/L四環(huán)素組成。微量元素溶液組成如下0.15g/L Na2MoO4×2H2O，2.5g/L H3BO3，0.7g/L CoCl2×6H2O，0.25g/L CuSO4×5H2O，1.6g/L MnCl2×4H2O和0.3g/L ZnSO4×4H2O。培養(yǎng)物在1升的錐形瓶中以150rpm旋轉(zhuǎn)震蕩30℃下12-16小時(shí)，之后測定其OD600值為2-4，進(jìn)一步發(fā)酵是在由Braun-Melsungen提供的BIOSTATRM研究用發(fā)酵罐中進(jìn)行的。培養(yǎng)物的總體積為2升。
該培養(yǎng)基含有17.5g/L葡萄糖，5g/L(NH4)SO4，0.5g/L NaCl，0.3g/L MgSO4×7H2O，15mg/L CaCl2×2H2O，75mg/L FeSo4×7H2O，1g/L檸檬酸三鈉×2H2O，1.5g/L KH2PO4，1ml/L微量元素溶液(參見上)，5mg/L維生素B1(硫胺素)，0.75g/L-苯丙氨酸，0.75g/L L-酪氨酸，2.5g/L酵母抽提物(Difco)，2.5g/L胰胨(Difco)和20mg/L四環(huán)素。
發(fā)酵罐中的葡萄糖用泵從700g/L(W/V)葡萄糖溶液(已高壓滅菌)中泵入，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達(dá)到17.5g/L，在培養(yǎng)前，發(fā)酵中加入四環(huán)素使其終濃度為20mg/L。此外，用泵從25%NH4OH溶液泵入罐內(nèi)使pH保持在6.7。
100ml預(yù)培養(yǎng)物泵入發(fā)酵容器中培養(yǎng)，起初體積約為1升，培養(yǎng)物開始以400rpm攪拌，用滅菌濾器壓入滅菌空氣(流速為1.5vvm)，30℃進(jìn)行發(fā)酵。
用25% NH4OH由自動(dòng)校正儀保持pH值在6.7，在發(fā)酵液中氧飽和度在發(fā)酵期間的任何時(shí)候都不應(yīng)低于20%，在發(fā)酵時(shí)氧飽和度的控制由攪拌速度而定。
隔2-3小時(shí)，營養(yǎng)液的葡萄糖含量，光密度值和色氨酸產(chǎn)量都應(yīng)不斷測量。葡萄糖含量是用由YSI提供的葡萄糖分析儀酶法測定。通過連續(xù)灌流裝置將葡萄糖濃度保持在5-20g/L之間。
發(fā)酵后培養(yǎng)基中的色氨酸含量用高效液相色譜(HPLC)測定。該培養(yǎng)物在一個(gè)Nucleosil 100-7/C8柱層析分離(250/4mm，Macherey-Nagel)，該柱以2ml/分的流速恒溶劑操作進(jìn)行，使用的流動(dòng)相為水/乙睛(83/17)，每升中再加入0.1ml H3PO4(85%)。檢測或用-二極管陣列檢測器，或用一個(gè)215或275nm固定的紫外光波長檢測。在44-50小時(shí)時(shí)發(fā)酵停止。48小時(shí)后在這一個(gè)發(fā)酵中產(chǎn)生的色氨酸是以g/L計(jì)算列于表3中。
權(quán)利要求
1.微生物菌株，其特征在于該菌株具有失調(diào)的色氨酸代謝，以及由一個(gè)反饋抗性Ser A等位基因而失調(diào)的絲氨酸代謝。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物菌株，其特征在于trp E等位基因的色氨酸Ki值在0.1mM和20mM之間。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其特征在于Ser A等位基因的絲氨酸Ki值在0.1mM和50mM之間。
4.如權(quán)利要求1至3的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的微生物菌株，其特征在于所述的Ser A等位基因是整合到染色體中的。
5.如權(quán)利要求1至4的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的微生物菌株，其特征在于該微生物為細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的生物菌株，其特征在于所述的細(xì)菌為大腸埃希氏菌種。
7.如權(quán)利要求5所述的微生物菌株，其特征在于所述的細(xì)菌為棒狀桿菌屬。
8.制備如權(quán)利要求1所述的菌株的方法，其特征在于一個(gè)反饋抗性Ser A等位基因被引入具有失調(diào)的色氨酸代謝的微生物菌株中。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的Ser A等位基因被引入具有失調(diào)的色氨酸代謝的微生物染色體中。
10.反饋抗性Ser A等位基因通過發(fā)酵在生產(chǎn)色氨酸中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求1至7中的一種或多種的菌株在生產(chǎn)色氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)色氨酸的微生物及其制備方法。該微生物具有失調(diào)的色氨酸代謝，絲氨酸代謝經(jīng)反饋抗性Ser A等位基因也失調(diào)。發(fā)酵本發(fā)明的菌株其結(jié)果表明含有反饋抗性Ser A等位基因，其絲氨酸Ki值在100μm和50mM之間，以及失調(diào)的色氨酸代謝，含有trp E等位基因，其色氨酸Ki值在0.1mM和20mM之間的菌株，提供最高的色氨酸產(chǎn)量。
文檔編號C12P13/22GK1085950SQ9311758
公開日1994年4月27日 申請日期1993年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月28日
發(fā)明者岡特·維歇, 沃爾弗來德·萊因菲爾德, 基思·巴克曼 申請人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)