專利名稱：地龍-碎栓酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及地龍-碎栓酶的制備方法。
地龍-碎栓酶是一種從蚯蚓組織中分離純化的蛋白酶，它具有較高的纖維蛋白(元)降解作用和溶栓等藥理作用，是當(dāng)今最新的治療栓塞癥的藥物。在目前治療栓塞癥臨床常用的藥物主要有SK(鏈激酶)、UK(尿激酶)、TPA(組織纖溶激酶)和蛇毒抗栓酶等，但以上藥物都存在藥源少，制備工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。目前雖然有生產(chǎn)地龍-碎栓酶的技術(shù)(發(fā)明人牛勃等)，但現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)提取的地龍-碎栓酶，存在毒性不穩(wěn)定，提取蛋白酶種類少(僅一種)，且工藝復(fù)雜、成本高等不足，限制了生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)展和臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種藥源廣泛、制備工藝簡(jiǎn)單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、可獲得七種蛋白酶，且經(jīng)濟(jì)的制備地龍-碎栓酶的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的以新鮮蚯蚓為原料，經(jīng)前處理除毒、細(xì)胞破碎、硫酸銨分段鹽析、CM和DEAE纖維素柱析以及sephacryl-S200或TSK分子篩過濾方法生產(chǎn)出層析純或電泳純地龍-碎栓酶。
下面結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)介紹附圖是本發(fā)明方法的工藝流程圖。
本發(fā)明共7個(gè)主要步驟，即除毒;細(xì)胞破碎;硫酸銨分段鹽析;脫鹽;CM層析;DEAE層析;sephacryl-S200或TSK分子篩過濾得到七種層析純或電泳純地龍-碎栓酶成分。
現(xiàn)分述如下a 除毒在蚯蚓體內(nèi)含有大量對(duì)人體有害及對(duì)隨后工藝有干擾的毒素，因此，首先要將毒素除掉。具體方法是將適量新鮮蚯蚓洗凈，用清水浸泡兩日，使之吐盡腸胃道中的污物。再將蚯蚓放入0.1M Nacl、0.1MKcl或0.1M(NH4)2SO4中，用20v電脈沖刺激使之排毒，及時(shí)更換鹽溶液3至4次，直至無肉眼可見黃色毒液分泌為止。
b 細(xì)胞破碎將上述步驟所獲得的無毒蚯蚓用組織搗碎機(jī)或超聲細(xì)胞破碎器進(jìn)行勻漿，再用高速冷凍離心機(jī)離心(4℃，15，000rpm，15分鐘)，經(jīng)過濾，除去沉淀，收集上清液。
c 硫酸銨鹽析將上述步驟上清液用硫酸銨分段法鹽析。樣品為0.05MPBS溶劑的溶液，含0.01%SDS、PH7.4，鹽析溫度4℃，鹽析時(shí)間18小時(shí);棄25%飽和度時(shí)的沉淀和65%飽和度時(shí)的上清部分，收集65%飽和度時(shí)沉淀蛋白，即有纖溶酶活性部分，離心速度為15，000rpm。
d 脫鹽將上述步驟所得有活性鹽析部分用超濾法或透析法常規(guī)除鹽，超濾或透析緩沖液為0.05M的PBS。獲得粗提取液。
e CM陽離子交換層析將上述步驟所得粗提取液用0.045M的醋酸鹽緩沖液平衡或稀釋，使樣品PH調(diào)至PH4.5。用0.045M醋酸緩沖液平衡CM柱。加樣后在0-0.3MNacl范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，棄無活性洗脫峰，收集活性峰。
f DEAE陽離子交換層析將上述步驟所得活性部分，分別用PH7.4的PBS(0.05M)緩沖液平衡，調(diào)樣品PH為7.4，上樣后進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。洗脫條件為0.05PBS;PH7.4;0-1MNacl;0.5MOL/分洗脫速度。收集0.10-0.18M/LNacl范圍的活性峰洗脫液。
g sephacryl-S200或TSK分子篩過濾將上述步驟所獲得有纖溶酶活性樣品進(jìn)行sephacryl-S200或TSK分子篩過濾，(洗脫液為PH7.4PBS，流速為0.81，mol/分)即可得到7種層析純或電泳純DL-碎栓酶為15，000、26，900±300、27，000、27，900±300、32，000±300、33，000、70，000道爾頓的蛋白酶。
用本發(fā)明的方法，從蚯蚓體組織中提取DL-碎栓酶，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高成本低，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，提取蛋白酶多(7種)，純度高。
權(quán)利要求
一種地龍-碎栓酶的制備方法，其特征在于利用蚯蚓為原料，經(jīng)前處理除毒，硫酸銨鹽析，CM陽離子層析和DEAE陰離子層析和sephacry1-S200或TSK分子篩過濾方法生產(chǎn)出七種層析純或電泳純地龍--碎栓酶。其過程為a.將洗凈蚯蚓放入0.31MNacl、0.31Mkcl或0.01M(NH4)2SO4溶液中用20V電脈沖剌激使之排毒，及時(shí)更換溶液3至4次，直至無肉眼可見黃色分泌物排出為止。b.將a所得除毒蚯蚓經(jīng)細(xì)胞破碎后離心取上清部分；用硫酸銨分段鹽析，樣品為0.05MPBS溶劑的溶液含0.01%SDS、PH7.4，鹽析溫度4℃，鹽析時(shí)間18小時(shí)；棄25%飽和度時(shí)的沉淀部分和65%飽和度時(shí)的上清部分，收集65%飽和度時(shí)的沉淀蛋白，脫鹽后獲得粗提取液。c.將b所獲得粗提取液用0.045M的醋酸鹽緩沖液平衡式稀釋；調(diào)樣品PH為4.5，用0.045M醋酸緩沖液平衡CM柱，加樣后在0--0.3MNacl范圍內(nèi)連續(xù)梯度洗脫，收集活性脫峰。d.將c所獲得活性洗脫峰，分別用PH7.4的PBS(0.05M)緩沖液平衡，調(diào)樣品PH為7.4，上樣后進(jìn)行連續(xù)洗脫、洗脫條件為0.05MPBS，PH7.4，0--1MNacl，0.5mol/分脫洗速度。收集0.10-0.18M/1Nacl范圍的活性峰洗脫液。e.將d所得0.035M--0.08M范圍內(nèi)的活性峰洗脫液進(jìn)行sephacry1--S200或TSK分子篩過濾，洗脫液為PH7.4PBS，流速為0.8Lmol/分。即可得到7種層析純或電泳純地龍--碎栓酶，分子量為1，5000、26900±300、27，000、27900±300、32000±300、33000、70，000道爾頓的蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明方法涉及一種從蚯蚓體內(nèi)制備地龍-碎栓酶的方法。本發(fā)明利用新鮮蚯蚓為原料，經(jīng)鹽電刺激除毒、硫酸銨鹽析、CM陽離子交換層析、DEAE陽離子交換層析、sephacryl—S200或TSK分子篩過濾，得到7種高純度地龍-碎栓酶。本發(fā)明生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)量高，產(chǎn)品化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，純度高。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1080956SQ9310468
公開日1994年1月19日 申請(qǐng)日期1993年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月24日
發(fā)明者牛勃, 程牛亮, 鄭國(guó)平, 單鴻仁 申請(qǐng)人:北京市首都生物技術(shù)研究所