專利名稱：r-亞麻酸及以其為主的生物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系屬于微生物領(lǐng)域，即提供了一種r-亞麻酸及以其為主要成份的生物制劑的制備方法和生物制劑。
r-亞麻酸(r-Llnotenlcacld)是一種十八碳不飽和脂肪酸，簡稱GLA。GLA是具有高度生物活性的前列腺素(prostaylandlns)的前體，它在機(jī)體內(nèi)具有重要的生理作用。因此，近十年來，r-亞麻酸不飽和脂肪酸的研究和應(yīng)用受到世界各國的重視。月見草油是目前比較受歡迎的防治高血脂藥物，它是由月見草籽中提取的，其主要成分是亞油酸，其次是r-亞麻酸，由于亞油酸含量高于r-亞麻酸7-8倍，因此限制了r-亞麻酸的生理功能和藥效。此外，由于自然條件的影響，月見草的資源有限。因此，日、英等國家采用了微生物法生產(chǎn)GLA，主要利用被孢霉(Morteralla)，根霉(Rhlzopus)工業(yè)化生產(chǎn)r-亞麻酸，但隨之而獲得的代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)含物卻未能得以應(yīng)用。
為了解決自然資源不足、開發(fā)利用我國的微生物資源，本發(fā)明提供了一種r-亞麻酸及以其為主要成份的生物制劑的制備方法，并將制備的發(fā)酵產(chǎn)物(包括副產(chǎn)物)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域。
本發(fā)明的主要特征是它由如下工序組成1、從產(chǎn)生不飽和脂肪酸的野生菌種中分離篩選出刺孢小克銀漢霉原始菌種;2、經(jīng)微波處理10-20秒鐘，搖瓶培養(yǎng)，選擇出r-亞麻酸產(chǎn)量高的菌株;3、用紫外線照射法進(jìn)行誘變處理，再經(jīng)搖瓶選擇;4、在PH6-5.5，溫度26-30℃條件下，將菌株培養(yǎng)在以葡萄糖或蔗糖、淀粉、糖密、醋酸鹽為碳源，以硫酸或尿素、蛋白胨為氮源，以及含有生物素，維生素和鉀鎂無機(jī)鹽的基質(zhì)中振蕩發(fā)酵96-144小時(shí)或者采用6-10%的蔗糖或糖密為碳源，C∶N＝30∶1，溫度為26-28℃，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分的500立升罐發(fā)酵140-150小時(shí);5、過濾、水洗、干燥。通過本發(fā)明所提供制備方法可以獲得r-亞麻酸為主要成份，配以誘變株的副代謝產(chǎn)物-多糖、各種氨基酸、多氧化物岐化酶和維生素，B1B2和E的生物制劑。此外將上述方法所獲得的產(chǎn)物用石油醚處理，可提取所含r-亞麻酸的油脂。
上述制備方法中提及的原始菌株-刺孢小克銀漢霉，經(jīng)微波和紫外線誘變處理后獲得的一株高產(chǎn)脂質(zhì)和r-亞麻酸能力較高的誘變株，該菌株在土豆汁瓊脂培養(yǎng)基中于28℃溫度下培養(yǎng)2天，菌落直徑3.0-4.0cm，菌絲松散、棉毛狀、白色，有部分白色分生孢子形成，培養(yǎng)4天，菌落直徑4.0-6.0cm，菌絲由白變白灰色，分生孢子呈灰黃色或駝色，培養(yǎng)6天，菌絲布滿培養(yǎng)器，呈灰黃色或土褐色，成熟的分生孢子為灰黃色或黃褐色，顯微鏡下觀察可見，營養(yǎng)菌絲發(fā)達(dá)多分枝，直徑10-20微米，分生孢子梗直立，分枝頂端形成的泡束有小梗，小梗上形成了園型或橢園型帶纖細(xì)刺的分生孢子，直徑10-15微米。
下面通過實(shí)施例詳述本發(fā)明所提供的r-亞麻酸的制備方法和生物制劑及其制備方法。
實(shí)施例1-一種r-亞麻酸的搖瓶發(fā)酵的制備方法(1)r-亞麻酸產(chǎn)生菌的篩選根據(jù)生長速度、脂質(zhì)和r-亞麻酸含量綜合考慮，選擇出刺孢小克銀漢霉菌種;
(2)微波和紫外線照射誘變處理;
將篩選出的原始菌株的孢子，在微波爐中處理15秒鐘，然后搖瓶培養(yǎng)測定脂質(zhì)和r-亞麻酸含量，選擇r-亞麻酸菌株，再用紫外線照射，從而獲得了高產(chǎn)脂質(zhì)、r-亞麻酸的菌株。
(3)搖瓶發(fā)酵將上述菌株培養(yǎng)在葡萄糖4%、尿素0.12%、磷漢氫鉀(KH2PO4)0.05硫化鎂(MgSO4.7H2O)0.025%，維生素B，生物素微量的基質(zhì)中，在28-30℃的溫度下振蕩培養(yǎng)4天;
(4)過濾、水洗、干燥(5)用石油醚提取法獲得r-亞麻酸的油脂。
實(shí)施例2-一種r-亞麻酸500立升罐發(fā)酵的制備方法(1)(2)步驟與實(shí)施例1相同，(3)采用以10%的蔗糖(或糖密)為碳源，C∶N＝30∶1，溫度為28℃，攪抖速度為200轉(zhuǎn)/分的500立升罐發(fā)酵小時(shí);
(4)(5)與實(shí)施例1亦相同。
實(shí)施例3-一種以r-亞麻酸為主要成份的生物劑及其制備方法。
本實(shí)施例同實(shí)施例1、2所不同的無需用石油醚提取法獲得r-亞麻酸的油脂，而是將經(jīng)過濾、水洗、干燥后的產(chǎn)物直接用來做為生物制劑，它的主要成份為r-亞麻酸，其余為多種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)含物。本發(fā)明所提供的生物制劑的具體成份為油脂產(chǎn)量31-36%，r-亞麻酸含量12-13%，菌體干重25-27克/升，此外還含有二十多種氨基酸多糖、多氧化酶岐化酶(SOD)和維生素B1B2PP和E等代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明將獲得的以r-亞麻酸為主要成分，配比上述的多種代謝產(chǎn)物制成的生物制劑，進(jìn)行了菌株的毒性和藥效試驗(yàn)。以不同劑量腹腔注射和灌胃方式，對70只小白鼠，進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，通過251天的大量動(dòng)物(小白鼠和大白鼠)的連續(xù)給樣試驗(yàn)，對動(dòng)物的生長、存活與死亡、血常規(guī)、肝功能、腎功能指標(biāo)檢測，證明無慢性毒性和蓄積性毒性。
通過對離體家兔和動(dòng)物長期飼育所進(jìn)行藥效試驗(yàn)，其結(jié)果證明，本發(fā)明所提供的生物制劑具有抑制血小板聚集，降低血漿比粘度，提高血中高密度脂蛋白，降低甘油三脂、全血粘度和血細(xì)胞壓積的作用，此外，也有得于改善血液流變學(xué)狀態(tài)和改變動(dòng)脈粥樣硬化。
不僅如此，本發(fā)明所提供的生物制劑還被用于30位患者臨床觀察3個(gè)月，結(jié)果證明，該制劑不僅可降低甘油三醇和血小板的聚集性而且可使全血粘度和膽固醇有明顯的降低，因此，給心腦血管疾病的防治開辟了新的途徑(見附件1，2，3，4，5，6)。
綜上所述可以看出，本發(fā)明所提供的r-亞麻酸的制備方法較之已有技術(shù)具有工藝簡單，菌種來源豐富等優(yōu)點(diǎn)，所制得的生物制劑可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，食品等領(lǐng)域中。
權(quán)利要求
1.一種以r-亞麻酸為主要成份的生物制劑的制備方法，其特征在于它由如下工序組成(1)從產(chǎn)生不飽和脂肪酸的野生菌種中分離篩選出刺孢小克銀漢霉原始菌種；(2)經(jīng)微波處理10-20秒鐘再用紫外線照射進(jìn)行透變處理，然后搖瓶培養(yǎng)，選擇出r-亞麻酸產(chǎn)量高的菌株；(3)在PH6-5.5，溫度26-30℃條件下，將菌株培養(yǎng)在以葡萄糖或蔗糖、淀粉、糖密、醋酸鹽為碳源，以硫胺或尿素，蛋白胨為氮源，以含有生物素，維生素和鉀鎂無機(jī)鹽的基質(zhì)中，振蕩發(fā)酵96-144小時(shí)或者采用以6-10%的蔗糖或糖密為碳源，C∶N-30∶1，溫度為28±2℃攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分的500立升罐發(fā)酵140-150℃小時(shí)。(4)過濾、水洗、干燥。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于最佳的培養(yǎng)基質(zhì)為葡萄糖(或蔗糖) 4-10%尿素 0.12-0.5%KH2PO40.025-0.08%MgSO47H2O 0.025-0.05%
3.一種由權(quán)利要求1、2所述的制備方法獲得的生物制劑，其特征在于它以r-亞麻酸為主要成份，配以誘變株的副代產(chǎn)物多糖、各種氨基酸，多氧化物岐化酶和維生素B1B2PP和E。
4.一種r-亞麻酸的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述制備方法中第4道工序獲得的產(chǎn)物用石油醚處理來提取所含的r-亞麻酸的油脂。
全文摘要
本發(fā)明系r-型麻酸及以其為主的生物制劑的制備方法，屬于微生物領(lǐng)域。其主要特征是選用刺孢小克銀漢霉，經(jīng)微波和紫外線誘變處理獲得一株高產(chǎn)脂質(zhì)和r-亞麻酸的透變株，再經(jīng)搖瓶發(fā)酵或500立升罐發(fā)酵來制取以r-亞麻酸為主的生物制劑。用石油醚提取法處理后可以獲得r-亞麻酸的油酯。由本發(fā)明所獲得的生物制劑可用于醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域中。
文檔編號C12P7/64GK1069070SQ91106190
公開日1993年2月17日 申請日期1991年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月30日
發(fā)明者趙振英, 周連甲, 馬慶祿, 葛美華, 馬曉軍, 劉鐵鑌, 劉鐵軍, 王雨勤 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所