專利名稱：聚醚抗菌素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的聚醚抗菌素。具體的說，本發(fā)明涉及抗菌素A82810，以及通過培養(yǎng)一種新的微生物制備它的方法。
動物醫(yī)藥產品的需要量很大?？咕匾恢笔且活愔匾膭游镝t(yī)藥產品，它不僅用來治療疾病，還用來促進動物的生長?？咕啬軌蛲ㄟ^減少疾病或增加飼料利用率而促進生長。
球蟲病是一種嚴重影響家禽業(yè)的疾病。球蟲病是通過一種或多種艾美球蟲屬(Eimeria)或等孢球蟲屬(Isospora)中的病菌感染產生的。由于球蟲病不斷造成的經(jīng)濟損失需要有性能得到改進的抗球蟲病藥品。
在獸醫(yī)學領域中，從經(jīng)濟的觀點看來期望達到的另一目的是通過提高飼料利用率促進生長。這種生長促進作用對于反芻動物(如牛)及單胃動物(如家禽和豬)來說尤其重要。
在動物醫(yī)藥領域中，聚醚抗菌素是一組非常重要的抗菌素。例如，聚醚莫能菌素是一種很有價值的市售產品，它被用來治療家禽球蟲病和提高動物的飼料利用率。
本發(fā)明提供了一種稱為A82810的聚醚抗菌素。Westley按照類和型對現(xiàn)有聚醚進行了分離(JohnW.Westley《聚醚抗菌素天然存在的酸性離子載體，第2卷、化學》，MarceLDekker，NewYork1983)。根據(jù)Westley的系統(tǒng)，A82810是1b類(1)型聚醚組中的一個新成員，因為它具有一個螺縮酮系統(tǒng)。此組中的其他成員還有A80190(US4，582，822);;A28695A和B(US3，839，558);A204Ⅰ和Ⅱ(US3，705，238);A-32887(US4，133，876);卡氏霉素(Carriomycin);醚霉素;CP-47，434，RP37454和X-14868等抗菌素。
因此，本發(fā)明在一個方面提供了一種式1的A82810化合物，它的基或烷基酯，它的烷基醚衍生物，或它的鹽
其中，R是氫或-CONHR1，而R1是烷基、芳基、烷芳基、芳烷基鹵代芳基、硝基芳基、鹵代芳烷基、烷氧芳基、芳氧芳基、芳基環(huán)烷基、?；蓟铜h(huán)烷基。
A82810的性質已確定抗菌素A82810的結構為式1所示的結構(根據(jù)質譜分析和NMR研究)。A82810(游離酸形式)具有下述特性狀態(tài)白色晶體熔點69～71℃PKa＝6.6(80%＝甲亞砜水溶液)〔α〕25589D-7.35℃(C1，MeoH)分子量842(場解吸質譜)
經(jīng)驗式C45H78O14紫外光譜只有末端吸收紅外光譜(CH3Cl)
圖1在下列頻率具有吸收(cm-1)3020 2977，2935，2880，1726，1458 1379 1206，1164，1146，1115，1104，1094，1073，1050，1025，1006，991，980及946溶解性不溶于水;溶于低級醇如甲醇，酮例如丙酮，酯例如乙酸甲酯，鹵代烴例如氯仿，以及烴類如乙醚、苯、甲苯和熱己烷。
從A82810的結構明顯可見，它具有一個能夠形成鹽和酯衍生物的羧酸功能團，并至少具有一個羥基，它能夠被酯化或形成醚衍生物。
在式1的化合物中，如果R不是氫則稱為尿烷衍生物。式1的化合物可作為抗菌素使用，或作為提高飼料利用率的藥劑。
術語“?；笔侵窩1-C7，優(yōu)選C1-C4的鏈烷酸部分，即具有下式的基團
其中，R1a是C1-C6烷基或氫，例如甲?；阴；?、丙?；?、丁?；?。
術語“環(huán)烷基”是指含有3-7個碳原子的環(huán)狀烴基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基等，優(yōu)選環(huán)己基。環(huán)烷基可由芳基(如本文所定義的)取代以形成芳基環(huán)烷基，例如2-(苯基)環(huán)丙基。
術語“烷氧基”是指C1-C7的具有一個氧取代基團的低級烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
術語“芳基”是指從芳香烴上除去一個氫原子產生的芳香殘基，例如苯基、吡啶基或呋喃基，尤其是苯基?！胺蓟笨捎筛鞣N基團取代。苯核上的取代基最好位于4位。例子有4-烷基芳基如4-甲基苯基(4-甲苯基);4-鹵代苯基如4-氯苯基;4-硝基苯基;4-芳氧基芳基如4-苯氧基苯基;4-烷氧基苯基如4-甲氧基苯基;4-(烷基-羧基)苯基如4-(甲基羧基)苯基或4-(苯基羧基)苯基。
術語“烷基”是指C1-C7直鏈或支鏈烴基，優(yōu)選C1-C4烴基例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基等。烷基可由芳香殘基取代(定義如上)以形成芳烷基殘基，例如苯乙基或2-苯乙基，或由鹵代芳香殘基取代以形成鹵代芳基烷基如4-溴苯乙基。
A82810及其衍生物的鹽類可用來分離和純化抗菌素。藥物上可接受的鹽類尤其有用。鹽類的例子有A82810及其衍生物的堿金屬、堿土金屬和胺的鹽類。
A82810具代表性的合適的堿金屬和堿土金屬鹽包括鈉、鉀、鋰、銫、銣、鋇、鈣和鎂鹽。A82810的合適的胺鹽包括銨和一級、二級及三級C1-C4烷基銨和羥基-C2-C4-烷基胺鹽。典型的胺鹽包括由A82810與下述物質反應所形成的胺鹽氫氧化銨、甲胺、仲丁胺異丙基胺、二乙胺、二異丙基胺、乙醇胺、三乙胺、3-氨基-1-丙醇等。
在治療動物體時，究竟是用化合物的游離堿或鹽一般說來不是很重要的。但由于經(jīng)濟、方便或毒性的原因而選擇鹽的形式。
本發(fā)明的另一方面涉及一種制備A82810的方法，包括在在深層通氣發(fā)酵條件下，培養(yǎng)纖維馬杜拉放線菌新種(Actinomadurafibrosasp.nov.)NRRL18348，或其產生A82810的突變體，以生產抗菌素A82810;以及隨意地鹽化。用極性有機溶劑從發(fā)酵液和從菌絲體中萃取A82810。A82810通過各種技術(例如柱層析)進行分離和進一步純化。
本發(fā)明進一步提供了纖維馬杜拉放線菌新種NRRL18348的生物學純培養(yǎng)物，或者產生A82810的突變體。為方便起見，此微生物被稱為培養(yǎng)物A82810.1.培養(yǎng)物A82810.1是由親本菌株(培養(yǎng)物A82810)衍生的天然變種，培養(yǎng)物A82810則是從土壤樣品(來自TogoWestAfrica)中分離出來的。
一種產生A82810生物的培養(yǎng)物已保藏于NRRL(NorthernRegionalResearchCenterAgriculturalResearchNorthCentralRegion1815NorthUniversityStreetPeoriaIllinois61604)并成為該機構所收集培養(yǎng)物的一部分，公眾可以NRRL18348的保藏號從該機構得到此培養(yǎng)物。
FrederickPMertz(LillyResearchLaboratories)對此變種進行了分類學研究。根據(jù)這些研究，此新的生物被分為馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)的一個新種，所建議的名稱是纖維馬杜拉放線菌新種。此分類是根據(jù)將它與相似種作實驗室比較，以及將A82810.1的特性與發(fā)表的相似種的特性作比較而作出的。
所用方法進行這些研究所采用的方法來自為確定鏈霉菌屬的種的特性而訂立的國際鏈霉菌屬工程(ISP)(E.B.Shirling和D.Gottlieb，“確定鏈霉菌屬種的特性的方法”，Int.J.SystBactriol16313-340，1966)，以及由Gordon給出的方法(R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan，C.Pang”空腔諾卡氏菌、自養(yǎng)諾卡氏菌和諾卡氏菌素菌株”Int.J.Syst.Bacteriol.2454-63，1974)。
淀粉水解作用是通過在ISP4號(無機鹽淀粉瓊脂)平板上用碘測試淀粉的存在而確定的。
NaCl耐性是通過在ISP2號瓊脂中加入相當于所需濃度的NaCl而測定的。
使用ICSS-NBSCentroidColorCharts2106號標準樣品(NationalBureauofStandards，1958，U.SDepartmentofCommerce，Washington，D.C.)和《ColorHarmonyManual》(第4版，ContainerCorporationofAmericaChicagoIllinois，1958)分別確定反面和氣生菌絲的顏色名稱。
利用光學顯微鏡和掃描電鏡(SEM)進行形態(tài)學研究。
通過Becker等人(B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon，H.E.Lechevalier，“通過完整細胞水解物的紙層析快速分辨諾卡氏菌和鏈霉菌”，Appl.Microbiol.12431-423，1964)和Lechevalier(M.P.Lechevalier“具有臨床重要性的需氧放線菌類的鑒別”J.Lab.Clin.Med.，71934-944，1968)的層析法，確定了完整細胞水解物中的二氨基庚二酸(DAP)的異構體。
通過將抗菌素敏感性圓片鋪在已接種的ISP2號瓊脂平皿表面來測定抗菌素抗性。如果觀察到?jīng)]有抑制帶則將抗性記為(+)，如果有抑制帶則記為(-)。
通過以Minnikin(D.E.Minnikin，L.Alshamaony及M.Goodfellow，“通過完整生物甲醇解物的薄層層析分辨分枝桿菌屬，諾卡氏菌屬和相關分類單位，”J.Gen.Microbiol，88200-204，1975))所述技術為基礎的方法測定霉菌酸。
由下述方法測定磷脂1)M.P.Lechevalier，H.Lechevalier，《《A.UniversityLaboratoryApproach》，Dietz和Thayer編，第6號特種出版物，工業(yè)微生物學協(xié)會，ArlingtonVA，1980;PP.277-284;
2)D.E.Minnikin，I.G.Hutchinson和A.B.Caldicott，“含有霉菌酸細菌的甲醇解物的薄層層析”，J.Chrematography188221-233，1980;及3)J.C.Dittmer和R.L.Lester，“測定薄層析上磷脂的簡單專一的噴霧法”，J.LipidResearch5(1)126-128，1964。
通過下述方法測定甲基萘醌類成分1)R.M.Kroppenstedt，《細菌分類學中的化學方法》，M、Goodfellow和D.E.Minnikin編，1985，173-196頁;
2)M.D.Collins;同上267-285頁。
利用HP5898A微生物鑒別系統(tǒng)(參見L.Miller和T.Berger，“通過完整細胞脂肪酸的氣相層析鑒別細菌”，Hewlett-PackardApplicationNote228-41，1985;第8頁)進行脂肪酸分析。由在同樣條件下培養(yǎng)的冷凍干燥的完整細胞制備脂肪酸甲基酯。
圖7所示的系統(tǒng)樹圖是以Euclidian距離為基礎由計算機作出的。
圖8所示的主要成分，分析是二維的，它也是由計算機完成的。
培養(yǎng)特性培養(yǎng)物A82810.1在復合和確定培養(yǎng)基中都能良好生長。但除了在ISP2號培養(yǎng)基、Bennetts氏瓊脂和番茄醬/燕麥粉(TPO)瓊脂上外，很少有氣生菌絲體的生成。生成的氣生孢子團是粉色至白色的。反面是紅棕色至鮮明的紅橙色。末觀察到可溶色素。表Ⅰ總結了培養(yǎng)物A82810.1的培養(yǎng)特性。
表Ⅰ.A82810.1在各種瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性a瓊脂培養(yǎng)基 A82810.1的特性bISP2號G大量R55.s.BrAm大量b白色Sp淡棕色ISP3號G良好R39.gy.rO
Am微量粉紅色Sp無ISP4號G大量R43.m.rBrAm微量粉紅色Sp無ISP5號G大量R37.m.rOAm無Sp無ISP7號G大量R43.m.rBrAm無Sp無ATCC172號G良好R39.gy.roAm微量5cal.Y.粉紅色Sp無Bennett氏G大量
R42.1.rBrAm良好白色Sp無Emerson氏G大量R54.broAm微量白色Sp無葡萄糖G大量天冬酰胺R39.gy.roAm微量5ca1、y、粉紅色Sp無Jensens氏G一般R39.gy.roAm微量白色Sp無養(yǎng)分G良好R53.m.OAm無Sp無土豆G良好胡蘿卜R39.gy.rOAm微量白色Sp無TPOG大量R58.m.BrAm良好5cbgy.y粉紅色Sp無Czapek氏G良好R43.m.rBrAm一般白色Sp無a于30℃培養(yǎng)14天bG＝生長;R＝反面;Am＝氣生菌絲體;Sp＝可溶色素形態(tài)特征培養(yǎng)物A82810.1產生大量的基質菌絲體。氣生菌絲很為少見。在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察時，沒有觀察到分段成孢子的現(xiàn)象。菌絲體似乎根本不產生孢子?？梢悦黠@見到許多菌絲束形成粗纖維。這些氣生菌絲中有些形成節(jié)狀或突出，它們有點象孢子。但用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些結構并不是真正的孢子。有時可觀察其他的纖維狀結構。這些結構及一般氣生菌絲的纖維狀外觀，就是種名為“纖維”的基礎。
生理特性培養(yǎng)物A82810.1由下列碳水化合物產生酸側金盞花糖醇、L-阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油、糖原、乳糖、麥芽糖、甘露糖，鼠李糖、核糖、蔗糖、繭蜜糖和木糖。A82810.1不從下列物質產生酸D-阿拉伯糖、纖維素、糊精、衛(wèi)矛醇、乙醇、赤癬糖醇、肌醇、旋覆花素、甘露醇、松三糖、蜜二糖、α-甲基-D-葡糖苷、蜜三糖、水楊苷、山梨醇、山梨糖和木糖醇。
培養(yǎng)物A82810.1利用下述有機酸(以鈉鹽的形式)乙酸、丁酸、丙酸和丙酮酸。它不利用苯甲酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、蘋果酸、粘酸、草酸、琥珀酸和酒石酸。
A82810.1能夠分解酷蛋白、彈性蛋白、七葉苷、次黃嘌呤、淀粉、睪酮、酷氨酸和脲，但不分解腺嘌呤、尿囊素、蘋果酸鈣、鳥嘌呤、馬尿酸和黃嘌呤。
A82810.1能產生過氧化氫酶、磷酯酶和脲酶，液化明膠;水解脫脂牛奶以及能在50℃下存活8小時。它不產生類黑素或H2S，還原硝酸或胨化脫脂牛奶。
A82810.1對先鋒霉素I(30μg)，林肯霉素(2ug)、青霉素G(10單位)、利福平(5μg)和溶菌酶(50μg/ml)具有抗性。它對桿菌肽(10單位)、慶大霉素(10μg)、新霉素(30μg)、夾竹桃霉素(15μg)、鏈霉素(10μg)、四環(huán)素(30μg)、妥布霉素(10μg)和萬古霉素(30μg)敏感。
培養(yǎng)物A82810.1在20-45℃的溫度范圍內生長。最適生長溫度似乎是37℃。培養(yǎng)物忍耐的NaCl濃度可高達(并包括)5%。
細胞壁分析
水解的完整細胞中含有內消旋二氨基庚二酸。在完整細胞的提取液中檢測到有下列糖類半乳糖、葡萄糖、甘露糖、馬杜糖(madurose)和核糖。因此，A82810.1具有Ⅲ型細胞壁和B型糖構成(參見M.P.Lechevalier和H.Lechevalier，“化學組成作為需氧型放線菌分類的標準”，Int.J.Syst.Bacteriol.20435-443，1970)。
沒有檢測到霉菌酸。
測定完整細胞的磷酯表明存在有磷酯酰肌醇、二磷酯酰甘油和GluNu(一種含有葡糖胺的未知結構)。磷酯酰乙醇胺和磷酯酰膽堿都未檢測到。因此，A82810.1具有Ⅳ型的磷酯構成(參見M.P.Lechevalier，A.E.Stern，H.A.Lechevalier，“放線菌類分類學中的磷酯”，《放線菌類》，K.P.Schaal和G.Pulverer編;Zbl.Bakt.Suppl.ll，GustavFischerVerlag，Stuttgart，NewYork，1981)。
在A82810.1中檢測到的甲基萘醌類是具有九個異戊二烯單位的六氫甲基萘醌MK-9(H6)，以及少量的八氫甲基萘醌MK-9(H8)。
菌株A82810.1的鑒別A82810.1的化學分類學性質以及培養(yǎng)和形態(tài)特征都支持將此分離物分入馬杜拉放線菌屬(參見V.B.D.Skerman，V.McGowan，P.H.A.Sneath，《細菌名稱的批準名單》，美國微生物學學會，WashingtonD.C.1980)。
使23型的馬杜拉放線菌種的菌株與培養(yǎng)物A82810.1在21種不同的瓊脂培養(yǎng)基上一起培養(yǎng)。比較其培養(yǎng)和形態(tài)特征。培養(yǎng)物A82810.1表現(xiàn)出與下述的相似性天盛馬杜拉放線菌(A.coerulea)、馬氏馬杜拉放線菌(A.madura)、粉狀馬杜拉放線菌(A.Pulveraceus)、紅馬杜拉放線菌(A.roseorufa)、紅色馬杜拉放線菌(A.rubra)、沙氏馬杜拉放線菌(A.salmonea)和疣孢馬杜拉放線菌(A.verrucsospora)。
由文獻中收集這七個種的生化特性，通過建立相似系數(shù)的表與A82810.1作比較。使用Jaccard Sj系數(shù)和簡單對比系數(shù)Ssm(W.Kurylowicz，A.Paszkiewicz，W.Woznicka，W.Kurzatkowski和T.Szulga，《鏈霉菌的數(shù)據(jù)分類學》，Polish Medical Publishers，Warsaw 1975，37頁)。
表Ⅱ中概括了這些數(shù)據(jù)。
表Ⅱ利用相似系數(shù)進行的A82810.1與幾種馬杜拉放線菌的比較a培養(yǎng)物 SjSsmA82810.1100100疣孢馬杜拉放線菌7281馬氏馬杜拉放線菌7379沙氏馬杜拉放線菌7078紅色馬杜拉放線菌7076玫紅馬杜拉放線菌6075粉狀馬杜拉放線菌5974a沒有天藍馬杜拉放線菌的數(shù)據(jù)對這些培養(yǎng)物的完整細胞進行脂肪酸分析。圖7和圖8分別顯示了由這些數(shù)據(jù)得到的系統(tǒng)樹圖和進行的主要成分分析。
相似系數(shù)和脂肪酸分析表明，在作比較的七個已知種中，粉狀馬杜拉放線菌和疣孢馬杜拉放線菌與A82810.1其有最多的共同性征。然而，此相似性還不足以作出結論說A82810.1是任一種的菌株。表Ⅲ給出了A82810.1和這兩個種之間的差別。
表Ⅲ粉狀馬杜拉放線菌、疣孢馬杜拉放線菌與A82810.1之間的區(qū)別特性A82810.1粉狀疣孢脲酶生成+--鳥嘌呤水解 - NDa+淀粉水解++-由下列物質生成酸L-阿拉伯糖+-+糊精-ND+果糖+-+肌酵-+-乳糖+-+甘露醇--+甘露糖+--繭蜜糖+-+
特性A82810.1粉狀疣孢利用乙酸鈉+-ND在45℃的生長+--孢子的存在-++藍灰色孢子-+-對于下述物質的抗性夾竹桃霉素(16μg)-ND+青霉素G(10單位)+ND-5%NaCl耐性 + ND -aND＝未做因此，此研究支持這一結論，即培養(yǎng)物A82810.1是馬杜拉放線菌屬的一個新種。由此原因，培養(yǎng)物A82810.1被命名為纖維馬杜拉放線菌新種，拉丁文的形容詞“纖維”是指氣生菌絲的纖維狀外觀。
與其他生物的情況一樣，本發(fā)明生產A82810.1纖維馬杜拉放線菌新種NRRL18348的特性是可以變異的。通過本領域的公知方法可得到此菌株的突變體，例如，利用各種物理和化學誘變劑進行處理，如紫外光、X射線、γ射線，化學試劑如n-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍。保留有A82810生產特性的纖維馬杜拉放線菌新種NRRL18348的天然或誘導突變體都被認為是本發(fā)明的構成部分。
用以培養(yǎng)纖維馬杜拉放線菌的培養(yǎng)基可以是許多培養(yǎng)基中的任意一種。但為了生產的經(jīng)濟性、最佳產率和產品的容易分離，優(yōu)選某些培養(yǎng)基。因此，大型發(fā)酵中的優(yōu)選碳水化合物源例如有葡萄糖和土豆糊精，雖也可以使用核糖、木糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇等。
優(yōu)選的氮源是酶解的酷蛋白和酵母、盡管也可使用肝粉、肉胨、魚粉等。培養(yǎng)基中可摻入的無機鹽養(yǎng)分是那些常規(guī)的水溶性鹽類，它們能夠產生鋅、鈉、鎂、鈣、銨、氯、碳酸根、硫酸根、硝酸根等離子。
培養(yǎng)基中還應包括生物的生長發(fā)育所必需的基本微量元素。這些微量元素一般作為雜質存在于培養(yǎng)基的其他成分中，其數(shù)量足以滿足生物生長的需求。泡沫的形成通常并不要緊，但如果需要，可在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基中加入少量(即0.2ml/L)消泡劑，例如聚丙二醇。
為了大量生產抗菌素A82810，優(yōu)選在罐中進行深層通氣發(fā)酵。通過搖瓶培養(yǎng)可以得到少量A82810。由于在一般的抗菌素生產中，用孢子形式的生物給大型罐接種存在時間上的遲滯作用，因此優(yōu)選使用無性接種物。無性接種物是如下制備的用該生物的孢子或菌絲片段給少量培養(yǎng)基接種，以得到該生物新鮮的活性生長的培養(yǎng)物。然后，將無性接種物轉移至大型罐中。無性接種物的培養(yǎng)基可以與大型發(fā)酵所用的相同，但其他培養(yǎng)基也是適用的。
在大約25℃至大約40℃之間的溫度下培養(yǎng)產生A82810的生物即可生產A82810。A82810生產的最適溫度似乎是大約34-36℃。
正象常規(guī)的深層通氣培養(yǎng)法一樣，由容器底部向其中吹入無菌空氣，并用常規(guī)的渦輪攪拌培養(yǎng)基。就迄今為止所采用的發(fā)酵條件而論，
氧的最大攝取量還沒有超過大約0.35mM/L/min。在含有大約115升培養(yǎng)基的165升全隔式發(fā)酵罐中，以300rpm的攪拌速度加上0.125V/V/min的通氣率，便可在0.34個大氣壓下足以使溶氧水平維持在或高于45%的空氣飽和度。
在發(fā)酵過程中可對抗菌素A82810的生產進行監(jiān)測，即測試培養(yǎng)基樣品對已知對此抗菌素敏感的生物的抗菌活性。枯草芽孢桿菌ATCC6633是一種可用來測試A82810的檢測生物。生物檢測通過常規(guī)的瓊脂孔擴散測試法進行。
在深層通氣發(fā)酵條件下完成1A82810的生產以后，可利用發(fā)酵領域所用方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收A82810。在產生A82810的生物的發(fā)酵過程中，過濾培養(yǎng)基及菌絲團二者都表現(xiàn)有抗菌活性。對A82810進行最大量回收的方法是，首先使培養(yǎng)基過濾使菌絲團和培養(yǎng)液分離，然后，分別純化過濾培養(yǎng)液及菌絲團，以得到它們各自的A82810部分。有許多技術可用于此純化過程。對于過濾培養(yǎng)液來說，優(yōu)選的純化技術是將其PH調至大約9，然后用合適的溶劑(例如乙酸乙酯)進行萃取。再使萃取溶劑在真空下蒸發(fā)，由此得到培養(yǎng)液中的A82810部分。
對于菌絲團來說，優(yōu)選的純化方法是用合適的溶劑(例如丙酮)萃取分離的菌絲濾餅。然后使萃取溶劑在真空下蒸發(fā)，以產生濃縮的水溶液。然后將此水溶液的PH調至大約9，并用合適的溶劑(例如乙酸乙酯)進行萃取。然后使萃取溶劑在真空下濃縮，以產生菌絲體中的A82810部分。
培養(yǎng)液和菌絲體中的A82810部分通過相似方法進一步純化。優(yōu)選方法為硅膠層析法。
另一選擇是，可以用包括培養(yǎng)基成分和菌絲體在內的培養(yǎng)物固體作為A82810的來源，而不必進行萃取或分離，但最好先去除水分。例如，在生產A82810以后，通過冷凍干燥、轉鼓式干燥、或通過共沸蒸溜和干燥使所有發(fā)酵培養(yǎng)液干燥。然后將干燥后的培養(yǎng)基直接混入飼料預混合物中。
根據(jù)制備陽離子鹽類的常用方法，制備式1化合物的堿金屬和堿土金屬鹽類。例如，將A82810的游離酸溶入合適的溶劑如丙酮中，加入三分之一體積的水，用所需陽離子鹽的堿(如NaOH、KOH)將此溶液的PH調至大約9-10。這樣形成的鹽可用常規(guī)方法分離，例如過濾或溶劑的蒸發(fā)。
形成鹽類的優(yōu)選方法是將A82810(酸形式)溶于與水不混溶的溶劑中，例如乙酸乙酯，加入等體積的水，用相應的陽離子堿(如NaOH、KOH等)將混合物的PH調至10。用水洗滌分離的有機相并濃縮至干燥。使殘渣在二噁烷中冷凍干燥?？捎煤线m的溶劑(如己烷)使鹽結晶。
通過類似方法能夠制備與有機胺形成的鹽。例如，可在A82810溶液(在合適的溶劑如丙酮中)中加入氣態(tài)或液態(tài)胺;溶劑和過量的胺可通過蒸發(fā)除去。
式1的?；パ苌锟赏ㄟ^(例如)下述方法制備用相應的酸酐或酰氯處理A82810。酯化作用發(fā)生在A82810的一個羥基上。這種酯類通常是在室溫下用，例如相應的酸酐與A82810反應而制備的。
式1的烷基酯衍生物利用標準方法通過羧基的酯化制備。式1的烷基酯衍生物在體外測定中活性通常較低。但使動物服用后，這種酯類可作為前藥而在體內轉化為它的活性形式。
式1的烷基酯衍生物是這樣一些化合物，其中它們的一個或多個羥基已被YR2基團取代，其中Y代表O或S;以及R2代表C1-C6-烷基，C1-C4-烷氧基-C2-C5-烷基，C1-C4-烷氧基羰基-C2-C5-烷基，氨基-C2-C5-烷基，巰基-C2-C5-烷基，羥烷基，鹵代烷基，或(R′)m-苯基(CH2)n-，其中R′代表C1-C4-烷基，C1-C4-烷氧基，或羥基;
m代表O-2;以及n代表O-3。
術語烷基和烷氧基具有前面所討論的意義，但其碳原子數(shù)目限于所指出的。
術語“羥烷基”是指單羥基-C2-C5-烷基部分，或當Y是0時，指2，3-二羥基丙基-1部分。
術語“鹵代烷基”是指具有1-3個鹵素取代基的C2-C5-烷基部分，鹵素選自由下述構成的一組溴、氯和氟。如果烷基部分是二鹵代或三鹵代的，則鹵素取代基必須是相同的鹵素原子。
優(yōu)選的式1醚衍生物是這樣的化合物，其中的Y代表O和R代表C1-C6烷基。醚衍生物通過使相應的A82810化合物或其鹽與所需的一級醇或硫醇反應而制備。
對于某些起始醇或硫醇來說，可能必須在反應液中加入酸性催化劑。合適的催化劑包括鹽酸、硫酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、二氧化硒和三氟化硼。
為了促進反應可加入一種溶劑，例如水、丙酮、苯、乙醚、四氫呋喃或二噁烷。反應通常于室溫下發(fā)生，盡管也可使用較高的溫度。
雖然常規(guī)的反應程序在某些時候已經(jīng)足夠了，但為了得到本發(fā)明的化合物有時還必需要進行進一步的純化。這種純化作用可通過眾所周知的方法來完成，例如柱層析、薄層層析、分級結晶等等。
本發(fā)明還提供了一種制備式1的脲烷衍生物的方法，包括使A82810或其鹽與式2的異氰酸酯反應，R1-NCO2其中，R1如上述所定義，以形成A82810的合適的脲烷衍生物。
優(yōu)選使用A82810的鹽，尤其是鈉鹽。加入的異氰酸酯應當稍微過量，例如過量大約10%，以形成最佳數(shù)量的單衍生物。反應優(yōu)選在惰性溶劑例如氯代烴如四氯化碳、二氯甲烷或氯仿，乙醚、乙酸乙酯，或芳烴溶劑例如苯或甲苯中進行。反應溫度并不重要，可以在0℃以上和反應混合物的沸點之間的溫度下進行，但優(yōu)選大約室溫。
式1的化合物(A82810化合物)具有抗細菌和抗球蟲菌活性。A82810化合物尤其有對抗厭氧細菌的活性。通過標準的瓊酯稀釋檢測法測定了A82810抑制各種細菌的最低抑菌濃度(MIC)，所得結果概括于表Ⅳ和表Ⅴ中。在培養(yǎng)24小時后讀取終點。
表Ⅳ抗菌素A82810的體外抗菌活性測試生物MIC(μg/ml)金黃色葡萄球菌X1.11.0金黃色葡萄球菌V411.0金黃色葡萄球菌X4001.0金黃色葡萄球菌S13E1.0表皮葡萄球菌2701.0表皮葡萄球菌2220.5釀膿鏈球菌C2031.0肺炎鏈球菌Park11.0屎鏈球菌X661.0糞鏈球菌20411.0流感嗜血桿菌C.L128流感嗜血桿菌7664大腸桿菌N101.0大腸桿菌EC148.0大腸桿菌TEM＞128產氣腸桿菌C328.0產氣腸桿菌EB178.0
克雷伯氏菌＞128沙門氏菌＞128銅綠假單胞菌X5282.0銅綠假單胞菌X2390.25銅綠假單胞菌PS18＞128銅綠假單胞菌PS720.25粘質沙雷氏菌＞128變形菌＞128索氏志賀氏菌2.0表Ⅴ厭氧細菌分離物對抗菌素A82810的敏感性厭氧細菌MIC(μg/ml)艱難梭菌29940.5產氣莢膜梭菌810.5敗毒梭菌11280.5產氣真桿菌1235≤0.25不解糖消化球菌1302≤0.25普氏消化球菌1281≤0.25厭氧消化鏈球菌1451≤0.25中間型消化鏈球菌1624≤0.25瘡皰丙酸桿菌792脆弱擬桿菌1118
脆弱擬桿菌18778脆弱擬桿菌1936B8多形擬桿菌14388產黑素擬桿菌1856/288產黑素擬桿菌27368普通擬桿菌12114嚙蝕擬桿菌18748共生梭桿菌14700.5壞死梭桿菌6054A≤0.25抗球蟲菌活性是A82810化合物的一個重要特性。例如，在針對纖細艾美球蟲(Eimeriatenlla)的體外培養(yǎng)篩選中，A82810在＜0.0025μg/ml時有活性，丙酰基-A82810在0.05μg/ml時有活性，乙?；?A82810在0.01μg/ml時有活性。
為了治療家禽的球蟲病，給感染或易受感染的家禽服用非毒性的抗球蟲菌有效量的A82810化合物，最好每天通過口服的方式給藥?？梢栽S多方式提供A82810化合物，但最方便的是與藥物上可接受的載體一起提供，優(yōu)選載體是由家禽攝入的飼料。雖然，在確定A82810化合物的合適濃度時必須考濾許多因素，但一般來說，在飼料中的給藥率在大約0.5至大約100ppm的范圍內，最好在大約1至大約25ppm的范圍內。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療球蟲病的組合物。在一組組合物中，包含有治療球蟲病有效量的A82810化合物及一種合適的載體。以前曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多化合物都對一種或多種聚醚抗菌素的抗球蟲病活性具有增效作用。例如，MauriceE.Callender和ThomasK.Jeffers(US4，218，438)公開了含有硝卡巴嗪或4，4′-二硝基對稱二苯脲(4，4′-dinitrocarbanilide)和聚醚抗菌素的抗球蟲菌組合物。
AlbertJ.Clinton和GeorgeO.P.O′Doherty發(fā)現(xiàn)，某些萘胺和苯胺對于某些聚醚抗菌素的抗球蟲菌活性具有增效作用(分別參見US4，764，534和US4，366，168)。LarryR.McDougald在US4，061，755中公開了一種莫能菌素和二氯二甲吡啶酚的抗球蟲菌組合物。
US2，731，382中記載了硝卡巴嗪和4，4′-二硝基對稱二苯脲。硝卡巴嗪是4，4′-二硝基對稱二苯脲和2-羥基-4，6-二甲基嘧啶的復合物，但單獨的4，4′-二硝基對稱二苯脲就表現(xiàn)有抗球蟲菌活性(參見Science122244，1955)。
本發(fā)明的A82810化合物也與這些類型的化合物表現(xiàn)出增效作用。因此，本發(fā)明的另一組組合物是增效組合物，它們包含有1)式1的A82810化合物或其藥物上可接受的鹽，并結合有2)一種由下述構成的一組中選擇出的化合物a)硝卡巴嗪b)4，4′-二硝基對稱二苯脲
c)式3的萘胺化合物其中R2是C1-C4烷基;
R2是鹵素，C1-C4氟代烷基，C1-C4氟代烷氧基或C1-C4氟代烷硫基;
R4是鹵素;
R5是氫或鹵素;
m是0、1或2;以及n是0或1;
前提是，如果存在有R4取代基，則它不位于2位;
d)下述的一種苯胺2，4-二硝基-N-〔4-(三氟甲氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺;2，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺或2，4-二硝基-N-〔4-(五氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺;
e)二氯二甲吡啶酚;或f)(a)-(e)化合物的藥物上可接受的鹽。
在式3中，C1-C4烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基等。
術語“鹵素”代表氟、氯、溴和碘。
C1-C4氟代烷基是具有一或多個氟原子的C1-C4烷基。這種氟代烷基包括三氟甲基、1，1，2，2-四氟乙基、五氟乙基、1，2，3，3-四氟丙基、九氟丁基等。
C1-C4氟代烷基基是具有一或多個氟原子的C1-C4烷氧基。這種氟代烷氧基包括二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-氟乙氧基、1，1，2，2-四氟乙氧基、五氟乙氧基、1，2，2，3，3-五氟丙氧基、七氟丙氧基、4，4，4-三氟丁氧基等。
C1-C4氟代烷硫基是具有一或多個氟原子的C1-C4烷硫基團。這種氟代烷硫基團包括三氟甲硫基、1，1，2，2-四氟乙硫基、五氟乙硫基、4，4，4-三氟丁硫基等。
優(yōu)選的式3化合物是m和n為O且R5為氫的那些化合物。
典型的式3化合物有4-氟-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
4-碘-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
4-三氟甲基-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
4-五氟乙基-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
6，7-二甲基-4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
2-異丙基-4-氯-N-〔3-氯-2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
8-正丁基-4-(4，4，4-三氟丁氧基)-N-〔3-溴-2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
3-甲基-6-丙基-4-七氟丙基-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
3，4-二氯-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
4-(1，1-二氟乙氧基)-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺和4-(1，1，2，2-四氟乙硫基)-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺。
在A82810化合物和化合物2(a)-(e)的組合物中，各組分的用量要足以在結合起來時能對對抗至少一種導致球蟲病的生物有增效作用。一般說來，在組合物中的最大用量與用單個組分作抗球蟲菌治療的最大用量相同。低限一般小于用單個組分治療時所需的量。因此，實施本發(fā)明的組合物一般含有1)從大約0.5至大約100ppm的一種A82810化合物，以及2)a)從大約5-125ppm的硝卡巴嗪，b)從大約25至大約150ppm的4，4′-硝基對稱二苯脲，c)從大約1至大約1000ppm的指定的萘胺，d)從大約1至125ppm的所指定的苯胺，或e)從大約20至大約70ppm的二氯二甲吡啶酚。A82810化合物與苯胺、萘胺或硝卡巴嗪一起給藥時特別有效。優(yōu)選的組合物含有從大約2至大約20ppm的A82810化合物及從大約5至大約80ppm的苯胺、萘胺或硝卡巴嗪。
A82810化合物的另一重要性質是能夠提高動物的飼料利用率。例如，A82810化合物能提高具有發(fā)育好的瘤胃功能的反芻動物的飼料利用率。利用ArthurP.Raun在US3，794，732(尤其參見實例5)中所述方法，能夠通過觀察瘤胃中丙酸酯化合物的生成和濃度而監(jiān)測飼料利用率。如果反芻動物以從大約0.02mg/kg/天至大約1.5mg/kg/天的量率口服A82810化合物，則此化合物對增加丙酸酯特別有效，并因此提高飼料利用率。優(yōu)選的給藥量率為從大約0.05mg/Kg/天至大約0.5mg/Kg/天。
優(yōu)選的給藥方法是將化合物與動物飼料混合;但也可以以其他方式給藥，例如作為片劑、浸液、大九劑或膠囊給藥。這些不同劑量形式的配制可通過獸醫(yī)藥學領域的公知方法完成。每種單獨的劑量單位所含本發(fā)明化合物的量應當直接相關待治療動物的合適的每日劑量。
本發(fā)明進一步涉及用以提高飼料利用率的飼料組合物，它含有定量飼料和2-40克/噸的A82810化合物。
在另一方面，A82810可用于治療豬痢疾。A82810在低至1.56μg/ml的水平時，仍可抑制豬痢疾密螺旋體(Treponemahyodysenteriae)的生長，它是導致豬痢疾的病原體。對于豬的優(yōu)選給藥方法是將適量的A82810化合物摻入定量飼料或飲用水中。合適的用量與是用來治療還是用來預防感染有關。一般說來，預防感染所需活性化合物的濃度低于消除已感染動物的疾患所需的濃度。通常每噸飼料中A82810化合物的含量在從大約20至大約100克的范圍內就能有效地預防感染。對于治療已患有痢疾的豬來說，推薦的用量為每噸飼料中含有從大約100至大約500克A82810化合物。這些用量提供了大約1至大約5mg/公斤體重/天(預防處理)或大約5至大約25mg/公斤體重/天(治療已感染的動物)。如果是加至飲水中，推薦的用量是每加侖水含大約0.04至大約0.2克(預防)或大約0.2至大約1克(治療)A82810化合物。
本發(fā)明進一步涉及用于治療豬痢疾的飼料組合物，它包括豬的定量飼料和用于此目的有效量的A82810化合物。正如前面所討論的，典型的有效量是每噸飼料含有大約20至大約500克A82810化合物。
如前面所述，A82810具有抗厭氧細菌的活性，包括產氣莢膜梭菌。因此，A82810化合物應當能夠用來治療或預防雞、豬、牛和羊的腸炎。A82810化合物還可用于治療反芻動物的腸原性毒血癥。
A82810化合物還具有抗病毒活性。例如，組織培養(yǎng)測定表明，A82810在低至1.56μg/ml的水平具有抑制單型皰疹病毒(HSVⅠ和Ⅱ)的活性，在低至0.04μg/ml的水平具有抑制Friend白血病病毒的活性。在其他的組織培養(yǎng)測定中，A82810在低至250μg/ml的水平具有抑制大湖(GreatLakes)和巴西(Brazil)流感病毒的活性。
此外，A82810化合物還具有某些抗蠕蟲活性。例如，在體外研究中，以50ppm的濃度給A82810的鈉鹽時，72小時后測量發(fā)現(xiàn)它能抑制Caenorhabditiselegans(抑制率85%)。
A82810化合物可通過口服或非腸道途徑給動物服用。它們還可通過吹入法給藥，即將藥粉形式的抗菌素吹入飼養(yǎng)動物或家禽所在的封閉空間或房間中。動物或家禽吸入空氣中的藥粉;通過眼睛，藥粉也可被攝入體內(此方法稱為眼內注射法)。
最實用的A82810化合物的給藥途徑是將其配制于飼料中。許多種飼料都可使用，包括常見的干飼料、液態(tài)飼料和顆粒飼料。雖然優(yōu)選的給藥方法是將其混入動物飼料中，但也可通過其他途徑給藥，例如作為片劑、獸用頓服藥、大九劑或膠囊給藥。每種單獨的劑量單位所含A82810化合物的量應當直接相關于待治療動物的合適的每日劑量。
將藥物配制于動物飼料中的方法是眾所周知的。優(yōu)選的方法是制備濃縮的藥物預混合物，然后用它制備藥物飼料。因此，本發(fā)明的一個方面是一種動物飼料預混合物，它含有1)作為活性組分的A82810化合物或2)結合有一或多種農學上可接受的載體的A82810增效組合物(見上)。典型的預混合物為每磅預混合物可含有大約1至大約200克的藥物。預混合物可以是液態(tài)或固體制劑。
動物或家禽飼料的最終配制是根據(jù)給藥量進行的。可使用常規(guī)的配制、混合和顆粒飼料制備法來制備含有A82810化合物的飼料。
根據(jù)獸醫(yī)學領域公知的方法，可將A82810化合物配制成非腸道給藥制劑。含有A82810化合物的有效的可注射組合物可以是懸浮液或溶液形式。呈溶液形式時，A82810化合物被溶于生理上可接受的載體中。這種載體包括合適的溶劑、防腐劑如苯甲醇(如果需要)以及緩沖劑。可用的溶劑包括，例如，醇類、二醇類、或惰性油類如植物油或高度精煉的礦物油類。
可注射的懸浮液組合物是利用化合物的非溶劑和作為載體的佐劑制備的。非溶劑可以是(例如)水或二元醇如聚乙二醇。
生理上可接受的合適佐劑是必需的，以維持化合物懸浮在懸浮液組合物中。佐劑可以從增稠劑中選擇，例如羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。許多表面活性劑也可用于懸浮化合物。卵磷脂、烷基苯酚聚環(huán)氧乙烷加成物、萘磺酸酯、烷基苯磺酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酯都可用于將藥劑懸浮在液態(tài)非溶劑中。
許多影響液體非溶劑的親水性、密度和表面張力的物質都能在不同情況下協(xié)助制備可注射的懸浮液。例如硅酮消泡劑、二醇類、山梨醇和糖類都可用作助懸劑。
在制備吹入法使用的粉塵劑時，通常使化合物與作為佐劑的滑石、硅藻土或其他惰性物質混合。
A82810化合物還可作為殺蟲劑使用。例如，A82810在低至100ppm的濃度時具有抗南方粘蟲、葉螨、麗蠅幼蟲的活性，在低至50ppm的濃度時具有抗成年廄蠅的活性。
下面提出一些實例以進一步說明本發(fā)明。
實例1A82810的制備A.A82810的搖瓶發(fā)酵用冷凍干燥顆粒狀的或保存在液氮中的懸浮液形式的纖維馬杜拉放線菌新種NRRL18348為種子培養(yǎng)基接種，該培養(yǎng)基具有如下組成種子培養(yǎng)基Ⅰ成分含量(%)葡萄糖1.0可溶性淀粉2.0酵母膏0.5酷蛋白的酶促水解物＊0.5
CaCO30.1去離子水加至1升未調節(jié)的pH＝6.6;滅菌前加入NaOH將pH提高至7.2;
滅菌后pH＝6.8。
＊NZ Amine A，Sheffield Chemical Co.，Norwich N.Y.
在種子培養(yǎng)基中加入2%瓊脂制成斜面或平板。使接過種的斜面在30℃下保溫大約10至大約14天。用無菌工具刮下成熟的斜面培養(yǎng)物，疏松孢子，取出菌絲層并使之縐片。利用大約四分之一的疏松孢子和培養(yǎng)物對50ml第一級種子培養(yǎng)基接種。
將裝在250ml三角瓶中的接過種的第一培養(yǎng)基于30℃下保溫大約120小時，三角瓶置于在兩英吋(5.08cm)圓圈中以250rpm旋轉的搖床中。
用此培養(yǎng)好的第一級培養(yǎng)基(0.4ml)對50ml生產培養(yǎng)基接種，它具有下列組成生產培養(yǎng)基Ⅰ成分含量(/L)葡萄糖5.0g酷蛋白的酶促水解物＊3.0g酵母膏5.0g廢糖蜜15.0g
MgSO4(無水) 1.0gCaCO32.0g土豆糊精25.0g油酸甲酯20.0ml冷自來水加至1升(滅菌前用5NNaOH調至pH至7.0)＊NZ Amine A將裝在250ml寬口三角瓶中的接過種的生產培養(yǎng)基于30-32℃在搖床上培養(yǎng)8-10天，搖床在兩英吋圓圈中以250rpm旋轉。
B.A82810的罐式發(fā)酵為了提供大量接種物，利用10ml部分A制備的培養(yǎng)過的第一級培養(yǎng)基對400ml第二級生長培養(yǎng)基接種，其組成和第一級培養(yǎng)基一樣。使此裝在2升寬口三角瓶中的第二級生長培養(yǎng)基于30℃在搖床上培養(yǎng)大約72小時，搖床在兩英吋圓圈中以250rpm旋轉。
用此培養(yǎng)好的第二級生長培養(yǎng)基(800ml)對115升無菌的生產培養(yǎng)基(如部分A所述制備，不同處在于加入了消泡劑)接種。使此接過種的生產培養(yǎng)基在165升攪拌式發(fā)酵罐中于34℃溫度下發(fā)酵8-10天。用低速氣流(0.12-0.25V/V/m)和低轉速攪拌(150-200rpm)使溶氧水平維持在空氣飽和度的40%以上。
實例2用實例1的方法生產A82810，不同處只是在部分B中1)第二級生長培養(yǎng)基的組成如下第二級培養(yǎng)基Ⅱ
成分含量(g/L)酵母膏5.0葡萄糖5.0土豆糊精10.0MgSO4·7H2O 2.0甘油1.0去離子水加至1升未調節(jié)的pH＝6.5;不進行PH調節(jié)，滅菌后pH＝6.4。
以及2)生產培養(yǎng)基具有如下組成生產培養(yǎng)基Ⅱ成分含量(g/L)葡萄糖10.0豬肝粉15.0廢糖蜜5.0MgSO4·7H2O 0.5土豆糊精25.0自來水加至1升未調節(jié)的pH＝6.1;用大約170ml5NNaOH調至7.0;滅菌后pH＝6.4。
加入消泡劑Sag471(0.2g/L)和p-2000(0.1ml/L)。
實例3
利用實例1的方法生產A82810，不同在于1)種子培養(yǎng)基如下種子培養(yǎng)基Ⅱ成分含量(g/L)胰蛋白酶(Trypticase)大豆湯30酵母膏3葡萄糖5麥芽糖4MgSO4·7H2O 2去離子水加至1升未調節(jié)的pH＝7.02)接過種的第一級培養(yǎng)基于36℃下培養(yǎng)48小時;2)接過種的第二級培養(yǎng)基于36℃下培養(yǎng)24小時;以及4)生產培養(yǎng)基體積是10升，培養(yǎng)溫度是36℃，組成如下生產培養(yǎng)基Ⅲ成分含量(g/L)土豆糊精30葡萄糖10酷蛋白的酶促水解物＊3酵母5廢糖蜜15
MgSO4(無水) 1CaCO32自來水加足1升未調節(jié)的pH＝6.3;用5N NaOH調PH至7.0;
滅菌后pH＝6.4。
加入消泡劑Sag471(0.2g/L)和p-2000(0.5ml/L)。
＊NZ Amine A實例4A82810的分離將按與實例1和2所述方法類似的方法制備的2個100升罐的所有發(fā)酵液合并(215升)，利用一種助濾料(3%，HyfloSuper-Cel，ManvilleProductsCorp.，LompocCA93436)使其通過壓濾機過濾，以產生180升濾液。
用丙酮萃取菌絲體濾餅兩次(每次60升)。合并丙酮萃取液，在真空下將體積濃縮至大約18升。濃縮物與培養(yǎng)基濾液合并。用5N NaOH將此混合物的pH調至9，產生的溶液用2/3體積的乙酸乙酯萃取，攪拌1小時并冰凍過夜。分離乙酸乙酯萃取液(115升)，與少量助濾料混合并過濾。澄清的萃取液在真空下濃縮成殘渣。
此殘渣溶于甲苯(200ml)中，將此溶液加到用甲苯裝填的含有2升硅膠(GraceGrade，20-300目)的柱中。用甲苯(10升)洗滌柱子，用甲苯∶乙醇展開〔(98∶2)，(96∶4)和(90∶10)依次各用10升〕，按每份1升收集。
通過利用枯草芽孢桿菌的生物檢測法和紅細胞瓊脂平板的溶解來監(jiān)測A82810的洗脫過程。合并含有大部分A82810的組分(13-20號)，并濃縮至油狀。將此油狀物溶于二噁烷(200ml)中并冷凍干燥，得到了A82810粗制品，也為油狀物。
A82810粗品溶于氯仿(200ml)中，加到氯仿裝填的含有2升硅膠(GraceGrade62，20-300目)的柱中。用氯仿(10ml)洗滌柱子，用氯仿∶丙酮展開〔(9∶1)、(4∶1)(7∶3)和(1∶1)依次各用10升〕，再用丙酮展開(10升)，按每份1升收集。
通過生物檢測來檢測組分的洗脫，根據(jù)生物檢測結果如下述合并組分6-9號(合并液A)，10-18號(合并液B)和19-28號(合并液C)。每種合并液都濃縮至殘渣，然后溶于二噁烷中冰冷干燥。合并液A和C產生油狀物質需要進一步純化，而合并液B則產生9.9克作為白色粉末的A82810。
合并液A溶于丙酮中(900ml)并加至水中(1升)。用5NNaOH將溶液pH調至9.0，將溶液體積在真空下濃縮至大約1升。濃縮物用甲苯萃取兩次，濃縮合并的萃取液，在二噁烷中冰冷干燥，又產生2.8克作為白色粉末的A82810。
以同樣方式處理合并液C，但在冰凍干燥后仍然呈油狀。將油狀物質溶于乙晴(50ml)中立即便有晶體形成。使晶體過濾，在真空下干燥，又產生1224mg作為鈉鹽的純A82810(熔點173-175℃)。
實例5A82810鈉鹽的結晶
通過在試管中的聲處理，使無定形A82810鈉鹽(400mg)懸浮于己烷(50ml)中，然后將其在室溫下放置。取出在試管壁上形成的結晶，真空干燥后產生50mg純A82810的鈉鹽(熔點225-257℃)。
圖2給出了在CHCl3中的紅外分析結果，圖中顯示了在下列頻率(cm-1)處有最大吸收3020、2970、2952、2936、2679、1570、1458、1393、1380、1363、1359、1163、1115、1093、1075、1067、1054、1027、1010、1001、990、979和940。
場解吸(FD)質譜圖6。
實例6A82810(游離酸)的制備將按實例4所述方法得到的A82810鈉鹽(200mg)溶于二噁烷(75ml)中。在此溶液中加入25ml水;通過加入1NHCl將所得溶液的pH調至3。此酸化溶液攪拌1小時，然后用氯仿萃取兩次(每次100ml)合并氯仿萃取液，在真空下濃縮產生A82810的游離酸。
實例7乙?；?A82810的制備將200mg A82810的鈉鹽溶于4ml吡啶中;加入4ml乙酸酐;使混合物于室溫下放置40小時。加入10ml水，用50ml氯仿萃取水溶液。用0.1N HCl、含有1%NaHCO3的水和水各50ml依次洗滌氯仿萃取液。然后使氯仿萃取液在真空下濃縮成殘渣，將殘渣溶于丙酮中。在真空下濃縮丙酮溶液以除去殘留的吡啶和乙酸。這一步驟重復三次，得到的殘渣溶于苯中，冷凍干燥后得到204ml乙?；?A82810的鈉鹽。
通過快原子轟擊質譜(FABMS)分析，分子量＝906。
圖3給出了在CHCl3中的紅外光譜，圖中在下述頻率(cm-1)顯示了最大吸收3021、2976、2935、2880、2831、1728、1458、1379、1357、1321、1314、1247、1226、1223、1201、1185、1101、1094、1076、1056、1024、990、981、947、929、896和875。
實例8丙?；?A82810的制備200mgA82810的鈉鹽溶于4ml吡啶中;加入4ml丙酸酐;使混合物于室溫下放置44小時。加入10ml水，用50ml氯仿萃取溶液。依次用0.1N HCl、含有1%NaHCO3的水和水各50ml洗滌氯仿萃取液。氯仿萃取液在真空下濃縮成殘渣，將殘渣溶于100ml丙酮中。在真空中濃縮丙酮溶液以除去殘留的吡啶和丙酸。此步驟重復三次。使殘渣溶于苯中，冷凍干燥后得到油狀丙酰基-A82810的鈉鹽。
將油狀物質溶于5ml乙晴中，然后加到用乙晴裝填的含有20ml硅膠(Woelm，100-200μm)的柱中。用100ml乙晴洗滌柱子，用乙晴∶丙酮展開〔(9∶1)、(4∶1)、(7∶3)和(1∶1)依次各用100ml〕，最后用100ml丙酮展開，按每份25ml收集。
通過硅膠薄層層析監(jiān)測洗脫過程，薄層層析用乙晴∶丙酮(1∶1)展開，然后用香子蘭醛-H2SO4噴霧進行檢測。合并含有大部分丙酰基-A82810鈉鹽的組分(13-23號)，在真空中濃縮成殘渣。將殘渣溶于二噁烷中，冷凍干燥后得到47ml所需酯。
通過FDMS分析，分子量＝920。
圖4給出了在CHCl3中的紅外光譜，圖中顯示在下列頻率(cm-1)具有最大吸收2975、2971、2935、2879、2831、1571、1457、1398、1380、1364、1359、1321、1237、1225、1216、1213、1191、1163、1116、1093、1076、1068、1054、1027、1010、1001、990、980、945、940、929和861。
實例9-11利用實例7-8的方法能夠制備下述A82810的酯衍生物正庚?；?A82810戊酰基-A82810叔丁?；?A82810實例12A828104-溴苯基脲烷衍生物的制備200mgA82810的鈉鹽溶于25ml苯中，在攪拌下加入在25ml苯中的225mg4-溴苯基異氰酸酯。加入一滴三乙胺，混合物在室溫下攪拌160小時。通過過濾分離形成的沉淀，濾液冷凍干燥后得到400mgA828104-溴苯基脲烷衍生物(鈉鹽)。
通過場解吸質譜(FDMS)分析，分子量＝1061。
圖5給出了在CHCl3中的紅外光譜，圖中顯示在下列頻率(cm-1)具有最大吸收2969、2935、2879、2830、1727、1589、1570、1517、1489、1460、1399、1379、1363、1344、1316、1306、1287、1265、1247、1238、1216、1211、1192、1163、1146、1116、1102、1093、1075、1068、1054、1025、1009、1000、990、979、943、923和861。
實例13-22利用實例12的方法能夠制備下述A82810的脲烷衍生物A828104-氯苯基脲烷A828104-硝基苯基脲烷A828104-甲基苯基脲烷A82810苯基脲烷A828104-碘苯基脲烷A828104-氟苯基脲烷A82810環(huán)己基脲烷A828102-苯乙基脲烷A828102-(苯基)環(huán)丙基脲烷A828104-苯氧苯基脲烷實例23A82810甲基醚衍生物的制備將酸形式A82810溶于甲醇中;加入1/2體積的水。使溶液靜置，直至形成醚衍生物為止。使溶液在真空下蒸發(fā)。產品通過(例如)硅膠層析后得到A82810甲基醚衍生物。
實例24-26利用與實例23相同的方法和合適的醇或硫醇，能夠制備下述A82810的醚衍生物
A82810正丙基醚衍生物A82810甲基硫醚衍生物A82810正丁基醚衍生物實例27A82810的層析鑒別1.薄層層析吸附劑硅膠層開系統(tǒng)乙晴∶丙酮(1∶1)檢測枯草芽孢桿菌Rf＝0.25(在此系統(tǒng)中，A82810的Rf值大約為0.44，用香子蘭醛噴霧檢測)。
2.高效液相層析吸附劑WatersμBondapakC18(4×300mm柱)溶劑系統(tǒng)CH3CN∶H2O(9∶1)含有1%HOAC檢測折射計流速3.0ml/分保留時間5.37分aa為了比較，A80190在此系統(tǒng)中的保留時間約為4.65分鐘。
實例28增效組合物的抗球蟲菌活性新孵化出的小雞在無球蟲菌的環(huán)境中飼養(yǎng)7天。在第8天的上午，稱重小雞，并分成不同的處理組。
在實驗期間，每組小雞(每組通常4或5只小雞)都關在一套籠子里。對每套籠子內的小雞都提供預計的恒定光照、飼料的任意攝取(每個實驗都包括非藥物和藥物處理)和水。實驗開始后兩天，對要進行感染的小雞用球蟲卵囊的純懸液作嗉囊插管。每次試驗所用的卵囊劑量要能夠在未用藥物處理的動物中產生球蟲病的臨床癥狀。
使小雞再生長7天后終止實驗。稱量每組小雞，測定每組消耗掉的飼料量。由這些測量計算出小雞的最終重量和飼料利用率。然后處死所有的小雞，檢查腸和盲腸，看是否存在有球蟲誘導的損傷。
某些試驗還包括測定卵囊的產生。進行這種測定時，在卵囊脫落期間收集每組小雞所產生的糞便。然后稀釋糞便，用血細胞計數(shù)器計數(shù)卵囊。此測定用來表明此寄生蟲在小雞內的繁殖能力，并因此對于藥物控制動物感染的能力提供準確的測定。
表Ⅵ-ⅩⅩⅣ總結了用本發(fā)明的增效組合物以此方式測試時觀察到的結果。
(接下頁)
表Ⅵ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲(Eimeria acervulina)株59和纖細艾美球蟲株1551的抗球蟲活性總損傷等級82810(ppm)苯胺(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.001.012.110.78.45.4412.47.66.34.03.5810.96.83.73.62.51210.46.24.92.14.31610.86.53.61.00.5體重增加，控制百分比A82810(ppm)苯胺(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.006760818592475819896978688489101101127393939291167686979497
1球蟲的離子載體敏感株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅶ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株FS-316和纖細艾美球蟲株FS-4561的抗球蟲活性總損傷等級A82810(ppm)苯胺(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.009.78.79.37.79.649.68.37.26.54.387.95.97.53.63.3126.53.63.52.02.0164.22.91.61.51.1體重增加，控制百分比A82810(ppm)苯胺(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.00898789959349089899398
894879495981288969590951687949490931球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅷ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株FS-316和纖細艾美球蟲株FS-4561的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.00808177858087688868389107786889192127589889191147088888790腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)2
08.12.33.33.01.285.92.91.11.31.2104.81.71.40.72.6125.92.01.10.40.5144.51.51.32.01.4盲腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2.5 3.0 3.5 4.003.33.22.93.23.083.33.13.43.33.1103.23.32.82.63.0123.13.32.92.72.8142.83.12.83.62.01球蟲的離子載體抗性株22·4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅸ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株FS-316和纖細艾美球蟲株FS-4561的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)
化合物(ppm)20 4 5 608987959816918989861891908987208491868722888984852485928584腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 4 5 605.32.81.31.7162.3000181.1000201.8000223.0000240.8000盲腸損傷的平均等級A82810(PPm)
化合物(ppm)20 4 5 603.23.22.33.2162.91.00.80.6183.00.40.50.5202.91.20.80.6222.61.20.40.5241.60.81.60.31球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅹ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株FS-3161的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.0069727373764747571768387181808179
128283878487167587828490腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 0.5 1.0 1.5 2.008.57.37.87.98.846.97.18.47.56.588.46.47.35.94.3126.35.34.82.40.3165.80.10.90.10.11球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅺ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲(Eimeria maxima)株FS-1771的抗球蟲活性腸損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.0
04.03.73.683.80.42.5123.91.30.8163.301.1體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.00697992877918812848886168794871球蟲的離子載體敏感株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表Ⅻ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-1771的抗球蟲活性腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 10
03.41.90.60.282.6122.20.10.30.5162.30.10.30.1體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 100105107108102879128811110510116102114107911球蟲的離子載體敏感株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅢ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株LIT-6261的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.75 2.0
098991021019489497949995109995929797129394899795149895939294腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.75 2.004.03.73.34.03.382.51.53.70.32.0103.50.91.03.41.2121.82.91.82.10.8143.81.21.72.21.31球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅣ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-4101的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(PPm)
化合物(ppm)20 2.5 3.0 3.5 4.00869088889189090929286109093948787128891969098149292899091腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2.5 3.0 3.5 4.003.83.83.13.52.283.82.81.32.81.7103.82.71.43.21.0123.70.80.70.31.1143.31.41.2001球蟲的離子載體抗性菌22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅤ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-4101的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.75093938291990959894109492988911879694951284919192腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.7504.04.03.33.894.02.43.83.6103.82.22.32.8113.71.62.52.6124.03.13.02.31球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅥ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-4101的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 4 5 606574748116719388881876908289208190839022798987872483868082腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 4 5 603.34.04.04.0164.00.500.7183.1000.2203.40.500223.7000.2242.600.30
1球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅦ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-4101的抗球蟲活性損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1003.92.32.72.483.3122.92.11.41.1162.41.91.10.8體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1006585898886812599088851674907983
卵囊生成的降低百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1000181836841201239591603573781球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅧ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-4101的抗球蟲活性腸損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.004.04.04.084.01.52.3123.92.30.9163.30.61.1
體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.008987898919510012959699169392961球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅨ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲H&C和纖細艾美球蟲Wis1的抗球蟲活性腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1006.21.20.40.386.0125.11.000.4164.70.40.50.1
體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 10065989180862126495907616699790651球蟲的離子載體敏感株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅩ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株FS-273和纖細艾美球蟲株FS-4561的抗球蟲活性損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1008.97.23.72.089.4128.44.91.21.2168.01.62.00.9
體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 1006368898687012728692821674958983卵囊生成的降低百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 2 6 10002265838171218849410016209599991球蟲的離子載體抗性株22，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺表ⅩⅩⅠ.單獨和結合使用A82810對未感染小雞生長的影響體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.75 2.00-981011059981001001039810210101102989710012949810297971498999910096表ⅩⅩⅡ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株59和纖細艾美球蟲株1551的抗球蟲活性總損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.0011.58.94.5411.23.71.988.72.20.8125.01.30.8164.41.30.3
體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.007093974809210587810198128093921692921021球蟲的離子載體敏感株24-氯-N-〔2，4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺表ⅩⅩⅢ.單獨和結合使用A82810針對大艾美球蟲株FS-1771的抗球蟲活性腸損傷等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.003.93.53.343.83.10.883.81.31.5
123.21.00.3161.00.50.5體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.5 2.0087991004879598880889712858893168487861球蟲的離子載體敏感株24-氯-N-〔2、4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺表ⅩⅩⅣ.單獨和結合使用A82810針對聚集艾美球蟲株59和纖細艾美球蟲株1551的抗球蟲活性體重增加，控制百分比A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.75
07087308247379848386694918812728487851667767970腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.7506.06.03.62.346.23.73.43.186.91.30.30.4126.60.52.10.3163.81.800.8盲腸損傷的平均等級A82810(ppm)化合物(ppm)20 1.25 1.5 1.7503.23.22.62.042.92.92.82.683.52.62.31.6
123.01.81.40.7162.91.70.90.51球蟲的離子載體敏感株24-溴-N-〔2、4-二硝基-6-三氟甲基)苯基〕-1-萘胺實例29控制球蟲病的含有A82810的雞飼料根據(jù)下述配方制備用以使雞快速生長的平衡的高能飼料成分%磅碾碎的黃玉米501，000精磨大豆粉，溶劑提取的去殼的50%蛋白質31.09621.8動物脂肪(牛脂)6.5130干魚粉，具有可溶物(60%蛋白)5.0100玉米酒糟4.080磷酸二鈣，飼料級1.836碳酸鈣0.816維生素預混合物(具有維生素A、D、E、K和B12膽堿、煙酸、泛酸、核黃素、生物素、用葡萄糖作為膨脹劑)0.510微量礦物質預混合物(含有MnSO4、ZnO、KI、FeSO4、CaCO3) 0.2 42-氨基-4-羥基丁酸(蛋氨酸的羥基類似物)0.12A82810(鈉鹽)0.010.2根據(jù)標準的飼料混合技術使這些物質混合。飼喂這種飼料的雞再加上水的隨意飲用，可保護其不受球蟲病的影響;而體重增加與喂以未加藥物的同樣飼料的無球蟲病小雞差不多。
實例30-32控制球蟲病的A82810增效的雞飼料組合物如實例29所述制備雞飼料，但是用下述A82810的增效結合物作為活性組分組分ppmA828100.25-102、4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺4-24組分ppmA828100.25-104-氯-N-〔2、4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺4-24組分ppmA828100.25-104-溴-N-〔2、4-二硝基-6-(三氟甲基)苯基〕-1-萘胺4-24實例33含有A82810的改善的肉牛飼料如下述制備平衡的高糧肉牛飼料成分%磅精磨玉米67.81356碾碎的玉米穗軸10200脫水苜蓿粉，17%蛋白5100去殼大豆粉，溶劑提取的，50%蛋白9.9956199.912
甘蔗糖蜜5100.0脲0.612.0A82810(Na鹽) 0.0044 0.088磷酸二鈣，飼料級0.510.0碳酸鈣0.510.0氯化鈉0.36.0微量礦物質預混合物0.030.6維生素A和D2預混合物＊0.07 1.4維生素E預混合物＊＊0.05 1.0丙酸鈣0.153.0＊每磅含有2，000，000國際單位維生素A;227，200國際單位維生素D2和385.7克大豆飼料，加有1%油。＊＊具有可溶物的干玉米酒糟，每磅含有20，000國際單位的d-α-乙酸生育酚酯將混合飼料制成丸。如果每只動物平均每天攝入15磅飼料，則此飼料將為每只動物每天提供大約300mg的A82810(鈉鹽)。
實例34A82810改進的豬飼料如下述制備平衡的豬產仔飼料成分%磅/噸碾碎的黃玉米65.101302去殼的大豆油粉，溶劑提取的18.50370干的甜菜果肉10.00200磷酸二鈣2.9058碳酸鈣1.2024豬維生素預混合物11.10 22
鹽(NaCl)0.5511氯化膽堿，25%0.357微量礦物質預混合物20.15 3維生素A預混合物30.10 2蛋氨酸的羥基類似物0.051總計100.0020001 每公斤預混合物含有77，161usp單位維生素D2;2，205國際單位維生素E;441mg核黃素;1，620mg泛酸;2，205mg煙酸;4.4mg維生素B12;441mg維生素K;19，180mg膽堿;110mg葉酸;165mg吡哆醇;110mg硫胺素;22mg生物素。
2每公斤預混合物含有50克硫酸錳形式的錳;100克碳酸鋅形式的鋅;50克硫酸亞鐵形式的鐵;5克氧化銅形式的銅;1.5克碘化鉀形式的碘和最多150克而最少130克的碳酸鈣形式的鈣。
3每公斤預混合物含有6，613，800usp單位的維生素A。
為了制備200磅這種飼料，如下制備預混合物將10克A82810加至少量溶劑提取的大豆飼料中，在研缽中用研棒磨碎，再加入溶劑提取的大豆飼料將研碎的混合物稀釋至一磅。然后將此預混合物加到200磅上述豬飼料中，通過標準技術混合。在這種加有藥物的飼料中，每噸飼料基質中含有100克A82810。用此藥物飼料在產仔前至少喂養(yǎng)母豬一天，優(yōu)選喂養(yǎng)七至十天，在產仔后的喂養(yǎng)時間長短視需要而定。
改變預混合物中A82810的數(shù)量和/或飼料基質的數(shù)量，制備出大量或少量具有不同A82810水平的藥物飼料。
喂養(yǎng)母豬的比率為每100磅飼料1.0至10克A82810。藥物飼料和水是可以隨意攝取的。通常，母豬每天大約消耗6-8磅飼料。
實例35用于豬仔的A82810制劑A82810溶于少量乙醇中。將此乙醇溶液懸于聚乙二醇200中。濃縮懸浮液，使每單位劑量的體積為大約0.5-2ml。將這種懸浮液以每磅0.5-50mg的比率喂給幼豬，每天3次通過管飼法進行。
實例36控制豬痢疾的改進飼料利用下述組分通過標準方法制備預混合物成分含量(g/Kg)活性化合物150.0硅酸鈣20.0碳酸鈣(牡蠣殼粉)830.0總重1000g利用標準的飼料混合技術，將此預混合物加至市售豬飼料中，得到的最終濃度為大約100克活性化合物/噸飼料。
權利要求
1.一種制備下述化合物的方法式1的抗菌素A82810
其中，R是氫；或它的一種衍生物，其中R是-CONHR1，R1是烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、鹵代芳基、硝基芳基、鹵代芳烷基烷氧芳基、芳氧芳基、芳基環(huán)烷基、酰基芳基和環(huán)烷基；或其?；蛲榛?；或烷基醚衍生物；或其鹽，其特征在于該方法包括在深層通氣發(fā)酵的條件下，在含有可同化碳源，氮源和無機鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)纖維馬杜拉放線菌(Actinomadura Fibrosa)新種NRRL18348，或其生產A82810的突變體，以制備抗菌素A82810；并且，如果需要的話，還可任意地鹽化、酯化、酰基化、形成其醚衍生物，或使之與式R1-NCO的異氰酸酯反應。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于制備抗菌素A82810或其農學上可接受的鹽。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于制備抗菌素A82810。
4.纖維馬杜拉放線菌新種NRRL18348的生物學純培養(yǎng)物，或其產生A82810的突變體。
5.一種抗球蟲菌的組合物，其特征在于它含有如權利要求1-3中任一項所定義的A82810，以及從由下列構成的一組物質中選擇出第二組分;a)硝卡巴嗪，b)4、4′-二硝基對稱二苯脲，c)結構式如下的苯胺
其中R2是C1-C4烷基;R3是鹵素、C1-C4氟代烷基，C1-C4氟代烷氧基或C1-C4氟代烷硫基;R4是鹵素;R5是氫或鹵素;m是0、1或2;以及n是0或1;前提是，如果存在有R4取代基，則它不在2位;d)由下述選擇出來的苯胺2，4-二硝基-N-〔4-(三氟甲氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺、2，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺或2，4-二硝基-N-〔4-(五氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺;e)二氯二甲吡啶酚;或f)(a)-(e)化合物的藥物上可接受的鹽;存在于飼料中的各組分的數(shù)量在結合起來時至少對對抗一種導致球蟲病的艾美球蟲株有增效作用。
6.如權利要求5的抗球蟲菌組合物，它含有作為活性成分的A82810，或其農學上可接受的鹽，以及2，4-二硝基-N-〔4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基〕-6-(三氟甲基)苯胺或其農學上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的聚醚抗菌素A82810，它的?；屯榛ァ⑼榛押碗逋檠苌锛捌潲}類，它們可作為抗菌和抗球蟲劑使用，并能提高動物的飼料利用率。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)纖維馬杠拉放線菌(Actinomadura Fibrosa)新種NRRL18348制備A82810的方法，及制備A82810化合物與硝卡巴嗪、4，4′-二硝基對稱二苯脲、某種萘胺和苯胺化合物及二氯二甲吡啶酚的增效組合物的方法。
文檔編號C12P17/18GK1038838SQ89104280
公開日1990年1月17日 申請日期1989年5月2日 優(yōu)先權日1988年5月2日
發(fā)明者羅伯特·L·哈米爾, 姚慈晃 申請人:伊萊利利公司