本發(fā)明屬于畜牧業(yè)動物營養(yǎng)技術(shù)研究領(lǐng)域，涉及一種以丁酸梭菌為飼料添加劑的飼料配方，更具體的說是一種改善斷奶仔豬腸道屏障功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子含量、D-乳酸（D-lactic）和二胺氧化酶（DAO）等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道是食物在體內(nèi)消化吸收的主要場所，同時也是重要的免疫器官。腸道處在機(jī)體與外界接觸的第一線，是病原微生物侵入體內(nèi)的主要通道，腸粘膜屏障是組織機(jī)體受病原微生物的感染，調(diào)節(jié)新陳代謝，維持內(nèi)外環(huán)境平衡的關(guān)鍵。機(jī)械屏障是一種重要的腸黏膜屏障，由腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接等構(gòu)成，而腸上皮細(xì)胞的機(jī)械屏障是黏膜屏障基礎(chǔ)，緊密連接蛋白在加強(qiáng)細(xì)胞間連接，減小細(xì)胞間間隙，保護(hù)細(xì)胞和黏膜完整性中具有重要作用。腸黏膜屏障能夠阻止消化道內(nèi)有害大分子入侵，保證機(jī)體選擇性吸收小分子物質(zhì)。因此，腸黏膜屏障在維持腸道正常生理功能方面起著關(guān)鍵作用。
抗生素類生長促進(jìn)劑在飼料工業(yè)中的大量使用導(dǎo)致諸多問題出現(xiàn)，如病原菌產(chǎn)生耐藥性、動物免疫機(jī)能下降、體內(nèi)菌群失調(diào)、畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留等。近年來，畜牧業(yè)養(yǎng)殖在保障動物健康、促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率等方面越來越得到重視，飼料添加劑的研究正在向著無殘留、無耐藥性和對人類健康和環(huán)境無危害的方向發(fā)展。丁酸梭菌具有耐熱、耐酸和耐多種抗生素等生物學(xué)特性，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、產(chǎn)生益生物質(zhì)、提高機(jī)體免疫力及促進(jìn)動物生長，同時具有無污染、無有害殘留等特點，逐漸成為熱門的抗生素替代品之一。雖然我國農(nóng)業(yè)部已于2009年7月批準(zhǔn)了丁酸梭菌制劑作為微生物飼料添加劑的使用，但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動物飼料，而在仔豬上應(yīng)用的相關(guān)報道還不多見。
仔豬斷奶是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一個重要階段，斷奶應(yīng)激是仔豬出生后經(jīng)受的最大應(yīng)激，由于生理、飼料和環(huán)境的改變常常造成仔豬腸消化系統(tǒng)損傷及菌群失衡等，因此仔豬腸道健康的營養(yǎng)調(diào)控這一領(lǐng)域的創(chuàng)新性有待于提高。通過在日糧中添加丁酸梭菌我們研究了一種調(diào)節(jié)改善仔豬腸道屏障功能的配合飼料，以此來改善仔豬腸道發(fā)育和健康的營養(yǎng)調(diào)控，會在一定程度上提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是公開了一種調(diào)節(jié)仔豬腸道屏障功能的配合飼料。
本發(fā)明的另一個目的是公開了所配制的飼料對斷奶仔豬腸道屏障功能調(diào)節(jié)的應(yīng)用效果。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容
一種調(diào)節(jié)仔豬腸道屏障功能的配合飼料，其特征在于在飼料原料中使用丁酸梭菌飼料添加劑，進(jìn)行合理配制日糧，由下述重量份數(shù)的原料組成：
玉米61—65 豆粕15—20 乳清粉3—6
魚粉5—10 葡萄糖1-3 酸化劑0.1-0.5
磷酸氫鈣0.5-1 石粉0.5-1 食鹽0.1-0.5
L-賴氨酸鹽酸鹽0.1-0.5 DL-蛋氨酸0.1-0.5 蘇氨酸0.1-0.5
仔豬預(yù)混料1-4 丁酸梭菌0.001-0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）
其中所述的仔豬預(yù)混料是指每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發(fā)明所述酸化劑指的是安徽華揚(yáng)農(nóng)牧科技有限公司產(chǎn)品，主要成分是乳酸、正磷酸、檸檬酸、富馬酸、甲酸。
本發(fā)明所述的斷奶仔豬配合飼料的制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進(jìn)行稱量，在小型混合機(jī)中混勻即可。
本發(fā)明一個優(yōu)選的配方：
玉米63.2豆粕19乳清粉4.8
魚粉8.4葡萄糖1酸化劑0.3
磷酸氫鈣0.6 石粉0.7食鹽0.3
L-賴氨酸鹽酸鹽0.3 DL-蛋氨酸0.1蘇氨酸0.1
仔豬預(yù)混料1 丁酸梭菌0.005（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）；
其中所述的仔豬預(yù)混料是指每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的配方：
玉米64.1豆粕18.5乳清粉4.9
魚粉7.2葡萄糖2 酸化劑0.3
磷酸氫鈣0.6石粉0.7 食鹽0.3
L-賴氨酸鹽酸鹽0.1 DL-蛋氨酸0.1蘇氨酸0.1
仔豬預(yù)混料1 丁酸梭菌0.006（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）；
其中所述的仔豬預(yù)混料是指每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了所配制的飼料對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的應(yīng)用效果。特別是對改善斷奶仔豬腸道黏膜發(fā)育等方面的應(yīng)用。本發(fā)明的斷奶仔豬配合飼料實驗結(jié)果表明：
日糧中添加丁酸梭菌后，顯著提高了緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)，顯著提高了血清中TNF-α和IL-10的分泌量，顯著降低了血清中D-lactin的濃度，血清中DAO的濃度也有下降趨勢，表明該飼料配方能有效提高仔豬腸道屏障功能。
為了更進(jìn)一步說明本發(fā)明的積極效果，提供如下的試驗方法及結(jié)果：
1．試驗動物及分組：
采用單因子試驗設(shè)計，選取體重6.95 ± 0.48 kg的健康杜×長×大三元雜交斷奶仔豬12頭，隨機(jī)分為2個處理，每個處理分為6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。每個處理組分別飼喂不同日糧：飼喂基礎(chǔ)日糧(NC)、飼喂基礎(chǔ)日糧+0.005%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g，試驗組）。丁酸梭菌為市售產(chǎn)品。
2．基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平：
根據(jù)NRC（1998）配制豬基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平如表1所示。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）
a 每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
b 根據(jù)NRC（1998）飼料成分表計算。
3．試驗規(guī)程：
試驗在一個商品萬頭豬場進(jìn)行，試驗期14天。飼喂、管理、免疫按豬場規(guī)定程序進(jìn)行。飼喂14天后，從每個處理的每個重復(fù)組中隨機(jī)選取1頭斷奶仔豬屠宰，屠宰前抽血，進(jìn)行血液指標(biāo)的分析，每個處理屠宰3頭仔豬，并取空腸腸段進(jìn)行緊密連接蛋白表達(dá)量的測定。整個試驗過程中觀察仔豬的健康狀況，記錄死、淘仔豬以及腹瀉、用藥情況。
4．測定指標(biāo)：
血液指標(biāo)的測定：每個處理隨機(jī)選3頭仔豬，屠宰前30min，前腔靜脈采血，4℃，4000g，15min離心，取上清，-20℃保存。采用生化法測定DAO，采用ELISA法測定TNF-α、IL-10和D-lactic?？漳c中緊密連接蛋白表達(dá)的測定：采血后處死，立即在無菌條件下打開腹腔，從空腸中段取5cm左右腸管，用PBS沖洗腸腔后分裝于凍存管中，分別標(biāo)號后即置于液氮中保存，用qPCR檢測Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)。
5．統(tǒng)計分析：
采用SAS統(tǒng)計軟件下的Compare Means模塊中的One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，并采用Duncan’s多重比較進(jìn)行組間差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著。
本發(fā)明公開的調(diào)節(jié)仔豬腸道黏膜的配合飼料在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用效果，主要包括：
（1）血清指標(biāo)：
由表2可知，丁酸梭菌：試驗組顯著提高了血液中TNF-α和IL-10的含量（P<0.05），分別比對照組提高了34.25%和27.23%，顯著降低了血液中D-lactic的濃度（P<0.05），比對照組降低了19.57%，DAO的濃度比對照組降低了13.07%。
表2 對仔豬血液指標(biāo)的影響
（2）腸粘膜屏障：
由表3可知，緊密連接蛋白mRNA水平表達(dá)：試驗組的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.01），試驗組中的Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量比對照組分別提高了59.00%、107.00%、59.00%。
表3 對腸道連接蛋白mRNA表達(dá)的影響
試驗結(jié)果表明：
日糧中添加丁酸梭菌后，顯著提高了顯著提高了Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA水平的表達(dá)量，表明該飼料配方能有效提高仔豬腸道屏障功能；
本發(fā)明對以丁酸梭菌為飼料添加劑的飼料配方進(jìn)行了安全性實驗，其方法如下：
（1）步驟：
材料和方法：選擇28日齡斷奶的杜×長×大仔豬6頭，臨床健康、發(fā)育正常，試驗期30天，試驗期內(nèi)隨時觀察中毒表現(xiàn)及死亡情況。
（2）飼喂的仔豬飼料原料組成：
玉米63.55、豆粕19.5、乳清粉4、魚粉7.4、葡萄糖2、酸化劑0.3、磷酸氫鈣0.5、石粉0.6、食鹽0.35、L-賴氨酸鹽酸鹽0.2、DL-蛋氨酸0.25、蘇氨酸0.15、仔豬預(yù)混料1.1、丁酸梭菌0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
結(jié)果：給斷奶仔豬飼喂上述試驗日糧，連續(xù)飼喂30天，未見明顯中毒現(xiàn)象，觀察期內(nèi)無死亡，尸檢中各主要臟器未見明顯異常。
（3）結(jié)論：斷奶仔豬日糧中添加0.01%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）飼喂仔豬，飼喂效果安全。
具體實施方式
通過以下實施例對本發(fā)明作一步說明，但不作為本發(fā)明的限制。本發(fā)明的實施例中所述的重量份數(shù)原料指的是克、公斤或噸，可根據(jù)生產(chǎn)實際的需要加以調(diào)整。本發(fā)明所用到的各種原料例如：磷酸氫鈣、石粉、食鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、DL-蛋氨酸、蘇氨酸、丁酸梭菌對外均有售；其中下面的產(chǎn)品均有市售：
酸化劑指的是安徽華揚(yáng)農(nóng)牧科技有限公司產(chǎn)品；
1%仔豬預(yù)混料購買于北京博農(nóng)利生物科技有限公司；
玉米指的是普通市售二級玉米；
豆粕指的是中糧集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；
乳清粉指的是天津市升騰飼料有限公司產(chǎn)品；
魚粉指的是進(jìn)口秘魯魚粉；
豆奶寶指的是天津市新概念生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；
次粉指的是河北永生食品有限公司產(chǎn)品；
葡萄糖指的是天津市升騰飼料有限公司產(chǎn)品；
丁酸梭菌指的是洛陽瑞萊生物工程有限公司產(chǎn)品。
實施例1
斷奶仔豬的配合飼料原料組成：
玉米62.48、豆粕18.5、乳清粉5、魚粉8.5、葡萄糖1.5、酸化劑0.2、磷酸氫鈣0.7、石粉0.63、食鹽0.34、L-賴氨酸鹽酸鹽0.25、DL-蛋氨酸0.3、蘇氨酸0.3、仔豬預(yù)混料1.2、丁酸梭菌0.001（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
其中所述的仔豬預(yù)混料是指每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進(jìn)行稱量，在小型混合機(jī)中混勻即可。
實施例2
斷奶仔豬的配合飼料原料組成：
玉米64.9、豆粕16、乳清粉5、魚粉8.6、葡萄糖1.5、酸化劑0.4、磷酸氫鈣0.65、石粉0.7、食鹽0.35、L-賴氨酸鹽酸鹽0.3、DL-蛋氨酸0.25、蘇氨酸0.25、仔豬預(yù)混料1、丁酸梭菌0.01（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。
其中所述的仔豬預(yù)混料是指每千克預(yù)混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進(jìn)行稱量，在小型混合機(jī)中混勻即可。
實施例3
采用斷奶仔豬的配合飼料飼喂斷奶仔豬的方法：
此系列配方適用28日齡斷奶仔豬，適用期為斷奶后30~45天，根據(jù)情況讓仔豬自由采食即可，必須提供充足的飲水，其他按正常的飼養(yǎng)管理進(jìn)行。
實施例4
比較試驗
常規(guī)的斷奶仔豬飼料：
方法：配制玉米-豆粕型斷奶仔豬日糧，不添加丁酸梭菌。選擇28日齡6頭仔豬，試驗期14天。試驗結(jié)束后對3頭仔豬進(jìn)行屠宰，采血、取空腸腸段。
步驟：采用生化法和ELISA試劑盒測定血液指標(biāo)，qPCR測定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)。
結(jié)果：血清中D-lactin和DAO的濃度分別為2.15 mmol/L、3.75 mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分別為41.42ng/L和58.91ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA水平表達(dá)量分別為0.96、0.99、0.97。
日糧中添加含丁酸梭菌后飼料：
方法：配制玉米-豆粕型斷奶仔豬日糧，添加0.005%丁酸梭菌（凍干粉中活菌含量為1×1010CFU/g）。選擇6頭28日齡仔豬，試驗期14天。試驗結(jié)束后隨機(jī)選3頭仔豬進(jìn)行采血、取空腸腸段。
步驟：采用生化法測定DAO，采用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-10和D-lactic。采用qPCR測定Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)。
結(jié)果：血清中D-lactin和DAO的濃度分別為1.67mmol/L、3.26mmol/L，TNF-α和IL-10的含量分別為77.16 ng/L和64.59 ng/L。Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)分別為1.55、2.03、1.41。
結(jié)論：日糧中添加丁酸梭菌能提高仔豬腸道屏障功能。通過比較試驗說明：日糧中添加丁酸梭菌能調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道屏障功能，改善腸道健康和提高仔豬整體健康狀況。