本發(fā)明涉及一種富硒及蛹蟲草活性物質(zhì)的飼料的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前蛹蟲草的人工栽培技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，其人工培養(yǎng)基多采用小麥或大米培養(yǎng)基，生產(chǎn)已有相當(dāng)規(guī)模，而且取得了一定的經(jīng)濟效益。在蛹蟲草的人工培育過程中，注重收獲的往往是具備較高活性成分如蟲草素含量的蛹蟲草子實體，而對于蛹蟲草培養(yǎng)基(基座)卻較少問津，這往往造成大量的蛹蟲草培養(yǎng)基廢棄，發(fā)酸變臭，造成環(huán)境污染。蛹蟲草培養(yǎng)基雖已被代謝利用，但其主要成分仍多為淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，很適合作為復(fù)合益生菌的培養(yǎng)原料。不僅如此，經(jīng)研究表明，蛹蟲草培養(yǎng)基中也含有很多有效的蛹蟲草活性成分，如蟲草素、蟲草多糖等。近年來，開發(fā)高效、無殘留、無公害的飼料添加劑成為研究的主要目標，這不僅是保障畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的必然，也是保障人類健康、維持生態(tài)環(huán)境平衡的迫切需要。一些對環(huán)境友好、對人類健康的綠色飼料添加劑相繼問世，如酶制劑、微生態(tài)制劑、功能性寡糖、酸化劑和中草藥制劑等，安全、生態(tài)、綠色、經(jīng)濟成為飼料添加劑開發(fā)的主要方向。而功能型飼料由于具有特定的生物學(xué)作用，也成為研究熱點。蛹蟲草活性成分具有增強心臟功能、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗癌及促進造血等功能，如果將蛹蟲草培養(yǎng)基相關(guān)產(chǎn)品再度開發(fā)為動物用飼料添加劑，則不僅可以協(xié)同疫苗免疫作用，增強群體免疫水平，降低疫病的發(fā)生率，而且有助于改善肉質(zhì)和風(fēng)味，提高產(chǎn)品附加值，是一種非常理想的功能型飼料。

在我國，硒的缺乏是一個普遍存在的問題。對缺硒地區(qū)而言，通過補充無機硒源——亞硒酸鈉，其吸收利用率低、安全性差，補硒還應(yīng)主要以富含有機硒為好，因有機硒在利用率方面要優(yōu)于無機硒，而通過微生物吸收、轉(zhuǎn)化、富集的硒就是一類生物利用率非常高的硒源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種富硒及蛹蟲草活性物質(zhì)的飼料的制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種制備混合菌發(fā)酵物的方法，包括如下步驟(a1)和步驟(a2)：

(a1)將產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

(a2)完成步驟(a1)后，向培養(yǎng)體系中加入干酪乳桿菌和植物乳桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)。

所述產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：0.5×10⁹CFU-1.5×10⁹CFU：0.8×10⁹CFU-2.1×10⁹CFU：1.1×10⁹CFU-2.6×10⁹CFU：1.5×10⁶CFU-5.0×10⁶CFU：0.5×10⁷CFU-1.5×10⁷CFU：100g。

所述產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比具體可為：1.0×10⁹CFU：1.4×10⁹CFU：1.8×10⁹CFU：3.2×10⁶CFU：1.0×10⁷CFU：100g。

所述產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比具體可為：0.5×10⁹CFU：0.8×10⁹CFU：1.1×10⁹CFU：1.5×10⁶CFU：0.5×10⁷CFU：100g。

所述產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比具體可為：1.5×10⁹CFU：2.1×10⁹CFU：2.6×10⁹CFU：5.0×10⁶CFU：1.5×10⁷CFU：100g。

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組成配比如下：蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基45-55g：麩皮25-35g：豆粕15-25g：水100ml。

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組成配比具體可為：蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基50g：麩皮30g，豆粕20g：水100ml。

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組成配比具體可為：蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基45g：麩皮25g：豆粕15g：水100ml。

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組成配比具體可為：蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基55g：麩皮35g：豆粕25g：水100ml。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基為培養(yǎng)過富硒蛹蟲草子實體，將富硒蛹蟲草子實體采收后的廢棄培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基為硒含量為3.0mg/kg以上的蛹蟲草培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基為硒含量為3.0mg/kg-10.0mg/kg的蛹蟲草培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體可為硒含量為5.0mg/kg的蛹蟲草培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體可為蛹蟲草小麥基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體還可為蛹蟲草大米基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草小麥基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法為：將蛹蟲草菌株接種于蛹蟲草子實體小麥培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)結(jié)束后，收獲子實體(沿著培養(yǎng)基座表面將子實體割斷，采收)，將剩余的培養(yǎng)體系烘干粉碎并過40目篩，得到富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基。

所述蛹蟲草大米基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法為：將蛹蟲草菌株接種于蛹蟲草子實體大米培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)結(jié)束后，收獲子實體(沿著培養(yǎng)基座表面將子實體割斷，采收)，將剩余的培養(yǎng)體系烘干粉碎，得到富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基。

所述烘干為65℃烘干至水分含量為8％(質(zhì)量百分含量)。

所述“蛹蟲草小麥基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法”或“蛹蟲草大米基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法”中，所述培養(yǎng)包括如下階段：發(fā)菌暗培養(yǎng)階段(10天)：黑暗培養(yǎng)，溫度20℃，空氣相對濕度60％；轉(zhuǎn)色期培養(yǎng)階段(20天)：溫度18℃-28℃(存在晝夜溫差，最高溫度為28℃，最低溫度為18℃)，空氣相對濕度70％，光照強度300lux，光照時間10小時/天，光源類型為日光燈；子實體生長管理階段(15天)：溫度14℃，空氣相對濕度80％，光照強度300Lux，光照時間8小時/天，光源類型為日光燈；藍光培養(yǎng)階段(10天)：溫度14℃，空氣相對濕度80％，光照強度200Lux，光照時間8小時/天，光源類型為藍光。

所述蛹蟲草子實體小麥培養(yǎng)基的原料配比為：1L營養(yǎng)液：1000g小麥籽粒；所述營養(yǎng)液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述營養(yǎng)液中的濃度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.03g/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、檸檬酸鐵銨0.03g/100ml、氯化鈉0.05g/100ml、硫酸鎂0.02g/100ml、亞硒酸鈉1mg/100ml、維生素B₁ 2mg/100ml、維生素B₂ 1mg/100ml、維生素B₁₁ 1mg/100ml；所述溶劑為水。

所述蛹蟲草子實體大米培養(yǎng)基的原料配比為：1L營養(yǎng)液：1000g大米；所述營養(yǎng)液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述營養(yǎng)液中的濃度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.03g/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、檸檬酸鐵銨0.03g/100ml、氯化鈉0.05g/100ml、硫酸鎂0.02g/100ml、亞硒酸鈉1mg/100ml、維生素B₁ 2mg/100ml、維生素B₂ 1mg/100ml、維生素B₁₁ 1mg/100ml；所述溶劑為水。

所述方法還包括如下步驟：完成步驟(a1)后，向培養(yǎng)體系中加入無菌水使培養(yǎng)體系的含水量達60-70％。

所述步驟(a1)的培養(yǎng)條件為：28-33℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)。

所述步驟(a1)的培養(yǎng)條件具體可為：33℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)。

所述步驟(a1)的培養(yǎng)條件具體可為：28℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)。

所述步驟(a1)的培養(yǎng)條件具體可為：30℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)。

所述步驟(a2)的培養(yǎng)條件為：35-42℃靜置發(fā)酵48h。

所述步驟(a2)的培養(yǎng)條件具體可為：35℃靜置發(fā)酵48h。

所述步驟(a2)的培養(yǎng)條件具體可為：42℃靜置發(fā)酵48h。

所述步驟(a2)的培養(yǎng)條件具體可為：38℃靜置發(fā)酵48h。

本發(fā)明還保護所述采用所述方法制備得到的混合菌發(fā)酵物。

所述混合菌發(fā)酵物滿足如下參數(shù)(c1)-(c12)中至少一種：

(c1)有機硒含量為400mg/kg以上；

(c2)總硒含量為420mg/kg以上；

(c3)蟲草素含量為1000mg/kg以上；

(c4)腺苷含量為700mg/kg以上；

(c5)游離氨基酸含量為50mg/g以上；

(c6)小肽占總肽的質(zhì)量分數(shù)為5.5％以上；

(c7)還原糖含量為40mg/g以上；

(c8)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為1.5×10⁸cfu/g以上；

(c9)地衣芽胞桿菌活菌數(shù)為1.5×10⁸cfu/g以上；

(c10)干酪乳桿菌活菌數(shù)為0.5×10⁷cfu/g以上；

(c11)植物乳桿菌活菌數(shù)為0.5×10⁶cfu/g以上；

(c12)產(chǎn)朊假絲酵母菌活菌數(shù)為2.5×10⁷cfu/g以上。

本發(fā)明還保護所述混合菌發(fā)酵物的應(yīng)用，為如下(b1)-(b4)中任一種：

(b1)作為飼料；

(b2)作為飼料添加劑；

(b3)制備飼料；

(b4)制備飼料添加劑。

本發(fā)明還保護一種混合菌劑，包括產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌。

所述混合菌劑的用途為制備所述混合菌發(fā)酵物。

本發(fā)明還保護一種用于制備所述混合菌發(fā)酵物的試劑盒，包括產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、麩皮和豆粕。

本發(fā)明還保護所述蛹蟲草基礎(chǔ)培養(yǎng)基在制備飼料或飼料添加劑中應(yīng)用。

以上任一所述飼料或飼料添加劑具體可為豬飼料或豬飼料添加劑。

以上任一所述飼料或飼料添加劑可以增加飼養(yǎng)動物的日采食量和日增重，降低飼養(yǎng)動物的腹瀉率。

以上任一所述麩皮具體為小麥麩皮。

以上任一所述產(chǎn)朊假絲酵母具體可為產(chǎn)朊假絲酵母S1204；所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204的來源具體可為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M2012216。產(chǎn)朊假絲酵母S1204已經(jīng)在發(fā)明專利(申請日：2012.07.24，申請?zhí)枺?01210258191.2，授權(quán)公告日：2014.09.10，授權(quán)公告號：CN 102816707 B)中公開。

以上任一所述地衣芽孢桿菌具體可為廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.182的菌株。

以上任一所述枯草芽孢桿菌具體可為廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.372的菌株。

以上任一所述干酪乳桿菌具體可為廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.159的菌株。

以上任一所述植物乳桿菌具體可為廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.191的菌株。

本發(fā)明采用蛹蟲草培養(yǎng)基為主要原料，將富硒蛹蟲草子實體收獲后的廢料充分利用，同時采用富硒產(chǎn)朊假絲酵母菌株等益生菌對蛹蟲草培養(yǎng)基中無機硒進行進一步的轉(zhuǎn)化與富集，增加有機硒源，提高營養(yǎng)價值，化廢為寶；在選用蛹蟲草培養(yǎng)基為主要原料的同時，發(fā)酵過程中還添加了豆粕粉、麩皮粉為輔料，經(jīng)益生菌代謝消化，使輔料在發(fā)酵時既保證了益生菌的有效發(fā)酵，降低了抗營養(yǎng)因子含量，又可減少豆粕麩皮中的營養(yǎng)物質(zhì)由于發(fā)酵造成的損失。而且經(jīng)過發(fā)酵之后，蛹蟲草活性活性成分得到有效釋放，達到特別強化蟲草活性營養(yǎng)成分目的。本發(fā)明獲得的產(chǎn)品填補了發(fā)酵飼料領(lǐng)域的空白，開發(fā)集蛹蟲草活性物質(zhì)和硒的諸多生理功能于一體的新型功能型發(fā)酵飼料，而且工藝簡單可行且綠色環(huán)保，在飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中具有很強的應(yīng)用價值和廣闊的前景，具有很大的社會效益和經(jīng)濟效益。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

蛹蟲草菌株：廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM5.269。

產(chǎn)朊假絲酵母S1204：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M2012216。產(chǎn)朊假絲酵母S1204已經(jīng)在發(fā)明專利(申請日：2012.07.24，申請?zhí)枺?01210258191.2，授權(quán)公告日：2014.09.10，授權(quán)公告號：CN 102816707 B)中公開。

地衣芽胞桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.182。

枯草芽孢桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.372。

干酪乳桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.159。

植物乳桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心，編號：GIM1.191。

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，亞硒酸鈉5mg，瓊脂15-20g，蒸餾水定容至1000mL；121℃高壓蒸汽滅菌20min。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，亞硒酸鈉5mg，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.3g，維生素B₁ 20mg，蒸餾水定容至1000mL；調(diào)pH至6.5-7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

蛹蟲草子實體小麥培養(yǎng)基：取葡萄糖，蔗糖，酵母粉，蛋白胨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，檸檬酸鐵銨、氯化鈉，硫酸鎂，亞硒酸鈉，維生素B₁，維生素B₂，維生素B₁₁，調(diào)pH至7.5，蒸餾水定容至1000ml，制成營養(yǎng)液；1000ml營養(yǎng)液與1000g小麥籽粒混合均勻，121℃高壓蒸汽滅菌20min。各溶質(zhì)在營養(yǎng)液中的濃度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.03g/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、檸檬酸鐵銨0.03g/100ml、氯化鈉0.05g/100ml、硫酸鎂0.02g/100ml、亞硒酸鈉1mg/100ml、維生素B₁ 2mg/100ml、維生素B₂ 1mg/100ml、維生素B₁₁ 1mg/100ml。

蛹蟲草子實體大米培養(yǎng)基：取葡萄糖，蔗糖，酵母粉，蛋白胨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，檸檬酸鐵銨、氯化鈉，硫酸鎂，亞硒酸鈉，維生素B₁，維生素B₂，維生素B₁₁，調(diào)pH至7.5，蒸餾水定容至1000ml，制成營養(yǎng)液；1000ml營養(yǎng)液與1000g大米混合均勻，121℃高壓蒸汽滅菌20min。各溶質(zhì)在營養(yǎng)液中的濃度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氫鉀0.03g/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、檸檬酸鐵銨0.03g/100ml、氯化鈉0.05g/100ml、硫酸鎂0.02g/100ml、亞硒酸鈉1mg/100ml、維生素B₁2mg/100ml、維生素B₂ 1mg/100ml、維生素B₁₁ 1mg/100ml。

PDA固體斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1000mL；121℃高壓蒸汽滅菌22min。

種子強化培養(yǎng)基：酵母粉10g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，糖蜜100g，亞硒酸鈉50mg，加蒸餾水定容1000ml，制成營養(yǎng)液；1000ml營養(yǎng)液與1000g小麥籽?；旌暇鶆颍羲?0min，得到種子強化培養(yǎng)基；121℃高壓滅菌25min。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL；121℃高壓滅菌20min。

營養(yǎng)肉汁固體斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，氯化鈉3g，磷酸氫二鉀1g，15g瓊脂粉，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0-7.2；121℃高壓蒸汽滅菌22min。

營養(yǎng)肉汁液體培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，氯化鈉3g，磷酸氫二鉀1g，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0-7.2；121℃高壓蒸汽滅菌22min。

糖蜜培養(yǎng)基：糖蜜100g，硝酸銨5g，蒸餾水定容至1000mL；121℃高壓蒸汽滅菌22min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母提取粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，吐溫801.0g，磷酸氫二鉀2.0g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05g，碳酸鈣20.0g，蒸餾水定容至1000mL，pH6.8；121℃高壓蒸汽滅菌22min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為：取富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基或富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基、麩皮和豆粕粉碎過40目篩，加蒸餾水定容至100ml，攪拌混合均勻，靜置30min；然后在壓力0.1Mpa，溫度110℃條件下蒸30min，進行混合原料的滅菌，滅菌后冷卻至室溫。按照上述方法分別制備得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲、固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙及固體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲中，各溶質(zhì)的濃度如下：富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基50g/100ml、麩皮30g/100ml、豆粕20g/100ml。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，各溶質(zhì)的濃度如下：富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基45g/100ml、麩皮25g/100ml、豆粕15g/100ml。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，各溶質(zhì)的濃度如下：富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基55g/100ml、麩皮35g/100ml、豆粕25g/100ml。

基礎(chǔ)日糧：玉米55％，豆粕粉22％，麩皮12％，豬濃縮料11％。

豬濃縮飼料：河南九鼎農(nóng)牧發(fā)展有限公司。

杜長大仔豬：江蘇輝煌豬業(yè)養(yǎng)豬有限公司。

實施例1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(富硒蛹蟲草培養(yǎng)基)的制備

一、蛹蟲草菌株的活化培養(yǎng)

將蛹蟲草菌株接種至活化培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，24℃避光培養(yǎng)7天。

二、蛹蟲草菌株液體種子的制備

1、用無菌生理鹽水懸浮蛹蟲草菌株的孢子，得到孢子濃度為1.8×10⁷個/mL的孢子懸液。

2、將步驟1得到的孢子懸液接種于PDA液體培養(yǎng)基中(孢子懸液和PDA液體培養(yǎng)基的配比為5ml∶100ml)，24℃，200r/min振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子。

三、蛹蟲草子實體的培養(yǎng)與收集

將100ml步驟二得到的液體種子接種于1000g蛹蟲草子實體小麥培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

具體的培養(yǎng)工藝包括如下階段：發(fā)菌暗培養(yǎng)階段(10天)：黑暗培養(yǎng)，溫度20℃，空氣相對濕度60％；轉(zhuǎn)色期培養(yǎng)階段(20天)：溫度18℃-28℃(存在晝夜溫差，最高溫度為28℃，最低溫度為18℃)，空氣相對濕度70％，，光照強度300lux，光照時間10小時/天，光源類型為日光燈；子實體生長管理階段(15天)：溫度14℃，空氣相對濕度80％，光照強度300Lux，光照時間8小時/天，光源類型為日光燈；藍光培養(yǎng)階段(10天)：溫度14℃，空氣相對濕度80％，光照強度200Lux，光照時間8小時/天，光源類型為藍光。

四、富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基的獲得

完成步驟三后，收獲子實體(沿著培養(yǎng)基座表面將子實體割斷，采收)，將剩余的培養(yǎng)體系65℃烘干至水分含量為8％，然后粉碎并過40目篩，得到富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基。經(jīng)測定，富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中的總硒含量為5.0mg/kg，蟲草素含量為2.5g/kg。

檢測總硒含量的方法：參照參考文獻“王瑩，鐵梅，康平利，等.ICP-MS等三種測定蛹蟲草硒含量方法的比較[J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法。

檢測蟲草素的方法：NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法。

五、富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基的獲得

采用蛹蟲草子實體大米培養(yǎng)基替代蛹蟲草子實體小麥培養(yǎng)基按照步驟一到步驟四進行操作，得到富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基。富硒蛹蟲草大米培養(yǎng)基中的總硒含量和蟲草素含量與富硒蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中的總硒含量和蟲草素含量無顯著性差異。

實施例2、多類益生菌的種子液的制備

一、產(chǎn)朊假絲酵母S1204菌株種子液的制備

1、將產(chǎn)朊假絲酵母S1204菌株接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)20h。

2、用10ml無菌的生理鹽水懸浮產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到菌濃度為0.6-1.8×10⁷CFU/ml的菌懸液。

3、將10ml步驟2制備的菌懸液接種至100g種子強化培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16h，得到強化種子。

4、稱取1g步驟3得到的強化種子，接種至100mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)16h，得到產(chǎn)朊假絲酵母S1204種子液(種子液中的菌濃度為0.5-1.5×10⁸CFU/mL)。

二、枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌種子液的制備

分別制備枯草芽孢桿菌種子液和地衣芽孢桿菌種子液。

1、將枯草芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株分別接種于營養(yǎng)肉汁固體斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h。

2、用10ml無菌的生理鹽水將步驟1培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉汁固體斜面培養(yǎng)基上的菌落洗脫，得到10ml枯草芽孢桿菌菌懸液(濃度為0.5-1.2×10⁶CFU/ml)和10ml地衣芽孢桿菌菌懸液(濃度為0.3-1.1×10⁶CFU/ml)。

3、將步驟2制備的10ml枯草芽孢桿菌菌懸液和10ml地衣芽孢桿菌菌懸液分別接種至裝有100mL的營養(yǎng)肉汁液體培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，37℃，搖床轉(zhuǎn)速250r/min下培養(yǎng)16h，得到枯草芽孢桿菌種子液(濃度為1.1-2.6×10⁸CFU/mL)和地衣芽孢桿菌種子液(濃度為0.8-2.1×10⁸CFU/mL)。

三、植物乳桿菌種子液的制備

1、將植物乳桿菌菌株接種至裝有100mL糖蜜培養(yǎng)基的150mL的三角瓶中，保鮮膜密封，30℃靜置培養(yǎng)24h，得到活化的菌液(濃度為0.5-2.0×10⁵CFU/mL)。

2、將100ml步驟1得到的菌液接種至裝有200mL的糖蜜培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，保鮮膜密封，30℃靜置培養(yǎng)24h，得到植物乳桿菌種子液(濃度為0.5-1.5×10⁶CFU/mL)。

四、干酪乳桿菌種子液的制備

1、將干酪乳桿菌菌株接種至裝有100mL的MRS培養(yǎng)基的150mL的三角瓶中，保鮮膜密封，30℃靜置培養(yǎng)24h，得到活化的菌液(濃度為0.3-0.9×10⁵CFU/mL)。

2、將100ml步驟1得到的菌液接種至裝有200mL的MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，保鮮膜密封，30℃靜置培養(yǎng)24h，得到干酪乳桿菌種子液(濃度為1.5-5.0×10⁵CFU/mL)。

實施例3、發(fā)酵飼料的制備

采用實施例2制備的產(chǎn)朊假絲酵母S1204種子液、地衣芽孢桿菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液、干酪乳桿菌種子液和植物乳桿菌種子液進行下述試驗。

1、發(fā)酵飼料的制備過程分為三個試驗組(均以100g固體培養(yǎng)基示例描述)：

試驗組甲：第一階段：將10mL產(chǎn)朊假絲酵母S1204種子液(10mL種子液中含有1.0×10⁹CFU的產(chǎn)朊假絲酵母)、10mL地衣芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有1.4×10⁹CFU的地衣芽孢桿菌)和10mL枯草芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有1.8×10⁹CFU的枯草芽孢桿菌)接種至100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲，33℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)，第36h加入無菌水增濕使培養(yǎng)體系的含水量達65％；第二階段：完成第一階段后，向培養(yǎng)體系中接種10mL干酪乳桿菌種子液(10mL種子液中含有3.2×10⁶CFU的干酪乳桿菌)和10mL植物乳桿菌種子液(10mL種子液中含有1.0×10⁷CFU的植物乳桿菌)，35℃繼續(xù)靜置發(fā)酵48h，得到發(fā)酵產(chǎn)物甲。

試驗組乙：第一階段：將10mL產(chǎn)朊假絲酵母S1204種子液(10mL種子液中含有0.5×10⁹CFU的產(chǎn)朊假絲酵母)、10mL地衣芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有0.8×10⁹CFU的地衣芽孢桿菌)和10mL枯草芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有1.1×10⁹CFU的枯草芽孢桿菌)接種至100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲，28℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)，第36h加入無菌水增濕使固體培養(yǎng)基含水量達70％；第二階段：完成第一階段后，向培養(yǎng)體系中接種10mL干酪乳桿菌種子液(10mL種子液中含有1.5×10⁶CFU的干酪乳桿菌)和10mL植物乳桿菌種子液(10mL種子液中含有0.5×10⁷CFU的植物乳桿菌)，42℃繼續(xù)靜置發(fā)酵48h，得到發(fā)酵產(chǎn)物乙。

試驗組丙：第一階段：將10mL產(chǎn)朊假絲酵母S1204種子液(10mL種子液中含有1.5×10⁹CFU的產(chǎn)朊假絲酵母)、10mL地衣芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有2.1×10⁹CFU的地衣芽孢桿菌)和10mL枯草芽孢桿菌種子液(10mL種子液中含有2.6×10⁹CFU的枯草芽孢桿菌)接種至100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲，30℃培養(yǎng)，第0-24h每6h攪拌一次，第24h-36h靜置培養(yǎng)，第36h加入無菌水增濕使固體培養(yǎng)基含水量達60％；第二階段：完成第一階段后，向培養(yǎng)體系中接種10mL干酪乳桿菌種子液(10mL種子液中含有5.0×10⁶CFU的干酪乳桿菌)和10mL植物乳桿菌種子液(10mL種子液中含有1.5×10⁷CFU的植物乳桿菌)，38℃繼續(xù)靜置發(fā)酵48h，得到發(fā)酵產(chǎn)物丙。

3、步驟2發(fā)酵結(jié)束后，分別取發(fā)酵產(chǎn)物甲、發(fā)酵產(chǎn)物乙、發(fā)酵產(chǎn)物丙，40℃-50℃干燥至水分含量為8％，然后粉碎過40目篩，得到飼料產(chǎn)品甲、飼料產(chǎn)品乙和飼料產(chǎn)品丙。各個產(chǎn)品冷卻后密封，置于4℃干燥處保藏。

4、對步驟3得到的飼料產(chǎn)品甲、發(fā)酵飼料產(chǎn)品乙和發(fā)酵飼料產(chǎn)品丙進行總硒含量、有機硒含量、蟲草素含量、腺苷含量、小肽含量(占總肽的質(zhì)量分數(shù))、游離氨基酸含量、還原糖含量和活菌數(shù)含量的測定。

檢測總硒含量的方法：參照參考文獻“王瑩，鐵梅，康平利，等.ICP-MS等三種測定蛹蟲草硒含量方法的比較[J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法。

檢測有機硒含量的方法：DBS 42/002-2014富有機硒食品硒含量要求。

檢測蟲草素、腺苷含量的方法：NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法。

檢測小肽含量(占總肽的質(zhì)量分數(shù))的方法：GB/T22492-2008大豆肽粉中的方法。

檢測游離氨基酸的方法：NY/T 1975-2010水溶肥料游離氨基酸含量的測定的氨基酸自動分析儀法。

檢測還原糖的方法：采用全自動還原糖測定儀測定還原糖。

檢測活菌數(shù)的方法：采用稀釋涂布法進行活菌數(shù)的檢測。

檢測結(jié)果如表1所示。

表1飼料產(chǎn)品成分含量檢測結(jié)果

飼料產(chǎn)品甲中有機硒含量占總硒含量的99.17％。

飼料產(chǎn)品乙中有機硒含量占總硒含量的95.24％。

飼料產(chǎn)品丙中有機硒含量占總硒含量的98.86％。

實施例4、飼喂效果實驗

將120只杜長大健康仔豬(8.5-9.5kg)隨機分為4組(對照組、實驗組甲、實驗組乙和實驗組丙)，每組10只(公母各半)，每組設(shè)置三個重復(fù)。各組仔豬飼喂的飼料如下：

對照組：基礎(chǔ)日糧。

實驗組甲：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分數(shù)0.1％的實施例3得到的飼料產(chǎn)品甲。

實驗組乙：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分數(shù)0.3％的實施例3得到的飼料產(chǎn)品乙。

實驗組丙：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分數(shù)0.5％的實施例3得到的飼料產(chǎn)品丙。

飼養(yǎng)采用全舍飼法，仔豬自由采食和飲水，試驗期為30天，記錄試驗豬的日采食量，試驗結(jié)束時結(jié)料并稱重，計算日均采食量、日增重、料重比、腹瀉率和成活率。結(jié)果見表1。

表1各組統(tǒng)計結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著：P＜0.05，肩標相同小寫字母表示差異不顯著：P＞0.05。

結(jié)果表明，同對照組相比，各實驗組的日采食量和日增重都有顯著提高，料重比降低，而且腹瀉率顯著下降，成活率明顯增加。