本發(fā)明涉及一種純化來自原料的多酚的方法。具體地講，本發(fā)明涉及富集能從植物材料獲得的多酚的特別是綠原酸(CGA)的級分，其中與原料相比，富集級分的異構體平衡基本上得到保持。

背景技術：

飲料(諸如咖啡)的一項重要性質是持久的泡沫(也稱為“奶泡(crema)”)和濃郁的香味，它們被認為是重要的質量指標。奶泡的體積、質地、細膩度、顏色和穩(wěn)定性是吸引消費者的獨特特性。奶泡的產生來源于對表面活性咖啡組分的提取，這些表面活性咖啡組分會包覆用加壓熱水噴射搗實的意式濃縮咖啡(espresso)基質而產生的氣泡并使其穩(wěn)定。

咖啡香味也是一項重要的性質，因為咖啡香味的濃郁程度是消費者所感受到的第一感官體驗。當嗅聞咖啡時，香味可以幫助你評價咖啡的風味和咖啡的亮度。在烘焙期間，許多芳族化合物自咖啡豆基質中形成或釋放，并且影響人們對于咖啡的感受(香味和風味)。芳族化合物最重要的前體之一是綠原酸，特別是咖啡?？崴?。

因此，人們已有興趣從許多不同種類的植物材料，例如，漿果、葡萄、柑橘、蔬菜、谷物、草藥、茶、咖啡、可可中分離富集多酚的級分。具體地講，人們已有興趣分離富集綠原酸化合物并具有類似于原始植物材料的綠原酸化合物異構體平衡的多酚的級分，以給食物和飲料產品增添例如香味和風味。

此外，已報道多酚具有抗微生物、抗病毒、抗誘變、抗癌、抗增殖和血管擴張效果。多酚可具有抗菌活性，其可用于對抗由變形鏈球菌(Streptococcus mutans)引起的蛀牙。多酚被列為益智藥，據(jù)說可改善腦力功能，諸如認知、記憶、智力、積極性、注意力和專注力。

然而，食物立法中加強了健康聲明的規(guī)則，制造商必須確?；钚猿煞值囊恢滤剑⑶乙峁┧圃飚a品達標的科學證據(jù)。

因此，需要一種提供富集多酚的級分(特別是包含綠原酸(CGA)的級分)的方法，該級分中綠原酸平衡類似于最初存在于植物材料中的綠原酸平衡。隨后，該富集級分可用于確保食物產品的活性成分具有恒定水平，以及確保在干預研究中具有恒定水平以證明攝入多酚(諸如來自咖啡的多酚)與給定的聲稱效果之間的因果關系。

因此，在行業(yè)中需要一種用于提供富集多酚(特別是綠原酸)的級分的方法，該級分相對于其來源的植物材料具有最本真的特性，該級分可用于增強食物或飲料的性質。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明描述了一種純化多酚的新方法，其中多酚平衡得到保持或基本上得到保持。此外，本發(fā)明的方法可導致在該方法期間形成有限的衍生物或者不會形成衍生物，例如多酚的乙酯。因為乙酯不具有與植物材料中天然存在的天然多酚相同的性質，所以它們是不期望的。此外，相對于原始產物而言，乙酯會改變富集級分的多酚平衡。

因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種從原料提供富集多酚的級分的方法，該方法包括以下步驟：

(i)將原料溶解于含水溶劑中；

(ii)將pH調節(jié)至pH 3以下；

(iii)使原料與色譜樹脂接觸；

(iv)從色譜樹脂解吸多酚，以提供包含多酚的洗脫物；

(v)將洗脫物的pH調節(jié)至pH 3.5以上；以及

(vi)將洗脫物與被洗脫的多酚分離，以獲得富集多酚的級分。

本發(fā)明的另一方面涉及能從根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的富集多酚的級分。

本發(fā)明的又一方面是提供一種食物成分，其包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分。

本發(fā)明的又一方面是提供一種食物產品，其包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分和/或根據(jù)本發(fā)明的食物成分。

另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分和/或根據(jù)本發(fā)明的食物成分作為產生香味、風味和/或發(fā)泡的前體的用途。

另一方面涉及一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分以及藥學上可接受的載體。

附圖說明

圖1示出了本發(fā)明的多酚的非限制性實施例。圖中(*)標記表示R¹的連接點。

圖2示出了用90％乙醇解吸CQA、FQA、二CQA和咖啡因的解吸動力學。

圖3示出了實驗室規(guī)模的根據(jù)本發(fā)明的純化方法的具體實施方案。

圖4示出了富集多酚的生咖啡級分與初始咖啡的總體組成的比較。

圖5示出了富集多酚的生咖啡級分與初始咖啡的CGA組成的比較。

圖6示出了5-CQA在75％乙醇中，在pH 1、pH 2、pH 7.4和pH 12的條件下2小時后的降解情況。

圖7示出了在t＝室溫、50℃和80℃下，5-CQA轉化成其乙酯的情況。

圖8示出了(a)在50℃下3小時內和(b)在室溫下36小時內形成5-CQA酯的情況。

圖9示出了用于生產規(guī)模的改良純化方案。

圖10示出了用于臨床研究的，脫咖啡因的富集多酚的生咖啡級分與初始咖啡的總體組成的比較。

圖11示出了脫咖啡因的富集級分與初始咖啡的詳細CGA組成的比較。

圖12示出了用于臨床研究的，含咖啡因的富集多酚的生咖啡級分與初始咖啡的總體組成的比較。

圖13示出了含咖啡因的富集級分與初始咖啡的詳細CGA組成的比較。

圖14示出了采用連續(xù)解吸步驟，在解吸混合物中乙醇比率漸增(1)20％、(2)50％、(3)80％的條件下，對綠原酸進行純化的方案。

圖15示出了在初始咖啡以及通過乙醇梯度解吸獲得的三個級分中，CGA的相對組成。

圖16示出了三種不同乙醇梯度解吸級分的HPLC色譜圖。

現(xiàn)將在下文中更詳細地描述本發(fā)明。

具體實施方式

本發(fā)明描述了一種使用色譜樹脂提供富集多酚的級分的新方法。從本發(fā)明得到的富集級分可以提供改善的性質，特別是香味、風味和發(fā)泡性質，這是因為富集級分中存在的多酚(例如綠原酸化合物)的異構體平衡基本上得到保持，并且類似于最初存在于植物材料中的多酚(例如綠原酸化合物)的異構體平衡。此外，根據(jù)本發(fā)明的提供富集多酚的級分的方法還提供了具有高純度和/或良好性質(產物性能)的富集級分。

在本發(fā)明的一個實施方案中，富集級分的綠原酸化合物含量為至少40％(w/w)，諸如至少50％(w/w)，例如至少60％(w/w)，例如至少70％(w/w)。

與其他純化方法相比，本發(fā)明的方法可以具有若干優(yōu)點。本發(fā)明的一個優(yōu)點可在于，富集級分的多酚(特別是綠原酸化合物)異構體平衡可得到保持。另一個優(yōu)點可在于，該方法產生有限的多酚的乙酯，或者不產生多酚的乙酯。本發(fā)明另外的優(yōu)點可在于，可獲得高水平的純度(即，>60％)。

根據(jù)本發(fā)明的方法的示意性細節(jié)示于圖3、圖9和圖14中。每個方案代表著根據(jù)本發(fā)明的方法的具體實施方案。

因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種從原料提供富集多酚的級分的方法，該方法包括以下步驟：

(i)將原料溶解于含水溶劑中；

(ii)將pH調節(jié)至pH 3以下；

(iii)使原料與色譜樹脂接觸；

(iv)從色譜樹脂解吸多酚，以提供包含多酚的洗脫物；

(v)將洗脫物的pH調節(jié)至pH 3.5以上；以及

(vi)將洗脫物與被洗脫的多酚分離，以獲得富集多酚的級分。

該方法是基于多酚化合物，例如圖1中所述多酚化合物的化學和物理性質而開發(fā)的。最重要的多酚之一是綠原酸(CGA)，它是存在于咖啡以及許多其他植物材料中的最主要的多酚。綠原酸(CGA)的具體(非限制性)示例為，3-咖啡?？崴?3CQA)、4-咖啡?？崴?4CQA)、5-咖啡?？崴?5CQA)、3,4-二咖啡酰奎尼酸(3,4二CQA)、3,5-二咖啡?？崴?3,5二CQA)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5二CQA)、3-阿魏?？崴?3FQA)、4-阿魏?？崴?4FQA)、5-阿魏酰奎尼酸(5FQA)和咖啡酸。

綠原酸是低分子量化合物，其分子量總體上在600g/mol以下。綠原酸具有一個或幾個芳族基團(即酚部分)?？稍诤羞@些芳族部分的化合物之間建立非共價芳族相互作用，也稱為π-π堆積相互作用。該性質用于將綠原酸特異性地吸附到具有芳族基團的基質。

綠原酸具有賦予酸堿性質的奎尼酸基團(pKa＝3.2)。在pH低于pKa時，綠原酸被質子化。此時分子不帶電荷，并且因此它是相當疏水的。在pH高于pKa時，酸官能團為羧酸酯形式，這意味著整個分子由于電荷而更為親水。該性質可用于調節(jié)分子的疏水性，進而用于純化目的。

包含多酚的原料可來自不同來源。在一個實施方案中，原料是植物材料。在另一實施方案中，植物材料選自：咖啡(諸如生咖啡、含咖啡因的咖啡、脫咖啡因的咖啡和脫咖啡因的生咖啡)、麥芽、可可、茶、漿果、葡萄、蔬菜、柑橘、草藥和谷物。原料最初可以溶解在例如沸水中。可能有利的是，在開始上述純化過程之前，先進行所溶解原料的初始沉淀步驟，以便除去高分子量(HMW)化合物，如蛋白質類、類黑精和多糖類，例如阿拉伯半乳聚糖。因此，在一個實施方案中，在進行步驟(ii)中的pH調節(jié)之前，在步驟(i)中獲得的所溶解原料可例如用醇(優(yōu)選地乙醇)進行沉淀以提供固相和液相。在另一實施方案中，在進行步驟(ii)中的pH調節(jié)之前，可經由過濾、離心和/或傾析將固相與液相分離。在該任選的分離步驟之后，并且在進行步驟(ii)中的pH調節(jié)之前，可對液相進行蒸發(fā)處理，以從液相除去用于使HMW沉淀的醇。

富集多酚的級分可以是不同形式的。因此，在一個實施方案中，富集多酚的級分可以是液體形式或干燥形式。在另一實施方案中，富集多酚的級分是冷凍干燥的。

下文的實施例1公開了一個具體示例，其中所溶解的原料用80％的醇進行沉淀。因此，在一個實施方案中，醇為乙醇。在另一實施方案中，醇(諸如乙醇)的濃度在50％至99％(w/w)的范圍內，諸如60％至99％(w/w)，諸如60％至90％(w/w)，諸如70％至90％(w/w)，諸如75％至85％(w/w)。

根據(jù)本發(fā)明的方法包括在將原料加載到樹脂柱上之前將其酸化至pH 3以下。在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(ii)中的pH調節(jié)是指調節(jié)至在pH2.5以下，優(yōu)選地在pH 2以下，更優(yōu)選地在pH 1.5以下，或者甚至更優(yōu)選地至約pH 1。在另一實施方案中，所用的酸選自強酸，例如鹽酸、硫酸和磷酸。之所以采用相對較低的pH，是因為純水和/或使用更高的pH值可能導致CGA從樹脂解吸。另一方面，在酸性條件下，由于綠原酸保持其質子化和疏水形式，所以保持與樹脂的相互作用。

下文所示的實施例2證明了在將原料加載到色譜樹脂上之前將pH降低至pH 1的效果。在pH調節(jié)后，并且在將原料加載到色譜樹脂上之前，可將材料過濾，除去較大的碎片。還可以在施加待純化的原料之前，用酸對色譜樹脂進行預調理。因此，在一個實施方案中，用pH在3以下的酸對色譜樹脂進行預調理，優(yōu)選在pH 2以下，更優(yōu)選在pH 1.5以下，或甚至更優(yōu)選低至約pH 1。在另一實施方案中，用于對柱進行預調理的酸選自鹽酸、硫酸和磷酸。酸的精確濃度可變。因此，在一個實施方案中，酸的濃度在0.001M至1M的范圍內，優(yōu)選地在0.001M至0.5M的范圍內，或者甚至更優(yōu)選地在0.05M至0.3M的范圍內。

在將原料加載到色譜樹脂上之后，可能是有利的是，漂洗色譜樹脂以除去未結合的材料。因此，在一個實施方案中，可以在使多酚解吸之前用漂洗溶液處理色譜樹脂。優(yōu)選地，漂洗溶液具有在pH 3以下的pH值，優(yōu)選地在pH 2以下，更優(yōu)選地在pH 1.5以下，甚至更優(yōu)選地約pH 1。在一個實施方案中，洗滌溶液包含酸，諸如鹽酸、硫酸或磷酸。由于酸的精確濃度可變，因此在本發(fā)明的一個實施方案中，漂洗溶液中的酸濃度在0.001M至1M的范圍內，優(yōu)選地在0.001M至0.5M的范圍內，或者甚至更優(yōu)選地在0.05M至0.3M的范圍內。

實施例3示出了用0.1M HCl對柱進行漂洗的效果，其結果是，與不包括漂洗步驟時相比，最終級分的純度從50％增加到66％。因此，可以得出結論，在解吸之前對柱進行漂洗可以進一步提高最終級分的純度。

原料和色譜材料之間的比例可影響純化產物的量。柱過載可能導致柱飽和，這會導致有價值的多酚化合物分離不充分，因為所溶解的原料的級分可能未被吸附到柱上。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，原料與色譜材料之間的比例可以為從2:1至1:4(基于重量：重量)，諸如從1:1至1:3(基于重量：基于重量)，例如約1:2(基于重量：重量)。

在本發(fā)明的上下文中，術語“色譜樹脂”涉及到存在于色譜柱中并且負責原料的分離的色譜介質。在本發(fā)明的一個實施方案中，色譜樹脂可以填充在填充床中或膨脹床中?？墒褂貌煌愋偷纳V樹脂。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(iii)可涉及在聚合物樹脂和/或技術人員已知的任何其他色譜介質上進行吸附色譜法。

對于解吸而言，必須削弱色譜樹脂與多酚的酚化合物之間的相互作用。不同的參數(shù)可影響本發(fā)明的解吸步驟。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在存在羥基組分(例如乙醇)的情況下，溫度可能是對多酚的乙酯的不期望的形成具有顯著影響的參數(shù)。

因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸期間的溫度可在70℃以下，諸如在60℃以下，諸如在50℃以下，諸如在40℃以下。在另一實施方案中，該溫度在10℃至40℃的范圍內，諸如在25℃至35℃的范圍內，例如為約30℃。實施例7證明了保持溫度低以避免CGA形成乙酯的優(yōu)點。因此，通?？赡苡欣氖?，在該方法的每個步驟期間保持盡可能低的溫度。然而，人們往往需要在測定速度(例如，蒸發(fā)和/或解吸步驟期間)和避免產生乙酯之間進行折中。

可影響解吸過程的另一參數(shù)是解吸洗脫液的組成。解吸洗脫液可包含可改善多酚的解吸的不同成分。在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸洗脫液可包含羥基組分，優(yōu)選地該羥基組分是乙醇。其他醇類或醇類的組合也可用作解吸洗脫液。

本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在存在羥基化合物(例如乙醇)的情況下，洗脫物和解吸洗脫液的pH可對該方法中多酚的乙酯的不期望的形成具有顯著影響。在本發(fā)明的一個實施方案中，洗脫物和/或解吸洗脫液的pH可在pH 3以上，諸如pH 3.5以上，優(yōu)選地約pH 4，或甚至更優(yōu)選地在4至5的pH范圍內。在高pH值下，例如在pH 12的強堿性條件下，可以減少不期望地形成綠原酸的乙酯的現(xiàn)象，但是可能引起多酚的其他不期望的反應。

在本發(fā)明的另一實施方案中，解吸洗脫液可包含羥基組分(優(yōu)選地為乙醇)與堿性水溶液的組合，該堿性水溶液可優(yōu)選地為KOH。

在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸洗脫液可包含至少20％的羥基組分，例如至少30％的羥基組分，諸如至少40％的羥基組分，諸如至少50％的羥基組分，例如至少60％的羥基組分，諸如至少70％的羥基組分，例如至少80％的羥基組分和至多20％的堿性水溶液，諸如至少90％的羥基組分和至多10％的堿性水溶液，或其逐級式的組合。

由于富集多酚的級分可包含許多不同的多酚化合物和綠原酸化合物，因此可以使用逐級洗脫。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸洗脫液可包含：

(i)在10％-30％范圍內的羥基組分，諸如15％-25％，諸如17％-23％或諸如19％-21％，或者

(ii)在40％-60％范圍內的羥基組分，諸如45％-55％，諸如47％-53％或諸如49％-51％，或者

(iii)在70％-90％范圍內的羥基組分，諸如75％-85％、諸如77％-83％或諸如79％-81％。

在本發(fā)明的另一實施方案中，解吸步驟可以是逐級洗脫，其包括(i)、(ii)或(iii)中提及的解吸洗脫液羥基組分濃度中的兩者或更多者的組合，諸如所有三者的逐步組合。通過在解吸期間添加羥基組分的濃度梯度進行洗脫，從而獲得包含不同多酚化合物的解吸洗脫液，也可以是有利的。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，可以在解吸期間以從最多100％至最小1％的梯度提供羥基組分，諸如從最多90％至最少15％，諸如從最多90％至最少70％，諸如從最多60％至最少40％，諸如從最多30％至最少10％。在上述實施方案中，羥基組分最初具有高濃度，然而，自低濃度過渡到高濃度可能是有利的。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，可以在解吸期間以從至少1％到至多100％的梯度提供羥基組分，諸如從至少15％到至多90％，諸如從至少10％到至多30％，諸如從至少40％到至多60％，諸如從至少70％到至多90％。在另一實施方案中，解吸步驟作為根據(jù)本發(fā)明的任何梯度范圍的逐級組合來提供。通過進行逐級洗脫，收集多種洗脫物(每種洗脫物具有不同多酚的不同含量)，隨后可以混合兩種或更多種所收集的洗脫物以獲得這樣的最終產物，該最終產物的多酚特別是綠原酸的異構體平衡更精確地類似于原料中存在的多酚特別是綠原酸的異構體平衡。如果只收集到一種洗脫物，則也許不可能達到上述效果。

如此前所提到的，溫度影響乙酯的形成。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸可在80℃以下的溫度下進行，諸如在75℃以下，諸如在50℃以下，諸如在35℃以下，或諸如在20℃至30℃的范圍內。然而，由于解吸的速度在較高溫度下較快，這又得進行折中。

在解吸之后，可以有利的是，進一步調節(jié)洗脫物的pH以避免形成乙酯。因此，在一個實施方案中，在解吸后將pH調節(jié)至3.5-6的范圍內，諸如3.5-5，諸如3.5-4.5，諸如4-5，或諸如約4或5的pH。

所獲得的洗脫物包含羥基組分，并且為了進一步提高洗脫物中多酚的濃度，可將羥基組分與多酚分離。

洗脫后的分離步驟，以及任選的pH調節(jié)，可按不同的方式進行。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過蒸發(fā)來進行步驟(vi)中的分離。由于溫度也影響乙酯的形成，因此洗脫物的蒸發(fā)在80℃以下的溫度下進行，諸如在75℃以下，在60℃以下，諸如在40℃至60℃的范圍內，或諸如45℃至5℃的范圍內，優(yōu)選地約50℃。然而，由于解吸的速度在升高的溫度下更快，這又得進行折中。在蒸發(fā)之后，得到包含羥基組分的蒸發(fā)相和包含多酚的冷凝相。

優(yōu)選地，殘余相中存在的羥基組分的含量小于5％(w/w)，更優(yōu)選地小于1％(w/w)，甚至更優(yōu)選地小于0.1％(w/w)，更優(yōu)選地小于0.01％(w/w)。

應當理解，pH調節(jié)可以在羥基組分的分離(諸如蒸發(fā))之前或在羥基組分的分離(諸如蒸發(fā))之后進行。此外，pH調節(jié)可以在羥基組分的分離之前和之后進行。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，解吸洗脫液的pH可被調節(jié)到在3.5至6范圍內，諸如3.5至5，諸如3.5至4.5，諸如4至5或諸如約4或5的pH。在本發(fā)明的一個實施方案中，分離步驟(諸如蒸發(fā))在分離之前進行、在分離之后進行或在分離之前和之后進行。在分離步驟之后，解吸洗脫液可以存在于酸性溶液中，其中多酚可以其疏水及顯著不溶的形式存在。為了更好地溶解多酚，如上所述地進行pH調節(jié)可以是有利的。

為了使純化方案具有工業(yè)實用性，處理時間可以是重要的。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，處理時間可為36小時或更少，諸如30小時或更少，例如25小時或更少，諸如20小時或更少，例如18小時或更少，諸如15小時或更少，例如12小時或更少，諸如10小時或更少，例如5小時或更少。在本發(fā)明的上下文中，處理時間涉及以下過程的時段：從原料溶解，直到洗脫物已經分離成包含羥基組分的相和包含多酚的殘余相，從而獲得根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分。

富集多酚的級分可進一步純化。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，富集多酚的級分可通過色譜、超濾、納濾、微濾、反滲透或其任何組合來進一步純化。最終產物還可冷凍干燥。

除了涉及純化方法之外，本發(fā)明還涉及能通過這種方法獲得的產物。因此，本發(fā)明的另一方面涉及能從根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的富集多酚的級分。此類產物可能是非常獨特的，因為它們具有與原始存在于原材料中的多酚平衡相類似的多酚平衡，特別是綠原酸的平衡。

在本發(fā)明的一個實施方案中，富集多酚的級分的多酚含量基于干物質計可為至少35％(w/w)，諸如至少45％，諸如至少55％，諸如至少65％或諸如至少75％。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，富集多酚的級分中多酚乙酯的含量基于干物質計并且相對于多酚總含量而言可為在20％(w/w)以下，諸如在15％(w/w)以下，例如在10％(w/w)以下，諸如在5％(w/w)以下，例如在1％(w/w)以下，諸如在0.1％至20％(w/w)的范圍內，諸如在0.1％至10％的范圍內，諸如在0.1％至5％的范圍內，諸如在0.1％至4％的范圍內，諸如在0.1％至3％的范圍內，諸如在0.1％至2％的范圍內，或諸如在0.1％至1％的范圍內。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，富集多酚的級分中，基于干物質計，多酚含量可為至少35％(w/w)，并且基于干物質計和相對于總多酚的含量，多酚的乙酯可為在20％(w/w)以下，諸如介于0.1％至20％(w/w)之間。

因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，多酚可為綠原酸(CGA)、咖啡酸或它們的組合。在本發(fā)明的另一實施方案中，綠原酸(CGA)可選自：3-咖啡?？崴?3CQA)、4-咖啡?？崴?4CQA)、5-咖啡?？崴?5CQA)、3,4-二咖啡?？崴?3,4二CQA)、3,5-二咖啡?？崴?3,5二CQA)、4,5-二咖啡?？崴?4,5二CQA)、3-阿魏?？崴?3FQA)、4-阿魏?？崴?4FQA)、5-阿魏?？崴?5FQA)、咖啡酸和其任何組合。

在本發(fā)明的另一實施方案中，富集多酚的級分可包含3-咖啡?？崴?3CQA)、4-咖啡?？崴?4CQA)、5-咖啡?？崴?5CQA)、3,4-二咖啡?？崴?3,4二CQA)、3,5-二咖啡?？崴?3,5二CQA)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5二CQA)、3-阿魏?？崴?3FQA)、4-阿魏?？崴?4FQA)、5-阿魏?？崴?5FQA)和咖啡酸。

在本發(fā)明的另一實施方案中，相對于原料中存在的含量而言，富集級分中3-咖啡酰奎尼酸(3CQA)、4-咖啡?？崴?4CQA)、5-咖啡?？崴?5CQA)、3,4-二咖啡?？崴?3,4二CQA)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(3,5二CQA)、4,5-二咖啡?？崴?4,5二CQA)、3-阿魏?？崴?3FQA)、4-阿魏?？崴?4FQA)和5-阿魏?？崴?5FQA)各者的含量至多偏離30％(w/w)，諸如至多25％(w/w)；例如至多20％(w/w)，諸如至多15％(w/w)；例如至多10％(w/w)。

在本發(fā)明的另一實施方案中，綠原酸(CGA)可包含至少50％(w/w)單-咖啡?？崴?，和/或至多25％(w/w)二-咖啡?？崴帷Ｔ诹硪幌嗨频膶嵤┓桨钢?，富集多酚的級分包含基于干物質計至少12％(w/w)的3-咖啡?？崴?3CQA)、4-咖啡?？崴?4CQA)或5-咖啡?？崴?5CQA)中的至少一種，諸如所述化合物中的至少兩種，優(yōu)選地所述化合物中的全部三種。

在本發(fā)明的另一實施方案中，富集多酚的級分可包含基于干物質計小于12％(w/w)的3,4-二咖啡?？崴?3,4二CQA)、3,5-二咖啡?？崴?3,5二CQA)或4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5二CQA)中的至少一種，諸如所述化合物中的至少兩種，優(yōu)選地所述化合物中的全部三種。

在本發(fā)明的又另一個實施方案中，富集多酚的級分可包含基于干物質計小于12％(w/w)的3-阿魏?？崴?3FQA)、4-阿魏?？崴?4FQA)或5-阿魏?？崴?5FQA)中的至少一種，優(yōu)選地包含全部三種。

富集多酚的級分可以直接用作食物成分或形成食物成分的一部分。因此，本發(fā)明的另一方面涉及一種食物成分，其包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分。在本發(fā)明的一個實施方案中，食物成分可包含相對于食物成分中多酚的總量而言介于0.1％至20％(w/w)之間的多酚乙酯，諸如在0.1％至10％的范圍內，諸如在0.1％至5％的范圍內，諸如在0.1％至4％的范圍內，諸如在0.1％至3％的范圍內，諸如在0.1％至2％的范圍內，或諸如在0.1％至1％的范圍內。

該富集多酚的級分或該食物成分可用于食物產品。因此，本發(fā)明的又一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分和/或食物成分的食物產品。在一個實施方案中，食物產品包含相對于食物產品中的多酚的總量而言介于0.1％至20％(w/w)之間的多酚乙酯，諸如在0.1％至5％的范圍內，諸如在0.1％至10％的范圍內，諸如在0.1％至4％的范圍內，諸如在0.1％至3％的范圍內，諸如在0.1％至2％的范圍內，或諸如在0.1％至1％的范圍內。

多酚可用于不同的目的，以改善食物產品。因此，本發(fā)明的一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分和/或根據(jù)本發(fā)明的食物成分作為產生香味、風味和/或發(fā)泡的前體的用途。

在又另一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的富集多酚的級分以及藥學上可接受的載體。由于多酚可以在體內表現(xiàn)出生物活性，例如抗氧化劑、酶的活化劑/抑制劑及受體，因此多酚可被認為是藥物組合物中的相關組分。

應當注意，在本發(fā)明的其中一個方面的上下文中描述的實施方案和特征也適用于本發(fā)明的其他方面。

現(xiàn)將在下面的非限制性實施例中進一步詳細描述本發(fā)明。

方法

級分

生咖啡級分由純的或脫咖啡因的生羅布斯塔(Robusta)咖啡豆制成。

樹脂

Amberlite FPX66(CAS N°9003-69-4)是商業(yè)食品級樹脂，其化學結構由大網(wǎng)狀芳族聚合物(即苯乙烯)組成。由于苯乙烯環(huán)不是官能化的，所以該基質是相當疏水的。

實驗室規(guī)模的實驗的純化設置

-柱：帶熱護套的XK 50/30玻璃柱(通用醫(yī)療(GE Healthcare))

工作臺規(guī)模的純化設置

-柱：帶熱護套的XK 50/100玻璃柱(通用醫(yī)療(GE healthcare))

通過HPLC-UV分析綠原酸

通過HPLC-UV使用以下設置進行綠原酸(CGA)的分析：

-系統(tǒng)-HPLC為Ultimate 3000，由提供。它配備了四元泵、進樣器、UV檢測器和Chromeleon軟件。

-樣品制備-樣品是粉末或級分。將粉末以2mg/mL的濃度溶解于甲醇：水(80:20)中。將級分在甲醇：水(80:20)中稀釋，使得被分析物的范圍在0.2mg/mL以下。

-HPLC方法-色譜分離在環(huán)境溫度下在Spherisorb ODS-1柱，5μm，250×4.6mm(沃特世公司(Waters))上實現(xiàn)。應用A/B(A：92％水/8％乙腈/1mL/L正磷酸，B：50％水/50％乙腈/2mL/L正磷酸)的二元梯度。進樣體積為20μL。綠原酸分析的波長設定在325nm，咖啡因分析的波長設定在275nm。

-綠原酸異構體-所使用的方法能夠在45分鐘內測定咖啡因和九種主要的綠原酸：3種咖啡?？崴?CQA)、3種阿魏?？崴?FQA)和3種二-咖啡?？崴?二-CQA)的濃度。

-校準-使用外標執(zhí)行校準。使用在甲醇：水(80:20)中濃度為0.2mg/mL的兩種標準品(5-CQA和咖啡因)。使用來自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司(Biopurify)的純標準品測定綠原酸異構體的換算系數(shù)。

根據(jù)以下公式，其他CQA的以克/100克表示的濃度由5-CQA的濃度確定：

-式中：

-W是以每100克新鮮產品的克數(shù)計的被分析物濃度。

-A_S是測試樣品溶液中被分析物的峰面積。

-C₀是以毫克/毫升計的標準品中被分析物的濃度，(5-CQA，如果被分析物不在標準品溶液中)。

-P是當純度小于0.95時標準品中被分析物的純度(如果純度≥0.95，P＝1)。

-V_s是測試溶液的體積，單位為毫升

-D是稀釋系數(shù)(10或1)。

-F是允許由5-CQA標準品計算其他綠原酸異構體的校正系數(shù)。

用于解吸研究和級分組成的LC-MS分析

通過LC-UV-MS/MS如下對咖啡級分進行表征：

-系統(tǒng)：使用1200SL、DAD檢測器(安捷倫科技有限公司(Agilent))和QToF 6520(安捷倫科技有限公司(Agilent))進行分析

-樣品制備：直接進樣

-HPLC方法：在聯(lián)接到QToF 6520(安捷倫科技有限公司(Agilent))的Kinetex C18柱，2.6μm，100×2.1mm(美國菲羅門公司(Phenomenex))上實現(xiàn)色譜分離。應用A/B(A：0.1％甲酸，B：0.1％甲酸的MeOH溶液)的二元梯度。

-柱溫度保持在30℃。樣品在水中的濃度為約10mg/mL。進樣體積為3μL。波長設定在325nm，參照設定在385nm，并且對于兩者，帶寬均為2nm。

-MS參數(shù)：質譜儀QTOF 6520(安捷倫科技有限公司(Agilent))在正負ESI模式下使用，并且在MS模式下操作以跟蹤綠原酸的解吸并在自動MS/MS模式操作進行化合物鑒定。

實施例1-沉淀

在沸水中以50％TC(干物質含量)制備生咖啡提取物(即，含咖啡因的/脫咖啡因的)，沒有任何問題。

由于未處理的提取物會導致柱的堵塞，所以通過在80％乙醇(V/V)中沉淀生咖啡提取物的高分子量(HMW)化合物(即蛋白質、類黑精、阿拉伯半乳聚糖)將這類化合物去除。通過在布氏(Büchner)過濾器(孔隙度等級1)上過濾除去沉淀。進一步蒸發(fā)乙醇。之后，在處理之前和之后通過HPLC-UV評估CGA(綠原酸)的濃度。主要結果為：

-在沉淀HMW化合物后沒有觀察到柱的堵塞。

-80％乙醇處理不影響CGA溶解度。

-CGA中的損失低并且大多包埋在沉淀物中。

總之，醇類(諸如乙醇)在根據(jù)本發(fā)明的方法中尤其的有用。

實施例2-吸附

首先原樣使用由實施例1獲得的咖啡溶液評定吸附。其顯示吸附速率較差。然后，將由實施例1獲得的咖啡溶液酸化至pH 1，以增強CGA物質和樹脂的芳族聚合物之間的疏水相互作用的強度。通過HPLC-UV分析CGA顯示：

-沒有酸化的提取物保留較差(11％)。

-酸化至pH 1顯著改善多酚的保留。與咖啡提取物的天然pH(即pH 4至7)相比，采用酸化步驟時吸附速率幾乎加倍。最終吸附速率增加至約19％。隨后通過優(yōu)化咖啡/樹脂的比例進一步改善該值。

-在酸性條件下，僅CGA和其他疏水性化合物被柱保留，而親水性分子(例如礦物質和糖)通過。

總之，酸性環(huán)境改進了本公開的方案的吸附步驟。

實施例3-柱漂洗

為了除去未保留但仍存在于柱的死體積中的化合物，用水和0.1M HCl進行漂洗。之后，檢查洗滌水的CGA。作為主要發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了：

-純水傾向于解吸CGA。

-在酸性條件下，由于綠原酸保持其質子化和疏水形式，所以保持與樹脂的相互作用。CGA在用0.1M HCl漂洗柱時不被解吸。

-當包括洗滌步驟時，最終富集級分的純度由50％增加至66％。

總之，洗滌步驟提高了最終產物的純度。

實施例4-解吸

對于CGA解吸，必須削弱樹脂和酚化合物之間的疏水相互作用?？紤]到食品級純化級分，選擇乙醇作為有機溶劑。加入KOH(10^-4M)以便提高解吸溶液的pH。將該乙醇/KOH混合物(90/10V/V)用作解吸溶液并且與純乙醇或乙醇/水混合物進行比較。發(fā)現(xiàn)了：

-當使用乙醇/水時，CGA不完全解吸。

-通過將解吸介質的pH升高至5，可顯著提高解吸效率。通過使用乙醇/KOH，CGA為部分去質子化的，即它們對樹脂具有較小的親和力，并且因此觀察到100％的解吸。

-溫度升高至70℃降低30％的解吸持續(xù)時間。

為了確保純化級分中CGA的組成保持與初始咖啡相同，至關重要的是了解不同異構體的解吸動力學以及含咖啡因樣品的咖啡因的解吸動力學。因此，在解吸期間收集一系列級分。如圖2所示，本研究顯示：

-使用90％乙醇時，CQA、FQA和二-CQA在相同的時間間隔內被洗脫，從而可以同時解吸所有異構體。

-對于單一異構體，解吸的最大值也在較小時間范圍內(數(shù)據(jù)未示出)。

-咖啡因開始與CGA一起洗脫，但比CGA解吸更緩慢。

實施例5-咖啡/樹脂比例

為了優(yōu)化咖啡/樹脂比例，在吸附階段期間在柱的出口處進行級分收集。通過UV在325nm(CGA的特征波長)處分析每種級分。最佳比例對應于CGA開始再次從柱中洗脫出來時的咖啡溶液的體積。由該溶液體積計算通過柱的咖啡固形物的相應質量。最佳咖啡/樹脂比例被確定為約0.55g咖啡對應1g樹脂。然而，由于從一種類型的咖啡到另一種類型的咖啡以及在相同種類的咖啡中，綠原酸的含量可能變化很大，所以該比例可變。

實施例6-實驗室規(guī)模下純化之前和之后的組成

在已經完成根據(jù)圖3的純化方案后，將組分與原料的含量進行比較。分析冷凍干燥的粉末的組成，以評估在純化CGA期間出現(xiàn)的其他化合物的變化。如圖4所示，主要變化如下：

-主要變化涉及CGA。其水平在富集的純化級分中高出約2倍；

-碳水化合物和有機酸由于其高極性而顯著降低(含量分別降為原來的1/12和1/10)；

-氨基酸也降低，但幅度小于碳水化合物和有機酸；

-咖啡因存在并且經歷富集高達1.2％(3倍多)，雖然初始咖啡是脫咖啡因的咖啡；

-在“其他”類別中列出的未鑒定化合物的比例變?yōu)?.2倍。造成這種增加的化合物可具有與CGA相同的疏水性，并且因此在該過程中也被吸附。

進一步評估了富集的多酚級分的詳細組成。CGA分布的分析顯示如圖5所示的以下結果。

-在實驗室規(guī)模的純化方案下，CGA水平從33％增加到56％。在富集的純化級分中仍保持CGA異構體的初始平衡；

-FQA平衡保持不變。

-CQA的相對含量略有降低，特別是3-CQA的相對含量。該異構體的較高極性可解釋其在樹脂上的較差吸附。

-二-CQA(主要是3,5-二-CQA和4,5-二-CQA)的含量增加。兩種咖啡酸殘基可賦予這些異構體對樹脂更高的親和力(對于FQA和CQA為兩種相互作用而不是一種)，使其能夠更有效地純化。

-游離咖啡酸的比例顯著增加(含量變?yōu)?倍)，可能是由于在純化過程中CQA的水解。

總體來說，異構體平衡可認為接近初始提取物的異構體平衡。

在所有純化步驟的連續(xù)優(yōu)化之后，可獲得純度為約70％的CGA級分和保留的CGA平衡。富集系數(shù)總體上約為2。該過程的關鍵步驟為：

-通過高分子量化合物在80％乙醇中沉淀進行的預純化。

-在疏水樹脂(即Amberlite FPX66)上的吸附階段，該階段通過在吸收之前酸化提取物至pH1來進行優(yōu)化。

-用乙醇/KOH 10^-4M(90/10)在70℃下進行的解吸階段。

-pH調節(jié)為5，以維持蒸發(fā)期間CGA的溶解度并且改進冷凍干燥時級分的性能。

-富集級分也類似地富集其他含有芳族部分的疏水化合物類，諸如較少的CGA、NPPA、DKP和咖啡因。

實施例7-實驗室規(guī)模下純化之前和之后的純可溶咖啡組成

由實施例6的實驗室規(guī)模研究的發(fā)現(xiàn)，將如圖9所示的優(yōu)化方案應用于純可溶咖啡。在本實施例中，應用以下條件：

-使用純可溶咖啡作為原料

-用實驗室規(guī)模的柱進行多酚富集級分生產。

結果是：

-在實驗室規(guī)模的純化方案下，被分級富集的CGA含量由10％增加到24％。在富集的純化級分中仍保持CGA異構體的初始平衡；

-在實驗室規(guī)模的純化方案下，CGA水平從33％增加到56％。在富集的純化級分中仍保持CGA異構體的初始平衡；

-該優(yōu)化的方案可應用于純可溶咖啡

實施例8-避免由CGA形成乙酯

研究了有利于由CGA不期望地形成乙酯的過程條件。隨后在模型研究中研究了CGA降解的動力學和分別的CGA酯的形成。在該過程中，可形成CGA的乙酯。然而，這是不期望的，因為它可顯著影響CGA平衡和富集級分的性質。

以下方案顯示了產生乙酯的酯化的一般反應機理。酸和醇之間的反應通過質子轉移催化，使得反應速率為pH依賴性的。作為第二關鍵參數(shù)，溫度應該影響降解速率，因為這是化學反應的通常情況。評價兩個參數(shù)以便確定避免CGA的乙基化的理想條件。

在實驗期間，通過改變以下參數(shù)pH、溫度和時間，在乙醇(75％乙醇溶液)存在下儲存5-CQA。

該過程在以下條件下使用5-CQA酯化作為模型進行。

對于每次試驗，將10mg的5-CQA溶解于40mL的75％乙醇溶液中。

-pH研究：用鹽酸(32％)將pH調節(jié)至pH 1、pH 2.7和pH 4，使用NaOH溶液(4N)將pH調節(jié)至pH 12，并且將所有樣品保持在80℃溫度的實驗室烘箱中2小時。

-溫度研究：將CQA溶液用鹽酸(32％)調節(jié)至pH 1，并且在實驗室烘箱中在室溫、50℃或80℃下保持2小時。

-時間研究：將5-CQA溶液調節(jié)至pH 1并且在室溫或50℃下保持1小時、2小時、3小時和36小時(僅室溫)。

-系統(tǒng)：使用具有DAD檢測器(美國菲尼根質譜公司(Thermo Finnigan))和Rheos HPLC系統(tǒng)(美國菲尼根質譜公司(Thermo Finnigan))的LCQ Deca質譜儀(美國菲尼根質譜公司(Thermo Finnigan))在LC-DAD-MS系統(tǒng)上進行分析。

-樣品制備：對于每個參數(shù)，將溶液的等分試樣以1:10稀釋，并且直接用于LC/MS-DAD分析。

-HPLC方法：在環(huán)境溫度下在Zorbax Eclipse C18柱，5μm，150×3mm(安捷倫科技有限公司(Agilent))上進行分離。應用A/B(A：0.1％甲酸，B：甲醇)的二元梯度。

-MS參數(shù)：所使用的質譜儀是以FullScan和數(shù)據(jù)依賴的MS/MS模式(m/z 100-1000)操作的LCQ-Deca，用于化合物鑒定。

pH

通過LC/MS-DAD監(jiān)測5-CQA的降解和相應乙酯的形成。圖6顯示在75％乙醇溶液中在不同pH下儲存2小時的5-CQA的色譜圖。pH研究顯示：

-在pH 1時，在2小時內觀察到5-CQA快速轉化成其酯。

-在pH 2.7時，5-CQA酯化顯著降低。

-在pH 4下，5-CQA在2小時后幾乎不降解。

-強堿性條件(pH 12)引起完全不同的反應方案，包括水解5-CQA產生咖啡酸和奎尼酸。此外，堿性條件有利于通過3-CQA和4-CQA的出現(xiàn)觀察到的5-CQA的異構化。

總之，在乙醇存在的條件下，富集級分的pH應該為約4，諸如4至5。因此，對于圖6所示的根據(jù)本發(fā)明的方法中的步驟(v)，約4至5的pH可能是最優(yōu)的，其中可以看出，在較低的pH(pH 2.7及以下)下發(fā)生乙酯形成，而在較高的pH(pH 12)下，發(fā)生5-CQA水解產生咖啡酸和奎尼酸。此外，堿性條件有利于通過3-CQA和4-CQA的出現(xiàn)觀察到的5-CQA的異構化。

溫度

在下一步驟中，評價了溫度的影響。為了模擬最壞情況，選擇pH 1。實際上，其對應于前面實驗中最關鍵的pH，并且其目前反映了純化方案的條件。2小時后，通過LC/MS-DAD監(jiān)測保持在三個溫度即環(huán)境溫度(室溫)、50℃和80℃下的5-CQA的降解(圖7)。溫度研究顯示：

-在室溫下，僅少量的5-CQA轉化成其乙酯。

-在50℃下，酯化速率升高。與天然5-CQA相比，高達40％的酯是可檢測的。

-在80℃下，5-CQA至其乙酯的酯化進一步加速，得到與5-CQA相比相同量的酯。

總之，在乙醇存在的情況下，咖啡提取物和富集級分的溫度應該降低，特別是在酸性條件下。

時間

雖然pH和溫度與純化裝置的尺寸無關，但停留時間隨著放大而明顯增加。因此，下一項研究評估了在給定pH和溫度下5-CQA轉化成其乙酯的酯化動力學。該研究在pH 1下在室溫和50℃下進行(圖8)。時間研究顯示：

-在50℃下，5-CQA在第一個3小時內穩(wěn)定地轉化成其乙酯。在對應于放大方案的當前解吸持續(xù)時間的時間段之后，形成30％的酯。

-在室溫下，5-CQA的穩(wěn)定性高得多。3小時后僅形成3％的酯。36小時后增加至14％。

總之，乙酯的形成取決于解吸步驟的pH和溫度。

實施例9-大規(guī)模下純化之前和之后的脫咖啡因咖啡組成

由實施例6的實驗室規(guī)模研究的發(fā)現(xiàn)，將優(yōu)化的方案(圖9)放大以用于更大量地生產富集級分而不降解CGA。在本實施例中，應用以下條件：

-使用脫咖啡因的生咖啡提取物作為原料

-用1m柱進行多酚富集級分的生產。

生產5批以便評估純化過程的可重復性。

進行脫咖啡因級分的完全表征，結果顯示在圖10中。

-脫咖啡因的分級富集的CGA含量從33％增加到63％。

-純化后組成的變化與實驗室規(guī)模制備期間觀察到的變化相似(參見實施例6)。

-與實驗室規(guī)模制備相比，其他化合物的群組較少富集(9.4％對18.8％)。

-與實驗室規(guī)模相比，咖啡因的富集較低(0.8％對1.2％)。

CGA的詳細組成示于圖11中。

如在實驗室規(guī)模條件下已經看到的，CGA平衡保持得相當好(實施例6)。

-主要變化涉及作為CGA中極性最高的化合物的3-CQA，其在純化后不太豐富。

-相反地，更多的非極性二-CQA和FQA在純化時被富集。

此外，評估了更新的方案(圖9)的性能。

-總體回收率為24％。

-CGA的回收率為46％。

-與初始量相比，CGA富集系數(shù)為1.9。

此外，使用HPLC-UV/MS對最終產物中CGA及其酯的分析顯示了：

-乙酯的轉化大大降低

-酯的最終濃度不超過天然CGA濃度的1％

因此，確實可以在工業(yè)上適用的規(guī)模下針對脫咖啡因組合物進行根據(jù)本發(fā)明的方法，而不會大大影響多酚平衡或產生大量乙酯。

實施例10-大規(guī)模下純化之前和之后的含咖啡因咖啡組成

對于含咖啡因的多酚富集級分，還按以下條件應用更新的方案(圖9)：

-使用含咖啡因的生咖啡提取物作為原料

-并行使用兩個60cm柱進行多酚富集級分生產以減少停留時間。

-生產10批以便評估純化過程的可重復性。

進行含咖啡因的級分的完全表征，結果可見于圖12中。

-含咖啡因的分級富集的CGA含量從33％增加到53％。

-咖啡因的量從9.7％增加一倍以上至19.9％。

-碳水化合物和有機酸由于其高極性而大大降低。

-其他化合物略有增加。

-這些變化與脫咖啡因的富集級分觀察到的變化相似。

富集的含咖啡因的級分中CGA的詳細組成示于圖13中。

-與脫咖啡因的富集級分相反，3-CQA濃度幾乎保持不變。

-主要變化涉及5-CQA，其在純化后不太豐富。

-總體而言，脫咖啡因的富集級分的組成變化較不明顯，并且分布保持與初始咖啡非常相似。

對于含咖啡因的富集級分，分別分析十個批次以評價批次與批次之間的性能。

-發(fā)現(xiàn)總體回收率為34％，因此相對于脫咖啡因的富集級分(24％)更高。

-相較于脫咖啡因的富集級分的46％的回收率，CGA的回收率為55％。

-相較于脫咖啡因的富集級分的1.9的富集系數(shù)，CGA富集系數(shù)為1.6。

還進行HPLC-UV/MS以控制含咖啡因的富集級分中CGA及其酯的含量。數(shù)據(jù)未示出。

-酯的最終濃度不超過天然CGA濃度的1％

-如對于脫咖啡因的富集級分已經看到的，該形成不可完全避免。

因此，確實可以在工業(yè)上適用的規(guī)模下針對含咖啡因的組合物進行根據(jù)本發(fā)明的方法，而不會大大影響多酚平衡或產生大量乙酯。

實施例11-脫咖啡因的富集級分和含咖啡因的富集級分的制備的性能比較。

結論：

-使用圖9中顯示的方案，對于脫咖啡因的咖啡，可獲得63％純度的級分，而對于含咖啡因的咖啡，可獲得53％純度的級分。

-脫咖啡因的級分的更好性能可能是由于咖啡因的存在/不存在。由于咖啡因以2的系數(shù)被富集，所以對于含咖啡因的級分，咖啡因達到幾乎20％的濃度，這同時降低CGA的相對濃度。

-對于其他化合物，在純化后沒有觀察到脫咖啡因的級分和含咖啡因的級分之間的具體差異。

-脫咖啡因的級分和含咖啡因的級分之間，3-CQA、4-CQA和5-CQA的比例不同。這是由于在脫咖啡因過程中已經發(fā)生的異構化。與初始分布相比，純化過程對富集級分中CGA的組成幾乎沒有影響，因此在整個過程中維持多酚的異構體平衡。

-在這兩種情況下，酯的濃度不超過天然CGA濃度的1％。

-由于在該方法期間存在大量的CGA和乙醇，所以在不完全改變方案的情況下不可完全避免酯形成。因此，對于CGA富集級分的食品級制備物，小于1％的酯的量必須被認為是技術上不可避免的。

-批次與批次之間的可重現(xiàn)性非常好，相對標準偏差小于10％。因此，該方案適于從一個批次向另一批次遞送富集CGA的級分，該級分具有指定量的CGA和眾所周知的單一異構體平衡。

實施例12-乙醇濃度的優(yōu)化

在前面的實施例中已經描述了純化咖啡多酚的食品級方案，其中咖啡多酚吸附到疏水性樹脂上。在等度條件下使用90％的含水乙醇進行解吸，在最終富集級分中多酚的純度為60％至70％。

考慮到生產更具體的多酚產物，研究了純化的咖啡多酚異構體的制備。為了這一目的，采用具有遞減極性的溶劑(即含水乙醇20/80、50/50、80/20)的連續(xù)解吸步驟。

在解吸混合物中在乙醇比例遞增的三個連續(xù)步驟中進行解吸。方案示出于圖14中。如下獲得三種純化的富集級分：

步驟1-用乙醇/水/KOH 20/70/10(v/v/v)解吸；

步驟2-用乙醇/水/KOH 50/40/10(v/v/v)解吸；

步驟3-用乙醇/水/KOH 80/10/10(v/v/v)解吸。

通過應用梯度從食品級樹脂進行解吸，獲得三種不同的富集級分。然后通過HPLC-UV評估這些富集級分的綠原酸組成。圖15示出了CGA的三個主要類別的相對貢獻。圖16示出了三種不同富集級分的HPLC色譜圖。

主要發(fā)現(xiàn)：

-與先前所示的初始提取物的多酚相比，所有富集級分含有約兩倍的多酚(即65-85％對33％)；

-用20％乙醇解吸產生含有70.7％綠原酸的富集級分，該綠原酸中97％是單CQA并且2.4％是單FQA。因此，在低乙醇比例(即20/80)下獲得幾乎僅含有CQA的富集級分；

-用50％乙醇解吸產生含有85.7％綠原酸的富集級分，該綠原酸具有接近初始生咖啡提取物的分布。因此，在中間乙醇比例(即50/50)下獲得具有CQA、FQA和二CQA的混合組成的富集級分；

-用80％乙醇解吸產生含有65.1％綠原酸的富集級分，該綠原酸中65％為較低極性的二-CQA。因此，在高乙醇比例(即80/20)下獲得富集非極性二-CGA的級分。

這種梯度應用在期望改進各種形式的綠原酸化合物類的解吸的情況下可能是有幫助的，并且之后可將富集級分組合以提供與最初在咖啡中的CGA異構體平衡類似的CGA異構體平衡。在需要更具體的組成的情況下，梯度解吸也可以是有用的。