一種血細胞分離管的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種血細胞分離管，所述分離管由管體、旋蓋、置于管體內(nèi)的細胞分離隔膜和加樣滑板組成；所述分離管管體是一個底部為半圓形或圓錐形的離心管，管口處有用于固定所述旋蓋的外螺紋，所述分離隔膜固定在所述分離管內(nèi)接近分離管管底處；所述加樣滑板由一個圓盤和與所述圓盤邊緣連接的∩型推桿組成，所述推桿的另一端設(shè)有一個橢圓形的推桿柄，所述圓盤邊緣與所述分離管內(nèi)壁之間有一個狹窄的環(huán)形間隙。本實用新型提供的血細胞分離管通過改變加樣和取樣方式使傳統(tǒng)的、復(fù)雜的加樣模式變成易于操作的方式，使得臨床醫(yī)學(xué)檢驗和細胞生物學(xué)研究中的細胞分離過程更簡化、操作更容易。
【專利說明】一種血細胞分離管

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細胞分離技術(shù)，具體涉及一種血細胞分離管，本 實用新型提供的血細胞分離管基于細胞密度梯度離心分離細胞的原理，通過改變加樣和取 樣方式使傳統(tǒng)的、復(fù)雜的加樣模式變成易于操作的方式。

【背景技術(shù)】
[0002] 在臨床醫(yī)學(xué)檢驗中，針對特定細胞功能和生物學(xué)特性的檢查常常涉及到細胞的分 離技術(shù)，從外周血液和各種體液（胸水、腹水、心包積液等）中分離單個核細胞是體外進行 淋巴細胞免疫學(xué)研究和細胞學(xué)實驗的重要前處理步驟，分離的目的細胞的質(zhì)和量是保證后 續(xù)實驗可靠性的重要環(huán)節(jié)。
[0003] 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是參與機體 免疫應(yīng)答反應(yīng)的一類重要免疫細胞群。PBMCs主要包含淋巴細胞和單核細胞，PBMCs中大部 分（80 %?90 % )為淋巴細胞，其余成分是單核細胞，淋巴細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細 胞兩大類，這兩種免疫細胞按其細胞表面標(biāo)志和細胞功能又分為不同的細胞亞群，按照淋 巴細胞表面標(biāo)志T淋巴細胞有⑶3+、⑶4+、⑶8+、⑶28+、⑶38+、⑶45+細胞等等，按照功能分 還有輔助T細胞（helper T cell，Th)、效應(yīng)T細胞（Effector T cells, Te)、遲發(fā)性變態(tài)反 應(yīng) T 細胞（Delayed type hypersensitivity T cells, Td)和細胞毒性 T 細胞（Cytotoxic T cells，Tc)等等；B淋巴細胞有B1、B2兩種亞型，對不同淋巴細胞亞群的分離、鑒別以及功 能的研究對疾病的診斷乃至治療都有十分重要的臨床意義。
[0004] 任何疾病的發(fā)生、發(fā)展都有相應(yīng)淋巴細胞的數(shù)量、形態(tài)或者功能的改變，從細菌、 病毒等一些病源微生物對人類的感染到腫瘤的發(fā)生以及一些免疫缺陷病、自身免疫性疾病 和遺傳性疾病等許多疾病都有淋巴細胞參與的應(yīng)激性免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為某些細胞亞群數(shù)量 的改變、淋巴細胞膜表面標(biāo)志物的變化或者引起細胞功能的變化（細胞因子的分泌或抗體 的產(chǎn)生），例如結(jié)核分枝桿菌侵入人體后會迅速被體內(nèi)的淋巴細胞所識別，從而引起相應(yīng)的 細胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致初始淋巴細胞在結(jié)核抗原刺激下轉(zhuǎn)化成效應(yīng)T淋巴細胞，這些效應(yīng)T淋 巴細胞再次受到結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后會產(chǎn)生相應(yīng)的細胞因子Y-干擾素，體外檢測 這些分泌Y-干擾素的效應(yīng)T淋巴細胞對于診斷結(jié)核分枝桿菌感染具有重要的臨床意義。
[0005] 淋巴細胞的分離方法有多種，這些分離方法的原理是根據(jù)各種細胞間的密度差 異、細胞的粘附特性或者細胞膜表面標(biāo)志的不同等物理的和生物學(xué)性能而設(shè)計的，主要方 法包括粘附分離法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和流式細胞儀法等。
[0006] 粘附分離法是根據(jù)細胞對玻璃、尼龍棉等不同材質(zhì)接觸表面的粘附差異分離細胞 的，被分離的混合細胞流經(jīng)吸附物體表面時粘附性高的細胞附著在吸附物表面，粘附性低 的隨液流被沖走。中國專利CN87102643A公布一種基于細胞粘附性質(zhì)設(shè)計的細胞分離器， 該專利對細胞吸附材料的制作進行優(yōu)化，目的是提高分離細胞的純度和比例。粘附分離法 分離目的細胞的回收率除了與選擇的吸附材料有關(guān)外，還與分離時控制輸入細胞的流速有 關(guān)，為此中國專利CN200520134012公布了一項微流體細胞分離裝置制造方法，該裝置在 控制被分離的混合細胞流速方面做了一些嘗試。粘附分離法需要控制被分離混合細胞的輸 入速度，操作比較麻煩，這種方法細胞分離純度不高、回收率也低。
[0007] 免疫磁珠法是應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合的原理分離細胞的，在各類淋巴細胞亞群 的細胞膜上有不同的分化抗原，利用標(biāo)記不同單克隆抗體的免疫磁珠與具有相同抗原表位 的淋巴細胞特異性結(jié)合，然后在磁力場或者離心力的作用下將不同的淋巴細胞分離，這種 分離細胞的方法如同用魚餌釣魚，免疫磁珠相當(dāng)于魚餌，由于具有特異性結(jié)合的特性，所以 免疫磁珠法具有分離純度較高的特點，通常分離純度能達到90%?99%，細胞的收獲率也 相對較高，但是，免疫磁珠分離的淋巴細胞的效果和活力受磁珠的種類和標(biāo)記抗體的影響， 而且成本高。
[0008] 流式細胞分離法是20世紀70年代發(fā)展起來的細胞鑒定和分選技術(shù)，它將激光技 術(shù)、計算機技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)融合，使 流式細胞儀得以誕生。流式細胞儀將細胞的分離和鑒別合二為一，其分離細胞的原理是： 細胞液流在高頻超聲振蕩波的作用下分成均勻的含單個細胞的微小液滴，液滴在交變電場 的作用下極化成帶有不同電荷微粒，不同種類的細胞極化后帶的電荷密度不一樣，這些帶 電微粒在電場力的作用下發(fā)生偏離，由此實現(xiàn)對帶有不同表面抗原的淋巴細胞分離。如果 將液流中的某些細胞預(yù)先用熒光染色抗體或者DNA染料標(biāo)記，標(biāo)記的細胞會被流式細胞儀 中的光電檢測系統(tǒng)識別，從而實現(xiàn)對細胞的自動分析。目前，流式細胞分離技術(shù)已經(jīng)比較成 熟，流式細胞術(shù)在分選細胞的同時還可以同時檢測細胞的DNA含量、細胞體積、細胞膜受體 和表面抗原以及細胞所處周期等許多生物信息，但是，用流式細胞術(shù)分選細胞成本較高，分 離過程可能對細胞有損傷，從而影響細胞的活性。另外，該方法不能進行無菌操作，這使得 分選的細胞不宜再做培養(yǎng)方面的研究。
[0009] 免疫磁珠法和流式細胞分離法分離的淋巴細胞對分離樣本有選擇，通常這兩種方 法使用的樣本是經(jīng)過密度梯度離心方法分離獲得的混合淋巴細胞，這也是上述兩種方法能 獲得較高純度的重要原因。
[0010] 在多種細胞分離方法當(dāng)中，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度離心法是分離淋巴細 胞最傳統(tǒng)和經(jīng)典的方法，這種方法是利用密度接近單個核細胞的聚蔗糖-泛影葡胺 (Ficoll-Hypaque)細胞分離液分離目的細胞的，原理是利用人類血液中各種血細胞之間 存在密度差異，例如紅細胞密度為1. 090?1. 093,粒細胞密度為1. 090?1. 092,單個核 細胞的密度為1. 075-1. 090,血小板為1. 030?1. 035。Ficoll-Hypaque是一種密度為 1. 077±0. 001g/L與血漿等滲的低粘度混合溶液，如果將全血疊加在Ficoll-Hypaque分離 液上面在離心力場的作用下，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細胞與粒細胞 由于密度較大，離心后沉降在分離液的底部，血漿和血小板密度較低，離心后懸浮在分離 液的上面，單個核細胞密度接近于分離液，由于分離液對單個核細胞的浮力作用大于離心 力的作用，所以使單個核細胞不會下沉，離心后依然位于分離液界面上，這樣就可以分離 獲得單個核細胞。密度梯度離心分離單個核細胞的主要優(yōu)點是：
[0011] ⑴操作步驟比較簡單，適合大量樣本的分離；
[0012] ⑵能夠?qū)崿F(xiàn)無菌操作，分離的單個核細胞適宜臨床應(yīng)用；
[0013] ⑶對分離的單個核細胞的損傷較小。
[0014] 正是由于密度梯度離心法具有的上述這些優(yōu)點，才使得它作為最經(jīng)典的細胞分離 方法占有重要的地位，雖然新的細胞分離方法不斷出現(xiàn)，但是，密度梯度離心法具備的這些 優(yōu)勢是其他方法難以替代的。盡管如此，密度梯度分離法也受一些因素影響，其主要影響因 素包括：
[0015] ⑴分離液的化學(xué)組成成分及性質(zhì)；
[0016] ⑵將樣本疊加在分離液液面上的操作技巧；
[0017] ⑶離心力和離心時間；
[0018] ⑷樣本抗凝和被稀釋比例；
[0019] (5)離心過程的溫度控制。
[0020] 分離液的化學(xué)組成和性質(zhì)是決定分離效果的重要的因素，為此一些研究人員通 過改變分離液的組成成分借此提高單個核細胞的分離效果，目前除了由聚蔗糖_泛影葡 胺制備的分離液，人們也開發(fā)了由不同化合物組成的密度梯度分離液，比如由Percoll 硅膠顆粒制備的連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度分離液，這種分離液能選擇性地分離某種類型 的免疫細胞，并且可以提高分離的目的細胞的純度。鄒常春等（實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2009， 27(4) :337-344)報道了一種改良的從全血中分離中性粒細胞的方法。2012年中國專利 CN201110456878公布了一種復(fù)方淋巴細胞分離介質(zhì)，配方中的全部原料均符合靜脈注射級 原料藥的標(biāo)準，原料的安全性高，分離的淋巴細胞純度及淋巴細胞回收率與常規(guī)分離液比 無顯著差異。另外一項中國專利CN20121011408公布了由羥乙基淀粉替代右旋糖酐的細胞 分離液的制備方法，這種組合方法進一步提高了分離液的生物安全性，使得分離的淋巴細 胞狀態(tài)更好，活力更高。
[0021] 密度梯度離心法是根據(jù)各種血細胞之間的密度差異分離單個核細胞的，由于分離 液的密度最接近目的細胞，因此，離心后這些細胞被富集在分離液的上面，形成一層濃集的 目的細胞層。一般情況下通過優(yōu)化離心力、離心時間等條件密度梯度離心法分離的目的細 胞混有其他雜細胞的數(shù)量是可以控制的（郭繼強，劉愛兵，沈丹等.中國組織工程研究與康 復(fù).2011，15(45) :8447-8450 ;樊衛(wèi)平，宋玉靖，郝顏琴等，山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010, 41(3): 274-284)。但是，任何改變分離液密度的因素都會影響密度梯度離心法的分離效果，分離液 密度的變化不僅會影響分離的目的細胞的數(shù)量，還可能導(dǎo)致富集的目的細胞層中混入其他 的雜細胞。為了不影響分離液的密度，除了離心時應(yīng)控制適當(dāng)?shù)臏囟韧?，再有就是在加入?本時操作必需非常小心，不能讓樣本沖散分離液液面，如果有部分樣本與分離液混合，勢必 會改變分離液的密度，影響分離效果。
[0022] 密度梯度離心法的操作過程有以下幾個步驟：⑴將樣本（如外周血液）用細胞培 養(yǎng)液或生理鹽水1 : 1?1 : 2稀釋，使各類細胞充分分散；⑵將1/2樣本量的分尚液加入 離心管中；⑶用巴氏吸管將稀釋樣本沿離心管管壁緩慢加到分離液的上面，盡量保持加入 樣本與分離液液面清晰；⑷以500?1000g的離心速度離心20?30min ;(5)用巴氏吸管吸 取目的細胞層。上述第⑶、第(5)步驟是密度梯度離心法操作最繁瑣的步驟，操作生疏者不容 易掌握，對于操作熟練者也是一個繁瑣、費力的事。 實用新型內(nèi)容
[0023] 為解決密度梯度離心法加樣、取樣操作繁瑣問題，本實用新型的目的是提供一種 血細胞分離管。
[0024] 為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用了以下技術(shù)方案：
[0025] -種血細胞分離管，其特征在于，所述分離管由管體、旋蓋、置于管體內(nèi)的細胞分 離隔膜和加樣滑板組成；所述分離管管體是一個底部為半圓形或圓錐形的離心管，管口處 有用于固定所述旋蓋的外螺紋，所述分離隔膜固定在所述分離管內(nèi)接近分離管管底處；所 述加樣滑板由一個圓盤和與所述圓盤邊緣連接的n型推桿組成，所述推桿的另一端設(shè)有一 個橢圓形的推桿柄，所述圓盤邊緣與所述分離管內(nèi)壁之間有一個狹窄的環(huán)形間隙。
[0026] 優(yōu)選地，所述分離管分離隔膜以上的一段長度為3?5厘米的管壁或分離隔膜至 管口這部分管壁為相同內(nèi)徑的圓柱形結(jié)構(gòu)。
[0027] 優(yōu)選地，所述分離管內(nèi)在所述分離隔膜以下預(yù)留的容積為3?5ml。
[0028] 優(yōu)選地，所述分離隔膜上有1個或1個以上等間距分布的小孔，所述小孔的孔徑相 同，所述孔徑為1?l〇mm。
[0029] 優(yōu)選地,所述小孔依軸心對稱分布。
[0030] 優(yōu)選地，所述環(huán)形間隙的寬度為0. 01?5mm，所述環(huán)形間隙的寬度使得在所述圓 盤以上加入一定量的血液樣本時，所述血液樣本在自身重力作用下不會通過所述環(huán)形間隙 向下泄漏，當(dāng)改變所述圓盤的上下位置時，所述血液樣本能夠通過所述環(huán)形間隙自由流動。
[0031] 優(yōu)選地，所述加樣滑板和管體的材料選擇非極性或弱極性的高分子聚合材料，這 些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以及SEBS其中 的任意一種。
[0032] 本實用新型的優(yōu)點和積極效果在于：所提供的血細胞分離管與應(yīng)用普通離心管分 離單個核細胞的方法相比，簡化了后者復(fù)雜的操作過程，其特征是使常規(guī)的必需應(yīng)用巴氏 吸管加樣、取樣操作簡化了。
[0033] 本實用新型所提出的加樣滑板改變了傳統(tǒng)的加樣方式，使血液樣本與分離液的疊 加界面更清晰，并減少了不必要的失誤。
[0034] 在以下本實用新型實施方案中，為了提高目的細胞的收率，采用在分離隔膜上增 加分離液的方式。因為有了加樣滑板，加樣時才可以直接倒入樣本，這樣不僅可以提高分離 細胞的收獲率，又仍然保持簡化的加樣操作的特點。
[0035] 本實用新型所提供的血細胞分離管適用所有密度梯度分離介質(zhì)，如將上述預(yù)充的 Ficoll-Hypaque分離液用Percoll分離液代替，在應(yīng)用Percoll連續(xù)的密度梯度分離方式 時，加入分離液的方法與加入Ficoll-Hypaque分離液相同。本實用新型所提供的血細胞分 離管更適用于Percoll不連續(xù)密度梯度法分離細胞，在利用Percoll不連續(xù)密度梯度法分 離目的細胞時，可將密度較高的Percoll分離液加在分離隔膜以下，然后直接將密度較低 的Percoll分離液倒入分離管的適當(dāng)?shù)母叨燃纯?，由于有分離隔膜的阻擋，不必擔(dān)心高密 度與低密度的Percoll分離液相互混合。
[0036] 本實用新型中，分離隔膜上的小孔依軸心對稱分布，使流體通過分離隔膜后流速 均勻分布同時增加其流通系數(shù)；制作加樣滑板和分離管的材料選擇非極性或弱極性的高分 子聚合材料，這些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以 及SEBS其中的任意一種，這類材料的表面能低，潤濕性差，所形成的縫隙能夠利用液體的 表面張力特性呈現(xiàn)自封閉性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1是血細胞分離管的完整結(jié)構(gòu)圖。
[0038] 圖中1旋蓋，2分離管管體，3推桿，4推桿柄，5加樣滑板，6圓盤7分離隔膜 [0039] 圖2是實例1的操作示意圖。
[0040] 圖中：I血漿層II單個核細胞層III分離隔膜IV紅細胞層
[0041] 圖3是實例2的操作示意圖。
[0042] 圖4是實例3的操作示意圖。

【具體實施方式】
[0043] 實例1本實用新型的一個應(yīng)用方式是，不用加樣滑板的情況下也可以按照簡化的 操作方法分離目的細胞。圖2是本方案的示意圖，在這項實施方案中可以將預(yù)分離血液樣 本直接倒入分離管中，在血液樣本倒入分離管過程中，分離隔膜將阻止樣本與分離液混合， 選擇2000轉(zhuǎn)/分的離心速度離心20分鐘，離心后紅細胞通過分離隔膜沉積在分離管底，單 個核細胞則被富集在分離隔膜以上的細胞分離液和血漿層之間，取樣時將分離隔膜以上的 液體直接倒入新的試管中即可。
[0044] 表1兩種方法分離的淋巴細胞濃度、純度和活力
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種血細胞分離管，其特征在于，所述分離管由管體、旋蓋、置于管體內(nèi)的細胞分離 隔膜和加樣滑板組成；所述分離管管體是一個底部為半圓形或圓錐形的離心管，管口處有 用于固定所述旋蓋的外螺紋，所述分離隔膜固定在所述分離管內(nèi)接近分離管管底處；所述 加樣滑板由一個圓盤和與所述圓盤邊緣連接的η型推桿組成，所述推桿的另一端設(shè)有一個 橢圓形的推桿柄，所述圓盤邊緣與所述分離管內(nèi)壁之間有一個狹窄的環(huán)形間隙。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血細胞分離管，其特征在于，所述分離管分離隔膜以上的一 段長度為3?5厘米的管壁或分離隔膜至管口這部分管壁為相同內(nèi)徑的圓柱形結(jié)構(gòu)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血細胞分離管，其特征在于，所述分離管內(nèi)在所述分離隔膜 以下預(yù)留的容積為3?5ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血細胞分離管，其特征在于：所述分離隔膜上有1個或1 個以上等間距分布的小孔，所述小孔的孔徑相同，所述孔徑為1?l〇mm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的血細胞分離管，其特征在于，所述小孔依軸心對稱分布。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血細胞分離管，其特征在于，所述環(huán)形間隙的寬度為 0. 01?5mm，所述環(huán)形間隙的寬度使得在所述圓盤以上加入一定量的血液樣本時，所述血 液樣本在自身重力作用下不會通過所述環(huán)形間隙向下泄漏，當(dāng)改變所述圓盤的上下位置 時，所述血液樣本能夠通過所述環(huán)形間隙自由流動。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血細胞分離管，其特征在于：所述加樣滑板和管體的材 料選擇非極性或弱極性的高分子聚合材料，這些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯 乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以及SEBS其中的任意一種。
【文檔編號】C12M1/12GK204097473SQ201420358393
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】宋雪, 程月紅 申請人:北京圣浦博大生物科技有限公司